KR20220155712A - 인유두종 바이러스 및 자궁경부암 감지용 다클론성 항체 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자궁경부암 진단을 위한 HPV 항체로써 에피토프 펩타이드 HPV 항원을 이용하여 제조하고, 이들의 용도에 대한 것이다. HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 에피토프 펩타이드 항원을 이용하여 HPV 다클론성 항체를 만드는 방법에 관한 것이다. 본 항체를 이용하면 HPV 항체에 특이적으로 결합하여 높은 민감도 및 정확도로 시료 내 HPV 6, 11, 16 및 18 항체를 복합적으로 검출할 수 있다. 항체 역가를 측정하여 HPV 백신의 접종시기를 결정하는데 활용될 수 있고, 백신접종 후 방어 기간의 측정 등에 활용 가능하다.
Description
본 발명은 분자 바이러스학 및 면역학 분야, 특히 HPV 감염의 치료와 관련된 분야에 관한 것으로,본 발명은 HPV 감염을 치료하기 위한 에피토프 펩타이드의 제조와 에피토프 펩타이드에 대한 항체에 관한 것으로 상세하게는 HPV 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 진단하거나 치료에 필요한 HPV의 진단을 위한 에피토프 펩타이드를 이용한 인유두종 바이러스 및 자궁경부암 감지용 다클론성 항체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
전세계적으로 매 2분마다 한 명의 여성이 자궁경부암으로 사망한다. 세계적으로 매년 발생하고 있는 자궁경부암은 전세계 여성에게 2번째로 빈번히 발생하는 암이며, 해마다 약 50만 명에게 발병하며 특히 여성에게는 유방암과 폐암에 이어 세 번째로 주된 암 사망의 원인이다. 자궁경부암의 99% 이상에서 HPV(Human Papillomavirus) 감염이 발견되는데, 이러한 HPV는 100종이 넘으며 그 중 30 ∼ 40 종은 점막조직(mucosal tissue) 감염을 유발하며 저위험성 HPV(low-risk HPV)와 발암성 HPV로 나뉜다. 무엇보다 중요한 것은, 자궁경부암과 직접 관련이 있는 15종 이상의 발암성 HPV이다. 이러한 발암성 HPV 중 16번, 18번이 가장 중요한데 이는 전세계적으로 70% 이상의 자궁경부암에서 발견된다. 대부분의 HPV 감염은 보통 6개월에서 2년 내에 자연 치유되지만 발암성 HPV에 지속적으로 감염되면 자궁경부암으로 발전할 수 있다. HPV의 아형의 종류는 인종적, 지형적, 환경적 특징을 갖기 때문에 백신개발에 있어 그 나라 고유의 아형 실정을 바로 알아야 하며, 한국에서 많이 발생하는 아형을 이용한 한국 고유의 백신 개발이 필요하며 나아가 이러한 백신의 개발시 필수적으로 백신의 면역원성(immunity)을 측정할 수 있는 기술 시스템이 확립되어야 한다. 현재까지 개발된 Gardasil(Merck사)와 Cervarix(GSK사)와 같은 HPV 예방백신 접종 후 항체의 유지기간과 효능 나아가 백신의 투여시기를 조사하기 위해서는 혈청 내 이들 HPV 아형에 대해 생성된 항체의 역가를 측정하는 것이 무엇보다 중요하다. 그러나 이러한 백신에 대한 면역원성을 동시에 측정할 수 있는 기법이 아직 확립되지 못했다. 최근에 개발된 마이크로칩 기술을 이용한 HPV 항체 스크리닝 키트(바이오메드랩, 한국)는 슬라이드상에서 반응하는 2차원적인 방법으로 교잡반응 후에 3차에 걸쳐서 세척과정을 거쳐야 하는 번거로움이 있다. 또한 서스펜션 어레이를 이용한 방법의 HPV 항체 스크리닝 키트가 개발되어 있으나, 신호 강도가 매우 낮아 현실적으로 스크리닝을 하기에는 그 한계가 있었다. 이에, 본 발명자들은 백신의 면역원성을 측정할 수 있는 HPV 항체 스크리닝 기술을 확립하기 위해 노력한 결과, HPV L1 항원에 타입 특이적인 에피토프 펩타이드를 이용하여 만든 HPV 항체로써 HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 에피토프 펩타이드 항원을 이용하여 HPV 다클론성 항체를 만들었다. 이는 HPV L1 단백질의 다양한 type별로 선택적이며 특이적으로 결합 할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 이는 또한 HPV 항체 스크리닝 키트로 개발하여 HPV 예방 백신 접종 후 백신에 대한 면역원서을 측정하는데 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명에서는 사람 파필로마 바이러스(HPV) L1 단백질에 특이적인 반응을 하는 에피토프 펩타이드를 이용한 사람 파필로마 바이러스(HPV) 및 경부암 감지용 다클론성 항체 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.
상기한 과제를 해결한 본 발명의 사람 파필로마 바이러스(HPV) 및 경부암 감지용 다클론성 항체는 HPV L1 항원에 타입 특이적인 에피토프 펩타이드를 이용하여 만든 HPV항체로써, HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 항원의 특이적 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 다클론성 항체는 HPV6L1 단백질의 485부터 500번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드와 170부터 179번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 다클론성 항체는 HPV11L1 단백질의 275부터 288번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드와 432부터 441번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 다클론성 항체는 HPV16L1 단백질의 377부터 391번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 다클론성 항체는 HPV18L1 단백질의 498부터 510번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 HPV L1 항원에 타입 특이적인 에피토프 펩타이드는 이하의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
| Peptide name | Peptide sequence | 아미노산 위치 | 비고 |
| HPV 6L1 HPV 6L1 (pep1) |
SKASAAPKRKRAKTKR (16 mer) QCTNTPVQAG (10mer) |
485~500 a.a 170~179 a.a |
both the peptides were mixed to immunize each rabbit |
| HPV 11L1 HPV 11L1 (UHP) |
KGGNNRSSVASSIY (14 mer) EKQDPYKDMS (10 mer) |
278~288 a.a 432~441 a.a |
both the peptides were mixed to immunize each rabbit |
| HPV16L1 | SETTYKNTNFKEYLR-C (16 mer) | 377~391 a.a | |
| HPV18L1 | C-ENKDPYDKLKFWN (14 mer) | 498~510 a.a |
본 발명에 의해 제공되는 다클론성 항체는 HPV 항체에 특이적으로 결합하여 높은 민감도 및 정확도로 시료 내 HPV 6, 11, 16 및 18 항체를 복합적으로 검출할 수 있다. 항체 역가를 측정하여 HPV 백신의 접종시기를 결정하는데 활용될 수 있고, 백신접종 후 방어 기간의 측정 등에 활용 가능하다.
도 1은 HPV L1 단백질의 다양한 유전형에 대한 특이적인 에피토프 펩타이드로부터 다클론성 항체를 제조하기 위한 Peptide sequences를 표로 나타낸 것이다.
도 2는 에피토프 펩타이드를 이용하여 다클론성 항체를 제작하는 과정모식도를 표로 나타낸 것이다.
도 3은 첫번째 토끼에서 얻은 HPV6L1-6 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 4는 두번째 토끼에서 얻은 HPV6L1-6 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 5은 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV6L1-6 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 6는 HPV6L1 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 하여 protein A elution을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 7는 정제된 HPV6L1-6 다클론성 항체를 농축한 후에 농도를 SDS-PAGE에 전기영동하여 농도를 확인한다. 농도는 2.3 mg/ml이며 정제된 HPV6L1-6 다클론성 항체 약 1 ml (2.3 mg)을 얻는다.
도 8은 순수 정제된 Anti-HPV6L1-6 다클론성 항체를 이용해 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 7은 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV11L1 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 8은 HPV11L1 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 하여 protein A elution을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 9은 첫번째 토끼에서 얻은 HPV11L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 10는 두번째 토끼에서 얻은 HPV11L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 11은 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV11L1 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 12는 HPV11L1 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 하여 protein A elution을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 13는 정제된 HPV11L1 다클론성 항체를 농축한 후에 농도를 SDS-PAGE에 전기영동하여 농도를 확인한다. 농도는 1mg/ml이며 정제된 HPV11L1 다클론성 항체 약 1ml (2.3 mg)을 얻는다.
도 14은 순수 정제된 Anti-HPV11L1 다클론성 항체를 이용해 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 15은 첫번째 토끼에서 얻은 HPV16L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 16는 두번째 토끼에서 얻은 HPV16L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 17은 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV16L1 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 18는 HPV16L1 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 하여 protein A elution을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 19는 정제된 HPV16L1 다클론성 항체를 농축한 후에 농도를 SDS-PAGE에 전기영동하여 농도를 확인한다. 농도는 1.67mg/ml이며 정제된 HPV16L1 다클론성 항체 약 1 ml (2.3 mg)을 얻는다.
도 20은 첫번째 토끼에서 얻은 HPV18L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 21는 두번째 토끼에서 얻은 HPV18L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 22은 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV18L1 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 23는 HPV18L1 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 하여 protein A elution을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 24는 정제된 HPV18L1 다클론성 항체를 농축한 후에 농도를 SDS-PAGE에 전기영동하여 농도를 확인한다. 농도는 4.63mg/ml이며 정제된 HPV18L1 다클론성 항체 약 1 ml (2.3 mg)을 얻는다.
도 25는 제작된 HPV16L1을 coating한 ELISA plate를 사용하여 anti-HPV18L1의 교차반응을 검증하기 위해 ELISA를 수행한다.
도 26은 제작된 HPV18L1을 coating한 ELISA plate를 사용하여 anti-HPV16L1의 교차반응을 검증하기 위해 ELISA를 수행한다.
도 27는 순수 정제된 Anti-HPV16L1 final-serum과 Anti-HPV18L1 final-serum을 이용하여 루미넥스 테스트를 실시한다.
도 28은 HPVL1 다클론성 항체의 최적 활성 조건을 알기 위해서 Bead와 serum 혹은 antibody를 섞은 후 루미넥스 테스트를 실시하여 최적의 incubation time을 조건별로 확인한다.
도 29은 제작된 HPV16, 18 Affinity purified antibody를 이용하여 임상샘플과 비교 분석한다.
도 30은 제작된 HPV16, 18 antibody와 Commercial Antibody와의 비교 test를 수행한다.
도 31는 제작된 HPV16, 18 purified Ab를 이용한 standard curve test를 수행한다.
도 32는 제작된 HPV16, 18 Affinity purified Ab를 이용하여 임상샘플의 역가측정을 수행한다.
도 2는 에피토프 펩타이드를 이용하여 다클론성 항체를 제작하는 과정모식도를 표로 나타낸 것이다.
도 3은 첫번째 토끼에서 얻은 HPV6L1-6 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 4는 두번째 토끼에서 얻은 HPV6L1-6 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 5은 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV6L1-6 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 6는 HPV6L1 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 하여 protein A elution을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 7는 정제된 HPV6L1-6 다클론성 항체를 농축한 후에 농도를 SDS-PAGE에 전기영동하여 농도를 확인한다. 농도는 2.3 mg/ml이며 정제된 HPV6L1-6 다클론성 항체 약 1 ml (2.3 mg)을 얻는다.
도 8은 순수 정제된 Anti-HPV6L1-6 다클론성 항체를 이용해 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 7은 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV11L1 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 8은 HPV11L1 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 하여 protein A elution을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 9은 첫번째 토끼에서 얻은 HPV11L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 10는 두번째 토끼에서 얻은 HPV11L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 11은 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV11L1 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 12는 HPV11L1 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 하여 protein A elution을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 13는 정제된 HPV11L1 다클론성 항체를 농축한 후에 농도를 SDS-PAGE에 전기영동하여 농도를 확인한다. 농도는 1mg/ml이며 정제된 HPV11L1 다클론성 항체 약 1ml (2.3 mg)을 얻는다.
도 14은 순수 정제된 Anti-HPV11L1 다클론성 항체를 이용해 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 15은 첫번째 토끼에서 얻은 HPV16L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 16는 두번째 토끼에서 얻은 HPV16L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 17은 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV16L1 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 18는 HPV16L1 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 하여 protein A elution을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 19는 정제된 HPV16L1 다클론성 항체를 농축한 후에 농도를 SDS-PAGE에 전기영동하여 농도를 확인한다. 농도는 1.67mg/ml이며 정제된 HPV16L1 다클론성 항체 약 1 ml (2.3 mg)을 얻는다.
도 20은 첫번째 토끼에서 얻은 HPV18L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 21는 두번째 토끼에서 얻은 HPV18L1 final-serum을 순수 정제하여 농축한 후에 ELISA를 수행하여 항체의 활성화 정도를 측정한다.
도 22은 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV18L1 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 23는 HPV18L1 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 하여 protein A elution을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인한다.
도 24는 정제된 HPV18L1 다클론성 항체를 농축한 후에 농도를 SDS-PAGE에 전기영동하여 농도를 확인한다. 농도는 4.63mg/ml이며 정제된 HPV18L1 다클론성 항체 약 1 ml (2.3 mg)을 얻는다.
도 25는 제작된 HPV16L1을 coating한 ELISA plate를 사용하여 anti-HPV18L1의 교차반응을 검증하기 위해 ELISA를 수행한다.
도 26은 제작된 HPV18L1을 coating한 ELISA plate를 사용하여 anti-HPV16L1의 교차반응을 검증하기 위해 ELISA를 수행한다.
도 27는 순수 정제된 Anti-HPV16L1 final-serum과 Anti-HPV18L1 final-serum을 이용하여 루미넥스 테스트를 실시한다.
도 28은 HPVL1 다클론성 항체의 최적 활성 조건을 알기 위해서 Bead와 serum 혹은 antibody를 섞은 후 루미넥스 테스트를 실시하여 최적의 incubation time을 조건별로 확인한다.
도 29은 제작된 HPV16, 18 Affinity purified antibody를 이용하여 임상샘플과 비교 분석한다.
도 30은 제작된 HPV16, 18 antibody와 Commercial Antibody와의 비교 test를 수행한다.
도 31는 제작된 HPV16, 18 purified Ab를 이용한 standard curve test를 수행한다.
도 32는 제작된 HPV16, 18 Affinity purified Ab를 이용하여 임상샘플의 역가측정을 수행한다.
이하, 본 발명을 첨부도면을 참조하여 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
자궁경부암종은 여성에서 두번째로 흔한 암이다. 침투성 자궁경부암과 역학연구 및 바이러스적 연구에 근거하여 HPV와의 상관관계가 밝혀진 바 있다. 자궁경부암의 원인으로 알려진 인유두종바이러스 (human papillomavirus, HPV)는 사람의 편평상피를 침범하는 직경 55 nm의 약 8 Kb genome을 가진 double strand circular DNA 바이러스로 자궁경부암의 95 % 이상에서 발견된다. 현재까지 약 120 종의 HPV 아형이 밝혀져 있으며, 이중 40 종 이상의 아형이 생식기에서 발견되는 것으로 보고되고 있다. HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 26, 66, 73, 82 등이 고위험군 바이러스로 알려져 있거나 추측되고 있다. 이들 중 고위험 바이러스를 대표하는 16형과 18형이 전체의 70 - 80%를 차지하고, 58, 52, 31, 33, 35형 등이 나머지 20 - 30%를 차지한다. 여성의 50~80%가 성 생활을 영위하는 동안 HPV에 감염될 수 있으며, 대부분의 감염은 자연적으로 소멸되지만 감염이 지속되면 전암 병변이나 자궁경부암으로 발전될 수 있다. 세포학적 검사(흔히 자궁경부 조직 검사(Pap smears)라고 함)이 다핵화된 세포를 감지하기 위한 주요 실험실 진단 기술이 된다. 수년간 이 기술을 이용하여 자궁경부암을 초기 진단하였다. 그러나, 이와 같은 기술은 모든 HPV 캐리어의 30%이상을 감지하지 못하였고, 좀더 심각한 질환으로 발전할 위험을 예견하지 못하였다. DNA에 의해 인코드되는 아홉개 면역원성 단백질 연구를 포함하는 HPV 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 구조 연구에서, 바이러스 복제 규칙성, 불사화, 상피 세포의 형질변형과 함께 스크리닝 방법도 개발하였다. 이의 근거는 생화학적, 면역학적, 그리고 병리학이 있는 경우에 정상치로부터 변이를 나타내는 유전자 변수들로 구성된다. 초기 진단을 위해 이와 같은 형태의 자료를 해석하고, 자궁경부암으로 발전 위험을 추정하거나 치료 효과를 예상하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 그 이유는 이용되는 기술의 측량이 감응성 또는 특이성을 요구하지 않으며, 측정되는 변수들도 세포 퇴행 과정을 직접적으로 반영하지 않으며, 이를 비율적으로 반영하지도 않기 때문이다. 환자에서 효소 면역검사(ELISA를 포함하나 이에 국한되지 않음) 및 면역방사능측정 검사(EP 특허 386734, 375555, 406542, 523391)를 이용하여 HPV 단백질에 특이적인 항체 역가를 측정함으로써 경부 암을 진단하는 기술이 설명되었다. 그러나 이와 같은 방법은 항체 역가와 경부 암 사이에 신뢰할만한 상관관계가 밝혀지지 않았기 때문에 기대를 받지 못했다. 그러나 이와 같은 기술들은 진단 그 이상으로 발전될 수 있는데, 그 이유는 HPV 감염이 모든 경우에서 자연 상태에서 약 80%가 단기적 감염으로 자발적으로 회수되거나 바이러스를 제거할 수 있기 때문이다. 여전히 대부분의 경우 HPV DNA에 대한 양성 결과로 경부 암의 발전을 신뢰성 있게 예측한다.
본 발명은 분자 바이러스학 및 면역학 분야, 특히 HPV 감염의 치료와 관련된 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HPV 감염을 치료하기 위한 에피토프 펩타이드의 제조와 에피토프 펩타이드에 대한 항체에 관한 것이다. 본 발명은 HPV 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 진단하거나 치료에 필요한 항체를 만들어 내는 것이다.
본 발명에서 용어, "인유두종바이러스"는 파포바 바이러스(papova virus) 계열에 속하는 DNA 바이러스로서 72개의 외각 단위단백질체(capsomer)로 이루어진 20면체이며 7,900 개의 염기서열이 이중 원형 DNA로 이루어져 있다. HPV는 게놈(genome)을 구성하고 있는 염기서열의 유사성에 따라 120 여종의 다른 아형으로 나누어진다. 이들 120 여종의 아형 중 30여 종이 하부 생식기에 감염되는 것으로 알려져 있으며, 자궁경부 상피내 종양과 자궁경부암을 유발하는 위험 정도에 따라 HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-57, HPV-58, HPV-59, HPV-67, HPV-68, HPV-73, HPV-74 등의 고 위험군(high risk type)과 HPV-2a, HPV-3, HPV-6, HPV-10, HPV-11, HPV-32, HPV-34, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44. HPV-54, HPV-55, HPV-61, HPV-69, HPV-70등의 저위험군(low risk type)으로 나누어진다.
HPV의 게놈 구조는 크게 초기전사부위 E (early gene region)와 후기전사부위 L (late gene region), 그리고 발현되지 않는 부위인 LCR (long control region)으로 나누어지며, HPV의 게놈 구조는 발병의 양상과 위험 정도, 예후에 커다란 영향을 끼친다. 특히 초기전사부위 중 E6와 E7 유전자는 HPV가 감염 세포의 게놈 내로 들어가 머물러 있는 동안 발현(expression)되어 발암에 가장 중요한 역할을 한다. 즉, HPV-16, -18 등의 고 위험군에 속하는 HPV의 E6와 E7 유전자는 종양억제유전자(tumor suppressor gene)인 p53과 rb(retinoblastoma) 유전자에서 발현되는 단백질들과 각각 결합하여 이들 단백질들을 불활성화시키며, 그 결과 세포주기(cell cycle)의 조절과 세포사멸(apoptosis) 기전이 저해됨으로써 자궁경부의 정상세포가 암세포로 변형된다. 이에 반해HPV-6, HPV-11 등의 저위험군에 속하는 HPV의 경우 종양억제 유전자들에서 발현되는 단백질들을 불활성화시키는 능력이 떨어지므로 자궁경부암을 유발하기 어렵다.
본 발명에서 용어, "L1 유전자"는 인유두종바이러스의 유전자 중 대부분을 차지하는 부분으로, 대부분의 인유두종바이러스에서 염기서열이 보존되어 있으며, HPV 타입간 변이가 존재한다. 인유두종바이러스의 캡시드 단백질의 대부분을 차지하고, HPV 감염 후기에 분화하는 상피세포에서 발현하며, 항원성이 가장 높은 부위이기도 하다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "에피토프"란 용어는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원상의 부분을 지칭한다. "에피토프"는 또한 "항원 결정인자"로서 공지되어 있다. 에피토프 또는 항원 결정인자는 일반적으로 아미노산, 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학 활성 표면 그룹들로 이루어지며, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 및 특이적인 전하 특징을 갖는다. 예를 들어, 에피토프는 일반적으로 독특한 입체 형태로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산을 포함한다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예를 들어 항체) 간의 모든 상호작용 부위들은 상기 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. 입체형태적 에피토프에서, 상기 상호작용 부위들은 하나의 단백질에서 서로 분리된 아미노산 잔기들에 걸쳐 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "에피토프 펩타이드"란 용어는 에피토프로서 작용하는 항원상의 펩타이드 단편을 지칭한다. 일부 조건 하에서, 에피토프 펩타이드는 단독으로 상기 에피토프에 대한 항체에 의해 특이적으로 인식/결합될 수 있다. 항체를 당해 분야의 숙련가에 의해 공지된 통상적인 기법에 의해 동일한 에피토프에 대한 결합의 경쟁력에 따라 선별할 수 있다. 예를 들어, 경쟁 또는 교차-경쟁에 대한 연구를 수행하여 항원(예를 들어 HPVL1 단백질)에의 결합에 대해 서로 경쟁하거나 교차-경쟁하는 항체들을 획득할 수 있다. 교차-경쟁을 근거로, 동일 에피토프에 결합하는 항체들을 획득하기 위한 대량처리 방법이 국제 특허 출원 WO 03/48731에 개시되어 있다. 따라서, HPVL1 단백질 상의 동일 에피토프에의 결합에 대해 본 발명에 따른 다클론성 항체와 경쟁하는 항체 및 그의 항원 결합 단편(즉 항원 결합 부분)을 당해 분야의 숙련가에 의해 공지된 통상적인 기법에 의해 획득할 수 있다.
본 발명으로 얻은 HPV 다클론성 항체의 활성정도를 측정하기 위해 다중 비드 어레이 분석기(예를 들어 루미넥스 분석기)를 이용하여 활성도를 측정한다. 비드 어레이용 비드로 루미넥스 비드(Luminex bead)를 사용할 수 있다. 비드는 다중 비드 어레이 방법에 사용될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 다중 비드 어레이용 비드는 색으로 100종류까지 구별할수 있으므로 특정 색(번호)의 비드에 특정 항원을 붙여주고 여러 비드 세트를 섞어서 반응을 진행한 후 다중 비드 어레이 분석기로 각 비드의 색과 그 비드 표면의 항원 항체 반응량을 동시에 측정하면, HPV 6 L1 항체, HPV11 L1 항체, HPV16 L1 항체 또는 HPV18 L1 항체를 포함하여 여러 항체를 동시에 측정할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 시료를 표지자 표지된 2차 항체와 반응시키는 단계 상기 2차 항체를 형광물질이 부착된 상기 표지자의 특이적 결합제와 반응시키는 단계 및 비드 유래의 형광값과 표지자의 특이적 결합제 유래의 형광값을 측정하여 시료 내 HPV 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 표지자는 비오틴(biotin)일 수 있고, 표지자의 특이적 결합제는 스트렙타비딘일 수 있다.
상기 2차 항체는 시료 내 HPV 6 L1 항체, HPV11 L1 항체, HPV16 L1 항체 및 HPV18 L1 항체와 특이적으로 결합하며 2차 항체에 결합된 비오틴은 스트렙타비딘(또는 아비딘)과 특이적으로 결합하므로 스트렙타비딘에 결합된 형광물질에서 형광을 발현하게 된다. 상기 형광물질은 예를 들어 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 또는 플루오레스카민일 수 있으나 이에 제한되지 않으며 당업계에 공지된 다양한 형광물질을 사용할 수 있다.
비드 유래의 형광값(각 비드의 색)과 표지자의 특이적 결합제 유래의 형광값을 함께 측정하여 항원 항체 반응량을 결정함으로써 시료 내 HPV 6 L1 항체, HPV11 L1 항체, HPV16 L1 항체 또는 HPV18 L1 항체의 존부 및 항체의 역가를 정확히 검출할 수 있다. 항체의 역가는 형광값의 판정 기준치(cutoff value) 설정하여 측정한다.
본 발명에 따른 인유두종 바이러스(HPV) 및 자궁경부암 감지용 다클론성 항체는 HPV L1 항원에 타입 특이적인 에피토프 펩타이드를 이용하여 만든 HPV항체로써, HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 항원의 특이적 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 것에 기술적 특징이 있는 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 다클론성 항체는 HPV6L1 단백질의 485부터 500번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드와 170부터 179번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합할 수 있는 것이다.
또한, 상기 다클론성 항체는 HPV11L1 단백질의 275부터 288번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드와 432부터 441번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것이다.
또한, 상기 다클론성 항체는 HPV16L1 단백질의 377부터 391번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것이다.
또한, 상기 다클론성 항체는 HPV18L1 단백질의 498부터 510번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 HPV L1 항원에 타입 특이적인 에피토프 펩타이드는 이하의 아미노산 서열을 가지는 것이다.
| Peptide name | Peptide sequence | 아미노산 위치 | 비고 |
| HPV 6L1 HPV 6L1 (pep1) |
SKASAAPKRKRAKTKR (16 mer) QCTNTPVQAG (10mer) |
485~500 a.a 170~179 a.a |
both the peptides were mixed to immunize each rabbit |
| HPV 11L1 HPV 11L1 (UHP) |
KGGNNRSSVASSIY (14 mer) EKQDPYKDMS (10 mer) |
278~288 a.a 432~441 a.a |
both the peptides were mixed to immunize each rabbit |
| HPV16L1 | SETTYKNTNFKEYLR-C (16 mer) | 377~391 a.a | |
| HPV18L1 | C-ENKDPYDKLKFWN (14 mer) | 498~510 a.a |
한편, 본 발명에 따른 상기 다클론성 항체의 제조방법을 설명하면, PBS 에 희석된 항원 펩타이드를 FCA 와 1:1 로 유화시켜, 토끼의 어깨 10개 부위에 0.2 ml 씩 피하주사한다. 항체 제조 과정 일정은 도 2의 내용대로 진행되었다. 주사 전 토끼의 혈청을 확보한 후, FCA와 혼합된 항원 펩타이드를 주사한다. 4주 뒤 FlA 와 혼합된 항원 펩타이드를 주사하고 5주차에 채혈하여 luminex test를 진행한다. 6주차에 FlA 와 혼합된 항원 펩타이드를 주사하고 7주차에 2차 채혈을 진행하여 luminex test를 진행하였다. 8주차에 FlA와 혼합된 항원 펩타이드를 주사하고 9주차에 토끼의 전채혈로 마지막 luminex test를 진행하는 방법으로 제조될 수 있다.
이상의 다양한 실험방법을 통해 본 발명의 다클론성 항체에 대한 설명을 하기로 한다.
[실험예 1]
HPV 6 L1, HPV 11 L1, HPV 16 L1, HPV 18 L1 특이적 에피토프 펩타이드에 결합하는 HPVL1 다클론성 항체의 정제HPVL1 다클론성 항체의 정제
실험예 1-1: HPV L1 단백질의 에피토프 펩타이드 선택
HPV L1 단백질의 각각의 타입별로 peptide 서열에 대한 domain search를 위하여 특이항원성이 높은 부위의 펩타이드를 선택하였다.
HPV 6 L1, HPV 11 L1, HPV 16 L1, HPV 18 L1 특이적 에피토프 펩타이드에 결합하는 HPVL1 다클론성 항체의 정제.
실험예 1-2: 토기의 면역반응 생성
본 발명은 토끼 1마리당 carrier와 결합시킨 펩타이드를 이용하여 제조한 emulsion 1mg/1㎖씩 피하주사를 시행하였으며, 항원면역반응 측정을 위한 1차, 2차 3차 boosting은 각각 4주, 6주, 8주째에 동일한 항원을 IFA(Incomplete Freund’s adjuvant, Difco, Rockford)와 동일하게 혼합하여 토끼 1마리당 500㎍/1㎖씩 피하주사 하였다. 각 boosting 단계마다 소량의 피를 채취하여 serum을 얻었고, 항체 생성여부 및 titer를 측정하였다. 3차 boosting 1주일 후 전채혈을 하였다. 소량의 피를 채취할 때는 꼬리 끝을 자른 후 피를 채취하며, 전채혈 시에는 심장채혈을 하였다.
실험예 1-3: ELISA를 이용한 혈청내 HPV L1 항체의 분석
항원의 주사로 유도된 면역반응은 두 마리 토끼의 혈청에 존재하는 항체의 정도를 ELISA를 수행하여 결정하였다. 96 well plate를 준비한 후 각각의 well에 coating buffer로 희석하여 250 ng/50 ul농도로 만든 펩타이드 항원을 넣고 냉장조건에서 12시간 반응시킨다. coating solution을 버린 후에 200 ul blocking solution (2% Skim milk/TBS-T)을 넣어 1시간 blocking한다. TBS-T로 씻어준 후에 50 ul 1차 항체를 각각의 well에 넣고 37도에서 2시간 동안 반응시킨다. TBS-T로 3번 씻어준 후에 50 ul 2차 항체(1:5000)를 각각의 well에 넣고 37도에서 1시간 동안 반응시킨다. TBS-T로 5번 씻어준 후에 50 ul OPD 또는 TMB를 각각의 well에 넣는다. 만일 색깔이 변하면 stop solution (1N H2SO4)을 넣어 반응을 종결시킨다. 그 후에 495nm(450nm)에서 O.D.값을 측정하였다.
실험예 1-4: Protein A를 이용한 혈청 내 HPV L1 항체의 정제
항체 정제는 protein A를 이용한 column 방법을 통하여 정제하였다. Protein A resin을 준비한 후 컬럼에 5 ml을 넣어 packing하였다. 5 ml 증류수를 넣어 비드를 씻어내는 과정을 다섯번 수행한 후, binding buffer를 넣어 resin을 씻어준다. Rabbit IgG항체를 filtering후 binding buffer를 넣어 씻어준 resin이 있는 컬럼에 넣는다. 뚜껑을 닫고 상온에서 1시간 동안 회전하여 섞어준다. 컬럼 뚜껑을 열고 binding buffer를 흘려보낸 후 한번 더 binding buffer를 넣어 씻어준다. Wash buffer를 넣어 컬럼내의 Resin을 씻어낸 후 elution buffer를 넣어 용출시킨 정제된 항체를 중화용액을 이용하여 중화한다. 각각 용출한 항체는 Protein A column을 사용하여 Anti-HPV6L1-6 final-serum과 Anti-HPV11L1 final-serum을 정제한 것을 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인하였다.
실험예 1-5: Affinity column를 이용한 혈청 내 HPV L1 항체의 정제
두 번째 정제 과정으로 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column제작 후 protein A elution을 정제하였다. 항원에 결합시키기 위해 Affigel 비드를 준비한 후 컬럼에 1 ml을 넣어 packing하였다. 10 ml 증류수를 넣어 비드를 씻어낸후, 10 ml의 coupling buffer (HEPES)를 넣어 비드를 한 번 더 씻어낸다. 1L HEPES buffer를 이용하여 냉장조건에서 12시간 투석하여 5mg 항원을 준비한다. 비드와 항원을 섞은 후 냉장조건에서 4시간동안 결합시킨다. 결합후에 blocking buffer를 넣어 흘려보내고, 10 ml 증류수를 넣어 비드를 씻어 낸 후 10 ml의 coupling buffer (HEPES)를 넣어 비드를 한번 더 씻어낸다. 만들어진 HPV L1 다클론성 항체를 컬럼에 넣은 후 반응한다. 컬럼내의 Resin을 씻어낸 후 elution buffer(0.1M Citric acid pH3.0)를 넣어 용출시킨 정제된 항체를 중화용액을 이용하여 중화한다. 정제된 HPV L1 다클론성 항체는 SDS-PAGE에 전기영동하여 확인하였다.
실험예 1-6: 혈청 내 HPV L1 항체의 투석 및 농축
최종적으로 HPV L1 다클론성 항체를 Dialysis(투석)을 하여 HPV6L1, HPV11L1, HPV16L1, and HPV18L1 다클론성 항체를 수획하였다. 정제된 항체는 50% glycerol이 포함된 PBS buffer에 녹여 -20℃에 보관하였고, HPV L1 각각의 타입에 특이적으로 반응하는 항체로 사용하였다. 각각 HPV6L1와 HPV11L1는 2.3mg/ml, 1mg/ml로 농축되었다.
실험예 1-7: ELISA를 이용한 정제된 HPV L1 다클론 항체의 분석
항체의 활성정도를 알아보기 위해 ELISA를 수행하여 결정하였다. 96 well plate를 준비한 후 각각의 well에 coating buffer로 희석하여 250ng/50ul농도로 만든 펩타이드 항원을 넣고 냉장조건에서 12시간 반응시킨다. coating solution을 버린 후에 200ul blocking solution (2% Skim milk/TBS-T)을 넣어 1시간 blocking한다. TBS-T로 씻어준 후에 50ul 1차 항체 (1:1,000, 1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000로 혈청 희석)를 각각의 well에 넣고 37도에서 2시간 동안 반응시킨다. TBS-T로 3번 씻어준 후에 50ul 2차 항체(1:5000)를 각각의 well에 넣고 37도에서 1시간 동안 반응시킨다. TBS-T로 5번 씻어준 후에 50 ul OPD 또는 TMB를 각각의 well에 넣는다. 만일 색깔이 변하면 stop solution (1N H2SO4)을 넣어 반응을 종결시킨다. 그 후에 495nm(450nm)에서 O.D.값을 측정하였다.
실험예 1-8: ELISA를 이용한 정제된 HPV16 L1 다클론 항체와 HPV18 L1 다클론 항체의 교차반응 검증
제작된 Anti-HPV16L1와 Anti-HPV18L1은 각각 HPV16L1과 HPV18L1이 coating된 ELISA plate와 교차반응을 검증하기 위해 ELISA를 수행하였다. 96 well plate를 준비한 후 각각의 well에 coating buffer로 희석하여 250ng/50ul 농도로 만든 펩타이드 항원을 넣고 냉장조건에서 12시간 반응시킨다. coating solution을 버린 후에 200ul blocking solution (2% Skim milk/TBS-T)을 넣어 1시간 blocking한다. TBS-T로 씻어준 후에 50ul 1차 항체, HPV16/18 L1 bleed, HPV16/18 L1 IgG, HPV16/18 L1 Affi (1:1,000, 1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000로 혈청 희석)를 각각의 well에 넣고 37도에서 2시간 동안 반응시킨다. TBS-T로 3번 씻어준 후에 50ul 2차 항체(1:5000)를 각각의 well에 넣고 37도에서 1시간 동안 반응시킨다. TBS-T로 5번 씻어준 후에 50 ul OPD 또는 TMB를 각각의 well에 넣는다. 만일 색깔이 변하면 stop solution (1N H2SO4)을 넣어 반응을 종결시킨다. 그 후에 495nm(450nm)에서 O.D.값을 측정하였다.
[실험예 2]
비드 어레이를 이용한 HPV의 유전형의 분석
실험예 2-1: 시료에서 DNA 추출
시료의 DNA를 분리하기 위해, 면봉으로 질 내벽을 긁어낸 샘플을 세포 용해 용액(lysis solution) 400 ul 에 풀어내고 이를 프로테이나아제 K(20mg/ml) 10 ul를 첨가 후, 58℃에서 1시간 반응시킨 후, 끓는 물에 15분간 반응 하여 준비하였다. HPV 18번의 L1 유전자가 클로닝된 플라스미드 (5X103부터 5X105 copy)와 HPV 16번 이 감염된 CaSki 자궁경부암 세포주와 HPV 음성인 자궁경부암 세포주 C33A의 유전체 DNA (genomic DNA) 200ng 사용하였다.
실험예 2-2: DNA 에서 HPV 유전자의 증폭
HPV 검출 및 유전형 분석을 위해, 실시예 2-1 에서 준비한 DNA 5 ul 를 주형으로 하고, HPV 프라이머 세트 0.4 uM, 0.1mM dNTP mix, 7.5mM Tris HCl(pH 9.0), 0.2mM MgCl2, 5 mM KCl, 2mM (NH4)2SO4, Taq 폴리머라아제 (Ultratools ,Spain) 1U 로 하여 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머의 염기서열은 서열번호 1 내지 서열번호 17의 프라이머 혼합물을 사용하였다. 서열번호 1 내지 12로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머는 5' 말단 포스페이트 표지하여 사용하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다; 95℃ 에서 5분 1 사이클 이후, 91℃ 에서 60 초, 55℃ 에서 60 초, 72℃ 에서 60초 조건으로 40 사이클 수행 후, 72℃에서 7분 반응하였다.
실험예 2-３： 인산화된 핵산 가닥의 제거
엑소뉴클레아제 6 ㎕, 완충액(10X) 1.5 ㎕, 증류수 2.5 ㎕의 조건으로 1차 PCR 산물에 10㎕ 넣어 준 후 37℃에서 30분간 인큐베이션한 후 80℃에서 15분 동안 활성화 효소 반응시켰다. 본 과정에서는 람다 엑소뉴클레아제를 이용하는데, 이 효소는 포스페이트로 표지된 이중가닥 DNA를 인지하고 포스페이트 표지된 가닥(strand)만 분해 한다. 본 과정에서 람다 엑소뉴클레아제를 넣어 이것이 이중 가닥 L1 산물(Double strand L1 product)에서 포스 페이트 표지된 것을 인식하여 분해시키도록 하였다.
실험예 2-４: 2nd 단일가닥 PCR 표지 반응
본 발명에서는 2nd 단일가닥 PCR 표지 반응을 통해서 탐침 혼성화 반응에 사용할 증폭산물을 표지하였다. 표지를 위해 실시예 2-3에서 형성된 산물 5ul 를 사용하고, 서열번호 1 내지 12의 프라이머 0.5 uM, 50 uM dATP, GTP, TTP mix, 20 uM biotin-dCTP(Invitrogen), 7.5mM Tris HCl(pH 9.0), 0.2mM MgCl2, 5 mM KCl, 2mM (NH4)2SO4, Taq polymerase (Ultratools, Spain) 1U 로 하여 단일가닥 선형 증폭을 수행하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다; 94℃ 에서 5분간 1 사이클을 하고, 94℃ 에서 30초, 55℃에서 60초, 72℃ 에서 120초씩 35 사이클 후 72℃에서 7분 반응하였다.
실험예 2-５: 비드 어레이를 이용한 혼성화반응
비드 어레이용 비드를 제조하기 위해 상기 실시예 1의 방법을 통해 얻어진 정제된 에피토프 펩타이드에 루미넥스 비드(Luminex bead)를 하기와 같은 방법으로 결합하여 제작하였다. 루미넥스 비드(Luminex bead)를 5 X 106개의 농도로 준비하고, 100 ㎕의 100 mM sodium phosphate(pH 6.2) 완충용액으로 세척 후, 50 mg/mL의 N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide(EDC)와 Nhydroxysuccinimide(NHS)를 각각 10 ㎕씩 첨가하여 차광된 실온에서 20분간 비드를 활성시켰다. 활성화된 비드는 250 ㎕의 커플링 완충용액(2-morpholinoethanesulfonic acid, 50 mmol/L, pH 5.0]로 2번 세척한 후, 상기 정제된 융합 폴리펩타이드와 혼합하여 500 ㎕의 커플링 완충용액 내에서 2시간동안 반응시킨 후 커플링 완충용액을 원심분리하여 제거하고, 다시 500 ㎕의 PBS-RBN 완충용액을 첨가하여 30분간 반응시킨다. 반응 후 PBS-RBN 완충용액을 제거하고, 1 mL의 PBS-TBN 완충용액[0.1% BSA, 0.02% sodium azide, 150 mM sodium chloride, 50mM sodium phosphate monobasic anhydrous, 0.02% tween-20; pH 7.4]으로 2회 세척하여 최종적으로 200 ㎕의 PBS-TBN 완충용액을 첨가한 후 사용하였다. 제조한 혼성비드에 상기 실시예 2-1 내지 2-4에서 가공된 시료 유전자를 혼성화 버퍼(50% 포름아미드, 1x Denhardt's, 6x SSC, 0.1% SDS, 250 ug/ml 연어 정자 DNA)에 녹인 후 서로 혼성화 반응을 하여주었다. 95℃ 에서 5분간 반응 후, 37℃ 에서 60분간 반응하였다. 이에 96 웰 필터 플레이트로 시료를 비드와 같이 동시에 옮긴 후, TE 버퍼를 이용하여 3번 세척하였다. 세척 후 스트렙타비딘 피코에리트린 (시그마알드리치, S3402)을 500배 희석한 용액 100 ul를 사용하여 15분간 암실에서 교반시켜주었다.
실험예 2-6: 비드 어레이의 시그날 검출
이렇게 준비된 혼성비드 샘플을 이용하여 Luminex 100 기계에서 웰 별로 비드를 읽는다. Luminex 100은 2개의 레이저를 이용하여 한 개는 비드 번호를 한 개는 반응된 피코에리트린의 양을 계산하여 수치로 나타내었다. 총 26종류의 비드를 읽으며 각각의 HPV 유전형의 판정은, HPV 유전형을 대표하는 비드의 MFI 값으로 대변되고, 이를 통해 HPV의 유전형을 판정하였다.
[실험예 3]
멀티플렉스 루미넥스 분석
4가 HPV 백신(서바릭스, GSK)과 Placebo 백신을 접종한 그룹을 대상으로 백신 접종 후 3개월 후에 혈액을 채취하여 혈청을 분리 한 후 개발된 HPV6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원을 이용하여 실제로 혈액 내 HPV 항체의 양을 측정하였다. 융합 폴리펩타이드가 결합된 비드 혼합액을 희석된 혈청과 필터 플레이트에서 1시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후 여과하여 혈청을 제거하고, 다시 여과방법을 사용하여 세척한다. 비오틴(biotin)이 결합된 2차 항체(goat anti-human IgG)를 1:1,000으로 희석하여 30분간 반응시킨다. 마지막으로 발색 시약인 스트렙타비딘-알-피코에리트린(streptavidin-R-phycoerythrin)을 첨가하여 30분간 반응시키고, Luminex analyzer로 median fluorescence intensity (MFI)를 측정하였다. Luminex analyzer는 2개의 레이저를 이용하여 한 개는 Bead 번호를 한 개는 반응된 피코에리트린의 양을 계산하여 수치로 나타낸다. 각각의 HPV 항체 유형의 판정은 HPV 항체 유형을 대표하는 비드의 MFI 값으로 대변되고, 이를 통해 HPV 항체 유형을 판정한다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
(1) HPV6L1, HPV11L1, HPV16L1, HPV18L1 단백질의 특이적인 에피토프 펩타이드
도 1은 HPV6L1, HPV11L1, HPV16L1, HPV18L1 단백질의 특이항원성이 높은 부위의 peptide를 나타낸 결과이다.
(2)
HPV
6 L1,
HPV
11 L1,
HPV
16 L1,
HPV
18 L1
다클론성
항체 정제
HPV 6 L1, HPV 11 L1, HPV 16 L1, HPV 18 L1 다클론성 항체를 정제하기 위해 먼저 항원의 주사로 유도된 면역반응은 두 마리 토끼의 혈청에 존재하는 순수 정제된 Anti-HPV L1 final-serum의 정도를 단계적으로 희석하여 ELISA를 수행하였다. 그 결과치는 495nm(450nm)에서 O.D.값으로 측정한 결과, 단계적으로 희석된 혈청 단백질이 그 값에 단계적으로 존재함을 나타내었다 (도 3, 도 4, 도 9, 도 10, 도 15, 도 16, 도 20, 도 21). 다음 단계로 Protein A column을 사용하여 각 Anti-HPVL1 final-serum을 정제한 것을 5회 씻어준 후, Elution으로부터 얻어진 단백질은 SDS-PAGE 전기영동으로 확인하였다 (도 5, 도 11, 도 17, 도 22). 또한, 두 번째 정제 과정으로 Peptide를 이용 coupling하여, affinity column을 제작 후 protein A elution을 정제하였다. 컬럼을 통해 정제된 HPV L1 다클론성 항체는 SDS-PAGE 전기영동으로 확인하였다 (도 6, 도 12, 도 18, 도 23). 최종적으로 HPV L1 다클론성 항체를 Dialysis(투석)을 하여 HPV6L1, HPV11L1, HPV16L1, HPV18L1 다클론성 항체를 수획하였고, 정제된 각각의 HPV L1 다클론 항체는 각각의 타입에 특이적으로 반응하는 항체로 사용하였다. 각각 HPV6L1, HPV11L1, HPV16L1, HPV18L1는 2.3mg/ml, 1mg/ml, 1.67mg/ml, 4.63mg/ml로 농축되었다 (도 7, 도 13, 도 19, 도 24). 농축된 항체의 활성정도를 알아보기 위해 ELISA를 수행한 결과, 각각의 HPV L1 다클론 항체를 단계적으로 희석하여 측정하였으며 그 측정값은 495nm(450nm)에서 O.D.값으로 나태내었다 (도 8, 도 14).
(3) ELISA를 이용한 정제된 HPV16 L1 다클론 항체와 HPV18 L1 다클론 항체의 교차반응 검증
Anti-HPV16 L1 항체의 교차반응 검증은 HPV16 L1 단백질이 coating 된 plate가 다양한 정제단계에서 분리된 Anti-HPV16 L1 다클론 항체와 Anti-HPV18 L1 다클론 항체와 반응시, Anti-HPV18 L1 다클론 항체는 HPV16 L1 단백질이 coating 된 plate 와 교차반응이 일어나지 않았다 (도 25). 또한, HPV18 L1 단백질이 coating 된 plate가 다양한 정제단계에서 분리된 Anti-HPV16 L1 다클론 항체와 Anti-HPV18 L1 다클론 항체와 반응시, Anti-HPV16 L1 다클론 항체는 HPV18 L1 단백질이 coating 된 plate 와 교차반응이 일어나지 않았다 (도 26).
(4) 멀티플렉스 루미넥스 분석
두 번째 HPV16L1과 HPV18L1 펩타이드를 주입한 두번째 Rabbit에서 혈청을 분리하여 루미넥스 에세이를 수행한 결과, 루미넥스 61, 67, 63 and 69 비드와 결합한 HPV6L1, HPV11L1, HPV16L1, HPV18L1 단백질들은 높은 특이도를 보일 뿐 아니라 교차반응도 보이자 않았다(도 27). HPVL1 다클론성 항체의 최적 활성 조건을 알기 위해서 비드와 결합 된 HPV L1 항원 단백질과 serum에 있는 항체를 사용하여 최적의 incubation time을 조건별로 확인한 결과, HPV11 항체를 제외하고 각 항체는 다른 항원과 교차반응을 하지 않았으며 incubation time을 증가하여도 발현정도가 확연히 다르지 않음을 보였다 (도 28). 도 29는 백신접종을 하지 않은 건강한 여성 20대 (sample 번호 1~10)와 10대 20대 남성 샘플 (sample 번호 11~15)을 대상으로 혈청 cut-off 값을 결정하여 본 결과 HPV6, 11, 16 혈청 cut off 값은 75 MFI인 반면 HPV 18은 100 MFI이다. 이 cut-off를 바탕으로 false positive는 한 개만을 나타내고 있다. 또한, 본 발명에서 제작된 HPV16, 18 antibody(영인)와 Commercial Antibody와의 비교한 결과, 타사 제품 (LS-Bio, Antibodies-online, Chemicon)에서 HPV16L1 항체는 MFI값이 낮았으며 HPV18L1 항원과도 교차반응을 보였으며 HPV18L1 항체도 항원-항체 특이성이 보이지 않았으며 HPV16L1 항원과도 교차반응이 보였다. 그러나, 본 발명에서 제작된 HPV16 L1항체 (영인)는 HPV16 항체와만 MFI 값이 보였으며, 본 발명에서 제작된 HPV18 L1항체 (영인)는 HPV18 항체와만 MFI 값이 보여 항원-항체 특이도가 있음을 나타내었다 (도 30). 본 발명에서 제작된 HPV16L1과 HPV18L1 항체는 1.5625ng에서도 매우 높은 민감도와 특이도를 보였다 (도 31). HPV를 접종하지 않은 혈청과 접종한 혈청에서 HPV neutralizing antibody titers를 계산한 결과 HPV16L1와 HPV18L1 혈청은 HPV16L1와 HPV18L1 단백질과 특이적으로 반응하는 MFI 값이 높게 나와 교차 반응이 보이지 않았다 (도 32).
Claims (7)
- HPV L1 항원에 타입 특이적인 에피토프 펩타이드를 이용하여 만든 HPV항체로써, HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 항원의 특이적 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종 바이러스(HPV) 및 자궁경부암 감지용 다클론성 항체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 다클론성 항체는 HPV6L1 단백질의 485부터 500번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드와 170부터 179번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것을 특징으로 하는 인유두종 바이러스(HPV) 및 자궁경부암 감지용 다클론성 항체. - 제 1 항에 있어서,
상기 다클론성 항체는 HPV11L1 단백질의 275부터 288번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드와 432부터 441번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것을 특징으로 하는 인유두종 바이러스(HPV) 및 자궁경부암 감지용 다클론성 항체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 다클론성 항체는 HPV16L1 단백질의 377부터 391번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것을 특징으로 하는 인유두종 바이러스(HPV) 및 자궁경부암 감지용 다클론성 항체. - 제 1 항에 있어서,
상기 다클론성 항체는 HPV18L1 단백질의 498부터 510번까지 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 단리된 에피토프 펩타이드에 결합 할 수 있는 것을 특징으로 하는 인유두종 바이러스(HPV) 및 자궁경부암 감지용 다클론성 항체. - 제 1 항에 있어서,
상기 HPV L1 항원에 타입 특이적인 에피토프 펩타이드는 이하의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 사람 파필로마 바이러스(HPV) 및 경부암 감지용 다클론성 항체.
- 다클론성 항체의 제조방법에 있어서 아래의 공정 순에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 인유두종 바이러스(HPV) 및 자궁경부암 감지용 다클론성 항체의 제조방법.
1. 주사 전 토끼의 혈청을 확보한다.
2. PBS에 희석된 항원 펩타이드를 FCA 와 1:1 로 유화시켜, 토끼의 어깨 다수 부위에 0.2 ml 씩 피하주사한다.
3. FCA와 혼합된 항원 펩타이드를 토끼에 주사한다.
4. 4주 뒤 FlA 와 혼합된 항원 펩타이드를 토끼에 주사하고 5주차에 채혈하여 luminex test를 진행한다.
5. 6주차에 FlA 와 혼합된 항원 펩타이드를 주사하고 7주차에 2차 채혈을 진행하여 luminex test를 진행하였다.
6. 8주차에 FlA와 혼합된 항원 펩타이드를 주사하고 9주차에 토끼의 전채혈로 마지막 luminex test를 진행하여 제조.
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