KR20200032695A - Hcv 항원의 다중-에피토프 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Hcv 항원의 다중-에피토프 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중-에피토프 융합 단백질을 비롯하여 HCV 코어 항원의 검출을 위한 시험관내 진단 면역어세이에서 교정제 및/또는 관리물질으로서 이의 용도에 관한 것이다. 다중-에피토프 융합 단백질은 C형 간염 바이러스 (HCV) 코어 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 2종 내지 6종의 상이한 비중복 선형 펩티드를 포함하고, 여기서 각각의 상기 펩티드는 비-HCV 아미노산 서열로 이루어지고 샤페론 아미노산 서열을 포함하는 스페이서에 의해 다른 상기 펩티드로부터 분리된다. 추가의 HCV 특이적 아미노산 서열가 상기 폴리펩티드에 존재하지 않는다. 추가 양상은 교정제 또는 관리물질 또는 둘 모두로서 상기 다중-에피토프 융합 단백질을 포함하는 HCV 코어 항원의 검출을 위한 시약 키트에 관한 것이다.

Description

HCV 항원의 다중-에피토프 융합 단백질 및 이의 용도
신뢰할만한 관리 (control) 및 교정제 (calibrator) 물질은 혈청학적 시험관내 진단 어세이, 특히 감염성 질환 영역의 필수 부분이다. 바이러스 감염의 진단을 뒷받침하기 위한 바이러스 항원의 핵산 검사 및 검출은 당분야에 충분히 공지된 방법에 속한다. C형 간염은 간에서 발병되어 만성이 되는 경향이 있는 RNA 바이러스인 C형 간염 바이러스 (HCV)에 의해 야기되는 전세계적으로 확산된 바이러스 감염이다. HCV는 혈액 대 혈액 접촉으로 전파된다 (예를 들어, 정맥내 약물 사용, 혈액 수혈, 임산/출산 동안 모계에서 태아로의 전파). RNA 검사이외에도, HCV 구조적 항원 예컨대 코어 항원의 혈청학적 검출은 C형 간염 바이러스 감염의 초기 검출을 위한 공통 방법이다.
HCV 코어 항원 검출을 위한 몇몇 상업적 키트가 시장에서 입수가능한데, 예컨대 Abbott Architect HCV Ag, Ortho HCV Core Ag EIA, Fujirebio Lumipulse II HCV 코어 어세이, Murex HCV Ag/Ab Combination, Bio-Rad Monolisa HCV Ag-Ab Ultra 등이 있다. 각각의 이들 어세이는 음성 및 양성 검체의 구별을 위해 신뢰할만한 컷-오프를 생성시키는 교정 (calibration) 물질을 필요로 한다. 정량적 어세이의 경우 교정 물질은 또한 검사되는 피분석물의 장비 측정치 및 이 피분석물의 실제 농도 간 상관성을 보여주고 입증하기 위해서 검사 시스템 판독치를 조정하는데 사용될 수도 있다. 게다가, 또한 교정 검증 또는 (정도 (quality)) 관리 물질이 필요하다. 정량적 어세이의 경우 이러한 관리 물질은 피분석물의 기지 농도를 가지며 환자 샘플과 동일한 방식으로 검사된다. 관리물질의 측정은 검사 시스템이 보고가능한 측정 범위 전반에서 샘플을 정확하게 측정하는 것을 보장한다. 단지 피분석물의 존재를 결정하는 정성적 어세이의 경우 관리물질의 측정은 검사 시스템이 적절하게 작동하고 그리하여 정도 결과를 생산한다는 것을 확신할 수 있게 보장한다.
HCV 코어 시험관내 진단 어세이의 경우 감염 환자 유래의 천연 혈청 또는 재조합적으로 생산된 HCV 코어 항원이 교정 물질로서, 그리고 종종 관리 물질로서도 사용된다. HCV 감염의 효과적인 치료적 처치 관점에서 HCV 양성 환자 혈청의 이용가능성은 점차적으로 도전이 되고 있다. 그러므로 재조합 HCV 코어 항원을 생산하고 나서 천연 혈청 또는 인공 매트릭스 및 완충제 시스템을 재조합 재료와 섞는 것이 한가지 선택안이다. 그러나, 이러한 인공적으로 생산된 매트릭스에서의 회수율이 천연 혈청에서의 회수율에 매우 근접하고 인공 매트릭스 그 자체가 임의의 간섭을 야기시키지 않는다는 것을 주의깊게 평가해야 한다.
인간 혈청 또는 혈장 중에서 HCV 코어 항원의 안정성에 관해서 알려진 바가 거의 없다. Tanaka 등 (Hepatol Res 2003, 26(4):261-267)은 HCV 코어 항원이 25℃에서 7일 동안 인큐베이션될 때 열 스트레스에 대해 매우 안정하다고 기술하고 있다. 이러한 스트레스 과정 이후에도 여전히 HCV 코어 항원을 ELISA로 검출할 수 있다. 그러나, 발명자는 코어-항원 양성 인간 혈청의 반응성을 비롯하여 재조합 HCV 코어 항원과 혼합된 샘플의 반응성은 수 일 동안 실온에서 저장된 경우에 상당히 저하된다는 것을 확인하였다.
그러므로 본 발명의 목적은 관찰된 한계를 극복한 HCV 면역어세이를 교정하고 관리하기 위해 장기간 안정성이 더 높고 저장 수명이 더 길어진 물질을 제공하는 것이다.
본 발명은 다중-에피토프 융합 단백질을 비롯하여 HCV 코어 항원의 검출을 위한 시험관내 진단 면역어세이에서 교정제 및/또는 관리물질로서 이의 용도에 관한 것이다. 다중-에피토프 융합 단백질은 C형 간염 바이러스 (HCV) 코어 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 2종 내지 6종의 상이한 비중복 선형 펩티드를 포함하고, 여기서 각각의 상기 상이한 펩티드는 상기 다중-에피토프 융합 단백질 중에 1 내지 5배로 존재하고 각각의 상기 상이한 펩티드는 샤페론 아미노산 서열을 포함하는 비-HCV 아미노산 서열로 이루어진 스페이서에 의해 다른 상기 펩티드로부터 분리된다. 추가의 HCV 특이적 아미노산 서열이 상기 폴리펩티드에 부재한다.
일 실시형태에서, 각각의 상기 선형 펩티드는 5 내지 50개 아미노산의 길이를 가지고, 다른 실시형태에서 3개의 상이한 선형 펩티드가 다중-에피토프 융합 단백질에 존재한다. 추가의 양상은 교정제 또는 관리물질 또는 둘 모두로서 상기 다중-에피토프 융합 단백질을 포함하는, 다중-에피토프 융합 항원을 포함하는 HCV 코어 항원의 검출을 위한 시약 키트에 관한 것이다.
개시된 아미노산 서열의 범례
SEQ ID NO: 1, HCV 코어, UniProt No. P26664에 따른 유전자형 1a (단리주 1), 191개 아미노산
Figure pct00001
SEQ ID NO: 2, HCV 엔벨로프 E1, UniProt No. P26664에 따른 유전자형 1a (단리주 1), 192개 아미노산
Figure pct00002
SEQ ID NO: 3, HCV 엔벨로프 E2, UniProt No. P26664에 따른 유전자형 1a (단리주 1), 363개 아미노산
Figure pct00003
SEQ ID NO: 4, HCV코어-3-에피토프 교정제 (HCV코어-3Epi-EcS-FP), 432개 아미노산; 2종의 이. 콜라이 SlyD 스페이서 폴리펩티드에 의해 분리된 3종의 상이한 HCV 코어 에피토프. 밑줄 부분은 3종의 상이한 HCV 코어 펩티드이다.
Figure pct00004
SEQ ID NO: 5, HCV코어-3-에피토프 교정제 (HCV코어-3Epi-EcS-FP, XY(Z, 초장형, C/A)), 473개 아미노산; 2종의 이. 콜라이 SlyD 스페이서 폴리펩티드에 의해 분리된 3종의 상이한 HCV 코어 에피토프. 밑줄 부분은 3종의 상이한 HCV 코어 펩티드이다.
Figure pct00005
SEQ ID NO: 6, HCV코어-3-에피토프 교정제 (HCV코어-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4), 513개 아미노산; 2종의 이. 콜라이 SlyD 스페이서 폴리펩티드에 의해 분리된 3종의 상이한 HCV 코어 에피토프. 밑줄 부분은 3종의 상이한 HCV 코어 펩티드를 의미한다. C-말단 에피토프는 4회 존재하는 반면 2종의 다른 에피토프는 단일 에피토프로서 존재한다.
Figure pct00006
자연 발생 항원에 상응하는 재조합 항원은 천연 피분석물을 효과적으로 모방하는 것으로 여겨진다. HCV 항원의 부분 서열은 선행 기술에서 광범위하게 설명되어 왔다. WO2016/172121은 전체 길이 코어 항원의 부분 서열을 포함하는 C형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 기술한다. 개시된 항원은 낙타과 항체의 생산과 후속 스크리닝을 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 이 공개물은 안정성 문제와 관련하여 언급되어 있지 않고, 교정제 또는 관리물질로서 코어 항원의 사용에 관한 어떠한 정보도 개시되어 있지 않다. 그러나, 우리는 사용된 매트릭스 (혈청, 혈장 또는 인공 매트릭스 예컨대 예를 들어 수성 완충제)와 독립적으로 천연 전체 길이 코어 항원에 근접한 크기를 갖는 C형 간염 바이러스 코어 항원이 수 일 이내에 상당한 정도까지 각각 이들 매트릭스 중에서 이의 반응성을 상실한다는 것을 관찰하였다. 이러한 불안정성에 대한 이유는 알려지지 않았지만 상기 매트릭스 중에 함유된 다른 물질에 의한 항원의 단백질 가수분해적 또는 화학적 분해 또는 차폐에 기인할 수 있다. 또한 기계적 및 열적 스트레스가 HCV 코어 항원의 안정성에 영향을 미칠 수도 있다.
놀랍게도, 코어 항원의 오직 짧은 섹션이 시험관내 진단 면역어세이에서 다중-에피토프 융합 항원으로서 사용되고, 거의 전체 길이 코어 항원 (168개 아미노산) 대신에 적용된 경우, 14일 동안 35℃에서 고-스트레스 검사시에 최종 신호 회수율이 매우 높았다. 재조합 다중-에피토프 융합 단백질의 신호는 10% 미만으로 저하된데 반해서 전체 길이 코어 항원은 본래 신호의 약 2/3까지 계속적인 신호 손실을 보였다.
그러므로 본 발명은 C형 간염 바이러스 (HCV) 코어 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 2 내지 6종의 상이한 비중복 선형 펩티드를 포함하는 다중-에피토프 융합 단백질에 관한 것이고, 여기서 각각의 상기 상이한 펩티드는 상기 다중-에피토프 융합 단백질 중에 1 내지 5배로 존재하며 각각의 상기 상이한 펩티드는 샤페론 아미노산 서열을 포함하는 비-HCV 아미노산 서열로 이루어진 스페이서에 의해서 다른 상기 펩티드로부터 분리되고 추가의 HCV 특이적 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드에 부재한다.
용어 "다중-에피토프 융합 단백질"은 "다중-에피토프 융합 항원"과 동의어이다. 다중-에피토프 융합 단백질은 항체, 예컨대 상기 에피토프의 검출을 위한 면역어세이에서 시약으로서 적용되는 항체에 의해 특이적으로 인식되어 결합되는 결합 부위인 하나 초과의 에피토프를 포함한다.
본 발명에 따른 다중-에피토프 융합 단백질은 오직 HCV 코어 단백질의 에피토프만을 함유한다. 이것은 2 내지 6종의 상이한 비중복 선형 펩티드가 코어 단백질의 별개 에피토프를 대표하고, 예를 들어 코어 및 엔벨로프 펩티드의 혼합물이 아니라는 것을 의미한다. 선행 기술 예컨대 국제 특허 출원 공개 번호 WO97/44469 또는 Chien 등 (J Clin Microbiol 1999, 37(5): 1393-1397)이 기술한 바와 같은 C형 간염 바이러스 다중-에피토프 융합 항원은 본 발명에 의해 포괄되지 않는데, 여기서는 HCV 코어, env, NS3 및 NS4와 같은 몇몇 바이러스 단백질 또는 몇몇 바이러스 단백질의 에피토프가 다중-에피토프 융합 단백질의 일부분이다. 선행 기술과 대조적으로, 본 발명의 다중-에피토프 융합 단백질은 천연 발생 HCV 코어 항원에 존재하는 에피토프를 함유한다. 대표적인 HCV 코어 단백질 (유전자형 1a, 단리주 1)의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된다. SEQ ID NO: 2 및 3은 각각 엔벨로프 1 (E1) 및 엔벨로프 2 (E2)의 아미노산 서열을 나타낸다.
다중-에피토프 융합 단백질은 상기 기술된 바와 같이 C형 간염 바이러스 (HCV) 코어 단백질의 아미노산 서열에 존재하는, 2 내지 6종의 상이한 비중복 선형 펩티드, 일 실시형태에서 3종의 상이한 선형 펩티드를 포함한다. 선형 펩티드는 직접 서열로, 차례로, 펩티드 연결을 통해 연결된 아미노산이고, 여기서 개별 아미노산은 서로 인접하고 공유적으로 연결된다. 다중-에피토프 융합 단백질은 공유적으로 연결된 아미노산의 연속적이고, 비개재된, 인접한 사슬이다.
용어 "비중복"은 선택된 아미노산 영역이 천연 코어 항원 내 공통의 중복되는 아미노산 서열을 갖지 않는 개별 에피토프라는 것을 의미한다. 예시로서, 아미노산 위치 60-75의 코어 에피토프가 에피토프로서 선택될 때 추가적으로 선택된 에피토프는 위치 76에서 시작할 수 있거나 또는 위치 59에서 종결될 수 있다. 위치 60-75, 97-117 및 152-171에서의 에피토프의 조합이 비중복의 요건을 충족하는 예이다.
이러한 다중-에피토프 융합 단백질 내 에피토프는 일반적으로 인접한 폴리펩티드 사슬 상에 적어도 5개 아미노산, 일 실시형태에서 5 내지 50개 아미노산, 일 실시형태에서 5 내지 31개 아미노산, 일 실시형태에서 5 내지 25개 아미노산, 일 실시형태에서 7 내지 21개 아미노산, 일 실시형태에서 15 내지 21개 아미노산을 포함한다.
용어 펩티드 및 폴리펩티드는 본 명세서에서 최대 50개 아미노산의 분자를 언급하는 동의어로서 이해한다. 용어 단백질은 50개 초과 아미노산의 폴리펩티드를 의미한다. 항원은 폴리펩티드일 수 있거나 또는 단백질일 수 있다. 용어 항원은 항체가 이에 특이적으로 결합할 수 있다는 사실을 의미한다. 항원은 적어도 하나의 에피토프 (항체의 결합 부위)를 포함하지만 일반적으로 하나 초과의 에피토프를 보유한다.
일반적으로, 다중-에피토프 융합 단백질에 함유되는 펩티드는 선형 펩티드 서열이 HCV 구조 단백질, 일 실시형태에서 HCV 코어 항원을 검출하는 면역어세이에서 특이적 시약으로서 적용되는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 상응하도록 선택된다. 개별 펩티드는 천연 피분석물의 일정 에피토프를 모방한다. 인공적으로 구성된 다중-에피토프 융합 단백질은 천연 샘플 중 코어 단백질의 경우처럼 어세이의 특이인자, 즉 피분석물-특이적 결합제와 매우 유사한 방식으로 반응하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 시험관내 진단 어세이는 적절하게 교정될 수 없다. 일 실시형태에서, 3종의 상이한 비중복 선형 펩티드는 다중-에피토프 융합 단백질의 일부이다. 다른 실시형태에서, 상기 3종의 상이한 선형 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 55 내지 80, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 90 내지 120, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 145 내지 175 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 실시형태에서 상기 3종의 상이한 선형 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 60 내지 75, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 97 내지 117, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 152 내지 171로 이루어진다. 다른 실시형태에서 상기 3종의 상이한 선형 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 60 내지 75, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 97 내지 117 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 111 내지 171로 이루어진다.
또한, SEQ ID NO: 1의 변이체, 예컨대 상이한 HCV 유전자형의 코어 항원이 포괄된다. 이들 변이체는 개시된 아미노산 서열의 보존성 또는 상동성 치환 (예컨대 예를 들어 알라닌 또는 세린으로 시스테인의 치환)을 통해서 당업자가 쉽게 생성시킬 수 있다. 본 문맥에서 용어 "변이체"는 또한 상기 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 변이체는 가장 우세한 단백질 이소폼의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 교환, 결실 또는 삽입을 보이는 이소폼일 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 실질적으로 유사한 단백질은 단백질의 가장 우세한 이포솜에 대해서 적어도 90%, 다른 실시형태에서 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. SEQ ID NO: 1의 변이체는 예를 들어 HCV 유전자형 1 내지 7의 코어 아미노산 서열이다. HCV 유전자형, 그들 출현율 및 전반적인 분포도는 당분야에서 충분히 설명되어 있고 예를 들어, [Messina et al., Hepatology 2015 61(1), p. 77-87]에 요약되어 있다.
2 내지 6종의 상이한 비중복 선형 펩티드 이외에 추가의 HCV-특이적 아미노산 서열은 상기 다중-에피토프 융합 단백질에 부재한다. 용어 "추가의 HCV-특이적 아미노산 서열의 부재" 및 "비-HCV 아미노산 서열"은 추가의 아미노산 스트렛치가 다중-에피토프 융합 단백질의 일부일 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 비-HCV 특이적 아미노산 서열이 존재하면 임의의 이들 비-HCV-특이적 서열에 대해 생성된 항체가 HCV 구조적 항원 예컨대 코어 항원에 높은 친화성으로 결합하지 않을 것이다. HCV 구조적 항원에 대한 이러한 항체의 친화성은 103 l/mol 미만일 것이다. 오직 2 내지 6종의 상이한 펩티드만이 환자 샘플 중 항체 또는 HCV 구조 단백질의 검출을 위한 특이적 면역어세이 시약으로서 사용되는 항체와 면역반응할 수 있다. 전형적으로, 면역어세이에서 HCV 구조적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 상기 단백질에 대해 적어도 107 l/mol, 일 실시형태에서 적어도 109 l/mol의 친화성을 갖는다.
일 실시형태에서, 2 내지 6종의 선형 펩티드는 선택된 서열이 중복되지 않도록 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 식 X - 스페이서 - Y - 스페이서 - Z를 갖는 다중-에피토프 융합 단백질에 관한 것으로서, 식에서 X, Y 및 Z는 HCV 코어 단백질에 존재하는 상이한 비중복 선형 아미노산 서열을 나타내고, 스페이서는 비-HCV 아미노산의 서열을 나타내며, 샤페론 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서 X, Y 및 Z 각각은 1 내지 5배로 존재한다. 다른 실시형태에서 Z는 1 내지 5배로 존재한다. 상기에 더욱 제공되는 모든 설명 및 정의는 또한 이 실시형태에도 적용된다. 일 실시형태에서, X는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 55 내지 80 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함하고, Y는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 90 내지 120 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함하고, Z는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 145 내지 175 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, X는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 60 내지 75로 이루어지고, Y는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 97 내지 117로 이루어지고, Z는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 152 내지 171로 이루어지고, 일 실시형태에서 Z는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 111 내지 171로 이루어진다.
2 내지 6종의 상이한 비중복 선형 펩티드는 C형 간염 바이러스 폴리단백질에 존재하지 않는, 특히 임의의 HCV 구조적 항원 코어 또는 env에 존재하지 않는 아미노산 서열로 이루어진 스페이서에 의해 분리된다. 적어도 25개 길이의 비-HCV 아미노산, 일 실시형태에서 적어도 100개, 일 실시형태에서 적어도 150개, 일 실시형태에서 적어도 200개, 일 실시형태에서 25 내지 200개 길이의 비-HCV 아미노산을 갖는 임의의 비-HCV 폴리펩티드가 스페이서로서 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 스페이서는 샤페론 또는 HCV-특이적 펩티드에 결합하는 것으로 추정되는 항체와 면역학적으로 교차 반응하지 않는 임의의 다른 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 샤페론은 SlyD, SlpA, FkpA 및 Skp로 이루어진 군으로부터 선택된다.
각각의 상이한 펩티드는 다중-에피토프 융합 단백질에 1 내지 5배로 존재할 수 있다. 이것은 개별 에피토프의 동일한 반복부가 존재한다는 것을 의미한다. 이들 반복적인 에피토프는 샤페론 아미노산 서열에 의해 분리될 필요는 없지만 비-샤페론 서열 예컨대 짧은 비-HCV 펩티드를 함유하는 스페이서에 의해 분리될 수도 있다. 예로서, 반복된 글리신 잔기와 같이 2 내지 15개 아미노산을 포함하는 스페이서가 동일한 HCV 코어 에피토프를 분리시킬 수 있다. 동일한 에피토프를 분리시키는 스페이서의 추가 예는 아미노산 서열 GGGSGGG이다.
추가 양상에서, 다중-에피토프 융합 단백질은 예를 들어 클로닝 과정으로 인해 존재할 수 있거나 또는 정제 목적을 위해 필요할 수 있는 추가의 비-HCV 아미노산이 측접될 수 있다. 이들 추가의 아미노산은 N-말단부 또는 C-말단부 또는 양쪽 말단부에 부착될 수 있다.
다른 실시형태에서, 다중-에피토프 융합 단백질은 SEQ ID NO: 4로 이루어진다. 추가의 실시형태에서 이것은 SEQ ID NO: 5 또는 6으로 이루어진다.
본 발명의 추가 양상은 상기 섹션에 기술된 바와 같은 가용성 다중-에피토프 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로서, a) 상술된 바와 같은 다중-에피토프 융합 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자가 작동적으로 연결되어 포함된 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, b) 상기 폴리펩티드의 발현 단계, 및 c) 상기 폴리펩티드의 정제 단계를 포함한다. 재조합 DNA 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 Sambrook 등 (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual)에 의해 선행 기술에서 광범위하게 기술되어 있다. 본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 작동적으로 연결된 재조합 DNA 분자, 즉, 하나의 C형 간염 바이러스 (HCV) 구조 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 2 내지 6종의 상이한 선형 펩티드를 포함하는 다중-에피토프 융합 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터이고, 여기서 각각의 상기 펩티드는 비-HCV 아미노산 서열로 이루어진 스페이서에 의해 다른 상기 펩티드로부터 분리되고 추가의 HCV-특이적 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드에 부재한다.
추가 양상은 HCV 코어 항원의 2 내지 6종의 상이한 비중복 선형 펩티드를 포함하는 가용성의, 안정한, 면역반응성 다중-에피토프 융합 단백질을 제조하기 위한 방법이다. 이 방법은
a) 상기 다중-에피토프 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 상기 기술된 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계;
b) 상기 다중-에피토프 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 단계;
c) 상기 다중-에피토프 융합 단백질의 정제 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서 본 발명은 HCV 코어 항원의 검출을 위한 시험관내 진단 검사에서 교정제 및/또는 관리 물질로서 본 명세서에 개시된 바와 같은 HCV 코어 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 다중-에피토프 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.
HCV 항원의 검출을 위한 면역어세이가 실행되는 시험관내 진단 (IVD) 장비의 교정은 다음과 같이 작업된다: 특이적 어세이를 위한 IVD 장비의 교정 절차는 일반적으로 분석기-특이적 어세이 지시서에 대한 적절한 조작자 매뉴얼에 따라 수행된다. 일반적으로 모든 시약 팩은 제공되는 교정제 물질을 사용하여 교정된다. 예로서, HCV 코어 항원의 경우, 상이한 코어-특이적 항체는 고체상에 항체를 부착시킬 수 있는 구성 및/또는 표지된 구성으로 사용된다. 교정제 물질, 일 실시형태에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 다중-에피토프 융합 단백질은 특이적 코어 항체와 인큐베이션되고 샘플과 동일한 방식으로 처리된다. 신호의 검출 이후 이 결과는 사전 정의된 값과 비교되고 적절한 측정 범위가 설정된다. 제조사의 지시서에 따라서 교정은 사전 정의된 간격으로 또는 필요에 따라서, 예를 들어 정도 관리 결과가 명시된 한계 밖에 존재하면 반복된다.
일 실시형태에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중-에피토프 융합 단백질은 정도 관리를 위한 물질로서 사용된다. 이것은 다중-에피토프 융합 단백질이 IVD 시스템이 적절하게 작동되고, 특히, 정량적 어세이의 경우에, 정확하게 측정된다는 것을 검증하기 위해서 샘플 대신에 사전 정의된 농도로 사용된다는 것을 의미한다.
본 발명의 역시 추가의 양상은 HCV 코어 항원의 검출을 위한 방법이다. 상기 방법은 교정제 또는 관리 물질 또는 둘 모두로서 상기에 더욱 상술된 바와 같은 다중-에피토프 융합 단백질을 적용한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 a) 체액 샘플을 적어도 하나의 HCV 코어 항원-특이적 결합제와 혼합하여 면역반응 혼합물을 형성시키는 단계; b) 체액 샘플에 존재하는 HCV 코어 항원이 상기 적어도 하나의 HCV 코어 항원-특이적 결합제와 면역반응하여 면역반응 생성물을 형성할 수 있는 충분한 기간 동안 상기 면역반응 혼합물을 유지시키는 단계; 및 c) 임의의 상기 면역반응 생성물의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계를 포함하고, 본 명세서에 개시된 바와 같은 다중-에피토프 융합 단백질은 교정제 및/또는 관리 물질로서 사용된다.
단백질의 검출을 위한 면역어세이는 당분야에 충분히 공지되어 있고, 그래서 이러한 어세이를 수행하기 위한 방법 및 실제 적용 및 절차도 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 다중-에피토프 융합 단백질은 샌드위치 구성으로 사용되고, 여기서 상기 다중-에피토프 융합 단백질은 적어도 2종의 항체, 표지된 항체, 및 고체상에 부착될 수 있는 항체에 의해 결합된다. 그러나, 다중-에피토프 융합 단백질이 교정제 및/또는 관리 물질로서 제공되므로, 이것은 임의의 검출 원리 (예를 들어, 효소 면역어세이, 전기화학발광 어세이, 방사선동위원소 어세이 등) 또는 어세이 구성 (예를 들어, 검사 스트립 어세이, 샌드위치 어세이, 간접 검사 개념 또는 상동 어세이 등)을 선택할 수 있도록 피분석물을 모방한다.
본 발명의 일 실시형태에서 면역어세이는 고체상으로서 미세입자를 적용하는 입자-기반 면역어세이이다. 본 명세서에서 사용되는 "입자"는 물리적 성질 예컨대 부피, 질량 또는 평균 크기가 고려될 수 있는 소형의, 국재화된 객체를 의미한다. 그에 따라서 미세입자는 대칭의, 구형, 본질적으로 구형 또는 구체 형상일 수 있거나, 또는 불규칙한, 비대칭 형상 또는 형태일 수 있다. 본 발명에서 고려되는 입자의 크기는 다양할 수 있다. 일 실시형태에서, 사용되는 미세입자는 구체 형상이고, 예를 들어 나노미터 및 마이크로미터 범위의 직경을 갖는 미세입자이다. 일 실시형태에서, 본 개시 내용에 따른 방법에서 사용되는 미세입자는 50 나노미터 내지 20 마이크로미터의 직경을 갖는다. 추가의 실시형태에서 미세입자는 100 nm 내지 10 ㎛의 직경을 갖는다. 일 실시형태에서 본 개시 내용에 따른 방법에서 사용되는 미세입자는 200 nm 내지 5 ㎛ 또는 750 nm 내지 5 ㎛의 직경을 갖는다.
상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 미세입자는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 재료를 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있고, 예를 들어 그들은 무기 또는 유기 재료를 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있거나 또는 그로 본질적으로 이루어질 수 있다. 전형적으로, 그들은 금속 또는 금속의 합금, 또는 유기 재료를 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있거나 또는 그로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 또는 탄수화물 구성요소를 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 미세입자에 고려되는 재료의 예는 아가로스, 폴리스티렌, 라텍스, 폴리비닐 알콜, 실리카 및 강자성 금속, 합금 또는 조성물 재료를 포함한다. 일 실시형태에서 미세입자는 자성 또는 강자성 금속, 합금 또는 조성물이다. 추가 실시형태에서, 재료는 특별한 성질을 가질 수 있으며, 예를 들어 소수성일 수 있거나, 또는 친수성일 수 있다. 이러한 미세입자는 전형적으로 수성 용액에 분산되고 작은 음의 표면 전하를 보유하여 미세입자가 분리된 채로 유지되고 비특이적 클러스터링은 피하게 된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 미세입자는 상자성 미세입자이고, 본 개시 내용에 따른 측정 방법에서 이러한 입자의 분리는 자력에 의해 촉진된다. 자력이 인가되어 용액/현탁액으로부터 상자성 또는 자성 입자를 끌어당기고 그들을 바람직하게 유지시키면서 용액/현탁액의 액체를 제거할 수 있고 입자는 예를 들어 세척 및 재현탁할 수 있다.
당업자에게 공지된 모든 생물학적 액체는 단리된 샘플로서 사용될 수 있다. 일반적으로 사용되는 샘플은 전혈, 혈액 혈청, 혈액 혈장, 소변, 뇌척수액 (액체 성분) 또는 타액과 같은 체액이고, 일 실시형태에서는 혈액 혈청 또는 혈장이다.
본 발명의 다른 부분은 적어도 하나의 HCV 코어 항원-특이적 결합제 및 교정제 물질로서 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 다중-에피토프 융합 단백질을 개별 용기 또는 단일 용기의 개별 구획에 포함하는, HCV 코어 항원의 검출을 위한 시약 키트에 관한 것이다.
용어 단일 용기는, Roche diagnostics의 Elecsys® 분석기 시리즈와 같은, 많은 자동 분석기의 경우에, 일정 피분석물을 측정하는데 필요한 시약이 시약 팩의 형태로, 즉 분석기 상에 맞춰져서 상이한 구획에 관심 피분석물의 측정에 필요한 모든 핵심 시약을 함유하는 하나의 용기 유닛으로서 제공된다는 사실에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 키트는 적어도 2종의 HCV 코어 항원-특이적 결합제를 포함하고, 여기서 상기 적어도 2종의 HCV 코어 항원-특이적 결합제 중 하나는 검출가능하게 표지된다. 또한, 상기 정의된 바와 같은 미세입자는 시약 키트의 일부일 수 있다. 일 실시형태에서, 시약 키트는 결합쌍의 제1 파트너로 코팅된 미세입자를 함유하고, 상기 적어도 2종의 HCV 코어 항원-특이적 결합제 중 두번째는 상기 결합쌍의 제2 파트너에 결합된다.
다른 양상에서, 키트는 관리 물질로서 본 명세서에 기술된 바와 같은 다중-에피토프 융합 단백질을 포함하는 추가의 개별 용기를 포함한다.
또한, 상기 정의된 시약 키트는 관리 및 표준 용액을 비롯하여 사용에 관한 지시서와 함께 보통의 당업자가 사용하는 바와 같은 일반 첨가제, 완충제, 염, 세제 등이 존재하는 하나 이상의 용액 중 시약을 함유한다.
다음의 실시형태가 또한 본 발명의 일부이다:
1. C형 간염 바이러스 (HCV) 코어 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 2 내지 6종의 상이한 비중복 선형 펩티드를 포함하는 다중-에피토프 융합 단백질로서, 여기서 각각의 상기 상이한 펩티드는 1 내지 5배로 존재하고 각각의 상기 상이한 펩티드는 샤페론 아미노산 서열을 포함하는 비-HCV 아미노산 서열로 이루어진 스페이서에 의해 다른 상기 펩티드로부터 분리되고, 추가의 HCV-특이적 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드에 부재한다.
2. 실시형태 1에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, 상기 HCV 코어 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열에 상응한다.
3. 실시형태 1 또는 2에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, 각각의 상기 2 내지 6종의 선형 펩티드는 5 내지 50개 아미노산, 일 실시형태에서 5 내지 31개 아미노산, 일 실시형태에서 5 내지 25개 아미노산, 일 실시형태에서 7 내지 21개 아미노산, 일 실시형태에서 15 내지 21개 아미노산의 길이를 갖는다.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, 하나의 C형 간염 바이러스 (HCV) 구조 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 3종의 상이한 선형 펩티드는 상기 다중-에피토프 융합 단백질의 일부이다.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, 상기 3종의 상이한 선형 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 55 내지 80, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 90 내지 120, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 145 내지 175 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함한다.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, 상기 3종의 상이한 선형 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 60 내지 75, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 97 내지 117 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 152 내지 171로 이루어진다.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, 하기의 식을 갖는다:
X - 스페이서 - Y - 스페이서 - Z
상기 식에서 X, Y 및 Z는 HCV 코어 단백질에 존재하는 상이한 비중복 선형 아미노산 서열을 나타내고, 스페이서는 샤페론 아미노산 서열을 포함하는 비-HCV 아미노산의 서열을 나타낸다.
8. 실시형태 7에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, X는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 55 내지 80 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함하고, Y는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 90 내지 120 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함하며, Z는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 145 내지 175 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함한다.
9. 실시형태 7 또는 8에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, X는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 60 내지 75로 이루어지고, Y는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 97 내지 117로 이루어지고, Z는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 152 내지 171로 이루어진다.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, 상기 스페이서는 적어도 25개의 비-HCV 아미노산 서열, 일 실시형태에서 적어도 100개, 일 실시형태에서 적어도 150개, 일 실시형태에서 적어도 200개, 일 실시형태에서 25 내지 200개의 비-HCV 아미노산 서열을 포함한다.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, 상기 샤페론은 SlyD, SlpA, FkpA 및 Skp로 이루어진 군에서 선택된다.
12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질에 있어서, SEQ ID NO: 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.
13. 가용성 다중-에피토프 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
a) 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자가 작동적으로 연결되어 포함된 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계,
b) 상기 폴리펩티드의 발현 단계, 및
c) 상기 폴리펩티드의 정제 단계를 포함한다.
14. HCV 항원, 일 실시형태에서 HCV 코어 항원의 검출을 위한 시험관내 진단 검사에서 교정제 및/또는 관리 물질로서의, 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 HCV 코어 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 다중-에피토프 융합 단백질의 용도.
15. 면역어세이에서 HCV 코어 항원을 검출하기 위한 방법으로서, 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질이 교정제 및/또는 관리 물질로서 사용된다.
16. 단리된 샘플에서 HCV 코어 항원을 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a) 체액 샘플을 적어도 하나의 HCV 코어 항원-특이적 결합제와 혼합하여 면역반응 혼합물을 형성시키는 단계,
b) 체액 샘플에 존재하는 HCV 코어 항원이 상기 적어도 하나의 HCV 코어 항원-특이적 결합제와 면역반응하여 면역반응 생성물을 형성할 수 있는 충분한 시간 기간 동안 상기 면역반응 혼합물을 유지시키는 단계; 및
c) 임의의 상기 면역반응 생성물의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계를 포함하고,
여기서 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질은 교정제 및/또는 관리 물질로서 사용된다.
17. HCV 코어 항원의 검출을 위한 시약 키트로서, 적어도 하나의 HCV 코어 항원-특이적 결합제 및 교정제 물질로서 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 다중-에피토프 융합 단백질을 개별 용기 또는 단일 용기의 개별 구획에 포함한다.
18. 실시형태 17에 따른 시약 키트로서, 적어도 2종의 HCV 코어 항원-특이적 결합제를 포함하고, 상기 적어도 2종의 HCV 코어 항원-특이적 결합제 중 하나는 검출가능하게 표지된다.
19. 실시형태 17 또는 18에 따른 시약 키트로서, 미세입자를 추가로 포함한다.
20. 실시형태 19에 따른 시약 키트로서, 상기 미세입자는 결합쌍의 제1 파트너로 코팅되고, 상기 적어도 2종의 HCV 코어 항원-특이적 결합제 중 두번째는 상기 결합쌍의 제2 파트너에 결합된다.
21. 실시형태 17에 따른 HCV 코어 항원의 검출을 위한 시약 키트에 있어서, 관리 물질로서 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 다중-에피토프 융합 단백질을 포함하는 추가의 개별 용기를 포함한다.
본 발명은 실시예를 통해서 더욱 예시된다.
실시예
실시예 1: 방법
단일클론 항체
적절한 동물의 면역화에 필요한 재조합 HCV 코어 항원은 당분야에 공지된 표준 기술을 사용해 바람직한 항원 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 이. 콜라이 발현 플라스미드에 삽입시킨 후 단백질의 과발현 및 정제에 의해서 수득하였다. 이들 표준 분자 생물학 방법은 예를 들어, [Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술되어 있다.
HCV 코어에 대한 쥐과 또는 토끼 단일클론 항체는 각각 당업자에게 공지된 바와 같은 표준 하이브리도마 기술 또는 재조합 핵산 기술 및 예를 들어 WO2016/091755에 기술된 바와 유사한 방식으로 재조하였다.
하기 실시예에서 포획 화합물로서 사용된 HCV 코어 단백질에 대한 단일클론 항체는 HCV 코어 단백질 (SEQ ID NO: 1)의 에피토프 aa 157-169 및 aa 65-71에 결합된다. 매우 유사한 에피토프 및 그들의 결정은 이미 EP1308507에 개시되어 있다. 검출 화합물로서, 단일클론 항체는 EP0967484 및 EP1308507에도 기술된 에피토프와 관련된 에피토프인, 코어 에피토프 aa 102-112에 결합할 수 있는 것을 선택하였다. 마우스 및 토끼의 면역화의 경우, HCV 유전자형 1에 의해 코딩되는 완전한 폴리단백질을 개시하고 있는, Genbank Acc. No: P26664.3 GI:130455 (SEQ ID NO: 1)에 따른 유전자형 1a의 HCV 코어 항원 서열을 사용하였다.
특히, WO 03/000878 A2, US 2009/0291892 A1, WO 2013/107633 A1에 개시된 절차에 따라 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) SlyD를 갖는 재조합 융합 단백질로서 아미노산 110-171 유래의 펩티드 또는 [Boulant, S. et al., 2005, J. Virol. 79:11353-11365]에 기술된 절차에 따른 재조합 단백질로서 아미노산 2-169 유래의 펩티드가 면역화에 사용되었다. 추가의 접근법에서, KLH (keyhole limpet hemocyanin)에 커플링된 아미노산 82-117 유래의 펩티드가 공지 방법에 따른 면역화에 사용되었다.
교정제/관리 시약으로서 사용되는 재조합 HCV 코어 항원
아미노산 2-169 유래 재조합 HCV 코어 항원 (rec. HCV 코어(2-169))은 [Boulant, S. et al., 2005, J. Virol. 79:11353-11365]에 기술된 절차에 따라 제조되었다.
상기 기술된 3종의 단일클론 항-HCV 코어 항체의 에피토프 및 2종의 이. 콜라이 SlyD 유닛을 함유하는 재조합 HCV 코어 항원 융합 단백질을 코딩하는 합성 유전자 (rec. HCV 코어-3Epi-EcS-FP, SEQ ID NO. 4)는 Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany)에서 구매하였다. Novagen (Madison, WI, USA)의 pET24a 발현 플라스미드를 기반으로 다음의 클로닝 단계를 수행하였다. 벡터는 NdeI 및 XhoI로 분해하였고 기술된 융합 단백질을 포함하는 카세트를 삽입하였다. 최종 플라스미드의 삽입부를 시퀀싱하였고 바람직한 융합 단백질을 코딩한다는 것을 확인하였다. 최종 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO. 4)은 본 발명의 서열 프로토콜에 표시되어 있다. Ni-NTA-보조 정제를 촉진하기 위해서 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 함유하였다. rec. HCV 코어-3Epi-EcS-FP는 다음의 프로토콜에 따라서 정제하였다. 발현 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 BL21 (DE3) 세포는 카나마이신 (30 ㎍/mL)이 더해진 LB 배지에서 1의 OD600 까지 성장시켰고, 세포졸 과발현은 37℃의 성장 온도에서 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG)를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 유도시켰다. 유도 후 4시간에, 세포는 원심분리 (20분, 5000 x g)를 통해 회수하였고, 냉동시켰으며 -20℃에 저장하였다. 세포 용해의 경우, 냉동된 펠렛을 50 mL의 완충액 (프로테아제 억제제 칵테일) 당 20 mM Tris 완충액 pH 8.0, 10 mM MgCl2, 10 U/mL Benzonase®, 1개 정제 Complete® 및 1개 정제 Complete® EDTA-free에 재현탁시켰고, 최종 현탁액은 고압 균질화를 통해서 용해시켰다. 미정제 용해물은 최대 20 mM 이미다졸을 보충하였다. 원심분리 후에, 상청액은 완충액 A (50 mL의 완충액 당 100 mM 소듐 포스페이트 pH 8.0, 300 mM 소듐 클로라이드, 20 mM 이미다졸, 1개 정제 Complete® EDTA-free)로 사전 평형화시킨 Ni-NTA (니켈-니트릴로트리아세테이트) 컬럼 상에 도포하였다. 용리 전에, 이미다졸 농도는 오염 단백질을 제거하기 위해 40 mM 까지 상승시켰다. 그 다음으로 250 mM의 이미다졸 농도를 적용하여 단백질을 용리하였다. 투석 후에, 단백질은 이온-교환 크로마토그래피 (Q-Sepharose)를 통해서 더욱 정제하였다. 마지막으로, 단백질에 대해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였고, 단백질-함유 분획을 풀링하였다.
단백질 결정
정제된 폴리펩티드의 단백질 농도는 비색 BCA 방법을 사용하거나 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 측정하여 결정하였다.
실시예 2: 활성화된 바이오틴화된 시약의 합성
바이오틴-PEGn-NHS-바이오틴화 시약 (CAS-Nr. 365441-71-0; n = 에틸렌 옥시드 단위의 개수)은 IRIS Biotech GmbH에서 수득하거나 또는 내부에서 합성하였다.
신규 합성에서, 에틸렌 옥시드 단위의 이산 개수의 제어는 [Chen and Baker, J. Org. Chem. 1999, 64, 6840-6873]에 기술된 방법에 따라서, 보다 짧은 PEG, 예컨대 테트라에틸렌 글리콜의 단계식 연장으로 보장하였다.
제1 단계에서, 비스-트리틸-PEGn (1) 을 수득하였다 (분명하게, n은 에틸렌 글리콜 단위의 개수를 나타냄).
(1)의 탈보호는 1시간 동안 실온에서 디옥산 중 1 M HCl에서 교반하여 수행하였다. 증발후 잔류물은 맑은 용액이 수득될 때까지 메탄올에서 환류시켰고 플라스크를 밤새 4℃에서 유지시켰다. 여과 후에 용액을 헥산으로 추출하였고, 메탄올층을 증발시키고 건조하여 오일 또는 왁스 (경도는 PEG 단위의 길이/개수 (n)에 의존)로서 상응하는 PEGn-디올 (2)을 얻었다.
다음으로, 산 작용기의 도입은 [Seitz and Kunz, J. Org. Chem. 1997, 62, 813-826]에 따라 tert-부틸 아크릴레이트에 PEGn-디올의 소듐 촉매 부가를 통해서 수행하였다. 이러한 방식으로 화합물 (3)을 수득한다.
메틸렌 클로라이드 중 HO-PEGn-COOtBu 3 (1 당량) 및 트리에틸아민 (2.5 당량)의 용액에 메틸술포닐 클로라이드 (2 당량)를 0℃에서 적가하였다. 1시간 동안 교반 후에 수성 워크업 및 증발을 후속하였다.
메실레이트 (4) (1 당량)는 2일 동안 실온에서 디메틸포름아미드 중에서 교반하면서 NaN3 (2 당량)과 직접 반응시켰다. 고체 및 디메틸포름아미드의 제거 후에, 디에틸에테르 및 Na2CO3 을 사용한 수성 워크업을 후속하였다.
미정제 생성물 (5)은 에틸 아세테이트/메탄올 15/1 중 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피를 통해서 정제하였다. 아지드 (5) (1 당량)의 환원은 실온에서 24시간 동안 테트라히드로퓨란/물 4/1 중 트리페닐포스핀 (1.1 당량)과 함께 교반하여 수행하였다. 증발 후에 잔류물을 물에 현탁하였고 에틸 아세테이트로 수 차례 세척하였다. 수층을 증발 및 건조시커서 무색 오일로서 아민 (6)을 제공하였다.
tert-부틸 에스테르의 절단은 수중 5% 트리플루오로아세트산을 사용해 수행하였다. 아미노-PEGn-산 (7)은 수 차례 물을 사용하여 증발을 통해 수득하였다.
바이오틴은 상응하는 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (8) (1.05 당량)를 디메틸포름아미드 중 트리에틸아민 (4 당량)과 실온에서 커플링시켜 도입시켰다. 증발 후에 미정제 생성물 (9)은 아세토니트릴/물 중 RP-HPLC을 통해 정제하였다.
마지막으로, N-히드록시숙신이미드 에스테르 (10)는 메틸렌 클로라이드 중 에틸 디메틸아미노프로필 카르보디이미드 (1.1 당량) 및 N-히드록시숙신이미드 (1.1 당량)와의 반응을 통해 형성되었다. 반응의 완료 후에, 반응 혼합물은 메틸렌 클로라이드로 희석하였고 물로 세척하였다. 증발 및 건조에 의해 순수한 바이오틴-PEGn-NHS (10)이 에틸렌 옥시드 단위의 개수에 따라서 각각 오일, 왁스 또는 고체로서 생성되었다.
반응식 1: 바이오틴-PEG(n)-NHS의 합성
Figure pct00007
실시예 3: 항체의 표지화
개별적으로, 항체에 바이오틴 및 루테늄 모이어티의 커플링:
항체는 당업자에게 매우 익숙한 최신 절차에 따라서 수득하고 정제하였다.
표지화 전에, 검출 항체는 펩신으로 절단하여 F(ab')2 단편을 수득하였고 간섭 경향의 Fc 단편을 제거하였다 (방법은 [A. Johnstone and R. Thorpe in Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific 1987]가 기술한 것임). 정제된 F(ab')2 단편은 동종이기능성 가교제 디숙신이미딜 수베레이트 (DSS)로 더욱 중합시켰고 S400 겔 여과 크로마토그래피를 적용하여 최적 크기 범위의 F(ab')2 중합체를 수집하였다 (원리는 DE3640412에 기술됨).
개별 표지의 부착을 위해서, 일반적으로 항체의 리신 ε-아미노 기를 N-히드록시-숙신이미드 활성화된 화합물에 의해 표적화하였다. 10　mg/mL의 단백질 농도에서, 항체는 각각 N-히드록시-숙신이미드 활성화된 바이오틴화 시약 (Biotin-PEG24-NHS) 및 N-히드록시-숙신이미드 활성화된 루테늄 표지화 시약과 반응시켰다. 바이오틴화 또는 루테늄 표지화 시약의 표지/단백질 비율은 각각 5-6:1 또는 15:1이었다. 반응 완충액은 50　mM 포타슘 포스페이트 (pH 8.5), 150 mM KCl이었다. 반응은 실온에서 15분 동안 수행하였고 L-리신을 10 mM의 최종 농도로 첨가하여 중지시켰다. 표지의 가수분해적 불활성화를 피하기 위해서, 개별 스톡 용액은 무수 DMSO (Sigma-Aldrich, Germany)에 제조하였다. 커플링 반응 후에, 미반응된 유리 바이오틴 또는 루테늄 표지는 미정제 항체 접합체를 겔 여과 컬럼 (Superdex 200 HI Load)을 통해 통과시키거나 또는 투석에 의해 제거하였다.
실시예 4: 원형 Elecsys HCV 코어 항원 어세이
Elecsys HCV 코어 항원 원형 어세이의 측정은 자동 cobas® e601 또는 e801 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 상에서 샌드위치 어세이 구성으로 수행하였다. 이 분석기에서 신호 검출은 전기화학발광을 기반으로 한다. 이러한 샌드위치 어세이에서 하나 이상의 포획 항체-바이오틴-접합체 (즉, 피분석물-특이적 결합제)는 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드의 표면에 고정된다. 검출-항체 (추가의 피분석물-특이적 결합제)는 신호전달 모이어티로서 착체화된 루테늄 양이온을 보유한다. 피분석물의 존재 하에서, 루테늄 착체는 고체상에 가교되고 분석기의 측정 셀에 포함된 백금 전극에서 여기 후 620 nm에서 빛을 방출한다. 신호 출력은 임의의 빛 단위이다. 측정은 몇몇 공급처에서 구매한 HCV 코어 항원 양성 및 음성 인간 혈청 및 혈장 샘플 (표 1 및 2)을 비롯하여 재조합 항원 HCV 코어 (2-169, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 2 내지 169에 상응) 및 HCV 코어-3Epi-EcS-FP (SEQ ID NO: 4, 표 1 및 도 1 & 2), HCV코어-3Epi-EcS-FP, XY(Z, 초장형, C/A) (SEQ ID NO:5, 표 2 및 도 2) 및 HCV코어-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4 (SEQ ID NO:6, 표 2 및 도 2)를 사용하여 수행하였다.
실험 HCV 코어 항원 어세이는 다음과 같이 수행하였다. 5.4% 만니톨 및 5.9% D(+)-수크로스, 0.01% N-메틸이소티아졸론-히드로클로라이드, 0.1% 옥시피리온 및 0.4% 소 알부민 및 전처리 시약 (PT: 0.25 M KOH, 1.125 M KCl, 1.5% 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드 (HTAC), 0.85% 옥틸글리코시드) 함유의 25 ㎕ 세제를 함유하는 36 mM HEPES-완충액 중 50 ㎕의 정상 인간 혈청, HCV 항원 양성 샘플 또는 재조합 항원 HCV 코어 (2-169) 또는 HCV 코어-3Epi-EcS-FP 또는 HCV코어-3Epi-EcS-FP, XY (Z, 초장형, C/A) 또는 HCV코어-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4를 함께 9분 동안 인큐베이션시켜서 항원을 방출시킨 후에 동일한 어세이 완충액 R1 및 R2 (200 mM Tris, pH 7.0, 225 mM KCl, 0.5% 소듐 타우로데옥시콜레이트, 0.3% zwittergent 3-14, 0.1% 옥시피리온, 0.01% 메틸이소티아졸리논, 0.2% 소 혈청 알부민, 0.2% 소 IgG, 50 ㎍/mL MAK33-IgG1, 50 ㎍/mL MAK33-F(ab')2-Poly, 50 ㎍/mL MAK IgG2b/Fab2a-Poly) 중 2종의 상이한 항체-바이오틴 접합체 (1.5 ㎍/mL 및 0.9 ㎍/mL)의 혼합물 35 ㎕ 및 1.2 ㎍/mL의 검출 항체 루테늄 표지 접합체 40 ㎕를 첨가하였다. 추가 9분의 인큐베이션 시간 이후에, 50 ㎕의 스트렙타비딘-코팅된 상자성 미세입자를 첨가하였고 추가 9분 동안 인큐베이션시켰다. 이후에, HCV 코어 항원을 (이들 실험에서 발생된 전기화학발광 신호를 통해) 검출하였다.
도 1은 14일 동안 35℃ 스트레스 이후에 양쪽 재조합 HCV 코어 항원 (거의 전체 길이 재조합 HCV 코어 rec. HCV 코어 (2-169) 및 rec. HCV 코어-3Epi-EcS-FP)의 신호 회수율을 도시한다. 0일 (아직 열스트레스 없음)에, 양쪽 교정제의 비교를 위해, 양쪽 교정제의 신호는 100%로 설정한다. 그러나, 열 스트레스 기간 (교정제의 35℃ 인큐베이션) 동안, 다중-에피토프 융합 단백질을 포함하는 교정제는 코어 (2-169) 교정제보다 우수하다. rec. HCV 코어-3Epi-EcS-FP의 신호는 4일 후에 10% 미만으로 저하되었고 열 스트레스의 다음날 내내 안정한 채로 남아있었다. 본래 신호의 약 2/3까지 HCV 코어 (2-169)의 계속적인 신호 손실은 관찰된 기간 동안 훨씬 더 상당하였다. 이러한 상황은 교정제 및/또는 관리 물질을 함유하는 시약 키트를 부적절한 조건 하에서, 예컨대 더운 날씨 조건 하에 수송 동안 저장한 경우의 현실적인 조건을 반영한다. 또한 키트의 일부일 수 있는 교정제의 저장 수명이 증가된다. 안정성 이유로 다중-에피토프 융합 단백질 예컨대 rec. HCV 코어-3Epi-EcS-FP는 전체 길이 또는 전체 길이 근접 재조합 교정제 HCV 코어 (2-169)에 비해서 교정제 또는/및 관리 시약으로서 훨씬 더 적합하다.
표 1은 본 발명에 따른 다중-에피토프 융합 단백질이 "Cal2" (피분석물 유사체로서 350　pg/mL rec. HCV 코어-3Epi-EcS-FP를 함유하는 양성 교정제)로서 적용된 실시예 4에 기술된 면역어세이의 결과를 도시한다. "Cal1"은 임의의 HCV 항원을 함유하지 않는 음성 교정제 (풀링된 정상 샘플)이다. Cal2 교정제가 제공하는 신호는 정상 (음성) 샘플 풀에 대해 수득된 신호에 비해 약 12배 더 높아, 어세이가 양성 결과와 음성 결과를 구별할 수 있도록 우수한 측정 범위를 제공한다. "COI"는 컷-오프 지수를 의미하고 측정된 신호를 사전 결정된 컷-오프로 나누어 수득된 비율이다. 컷-오프는 양성 샘플로부터 음성 샘플을 구별하기 위한 한계치이다. 이러한 경우에, 컷-오프는 양성 교정제 Cal2의 평균 값에 0.2를 곱하여서 (표 1 참조), 그 결과 컷오프로서 2041 계측치를 생성시켜 결정된다. 계측치가 이 숫자 이하인 샘플은 음성으로 분류되고, 2041 계측치를 초과하는 샘플은 양성 (반응성 또는 감염) 샘플로서 분류된다.
측정 결과를 살펴보면, 정상 (음성) 샘플에 대해 수득된 값은 음성 (Cal 1) 교정제에 매우 근접한다. 모두 음성으로 검출된 혈액 공여자 샘플에 대해서도 동일하게 참이다. 다른 한편으로, 또한 양성 (HCV-감염) 샘플은 양성으로서 올바르게 검출된다. 달리 말하면, 본 명세서에 기술된 바와 같은 다중-에피토프 융합 단백질은 HCV 구조적 항원의 검출, 특히 HCV 코어 항원의 검출을 위한 면역어세이를 교정하기 위한 신뢰할만한 물질로서 제공된다.
도 2는 추가적인 다중-에피토프 융합 단백질 rec. HCV코어-3Epi-EcS-FP, XY(Z, 초장형, C/A) 및 rec. HCV코어-3Epi-EcS-FP,XY(Z)4로 확장시켜 도 1에 기술된 바와 같이 수행된 독립 실험의 결과를 도시한다. 일관적으로, 안정성 이유로 다중-에피토프 융합 단백질 예컨대 rec. HCV 코어-3Epi-EcS-FP, rec. HCV코어-3Epi-EcS-FP, XY(Z, 초장형, C/A) 및 rec. HCV코어-3Epi-EcS-FP,XY(Z)4는 전체 길이 또는 전체 길이 근접 재조합 교정제 HCV 코어(2-169)보다 교정제 또는/및 관리 시약으로서 훨씬 더 적합하다.
표 2는 표 1에 대해 기술되고, 본 발명에 따른 추가의 다중-에피토프 융합 단백질이 "Cal2" (피분석물 유사체로서 400 pg/mL rec. HCV코어-3Epi-EcS-FP, XY(Z,초장형, C/A) 또는 520 pg/mL rec. HCV코어-3Epi-EcS-FP,XY(Z)4를 함유하는 양성 교정제)로서 적용된 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행된 독립 실험의 결과를 보고한다. rec. HCV코어-3Epi-EcS-FP 이외에도 다중-에피토프 융합 단백질 rec. HCV코어-3Epi-EcS-FP, XY(Z, 초장형, C/A) 및 rec. HCV코어-3Epi-EcS-FP,XY(Z)4는 또한 HCV 구조적 항원의 검출, 특히 HCV 코어 항원의 검출을 위해 면역어세이를 교정하기 위한 신뢰할만한 물질로서 제공된다.
표 1: 다중-에피토프 융합 단백질로 교정된, 정상, 혈액 공여자 및 HCV 양성 샘플의 데이터
Figure pct00008
표 2: 추가 다중-에피토프 융합 단백질로 교정된, 정상, 혈액 공여자 및 HCV 양성 샘플의 데이타
Figure pct00009
<110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics Operations, Inc. <120> Multi-epitope fusion protein of an HCV antigen and uses thereof <130> P34291-WO-IR <150> EP17183523.4 <151> 2017-07-27 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 1 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala 180 185 190 <210> 2 <211> 192 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 2 Tyr Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr 20 25 30 Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp 35 40 45 Val Ala Met Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ala 50 55 60 Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu 65 70 75 80 Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val 85 90 95 Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Gly 100 105 110 Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala 115 120 125 Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Met Ala 130 135 140 Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala 145 150 155 160 His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn 165 170 175 Trp Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala 180 185 190 <210> 3 <211> 363 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 3 Glu Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly His Thr Val Ser Gly Phe 1 5 10 15 Val Ser Leu Leu Ala Pro Gly Ala Lys Gln Asn Val Gln Leu Ile Asn 20 25 30 Thr Asn Gly Ser Trp His Leu Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp 35 40 45 Ser Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr His His Lys Phe 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Pro Leu Thr 65 70 75 80 Asp Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly 85 90 95 Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys Gly 100 105 110 Ile Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro 115 120 125 Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr 130 135 140 Ser Trp Gly Glu Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg 145 150 155 160 Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly 165 170 175 Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Ala Gly 180 185 190 Asn Asn Thr Leu His Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Asp 195 200 205 Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys 210 215 220 Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn 225 230 235 240 Tyr Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg 245 250 255 Leu Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu 260 265 270 Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Thr Thr Thr Gln 275 280 285 Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr 290 295 300 Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr 305 310 315 320 Gly Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val 325 330 335 Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu 340 345 350 Trp Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala 355 360 <210> 4 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV core 3-epitopes calibrator <400> 4 Met Arg Gly Ser Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro 1 5 10 15 Glu Gly Arg Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Met Lys Val Ala Lys 20 25 30 Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr Gln Val Arg Thr Glu Asp Gly Val 35 40 45 Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu Asp Tyr Leu His Gly 50 55 60 His Gly Ser Leu Ile Ser Gly Leu Glu Thr Ala Leu Glu Gly His Glu 65 70 75 80 Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala Val Gly Ala Asn Asp Ala Tyr Gly 85 90 95 Gln Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gln Arg Val Pro Lys Asp Val Phe Met 100 105 110 Gly Val Asp Glu Leu Gln Val Gly Met Arg Phe Leu Ala Glu Thr Asp 115 120 125 Gln Gly Pro Val Pro Val Glu Ile Thr Ala Val Glu Asp Asp His Val 130 135 140 Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gln Asn Leu Lys Phe Asn 145 150 155 160 Val Glu Val Val Ala Ile Arg Glu Ala Thr Glu Glu Glu Leu Ala His 165 170 175 Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His Asp His Asp His Asp 180 185 190 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro 195 200 205 Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser 210 215 220 Gly Gly Gly Met Lys Val Ala Lys Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Val Arg Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser 245 250 255 Ala Pro Leu Asp Tyr Leu His Gly His Gly Ser Leu Ile Ser Gly Leu 260 265 270 Glu Thr Ala Leu Glu Gly His Glu Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala 275 280 285 Val Gly Ala Asn Asp Ala Tyr Gly Gln Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gln 290 295 300 Arg Val Pro Lys Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gln Val Gly 305 310 315 320 Met Arg Phe Leu Ala Glu Thr Asp Gln Gly Pro Val Pro Val Glu Ile 325 330 335 Thr Ala Val Glu Asp Asp His Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu 340 345 350 Ala Gly Gln Asn Leu Lys Phe Asn Val Glu Val Val Ala Ile Arg Glu 355 360 365 Ala Thr Glu Glu Glu Leu Ala His Gly His Val His Gly Ala His Asp 370 375 380 His His His Asp His Asp His Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala 385 390 395 400 His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn 405 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Ala Ile Arg Glu Ala Thr Glu Glu Glu Leu Ala His 165 170 175 Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His Asp His Asp His Asp 180 185 190 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro 195 200 205 Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Gly Gly Gly Ser 210 215 220 Gly Gly Gly Met Lys Val Ala Lys Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Val Arg Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser 245 250 255 Ala Pro Leu Asp Tyr Leu His Gly His Gly Ser Leu Ile Ser Gly Leu 260 265 270 Glu Thr Ala Leu Glu Gly His Glu Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala 275 280 285 Val Gly Ala Asn Asp Ala Tyr Gly Gln Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gln 290 295 300 Arg Val Pro Lys Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gln Val Gly 305 310 315 320 Met Arg Phe Leu Ala Glu Thr Asp Gln Gly Pro Val Pro Val Glu Ile 325 330 335 Thr Ala Val Glu Asp Asp His Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu 340 345 350 Ala Gly Gln Asn Leu Lys Phe Asn Val Glu Val Val Ala Ile Arg Glu 355 360 365 Ala Thr Glu Glu Glu 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Gly Gly Ser Gly Gly Gly His His His His His 500 505 510 His

Claims (15)

  1. C형 간염 바이러스 (HCV) 코어 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 2 내지 6종의 상이한 비중복 선형 펩티드를 포함하는 다중-에피토프 융합 단백질로서, 각각의 상기 펩티드는 상기 다중-에피토프 융합 단백질에 1 내지 5배로 존재하고 각각의 상기 상이한 펩티드는 샤페론 아미노산 서열을 포함하는 비-HCV 아미노산 서열로 이루어진 스페이서에 의해 다른 상기 펩티드로부터 분리되고, 추가의 HCV 특이적 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드에 부재하는 것인 다중-에피토프 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HCV 코어 단백질은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 상응하는 것인 다중-에피토프 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 상기 2 내지 6종의 선형 펩티드는 5 내지 50개 아미노산, 일 실시형태에서 5 내지 31개 아미노산, 일 실시형태에서 5 내지 25개 아미노산, 일 실시형태에서 7 내지 21개 아미노산, 일 실시형태에서 15 내지 21개 아미노산, 일 실시형태에서 15 내지 30개 아미노산, 일 실시형태에서 15 내지 65개 아미노산의 길이를 갖는 것인 다중-에피토프 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCV 코어 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 3종의 상이한 선형 펩티드는 상기 다중-에피토프 융합 단백질의 일부인 것인 다중-에피토프 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3종의 상이한 선형 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 55 내지 80, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 90 내지 120, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 145 내지 175 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함하는 것인 다중-에피토프 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 식을 갖는 것인 다중-에피토프 융합 단백질:
    X - 스페이서 - Y - 스페이서 - Z
    [상기 식에서, X, Y 및 Z는 HCV 코어 단백질에 존재하는 상이한 비중복 선형 아미노산 서열을 나타내고, Z는 1 내지 5배로 존재하며, 스페이서는 샤페론 아미노산 서열을 포함하는 비-HCV 아미노산의 서열을 나타냄].
  7. 제6항에 있어서, X는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 55 내지 80 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함하고, Y는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 90 내지 120 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함하며, Z는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 145 내지 175 내에 존재하는 선형 아미노산 서열을 포함하는 것인 다중-에피토프 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 적어도 25개의 비-HCV 아미노산의 서열, 일 실시형태에서 적어도 100개, 일 실시형태에서 적어도 150개, 일 실시형태에서 적어도 200개, 일 실시형태에서 25 내지 200개의 비-HCV 아미노산의 서열을 포함하는 것인 다중-에피토프 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 4 내지 6 중 어느 하나로 이루어지는 것인 다중-에피토프 융합 단백질.
  10. 가용성 다중-에피토프 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 다중-에피토프 융합 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자가 작동적으로 연결되어 포함된 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포를 배양하는 단계,
    b) 상기 폴리펩티드의 발현 단계, 및
    c) 상기 폴리펩티드의 정제 단계
    를 포함하는 것인 제조 방법.
  11. HCV 코어 항원의 검출을 위한 시험관내 진단 검사에서 교정제 및/또는 관리 물질로서의, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 HCV 코어 항원의 아미노산 서열을 포함하는 다중-에피토프 융합 단백질의 용도.
  12. 면역어세이에서 HCV 코어 항원을 검출하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 다중-에피토프 융합 단백질이 교정제 및/또는 관리 물질로서 사용되는 것인 검출 방법.
  13. HCV 코어 항원의 검출을 위한 시약 키트로서, 적어도 하나의 HCV 코어 항원-특이적 결합제 및 교정제 물질로서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 다중-에피토프 융합 단백질을 개별 용기 또는 단일 용기의 개별 구획에 포함하는 것인 시약 키트.
  14. 제13항에 있어서, 적어도 2종의 HCV 코어 항원-특이적 결합제를 포함하고, 상기 적어도 2종의 HCV 코어 항원-특이적 결합제 중 하나는 검출가능하게 표지되는 것인 시약 키트.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 미세입자를 추가로 포함하는 것인 시약 키트.
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