KR102570713B1 - SARS-CoV-2 감염의 진단을 위한 방법 및 시약 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 대상체로부터 유래한 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 감염의 진단을 위한 방법, 코로나바이러스 감염의 감별 진단을 위한 방법, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체의 SARS-CoV-2 감염을 진단하기 위한 용도, 또는 코로나바이러스 감염의 감별 진단을 위한 용도, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염과, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1 감염을 구별하기 위한 용도와, 바람직하게는 진단상 유용한 담체에 코팅된 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드와, 서열 번호 1에 대한 항체, 세척 완충제, 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체와 특이적으로 결합하는 2차 항체, 바람직하게는 검출가능 표지를 포함하는, IgA 군 항체와 특이적으로 결합하는 2차 항체의 존재를 검출하기 위한 수단, 그리고 희석 완충제를 포함하는 군의 시약 1가지 이상, 바람직하게는 모두를 포함하는 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 대상체로부터 유래한 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 감염의 진단을 위한 방법, 코로나바이러스 감염의 감별 진단을 위한 방법, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체의 SARS-CoV-2 감염을 진단하기 위한 용도, 또는 코로나바이러스 감염의 감별 진단을 위한 용도, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염과, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1 감염을 구별하기 위한 용도와, 바람직하게는 진단상 유용한 담체에 코팅된 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드와, 서열 번호 1에 대한 항체, 세척 완충제, 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체와 특이적으로 결합하는 2차 항체, 바람직하게는 검출가능 표지를 포함하는, IgA 군 항체와 특이적으로 결합하는 2차 항체의 존재를 검출하기 위한 수단, 그리고 희석 완충제를 포함하는 군의 시약 1가지 이상, 바람직하게는 모두를 포함하는 키트에 관한 것이다.
2019년 말, 중국 후베이성 수도인 우한으로부터 중국 거의 전역에 미지의 병원체에 의한 폐렴 환자 수가 급증하였다. 신종 코로나바이러스가 단리되었는데, 코로나바이러스 연구 그룹(Coronavirus Study Group; CSG)은 이 신종 코로나바이러스의 계통발생, 분류학 및 관습을 기반으로 이 바이러스가 중증 급성 호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-1)와 동종계통임을 알아내고, 제2형 중증 급성 호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2)라 명명하였다. SARS-CoV-2는 보통 SARS-CoV-1과 중동 호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)보다 병원성이 약하지만, 전파력은 비교적 크다. 증상들은 경증일 수 있으며, 감기와 혼동될 수 있으므로, 환자들은 자신이 감염되었음을 인지하지 못할 수 있고, 이 점은 바이러스를 더 널리 확산시키는데 일조할 수 있다는 위험이 있다.
SARS-CoV-2는 4가지 주요 구조 단백질, 구체적으로 스파이크 (S), 외피(envelope) (E), 막(M) 및 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 가지는 코로나바이러스이다. N 단백질은 RNA 게놈을 둘러싸고 있는 단백질인 반면, 이 N 단백질 이외의 구조 단백질 3가지는 바이러스 외피의 구성성분이다. S 단백질은 바이러스가 숙주 세포의 막에 부착하여 이에 융합되는 것을 허용하는데 관여한다. 이 S 단백질은 부착을 매개하는 S1 도메인과, 바이러스 세포막과 숙주 세포의 융합을 매개하는 S2 도메인을 포함한다. S1 도메인은 수용체 결합 도메인(RBD), 즉 인간 숙주 세포의 수용체 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)와의 결합 부위를 포함한다. 따라서, RBD는 바이러스와 이의 숙주 세포간 상호작용을 차단하여 면역성을 제공하는 중화 항체의 결합 부위이다. 높은 사망률 및 중증의 질병과 연관된 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2와 대조되게, 경증 및 앓고 지나가는 정도의 질병과 연관된 기타 코로나바이러스, 예컨대 코로나바이러스 229E, NL63, OC43 및 HKU1도 존재한다. 이러한 코로나바이러스는 특히 어린이들 사이에서 발생하는 흔한 감기(common cold)와 종종 연관되어 있다.
SARS-CoV-2의 큰 전파력과 건강에 미치는 영향으로 말미암아 SARS-CoV-2 감염의 진단을 위한 방법으로서 신뢰할 수 있는 방법은 다른 무엇보다 중요하다. 과거에는 코로나바이러스 감염을 검출 및 확인하기 위해 혈청학적 방법과 실시간 전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 방법이 병행되었다.
RT-PCR 방법은 관심 코로나바이러스의 핵산, 더욱 구체적으로 바이러스 리보핵산(RNA) 1개 이상의 검출을 기반으로 한다. RT-PCR 기반 방법은 인후 또는 비인두 면봉 시료를 기반으로 하는 방법으로서, 신속하고, SARS-CoV-2 검출을 위해 질병 발생 1주차 동안에 이용될 수 있다. 그러나 이 방법의 유용성은 시료내 핵산이 얼마나 오랫동안 검출될 수 있는지(바이러스마다 차이가 남)에 매우 많이 의존한다. 특히 질환의 조기 단계에 수득된 시료를 대상으로 한 진단 테스트로부터 얻어진 음성 결과는 무의미할 수 있다. 더군다나, 보통 환자의 상기도로부터 유래한 시료가 필요하다. 이러한 시료의 부적당하거나 불충분한 회수, 오랜 운반 시간 및 이와 연관된 바이러스 RNA의 분해(degradation), 또는 기기의 오작동은 위음성 결과를 초래할 수도 있다. 그러므로 감염 1주차에 수득한 시료 하나와, 감염후 3주차~4주차에 수득한 추적 검사용 시료와 같이, 여러 번의 시료 검사가 이루어져야 한다.
Corman외 다수는, SARS-CoV-2 검출을 위한 실시간 RT-PCR 기반 검정을 발표하였다(Corman VM, Landt O, Kaiser M, et al. “Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR”. Euro Sun/eill. 2020;25(3):2000045.doi:10.2807/1560-7917. ES.2020.25.3.2000045; 2020년 1월 WHO 웹페이지에 처음 발표).
혈청학적 테스트도 또한 자주 사용된다. 이 테스트는, 어떤 바이러스 특이 항원에대해 생성된 항체를 검출하는 것을 기반으로 한다. 그러나, 혈청학적 검정은 또한 다음과 같은 심각한 단점이 있다:
자주 관찰되는 한 가지 문제점은, 양성 결과를 수득하기 위한 혈청학적 검정을 수행함에 있어 환자의 혈액 중 바이러스-항원 특이 항체가 존재해야 하는 것과 같이 민감도에 제한이 따른다는 점이다. 일반적으로 새로운 바이러스에 감염된 후 항체가 처음 생산되어 검출가능하게 되는 시점은 예측 불가능한데, 그 이유는 이 시점이 바이러스 자체, 바이러스 균량, 즉 소정량의 환자 혈액 중 바이러스의 양, 환자와 관련된 요인, 예컨대 연령, 성별, 건강 상태, 면역 상태 등, 관심 항체의 면역글로불린군, 그리고 진단 검사를 확립하기 위해 선택된 항원 표적을 비롯한 여러가지 요인들에 의존적이기 때문이다. 특히, 질환의 아주 조기 단계, 즉 환자의 신체가 특이 항체 반응을 검출가능한 수준으로 증가시킬 수 있게 되기 전에는, 감염이 되었음에도 불구 혈청학적 검정은 음성의 결과를 보일 수 있다. 검출하고자 하는 항체가 어떤 면역글로불린(Ig) 군에 속하는지가 고려되었을 때, 추가의 혈청학적 테스트는 질환의 진행경과를 모니터링하고, 과거 감염 병력 또는 백신접종 여부와 급성을 구별하는 것을 도울 수 있다. 그러므로 SARS-CoV-1 감염을 비롯한 바이러스 감염 검출에 현재 이용 가능한 대부분의 혈청학적 검정은 IgG군 항체, 또는 IgG군 및 IgM군 항체의 검출에 중점을 두고 있다. 그러나 항체 반응 고유의 지연으로 말미암아, 특히 감염의 아주 조기 단계에 위음성 결과가 얻어진다는 혈청학적 검정의 위험성 이외에도, SARS-CoV-1 감염을 진단하기 위한 혈청학적 검정은 또한 위양성 결과가 얻어지는 경향이 있는데, 이는 아마도 흔한 계절성 코로나바이러스(CoV)에 대한 항체 모집단에 있어 혈청학적 유병률이 높고, 이와 관련하여 면역원성 바이러스 단백질의 보존적 부분에 대해 생성된 교차 반응성 항체가 존재하기 때문일 것이다. 이처럼 항원의 측면에서 매우 밀접하게 관련되어 있는 계절성 코로나바이러스에 대한 이와 같은 교차 반응성은 또한 감별 진단, 예컨대 생명을 위협하는 SARS-CoV-1 변이체를 기타 코로나바이러스와 감별하지 못하게 만들었다. 코로나바이러스의 진단 및 감별, 특히 SARS-CoV-1의 진단을 위한 혈청학적 검정의 난관과 이에 따른 어려움은 문헌[Meyer, Drosten & Miiller, Virus Research 194 (2014); 175-186]에서 검토된 바 있다. 이처럼 조기 코로나바이러스의 혈청학적 진단과 연관된 여러 가지 난관(예컨대 감염 조기 단계에서의 민감도 저하 및 교차 반응성 항체의 존재로 말미암아 유발되는 특이성 저하)은 또한 최근 출현한 중증 급성 호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)의 검출을 위한 진단 검정의 개발에도 적용된다.
최근 진행중인 글로벌 SARS-CoV-2 팬데믹에 의해 현재 제기되는 심각한 위협과, 이 SARS-CoV-2 감염을 진단하는데 이용 가능한 검정의 전술된 문제점들에 비추어 볼 때, 표적화도와 바이러스 특이성이 더 커서 더욱 유효한 치료를 가능하게 만들기 위한, SARS-CoV-2 감염의 진단, 특히 SARS-CoV-2 감염의 조기 진단과, 기타 코로나바이러스 감염, 예컨대 흔한 계절성 코로나바이러스 감염과 SARS-CoV-2 감염의 감별을 위한 것으로서, 개선된 수단과 방법, 특히 민감도와 특이성이 더 커서 더욱 신뢰할 수 있는 수단과 방법이 절실히 필요한 실정이다.
본 발명은, 이처럼 전술된 단점들을 극복한 진단 수단 및 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 해결한다.
특히 본 발명은 제한하려는 의도없이 이하 문제점들을 해결한다: 본 발명이 해결하고자 하는 한 가지 문제는 SARS-CoV-2의 조기 혈청학적 검출을 위한 검정 및 시약을 제공하는 것이다. 이는, 음성 PCR 결과가 수득되었더라도 환자가 여전히 활동성 질환을 앓고 있고 전염성이 있을 수 있으므로 특히 중요하다. 질병통제예방센터(CDC)는 증상이 발현된 후 길어야 10일 동안, 중증 질환의 경우 최장 20일 동안 환자는 격리 상태를 유지할 것을 권고하고 있음에 주의한다.
본 발명에 의해 해결되는 또 다른 문제는, 공지의 코로나바이러스 감염, 특히 SARS-CoV-2 감염을, 기타 코로나바이러스 감염, 바람직하게는 경증의 감기 증상과 유사한 증상과 연관된 코로나바이러스 또는 기타 병원체 감염과 구별하거나, 또는 이러한 증상의 원인과 구별하는 데 사용될 수 있는 검정을 제공하는 것이다. 바람직하게는 감염은 조기 단계에 구별될 수 있다.
본 발명에 의해 해결되는 또 다른 문제는, 특히 민감도 및/또는 특이성, 바람직하게는 민감도와 관련하여 신뢰성이 고도로 최적화된 검정을 제공하는 것이다.
본 발명에 의해 해결되는 또 다른 문제는, SARS-CoV-2 N 단백질에 대한 항체가 없거나 IgM군 항체가 없는 환자에 대해 고감도 검정을 제공하는 것이다.
본 발명에 의해 해결되는 또 다른 문제는 고감도가 오랫동안 지속되는 검정을 제공하는 것이다.
코로나바이러스 감염을 진단하기 위한 이전의 검정들은, 예컨대 이하 문헌에 기재되어 있는데; WO2014/045254에는 바이러스의 단백질성 항원에 대한 항체가 시료 중에서 검출되는 혈청학적 검정을 비롯한 중동 호흡기증후군 관련 코로나바이러스(MERS-CoV) 감염을 진단하기 위한 검정이 개시되어 있다. 그러나 이러한 검정에 대한 실질적 증거는 보이지 않는다. US2005/0112559에는 SARS-CoV-1 관련 방법 및 제제가 개시되어 있다. 뉴클레오캡시드(N) 단백질은 주요 진단 항원으로 간주된다. W02005/118813에는 SARS-CoV-1 관련 S 단백질의 변이체와, 시료 중 이의 존재 또는 이것과 결합하는 항체의 존재를 검출하는 방법이 개시되어 있다. US2006/0188519에는 SARS-CoV-1 감염을 진단하기 위한 펩티드가 개시되어 있다. Hsueh외 다수는, SARS-CoV-1 감염된지 4일만에 IgG가 검출될 수 있었음을 보고하였는데, 이 기간은 IgM 및 IgA 검출시기와 동일하거나 1일 빠르다(Hsue, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L., and Yang P. C. (2004) “Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus”, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066). Reusken외 다수는, 특이적이지만 반드시 민감한 것은 아닌 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 단편에 대한 항체 검출법을 개시하였다(“Specific serology for emerging human corona-viruses by protein microarray.” Euro Surveill. 2013;18(14)). Yu외 다수는, 특이 항원을 지적하지는 않았지만, 면역학적 방법이 SARS-CoV-2 감염을 검출하기 위해 사용될 수 있는데, 다만 민감도와 특이성이 떨어지는 문제가 있음을 개시하였다(Yu et al. (2020) “Measures for diagnosing and treating infections by a novel coronavirus responsible for a pneumonia outbreak originating in Wuhn, China, Microbes and Infection 22” (2020), 74-79).
상기 언급된 문제들은 본 발명의 설명과 특허청구범위에 기재된 바와 같이 본 발명에 의해 해결된다.
제1 양태에서, 본 발명은 대상체로부터 유래한 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgM, IgG 및/또는 IgA 군(class) 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 진단을 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 설명 전반에 걸쳐 서열 번호가 언급될 때마다 이 서열 번호는 아미노산 서열을 지칭하는 것이고, 이에 연결되는 “폴리펩티드”라는 용어가 구체적으로 언급되지 않더라도 상기 서열 번호에 대응하는 아미노산 열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하도록 의도된다. “를 포함하는”이란 용어는, 본 발명과 관련하여 두 가지 의미, 즉 “~를 함유하는” 및 “~으로 이루어진”의 의미를 가진다.
제2 양태에서, 본 발명은 코로나바이러스 감염의 감별 진단을 위한 방법, 바람직하게는 SARS-CoV, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염과, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1 감염의 구별을 위한 방법으로서, 대상체로부터 유래한 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 서열 번호 1에 대한 IgG 및/또는 IgM 군 항체의 존재는 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체에 더하여 검출된다.
본 발명에 따르면, “대상체” 또는 본원에서 이와 호환되어 지칭되는 “환자”란, 포유동물, 바람직하게는 인간을 지칭하지만, 대안적으로는 상이한 포유동물, 예컨대 인간 이외의 영장류 또는 기타 포유동물, 심지어는 포유동물이 아닌 동물이되, 서열 번호 1 또는 이의 변이체에 대한 항체를 생성할 수 있는 동물을 지칭할 수도 있다.
본 발명에 따르면, 대상체로부터 유래한 “시료”란 용어는, 상기 대상체의 임의의 체액 또는 조직과 같은 시료로서, 항체를 포함할 수 있는 시료일 수 있다. 예시적 체액으로서는, 예컨대 혈액, 타액, 비강 점액 또는 림프액을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 시료는 혈액 시료, 바람직하게는 전혈, 혈청, 혈장, 모세혈(capillary blood), 동맥혈, 정맥혈 또는 이의 임의의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈액 시료이다. 모세혈은, 바람직하게는 환자에 의해 생산되어, 실험실로 보내어진 후, 추출되어 건조된 혈액의 블럿 점(blot spot) 형태이다. 당 업자는 본원에 개시된 방법의 목적에 적합한, 대상체로부터 시료를 수득하는데 사용될 수 있는 다양한 수단과 방법, 물품 및 이의 용도, 그리고 이에 필요한 양을 알고 있다. 임의의 구현예에서, 시료는 전문의에 의해 대상체로부터 수득될 수 있는 반면에, 기타의 경우, 시료는, 예를 들어 최소한의 침습 수단, 예컨대 혈액 채취를 위한 손가락 채혈(finger pricking) 수단(“손가락 채혈용 스틱(finger-stick blood)”)을 이용하여 대상체 자신에 의해 수득될 수 있다.
본원에 개시된 본 발명의 목적을 위해 시료는 단일 대상체, 즉 단일 개체로부터 기원할 수 있지만, 대안적으로 하나를 초과하는 대상체로부터 유래한 시료도 포함할 수 있고, 하나를 초과하는 대상체로부터 유래한 상기 시료는 단일 시료로 풀링(pooling)될 수 있음이 이해된다. 예를 들어 임의의 경우, 대상체들(에컨대 보통의 가족 구성원, 학급 구성원, 스포츠팀 구성원 또는 회사내 동일 부서 구성원)의 군으로부터 유래한 시료를 포함하는, 풀링된 시료를 우선 분석하고, 서열 번호 1 또는 이의 변이체에 대한 항체의 존재를 검출하는 경우에만, 개별 대상체들로부터 유래한 시료를 별도 검정하는 2차 분석을 수행하는 것이 자원과 실험 시간의 관점에서 더욱 유효할 수 있다.
본 발명에 따른 다양한 방법과 용도가 본원에 기재된 바와 같은 대상체로부터 유래한 시료로 수행 및 구현될 수 있다. 이러한 방법 또는 용도는 또한 “시험관내” 방법 또는 “시험관내” 용도로서 특징지어질 수 있다.
본 발명에 따르면, “2차 항체”란 용어는 최광의로서 임의의 종류의 “결합기(binding moiety)”, 바람직하게는 IgA, IgG 및/또는 IgM 군 항체 또는 이것들의 단편, 예컨대 선택된 종, 바람직하게는 인간 종의 특정 Ig 군 불변 도메인과 특이적으로 결합할 수 있는 결합 단백질을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 결합기의 비제한적 예로서는 항체, 예컨대 임의의 종, 예컨대 인간, 닭, 낙타, 라마, 칠성장어, 상어, 염소, 설치류, 소, 개, 토끼 등으로부터 유전적으로나 면역학적으로 유도된 항체, 이의 항체 단편, 도메인 또는 일부, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, scFab, Fv, scFv, VH, VHH, VL 및 VLR 등, 다이아바디(diabodies), 모노클로날 항체(mAb), 폴리클로날 항체(pAb), mAbdAb, 파아지 전시 유도 결합제(phage display-derived binders), 아피바디, 헤테로컨쥬게이트 항체, 이중 특이적 항체, 에비바디(evibodies), 리포칼린(lipocalins), 안티칼린(anticalins), 아피바디(affibodies), 아비머(avimers), 맥시바디(maxibodies), 열 충격 단백질, 예컨대 GroEL 및 GroES, 트랜스-바디, DARPins, 앱타머, C형 렉틴 도메인, 예컨대 테트라넥틴; 인간 Y-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴-유도 결합제, 예컨대 아필린(affilins), PDZ 도메인-유도 결합제; 전갈 독 및/또는 쿠니츠(Kunitz)형 도메인 결합제, 피브로넥틴 유도 결합제, 예컨대 아드넥틴, 수용체, 리간드, 렉틴, 스트렙타비딘, 비오틴, 예컨대 이의 유도체 및/또는 조합, 예컨대 이들 결합 분자 중 2개 이상으로 형성된 이중 특이적/다중 특이적 포맷을 포함한다. 항체로부터 유래한 것 다수 및 대안적(즉 비-항체) 결합 단백질 스캐폴드(scaffold)를 비롯한 다수의 것의 제조 방법은 당 분야에 공지되어 있다(예컨대 문헌(Chiu ML외 다수 공저, Antibodies (Basel), (2019);8(4):55; Simeon R. & Chen Z., Protein Cell. (2018);9(1):3-14; 및 Stefan Diibel 편저 Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007)의 Chapter 7)에 검토되어 있음).
이러한 유형의 분자 모두는 당 분야에 공지되어 있다. 몇몇 예들이 이하 본원에 더욱 상세히 기재되어 있다.
“에비바디”는 T-세포 표면 수용체 세포독성 T 림프구 연관 항원 4(CTLA-4)의 가변(V) 세트 Ig 유사 스캐폴드로부터 유래한 조작 결합 단백질이다. 항체 CDR에 대응하는 루프는 이종 서열로 치환될 수 있으며, 그 결과 상이한 결합 특성이 제공된다. 에비바디를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 제7,166,697호에 기재되어 있다.
“리포칼린”은 소수성의 소형 분자, 예컨대 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질을 운반하는 세포외 단백질의 한 과이다. 리포칼린은 상이한 표적 항원과 결합하도록 조작될 수 있는 것으로서, 루프 다수가 원추형 구조의 개방 말단에 있는 견고한 베타 시트형 2차 구조를 가진다. 본 발명에 따르면 “아필린”이라고도 칭하여지는 “안티칼린”은 크기가 160개~180개 아미노산이며, 리포칼린으로부터 유래한다(Rothe C & Skerra A., BioDrugs. (2018);32(3):233-243; Gebauer M & Skerra A, Curr Opin Biotechnol. (2019); 60:230-241).
“아피바디”는 스타필로코커스 단백질 A의 Z 도메인으로부터 유도되는 항체 모의체의 한 과이다. 아피바디는 구조상 삼중 나선체 묶음 도메인을 기반으로 한다. 아피바디의 분자 질량은 약 6 kDa이고, 고온과 산성 또는 알칼리성 조건하에서 안정적이다. 표적 특이성은 모 단백질 도메인의 결합 활성에 관여하는 알파 나선체 2개의 내부에 위치하는 아미노산들의 무작위화에 의해 수득된다(Feldwisch, J & Tolmachev, V. (2012) Methods Mol. Biol. 899:103-126). 아피바디를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 문헌(Wikman M et al., Protein Eng Des Sel.(2004);17(5):455-62)에 기재되어 있다.
결합활성 다량체(avidity multimer)의 축약어인 “아비머”는 다수의 결합 부위를 통해 임의의 항원과 특이적으로 결합하는 인공 다중 도메인 단백질의 한 군이다. 이 단백질은 또한 “맥시바디” 또는 저밀도 지단백 수용체(LDLR) 도메인 A라고도 공지되어 있다. 이는, A 도메인을 기반으로 하는 (폴리)펩티드 서열 2개 이상으로 이루어져 있다. A 도메인은 세포외 시스테인 풍부 세포 표면 수용체 단백질로부터 유래하고, 칼슘 이온 생성 및 착화를 위해 이황화 결합에 의해 안정화되는, 30개~35개 아미노산 스캐폴드(약 4 kDa)이다. 이 스캐폴드 구조는, 남아있는 비 보존 잔기 모두는 무작위화 및 리간드 결합에 순응하도록 남겨둔 채, 보존된 아미노산 12개에 의해 유지된다. 아비머는 열 안정성이 매우 크다. 아비머는 크기가 작은 관계로 종종 다수의 A 도메인으로 이루어져 형성되고, 이때 A 도메인 각각은 표적상 상이한 부위와 결합함으로써, 결합활성을 통한 친화성 증가가 달성된다(Silverman J et al. (2005), Nat Biotechnol 23:1556-1561).
“DARPin”은 디자인된 안키린 반복 도메인으로서, 조밀하게 팩킹된 안티린 반복부를 기반으로 하는데, 이 경우 안키린 반복부 각각은 β턴(β-turn)과 역평행 α-나선체 2개를 형성한다. DARPin은 보통 인공 공통 서열에 대응하는 반복부 3개를 운반하므로, 단일 반복부는 통상 33개의 아미노산으로 이루어지는데, 이들 중 6개는 결합 표면을 형성한다. 이 부위는 재조합체 라이브러리 디자인 중 무작위 아미노산 코돈들을 도입하는데 사용된다. DARPin은 통상 소수성 영역을 차폐하는 N-말단 모티프 및 C-말단 모티프 사이에 함유된 결합 모티프들 중 2개 또는 3개에 의해 형성된다. DARPin은 열 안정성이 매우 크고 프로테아제 및 변성제에 저항성이 큰 소형 단백질(약 14 kDa~18 kDa)이다(Pliickthun A., Annu Rev Pharmacol Toxicol. (2015);55:489-511).
“쿠니츠형 도메인 결합제”는 쿠니츠형 프로테아제 억제제, 예컨대 아프로티닌(소 췌장 트립신 억제제), 알츠하이머(Alzheimer) 아밀로이드 전구체 단백질 및 조직 인자 경로 억제제의 활성 모티프로부터 유래하는, ~60개 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드(약 7 kDa)이다. 쿠니츠 도메인의 소수성 코어는 이황화 결합쌍 3개에 의해 안정화된, 꼬인 두 가닥 역평행 β-시트 및 α-나선체 2개로 구성되어 있다. 루프 3개에 있는 잔기들은 구조 틀을 불안정하게 만들지 않고 치환될 수 있다(Hosse RJ et al. (2006). Protein Sci 15:14-27; Simeon R. & Chen Z. Protein Cell. (2018);9(1) :3-14).
“아드넥틴(Adnectins)”은 인간 피브로넥틴 III형(FN3)의 반복 단위 15개 중 10번째 도메인의 천연 아미노산 서열 주쇄로 이루어진 스캐폴드를 가지는 결합 단백질의 한 군이다. 이 분자는, 면역글로불린 도메인과 유사하게, 7개 가닥이 루프 6개로 연결되어 있지만 그 어떠한 이황화 결합도 가지지 않는, β-샌드위치 폴딩(folding)을 채택한다. β-샌드위치의 한쪽 말단에 있는 루프 3개는, 아드넥틴이 관심 표적을 특이적으로 인지할 수 있도록 조작될 수 있다. 비 루프 잔기도 또한 가용 결합 발자국(binding footprint)을 확장시키는 것이 확인되었다. 결합 친화성이 나노몰에서 피코몰 범위인 리간드 결합 아드넥틴 변이체가 mRNA, 파아지 및 효모 전시를 통해 선택되었다(Hackel BJ, et al. (2008) J Mol Biol 381 :1238-1252).
원하는 표적 구조, 예컨대 IgA 및/또는 IgG 군 항체에 대해 다양한 스캐폴드를 가지는 적합한 결합 분자, 예컨대 본원에 전술된 분자들(이에 한정되는 것은 아님)의 개발, 스크리닝 및 동정을 위한 수단과 방법이 당 분야에 공지되어 있고, 통상 사용되고 있다. 현재 통상적으로 수행되는 방법의 예로서는 고처리량(HT) 조합 라이브러리 기반 전시(display) 및 선택 방법, 예컨대 파아지 전시, 리보좀 전시, mRNA 전시 및 세포 표면 전시(예컨대 효모 전시)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 2차 항체는 인간 이외의 종에서 생성된 면역글로불린(Ig), 바람직하게는 IgG로서, 상기 2차 항체는 선택된 다른 종, 바람직하게는 인간 종의 특정 Ig 군들 중 1가지 이상의 면역글로불린 또는 이것들의 단편(예컨대 특정 Ig 군의 불변 도메인)과 특이적으로 결합한다. 염소에서 생성된 폴리클로날 항체로서, 인간 IgA를 특이적으로 인지하는 폴리클로날 항체(즉 폴리클로날 염소 항 인간 IgA 항체)가 그 예이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 2차 항체는 선택된 다른 종, 바람직하게는 인간 종의 특정 Ig 군들 중 1가지 이상의 면역글로불린 또는 이의 단편(예컨대 특정 Ig 군의 불변 도메인)과 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체이다. 선택된 표적 항원 1가지 이상과 특이적으로 결합할 수 있는 (모노클로날 또는 폴리클로날) 항체를 제조하기 위한 수단과 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
임의의 구현예에서, 2차 항체는 Ig 항체 군들 중 단 1가지, 단 2가지 또는 3가지 모두, 즉 IgA, IgG 및/또는 IgM과 특이적으로 결합하도록 선택될 수 있다. 임의의 구현예에서, 단 1가지 종류의 2차 항체가 사용되는 대신에, 몇 가지의 상이한 2차 항체들의 혼합물이 사용될 수 있는데, 단 이 경우 상이한 2차 항체들은 동일한 Ig 군 1가지 또는 상이한 Ig 군들과 결합하거나(예컨대 모두 IgA와 결합하는 상이한 항체들의 혼합물(예컨대 폴리클로날 항체)), 또는 예컨대 IgA 및 IgG 또는 IgM과 결합하거나, 또는 상이한 2차 항체들은 상이한 개별 표적 구조와 결합한다(예컨대 2차 항체 1가지 종류는 IgA와 특이적으로 결합하고, 다른 종류는 IgG와 특이적으로 결합함).
바람직한 구현예에서, 서열 번호 1에 대한 항체는 표지된 2차 항체, 바람직하게는 IgA, IgG 및/또는 IgM 군 항체와 결합하는, 표지된 2차 항체가 사용되어 검출된다.
본원에 2차 항체와 관련하여 사용된 바와 같은 “표지된”이란 용어는, 2차 항체가, 이 2차 항체 자체에 커플링, 바람직하게는 물리적 결합을 통하여 검출가능한 물질, 예컨대 그 존재가 기질 성분과의 반응성 및/또는 기질 성분의 전환을 기반으로 평가되고, 선택적으로는 정량되는, 방사능 제제 또는 검출가능한 신호를 제공하는 기타 분자, 예컨대 형광단, 예컨대 소형 유기 화학 형광단 또는 형광 단백질, 또는 효소 활성 표지, 즉 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타아제(이에 한정되는 것은 아님)이 표지된 구현예들 포함하도록 의도된다. 적합한 검출가능 표지 다수가 당 분야에 공지되어 있으며, 이것들 중 일부도 또한 이하 본원에 기재되어 있다.
바람직한 구현예에서, 항체, 바람직하게는 IgA, IgG 또는 IgM 군 항체는 비색법, 면역형광법, 효소활성 검출, 화학발광법 및 방사능 검출을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법이 사용되어 검출된다.
바람직한 구현예에서, 감염은 조기 단계에 검출된다. 바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 감염 과정에 관한 내용에서 본원에 지칭되는 바와 같은 “조기 단계(early stage)”란 용어는, 감염 시점이 공지된 경우, 예컨대 실험실 실험에서의 대상체 감염의 경우에는 감염 시점, 즉 바이러스와 대상체 신체가 처음 접촉한 시점 이후 14일 미만, 바람직하게는 6일 미만의 기간내 임의의 시점을 지칭한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 감염 과정에 관한 내용에서 본원에 지칭되는 바와 같은 “조기 단계”란 용어는, 질병이 발생한 후, 즉 통상의 SAR-CoV-2 감염 연관 임상 증상, 예컨대 본원에 정의된 바와 같은 증상 1가지 이상이 처음 발생한 후 14일 미만, 바람직하게는 6일 미만의 기간내 임의의 시점(바이러스학 분야에서는 “질병 발생 후 경과일(days post onset of illness; dpoi)”이라고도 지칭됨)을 지칭한다. 당 업자는, 감염시 코로나바이러스 구성성분이, 예를 들어 핵산 검출을 위한 PCR과, 시료 중 바이러스 항원을 검출하기 위한 면역검정이 이용되어 직접 검출될 수 있음을 알고 있다. 최대 바이러스량을 보이는 감염의 피크가 지난 후, 아마도 환자가 바이러스와 처음 접촉하고 나서 며칠 지나지 않아서, 바이러스의 농도는 감소하게 되는데, 이는 직접 검출을 점점 더 어렵게 만들고, 최종적으로, 즉 가장 늦게는 바이러스가 시료 중에 존재하지 않게 될 때 검출을 불가능하게 만든다. 한편, 바이러스 구성성분이 환자의 혈액 중에 존재하게 되고 나서 바로, 바이러스 구성성분에 대한 항체의 생성은 촉발된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, “조기 단계”란 용어는, 바이러스와 환자가 처음 접촉한 때 또는 질병이 발생하였을 때, 바람직하게는 질병이 발생하였을 때와, 바이러스에 대해 IgG 항체가 검출가능한 정도로 생성된 때, 더욱 바람직하게는 IgG 항체가 우세한 면역글로불린 군일 때, 즉 IgG 항체가 IgA 및 IgM보다 더 높은 농도로 존재할 때, 가장 바람직하게는 IgG 농도가 피크에 도달하기 전 사이의 시간대를 지칭한다. 그러므로 IgA 항체 및 IgM 항체의 검출은 여전히 급성이면서 검출가능한 증상을 동반하거나 동반하지 않되, IgG의 전체 면역 반응이 발현되기 전의 감염 진단에 기여할 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 SARS-CoV-2 감염을 진단하거나, 또는 코로나바이러스 감염의 감별 진단, 바람직하게는 SARS-CoV, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염과, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1 감염을 구별하기 위한, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA군 항체의 용도를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 이 용도는 조기 진단, 즉 SARS-CoV-2 감염의 조기 단계 진단을 위한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은, 바람직하게는 진단상 유용한 담체에 코팅된 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드와, 서열 번호 1에 대한 항체, 세척 완충제, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA, IgG 및/또는 IgM 군 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 군 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 군 항체와 특이적으로 결합하는 2차 항체, 바람직하게는 검출가능 표지를 포함하는, IgA 군 항체와 특이적으로 결합하는 2차 항체의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 수단, 그리고 희석 완충제를 포함하는 군의 시약 1가지 이상, 바람직하게는 모두를 포함하는 키트를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 진단상 유용한 담체는 비드, 바람직하게는 자성 또는 상자성 비드, 테스트 스트립, 미세정량 평판, 막을 포함하는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 니트로셀룰로스 막, 웨스턴 블럿, 라인 블럿 및 닷 블럿, 측방 유동 디바이스, 유리 표면, 슬라이드, 마이크로어레이, 크로마토그래피 컬럼 및 바이오칩을 포함하는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 미세정량 평판이다.
바람직한 구현예에서, 키트는 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상의 표준물질(calibrator)을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 각각의 표준물질은 서열 번호 1에 결합하고, 바람직하게는 IgA 군 항체와 결합하는 2차 항체에 의해 인지되는 재조합체(recombinant) 항체이다. 임의의 바람직한 구현예에서, 표준물질은 서열 번호 1 또는 이의 변이체에 결합하는 재조합체 항체이고, 상기 재조합체 항체는, 바람직하게는 2차 항체와 결합하는 Ig 군과 동일한 Ig 군의 면역글로불린(Ig)이다.
제5 양태에서, 본 발명은 이 양태에 따른 진단 키트를 제조하기 위한, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체의 용도를 제공하고, 본 발명은 구체적으로 진단 키트를 제조하기 위한, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 진단 키트를 제조하기 위한, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체의 용도도 또한 제공한다.
진단 키트는, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 진단, 또는 코로나바이러스 감염의 감별 진단, 바람직하게는 SARS-CoV, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염과, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1 감염의 구별을 위한 것이다. 그러므로 본 발명은 SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 진단 키트를 제조하기 위한, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 상기 SARS-CoV-2 감염의 진단은, 예를 들어 대상체 유래 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 SARS-CoV-2 감염의 진단은 또한 대상체로부터 시료를 수득하는 단계와, 대상체 유래 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명은 추가로 코로나바이러스 감염의 감별 진단용, 바람직하게는 SARS-CoV, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염과, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1 감염을 구별하기 위한 진단 키트를 제조하기 위한, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 상기 감별 진단은, 예를 들어 대상체 유래 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 및/또는 IgG 군 항체, 가장 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 감별 진단은 또한 대상체로부터 시료를 수득하는 단계와, 대상체 유래 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 및/또는 IgG 군 항체, 가장 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
이 양태에 따르면, 본 발명은 마찬가지로 진단, 예를 들어 인간 또는 동물의 신체를 대상으로 수행되는 진단 방법에 사용하기 위한, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 SARS-CoV-2 감염 진단에 사용하기 위한, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 상기 SARS-CoV-2 감염의 진단은, 예를 들어 대상체 유래 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 및/또는 IgG 군 항체, 가장 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 SARS-CoV-2 감염 진단은 또한 대상체로부터 시료를 수득하는 단계와, 대상체 유래 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 및/또는 IgG 군 항체, 가장 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명은 코로나바이러스 감염의 감별 진단용, 바람직하게는 SARS-CoV(바람직하게는 SARS-CoV-2) 감염과, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1 감염을 구별하는데 사용하기 위한, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 상기 감별 진단은, 예를 들어 대상체 유래 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 및/또는 IgG 군 항체, 가장 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 감별 진단은 또한 대상체로부터 시료를 수득하는 단계와, 대상체 유래 시료 중 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 및/또는 IgG 군 항체, 가장 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 진단, 예를 들어 인간 또는 동물의 신체를 대상으로 수행되는 진단 방법에 사용하기 위한, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 군, IgM 군 및/또는 IgG 군, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 및/또는 IgG 군 항체, 가장 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체를 추가로 제공한다. 구체적으로 본 발명은 SARS-CoV-2 감염을 진단하는데 사용하기 위한, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 군, IgM 군 및/또는 IgG 군, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 및/또는 IgG 군 항체, 가장 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 코로나바이러스 감염의 감별 진단, 바람직하게는 SARS-CoV(바람직하게는 SARS-CoV-2) 감염과, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1 감염을 구별하는데 사용하기 위한, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 및/또는 IgG 군 항체, 가장 바람직하게는 IgA 군 항체에 관한 것이다.
제6 양태에서, 본 발명은 바람직하게는 표준물질로서 IgA 군 항체와 결합하는 2차 항체에 의해 인지되는, 서열 번호 1에 결합하는 재조합체 항체의, SARS-CoV-2 감염 조기 진단을 위한 용도를 제공한다.
이 양태에 따르면, 본 발명은 또한 대상체 유래 시료 중 표준물질, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체를 검출하기 위한 표준물질로서, 서열 번호 1에 결합하는 재조합체 항체, 예컨대 재조합체 IgA 군 항체의 용도도 제공한다. 이러한 표준물질은, 구체적으로 코로나바이러스 감염의 감별 진단을 위한 방법, 바람직하게는 SARS-CoV, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염과, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1 감염의 구별을 위한 방법에 있어 SARS-CoV-2 감염을 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 마찬가지로 표준물질로서 서열 번호 1에 결합하는 재조합체 항체, 예컨대 재조합체 IgA 군 항체의, 바람직하게는 진단, 구체적으로 SARS-CoV-2 감염의 조기 진단을 위한 용도를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 인간 대상체는 백신을 투여받은 인간 대상체이다.
바람직한 구현예에서, 본 방법은 진단 결과를 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 진단 또는 평가의 결과를 상이한 장소에 이송하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 항원과 항체가 코로나바이러스, 특히 전 바이러스 또는 전 바이러스의 구조적 단백질 또는 단편 중 임의의 것, 그리고 이러한 항원에 결합하는 항체의 면역학적 검출에 대한 기초로서 사용되어 왔다.
본 발명은 본 발명자들의 놀라운 발견, 즉 서열 번호 1에 대한 항체가 감염 조기 단계에 검출될 수 있다는 점을 기반으로 한다. 이 항체는 감염의 조기 단계에 해당 감염의 발생을 확정하기 위해 검출될 수 있다.
다시 말해서, 본원에 개시된 결과는, 바람직하게는 검사된 시료의 총 수를 기준으로 양성으로 올바르게 확정된 시료의 수에 의해 측정되는 바와 같이, 감염의 조기 단계에 이미 SARS-CoV-2에 감염되었음을 진단함에 있어 민감도가 월등함을 입증한다. 관찰된 민감도 증가에 대한 중요한 기여는, 검출가능한 IgM 항체가 없는 환자의 종속 모집단을 비롯한 다수의 환자에서 서열 번호 1에 대한 IgA군 항체가 기타 Ig 군 항체, 예컨대 IgG 항체보다 더 일찍 검출될 수 있게 된다는 놀라운 발견으로부터 기인한다. 더욱이, 본 발명은 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgG 및/또는 IgA가 SARS-CoV-2 N 단백질에 대한 항체보다 더 오랫동안 지속적으로 존재하고, 더 오랜 기간 동안 검출가능하다는 놀라운 발견을 기반으로 한다.
또한, 기타 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2를 제외한 코로나바이러스에 감염된 환자로부터 유래한 시료 중 다양한 항체들간 교차 반응성은 놀라울 정도로 작은데, 이는 검사된 시료 총 수에 비해 올바르게 동정된 음성 시료의 수가 많다는 점, 즉 검사된 시료 총 수에 비해 위양성으로 동정된 시료의 수가 적다는 점에 의해 측정되는 바와 같이, 서열 번호 1에 대한 항체 검출시의 월등한 특이성에 기여한다. 구체적으로 본 발명자들은 항원인 서열 번호 1의 특이성이 서열 번호 33(S2 도메인)의 특이성에 비해 월등하다는 것을 발견하였다(Okba et al., “Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2-Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease Patients”. Emerg Infect Dis. 2020 Jul;26(7):1478-1488, medRxiv 2020.03.18.20038059 발행).
바람직한 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 “진단”이란 용어는, 가능한 한 가장 넓은 의미로 이해되어야 하는 것으로서, 어떤 환자가 과거, 진단 당시 또는 미래에 어떤 질환이나 장애가 발병한 적이 있거나, 발병하였거나, 발병할 가능성이 있거나, 평균 대상체 또는 비교 대상체(바람직하게는 유사한 증상을 보이는 대상체)에 비해 발병할 가능성이 더 큰지 여부를 평가함에 있어 중요한 정보를 수득하거나, 해당 질환이 어떻게 진행되는지 아니면 미래에 어떻게 진행될 수 있는지를 파악하거나, 또는 일반적으로 치료, 바람직하게는 백신과 관련한 환자 또는 환자들의 반응성을 평가하거나, 또는 어떤 시료가 그러한 환자로부터 유래하였는지 여부를 파악하는 것을 목표로 하는 임의의 종류의 절차를 지칭할 수 있다. 이러한 정보는 임상 진단에 사용될 수 있지만, 또한 일반적인 연구, 예를 들어 환자 코호트 또는 모집단에서 해당 질환이 발병한 대상체 비율을 확정하기 위한 연구를 목적으로 하는 실험 및/또는 연구 실험실에 의해 수득될 수도 있다. 다시 말해서, “진단”이란 용어는, 어떤 질환이나 장애를 진단하는 것뿐 아니라, 해당 질환이나 장애의 경과를 예후 및/또는 모니터링하는 것, 예컨대 어떤 약물이나 후보 약물의 투여에 대해 1명 이상의 환자의 반응을 모니터링하는 것, 예컨대 어떤 약물이나 후보 약물의 효능을 확정하는 것을 포함한다. 또한, 서열 번호 1에 대한 IgA 및/또는 IgG 항체가 조기 출현하고/조기 출현하거나 오랫동안 지속적으로 존재한다는 성질이 이용될 수 있다. 결과는 임상 진단의 용도로 특정 환자에게 제공될 수 있고, 예를 들어 전화, 팩스, 서신 또는 전자 포맷, 예컨대 이메일이나 데이터베이스를 사용하여 해당 환자를 치료하고 있는 의료진이나 기관과 소통될 수 있지만, 예를 들어 연구를 목적으로 하는 진단(이 경우는 익명의 환자나 환자 코호트로부터 유래한 시료에 결과를 할당하는 것으로 충분할 수 있음)과 같은 다른 용도의 경우에는 반드시 그러한 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 진단될 사람, 즉 “대상체” 또는 “환자”는 자신의 혈액이 치료적으로 유용한 항체를 수득하기 위해 공여 또는 사용될 수 있는, 익명의 혈액 공여자이다. 바람직하게는 이 질환은 SARS-CoV-1 감염 및 SARS-CoV-2 감염을 비롯한 SARS 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법, 물품 및 용도는 상호작용 연구(interaction study), 예컨대 어떤 약물 후보 또는 기타 화합물, 예컨대 후보 백신 또는 임의의 체성 화합물, 예컨대 차단 항체가 존재하는지, 그리고 이것이 SARS-CoV-2에 대한 항체의 결합을 방해할 수 있는지, 또는 임의의 하류 과정에 영향을 미칠 수 있는지를 확정하는 연구에 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 것들은 서열 번호 1 또는 이의 면역원성 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물이, 예컨대 포유동물(인간 이외의 포유동물, 예컨대 실험실 동물일 수 있음)에 투여된 후의 면역 반응, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어진 폴리펩티드에 대한 항체의 출현 및/또는 역가를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. IgA 항체 및/또는 IgG 항체의, 바람직하게는 대상체 면역화 후기 단계에서의 검출, 더욱 바람직하게는 검출 민감도를 증가시키거나 검출 민감도를 최적화하기 위한 검출이 특히 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 면역화는 SARS-CoV-2 감염의 결과 또는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 백신의 투여 결과이다. 이 증가 또는 최적화는 SARS-CoV-2 또는 이의 구성 성분, 예컨대 서열 번호 30(N 단백질)에 대한 기타 항체, 바람직하게는 서열 번호 30에 대한 IgG군 항체의 민감도에 비한 것일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 “후기 단계(late phase)”란 용어는, 질병 발생후, 또는 백신 1차 투여후, 20일차, 30일차, 40일차, 50일차, 60일차, 61일차, 70일차, 80일차 또는 90일차, 바람직하게는 60일차로부터 시작되는 기간을 지칭한다. 바람직하게는 이 기간은 28일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월, 12개월, 15개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월, 60개월, 또는 이 이상, 바람직하게는 3개월 이상 동안 지속된다. 바람직한 구현예에서, 방법 또는 용도는 면역화의 장기 모니터링을 위한 것일 수 있다. 면역화는 SARS-CoV-2 감염 또는 백신 투여, 바람직하게는 서열 번호 1 또는 이의 변이체 투여의 결과일 수 있다. 후기 단계 동안 수득된 시료 적어도 1개, 바람직하게는 2개 이상이 분석된다. 시료는 후기 단계 동안 1주일에 적어도 1회 또는 1개월에 적어도 1회 수득되어 분석될 수 있다.
만일 서열 번호 1에 대한 IgA 및/또는 IgG 및/또는 IgM 항체가 대상체 유래 시료 중에서 검출되면, 해당 대상체는 SARS-CoV-2 감염될 가능성이 있는 개체이거나 가능성이 더 큰 개체이다. 당 업자는 결과의 해석이 항체의 존재 또는 부재를 반영한다는 것에 관한 바이러스학의 일반적인 원리를 잘 알고 있다(예를 들어 문헌(Doerr, H. W., and Gerlich, W., Medizinische Virologie: Grundlagen, Diagnostik, Prevention und Therapie, Thieme 2010) 및 이에 포함된 도 9.7 참조). 요약하면, 바이러스 특이 항원에 특이적인 항체의 1차 검출은 감염의 처음 진단에 사용될 수 있다. IgA 항체는 특정의 경우, 예컨대 장내 바이러스에 의한 감염의 경우를 제외하고 보통 진단상 무관하지만(Gressner/Arndt, Lexikon der Medizinischen Labordiagnostik, 2. Auflage, Springer, 2013, page 1387), 만일 IgA 항체가 나타나면, 이 IgA 항체의 역가는 통상 IgM 및 IgG 군 항체의 역가보다는 더 낮을 것이고, 더 늦게 나타날 수 있다. 바람직하게는 IgM 및 IgA 군 항체가 부재하면서, IgG군 항체의 농도가 낮음은, 과거 면역화되었음을 나타낸다. IgG군 항체 역가의 증가 또는 높은 농도는 급성 감염 또는 재감염을 나타내는 것일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 서열 번호 1에 대한 항체가 존재함은, 이전 또는 현재 SARS-CoV-2 감염이 된 결과 또는 백신을 투여한 결과 중 어느 하나로 인해 면역화되었음을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 백신(또는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 가지는 백신, 예컨대 RNA 기반 백신)의 성공적인 백신 투여는, 서열 번호 1 이외의 SARS-CoV-2 항원에 대한 항체의 부재를 확인함으로써, 바람직하게는 서열 번호 30(SARS-CoV-2 N 단백질)에 대한 항체의 부재를 확인함으로써 SARS-CoV-2 감염과 구별될 수 있다.
시료는, 바람직하게는 포유동물 시료, 즉 포유동물로부터 유래한 시료, 더욱 바람직하게는 인간 시료, 즉 인간으로부터 유래한 시료이다.
“진단”이란 용어는, 바람직하게는 본 발명에 따른 진단 방법 또는 제제가 한정적일 것이며, 매개변수는 말할 것도 없이 1회의 테스트를 토대로 진단을 마무리하는데 충분할 것임을 함축하는 것은 아니고, “감별 진단”, 즉 다양한 진단 매개변수를 기반으로 다양한 조건이 조성될 가능성이 고려된 체계적 진단 절차라고 불리우는 것에 대한 기여를 지칭할 수 있다. 본 발명에 따르면, 환자, 바람직하게는 코로나바이러스 감염된 것으로 이미 의심되는 환자에 SARS, 바람직하게는 SARS-CoV-1 감염 및/또는 SARS-CoV-2 감염이 발생하였는지, 아니면 또 다른 코로나바이러스 감염, 바람직하게는 MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1을 포함하는 군의 감염이 발생하였는지가 구별될 수 있다. NL63, 229E, OC43 및 HKU1은 유의미한 수의 흔한 감기 사례와 연관되어 있으므로, 감별 진단은 SARS-CoV-1 및/또는 SARS-CoV-2와, 이러한 감기를 구별하는 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어 환자는 위험한 환경에 대해 일어날 수 있는 노출로 말미암고/말미암거나 일반적인 증상, 예컨대 발열, 기침 및 숨가쁨을 토대로 코로나바이러스 감염이 발생한 것으로 처음에 의심될 수 있다. 이러면 PCR(예를 들어 문헌(Corman VM, Landt O, Kaiser M, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Sun/eill. 2020;25(3):2000045. doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045) 참조) 및/또는 면역검정이 수행될 수 있다. 만일, 예를 들어 시료가 감염 후 수 일이 경과한 후에 채취된 관계로 PCR 결과가 음성이면, 본 발명의 방법은 서열 번호 1에 대한 항체의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, 또 다른 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-1, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1를 포함하는 군, 더욱 바람직하게는 MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1를 포함하는 군으로부터 유래한 항원에 대한 항체의 존재 또는 부재가 검출될 수 있다. SARS-CoV-2 유래 서열 번호 1의 상동체 및 변이체에 대한 항체가 검출될 수 있다. 진단은 특정의 임상 증상, 예컨대 SARS-CoV-1에 더욱 특징적인 두통 및 근육통(body pain), 또는 미각과 후각 상실, 그리고 인후통을 기반으로 완결될 수 있다. 환자가 감염된 환자에 노출되었는지 여부가 고려될 수 있다. 예를 들어 SARS-CoV-1 사례는 매우 드물기 때문에, SARS-CoV-2 팬데믹때 일반적인 SARS-CoV-1 증상 및 SARS-CoV-2 증상을 보이는 다수의 환자는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 감염되었다고 추정될 수 있다. SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 변별은 상이한 시간 분석 면역글로불린(Ig) 군 시그니처, 구체적으로 SARS-CoV-1에 있어서 IgA군 항체의 후기 출현을 기반으로 이루어질 수 있다(Hsue, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L, 및 Yang P. C. (2004) “Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus”, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066). 항체 수준은, 예를 들어 관심 항체의 소멸 또는 출현을 검출하기 위해(이는 1차 또는 2차 감염으로 인한 것인지, 또는 예를 들어 백신 투여의 결과로 인한 면역화로 인한 것인지를 구별하는데 도움이 될 수 있음) 또는 1가지를 초과하는 코로나바이러스가 감염되었음을 인지하기 위해, 예를 들어 수 주에 걸쳐 모니터링될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 “SARS-CoV-2”란 용어는, GenBank에 승인 코드 MN908947으로 기탁된 게놈 또는 서열 번호 13의 게놈, 바람직하게는 서열 번호 13에 보인 게놈, 그리고 전체 게놈 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80 퍼센트, 바람직하게는 85 퍼센트, 바람직하게는 88 퍼센트, 바람직하게는 90 퍼센트, 바람직하게는 91 퍼센트, 바람직하게는 92 퍼센트, 바람직하게는 93 퍼센트, 바람직하게는 94 퍼센트, 바람직하게는 95 퍼센트, 바람직하게는 96 퍼센트, 바람직하게는 97 퍼센트, 바람직하게는 98 퍼센트, 바람직하게는 99 퍼센트, 바람직하게는 99.5 퍼센트, 바람직하게는 99.8 퍼센트, 바람직하게는 99.9 퍼센트 또는 99.99 퍼센트의 서열 동일성을 보이는 이의 유도체에 의해 특징지어지는 바이러스를 지칭한다. 본원에 사용된 모든 데이터 베이스 항목 또는 제품 코드는 본 출원의 출원일 또는 가장 빠른 우선권 날짜에 온라인 제출된 버전에 대응한다. 예를 들어 승인 코드 MN908947, MN908947.3 버전(2020년 1월 17일 발행)로 기탁된 SARS-CoV-2 게놈 서열은 본 출원의 출원일 또는 가장 빠른 우선권 날짜에 온라인 제출된 것이다. MN908947.3에 개시된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 13의 서열과 동일하다. 더욱 바람직하게는 돌연변이체, 예컨대 영국 변이체 B.1.1.7, 남아프리카 변이체 B.1.351, 브라질 변이체 P.1 및 덴마크 밍크(Mink) 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 돌연변이체가 포함된다.
바람직한 구현예에서, 진단될 SARS-CoV-2 감염은 서열 번호 1에 관하여 His 54 및/또는 Val55, Gln486Tyr, Ala555Asp, Asp599Gly 및 Pro666His 결실(들)을 포함하는 군의 돌연변이 1개 이상, 바람직하게는 돌연변이 모두가 발생한 스파이크 단백질로 특징지어지는 영국 변이체 B.1.1.7과 연관되어 있거나 연관되어 있을 수 있다. 바람직하게는 His 54 및/또는 Val55, Gln486Tyr, Ala555Asp, Asp599Gly 및 Pro666His 결실(들)을 포함하는 군의 돌연변이 1회 이상, 바람직하게는 돌연변이 모두가 발생한 서열 번호 1의 변이체는 본 발명에 따른 시약, 방법 및 용도에 사용된다. 모든 돌연변이를 포함하는 서열 번호 1의 변이체는 서열 번호 51로 표시된다.
바람직한 구현예에서, 진단될 SARS-CoV-2 감염은 서열 번호 1에 관하여 Lys402Gln, Glu469Lys, Gln486Tyr 및 Asp599Gly을 포함하는 군의 돌연변이 1개 이상, 바람직하게는 돌연변이 모두가 발생한 스파이크 단백질로 특징지어지는 남아프리카 변이체 B.1.351과 연관되어 있거나 연관되어 있을 수 있다. 바람직하게는, Lys402Gln, Glu469Lys, Gln486Tyr 및 Asp599Gly을 포함하는 군의 돌연변이 1개 이상, 바람직하게는 돌연변이 모두가 발생한 서열 번호 1의 변이체는 본 발명에 따른 시약, 방법 및 용도에 사용된다. 모든 돌연변이를 포함하는 서열 번호 1의 변이체는 서열 번호 52로 표시된다.
바람직한 구현예에서, 진단될 SARS-CoV-2 감염은 서열 번호 1에 관하여 Glu469Lys 및 Gln486Tyr을 포함하는 군의 돌연변이 1개 이상, 바람직하게는 돌연변이 모두가 발생한 스파이크 단백질로 특징지어지는 브라질 변이체 P.1과 연관되어 있거나 연관되어 있을 수 있다. 바람직하게는 Glu469Lys 및 Gln486Tyr을 포함하는 군의 돌연변이 1개 이상, 바람직하게는 돌연변이 모두가 발생한 서열 번호 1의 변이체는 본 발명에 따른 시약, 방법 및 용도에 사용된다. 모든 돌연변이를 포함하는 서열 번호 1의 변이체는 서열 번호 53으로 표시된다.
바람직한 구현예에서, 진단될 SARS-CoV-2 감염은 서열 번호 1에 관하여 His 54 및/또는 Val55, Asp599Gly 및 Tyr438Phe 결실(들)을 포함하는 군의 돌연변이 1개 이상, 바람직하게는 돌연변이 모두가 발생한 스파이크 단백질로 특징지어지는 덴마크 밍크 변이체와 연관되어 있거나 연관되어 있을 수 있다. 바람직하게는 His 54 및/또는 Val55, Asp599Gly 및 Tyr438Phe 결실(들)을 포함하는 군의 돌연변이 1개 이상, 바람직하게는 돌연변이 모두가 발생한 서열 번호 1의 변이체는 본 발명에 따른 시약, 방법 및 용도에 사용된다. 모든 돌연변이를 포함하는 서열 번호 1의 변이체는 서열 번호 54로 표시된다.
바람직한 구현예에서, “진단”이란 용어는, 방법 또는 물품 또는 용도가 어떤 질환을 진단하거나 어떤 질환이 발병할 위험이 있는 대상체를 동정하는 것을 보조하기 위해 사용 또는 적용될 수 있음을 의미한다. “진단”이란 용어는 또한 환자에게 가장 효과가 큰 치료 계획을 선택하는데 사용되는 방법이나 제제를 지칭할 수도 있다. 다시 말해서, 본 방법 또는 제제는 대상체를 위한 치료 계획을 선택하는 것과 관련될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 진단상 유용한 담체 및 감염이 의심되는 환자, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간 환자로부터 유래한 시료를 제공하는 단계를 포함한다. 담체는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드로 코팅된다. 이후 담체는 임의의 항체와, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 결합이 허용되는 조건 하에서 시료와 접촉될 수 있다. 그 다음, 시료는 제거되고, 담체는 남아있는 임의의 시료를 제거하기 위해 세척될 수 있다. 검출하고자 하는 항체와 결합하고, 검출가능한 표지를 운반하는 2차 항체 또는 유사한 시약이나 수단은 이후 결합된 임의의 항체와 2차 항체간 복합체 형성이 허용되는 조건 하에서 담체와 접촉될 수 있다. 그 다음, 담체는 미결합 2차 항체를 제거하기 위해 세척될 수 있다. 마지막으로 항체의 존재는 2차 항체가 검출될 수 있는지 여부를 검토함으로써 확인된다.
바람직한 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 “SARS-CoV-2 감염”이라는 용어 또는 유사 용어는, 대상체, 바람직하게는 인간 대상체가 SARS-CoV-2로 감염된 경우, 즉 상기 대상체의 체내에 바이러스가 적어도 일시적으로 존재하는 것, 더욱 바람직하게는 검출가능한 수준의 바이러스 자체 및/또는 구조 단백질, 구체적으로 S 단백질 및 N 단백질, 더욱 바람직하게는 S1 도메인을 포함하는 군의 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 포함하는 군의 바이오마커 1가지 이상, 그리고 이것과 결합하는 항체 및/또는 SARS-CoV-2 유래 핵산(이는 PCR로 검출가능함)이 존재함과 아울러, 상기 대상체의 체내에 바이러스가 적어도 일시적으로 존재하는 것을 지칭한다. 대상체는 발열, 피로감, 마른 기침, 코막힘, 콧물 및 인후통을 포함하는 군 중 1가지 이상의 임상 증상, 더욱 바람직하게는 모든 임상 증상을 보일 수 있다. 더욱 중증인 증상으로서는 호흡 곤란, 가슴 통증 또는 가슴 압박감 및 갑작스러운 의식혼란을 포함한다. 질환은 폐렴, 급성 호흡장애 증후군, 패혈증, 패혈증성 쇼크 및 신부전과 같은 합병증을 유도할 수 있다. 그러나 다수의 감염 대상체는 경증의 증상만을 보이고, 심지어 자신이 감염되었음을 인지하지 못할 수도 있다.
바람직한 구현예에서, 본 방법은 동일 환자로부터 유래한 시료를 검사하기 위해, 바람직하게는 상이한 날에 1회 이상 사용된다. 예를 들어 항체의 존재 또는 부재는 1주 또는 2주에 걸쳐 매일 검출될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상이한 날에 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 시료가 검사된다. 바람직한 구현예에서, 시료는 적어도 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주 또는 16주의 기간에 걸쳐 채취된다.
본 발명에 따른 방법, 시약 및 용도는 또한 항바이러스 약물 또는 백신 또는 백신 후보의 효능 및 유용성을 스크리닝하는데 이용 또는 적용될 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 방법은 백신 투여된 인간에서 인증되었음에 주목할 만한데, 즉 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 대한 항체가 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물 백신이 투여된 인간에서 검출될 수 있었음에 주목할만하다. 백신 투여된 인간은, 인간 및 기타 대상체, 예컨대 실험실 동물에서 백신의 품질을 확인하거나, 대상체의 면역계가 백신 투여에 반응하는지를 확인하기 위한, 백신 투여에 관한 임상시험 및 연구의 한 자원으로서 사용될 수 있다. 바람직하게는 백신은 서열 번호 1 또는 이의 단편을 기반으로 한다. 본 방법, 시약 및 용도는 상기 환자가, 예컨대 이전에 SARS-CoV-2에 감염되었거나 아니면 이전의 백신 투여로 말미암아 이미 면역화되었는지 여부를 검사하기 위해 백신 초회 투여 전 환자를 처음으로 진단하는데 사용 및 적용될 수 있다. 예를 들어 환자는 연구 또는 임상실험에 포함시키거나 이로부터 배제시키기 위해 선택될 수 있으며, 경시적으로 모니터링될 수 있다. 구체적으로 이미 감염된 대상체는 백신 후보 테스트로부터 배제될 수 있다. 이전의 백신 투여가 여전히 유효한지는, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 및/또는 IgG 군 항체의 검출을 기반으로 확인될 수 있다.
본 발명에 따른 방법과 시약은 또한, 예컨대 치료에 사용하기 위한 목적으로 공여된 혈액이 코로나바이러스로 오염되었는지 여부 또는 공여된 혈액으로부터 추출될 수 있는, SARS-CoV-2, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 항체를 혈액 공여자가 생산하는지 여부를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 서열 번호 1에 대한 IgG, IgM 및/또는 IgA 군 항체, 바람직하게는 IgG 및 IgA, 더욱 바람직하게는 IgA의 존재 또는 부재가 검출된 후, SARS-CoV-2, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 항체는 혈액 공여자의 혈액으로부터, 예를 들어 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있거나, 또는 서열 번호 1에 대한 항체와 담체를 포함하는 복합체 형성과 양립 가능한 조건 하에 본 발명에 따른 담체를, 공여된 혈액과 접촉시킨 다음, 남아있는 임의의 공여 혈액을 제거하고, 담체로부터 항체를 분리함으로써 정제될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 공여된 혈액은 전혈, 혈장 및 혈청을 포함하는 군으로부터 선택되고, 항응고 시약을 함유할 수 있다. 시트르산염, 인산염, 덱스트로스 및 아데닌을 포함하는 군으로부터 선택된 화합물, 바람직하게는 이것들 모두도 또한 존재할 수 있다.
검출하고자 하는 항체는, 바람직하게는 서열 번호 1과 특이적으로 결합한다. 특이적 결합이란, 바람직하게는 결합 반응이, 25℃에서 PBS 완충제(pH 7) 중 Biacore 장치가 사용되는 표면 플라스몬 공명법에 의해 확정되는 바에 따르면 해리 상수 1 x 10-5 M, 더욱 바람직하게는 1 x 10-7 M, 더욱 바람직하게는 1 x 10-8 M, 더욱 바람직하게는 1 x 10-9 M, 더욱 바람직하게는 1 x 10-10 M, 더욱 바람직하게는 1 x 10-11 M, 더욱 바람직하게는 1 x 10-12 M로 특징지어지는 결합 반응보다 더 큰 경우를 의미한다.
본 발명의 교시 내용은 오로지, 예를 들어 기능, 명칭, 서열 또는 승인 번호에 의해 본 출원에 명백하게 언급된 정확한 서열, 예컨대 서열 번호 1 또는 6을 가지는 폴리펩티드가 사용되어 수행될 수 있는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 본원에 사용된 바와 같은 “변이체”란 용어는 또한 언급된 전장 서열의 단편 적어도 1개 또는 상기 단편을 포함하는 폴리펩티드, 더욱 구체적으로는 전장 서열에 비해 한쪽 말단 또는 양 말단의 아미노산 1개 이상만큼이 절단된, 1개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 단편은 원래 서열 또는 이의 변이체의 연속 아미노산 적어도 10개, 15개, 25개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 400개, 500개 또는 600개를 가지는 (폴리-)펩티드를 포함하거나 암호화한다. 예를 들어 서열 번호 1의 단편은 서열 번호 12 및 서열 번호 31을 포함한다. 단편의 복사체 2개 이상은 민감도를 증가시키기 위해 융합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 “변이체”란 용어는 또한 언급된 참조 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 이와 같은 폴리펩티드 또는 단편, 바람직하게는 언급된 참조 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 연속 아미노산 적어도 25개, 더욱 바람직하게는 50개, 더욱 바람직하게는 200개를 포함하는 단편도 포함하되, 단 여기서 생물 활성, 예컨대 관심 항체와 특이적으로 결합하거나, 폴리펩티드의 폴딩 또는 구조를 유지하는 능력에 필수인 아미노산 이외의 아미노산은 결실 또는 치환될 수 있으며/있거나 이러한 필수 아미노산 1개 이상은 보존적 방식으로 대체될 수 있으며/있거나 아미노산은, 폴리펩티드의 생물 활성이 적어도 부분적으로 보존되도록 부가 또는 결실된다는 것도 또한 이해된다. 예를 들어 서열 번호 1의 단편은 서열 번호 5, 서열 번호 12, 서열 번호 14~29, 서열 번호 35~37 및 서열 번호 40~43을 포함한다. 현재의 최신 기술은 소정의 핵산 또는 아미노산 서열 2개를 정렬하고, 동일성의 정도를 산정하는데 사용될 수 있는 다양한 방법을 포함하는데, 예를 들어 문헌(Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 제3판)을 참조한다. 바람직한 구현예에서, 디폴트 설정값이 적용되는 ClustalW 소프트웨어(Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948)가 사용된다.
특정 아미노산 서열에 관한 SARS-CoV-2 관련 간행물, 예컨대 Beal외 다수의 문헌(Beal, J., Mitechell, T., Wyschogrod, W., Manthey, J, and Clore, A. (2020) Highly Distinguished Amino Acid Sequences of 2019-nCoV (Wuhan Coronavirus) doi: https://doi.org/10.1101/2020.01.31.929497)뿐 아니라, SARS-CoV 관련 간행물, 예컨대 상동성 에피토프들이 발견될 수 있고, SARS-CoV-2 에피토프가 이 에피토프들의 상동성으로 말미암아 동정될 수 있다는 Hua외 다수의 문헌(Hua, R., Zhou, Y., Wang, Y., Hua, Y and Tong, T. (2004) Identification of two antigenic epitopes on SARS-CoV spike protein, BBR 319, 929-935)은 당업자가 변이체를 디자인하는데 도움이 될 수 있다. 예를 들어 존재할 수 있는 에피토프는 서열 번호 5로부터 유래할 수 있다. Dahlke외 다수는, S1 폴리펩티드 유래 중첩성 15량체 펩티드를 포함하는 마이크로어레이를 기반으로 한 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 제시한다(Dahlke, C., Heidepriem, J., Kobbe, R., Santer R., Koch, T., Fathi, A., Ly, M. L, Schmiedel, S., Seeberger, P. H., ID-UKE COVID-19 study group, Addo, M. M., and Loeffler, F. F. (2020) https://doi.org/10.1101/2020.04.14.20059733doi). 더욱 구체적으로 S1 단백질의 아미노산 서열 SSVLHSTQDLFLPFF(서열 번호 14; 서열 번호 1의 30번~44번 아미노산), TWFHAIHVSGTNGTKRFDNPV(서열 번호 15; 48번~68번 아미노산), NVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEG(서열 번호 16; 110번~166번 아미노산), DLPQGFSALEPLVDL(서열 번호 17; 200번~214번 아미노산), LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAY(서열 번호 18; 226번~250번 아미노산), QPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDP(서열 번호 19; 256번~277번 아미노산), NATRFASVYAWNRKR(서열 번호 20; 328번~342번), TGKIADYNYKLPDDF(서열 번호 21; 399번~414번 아미노산), YNYLYRLFRKSNLKP(서열 번호 22; 434번~448번 아미노산), FGRDIADTTDAVRDPQTLEILDI(서열 번호 23; 550번~572번 아미노산), SNQVAVLYQDVNCTE(서열 번호 24; 590번~604번 아미노산), AGCLIGAEHVNNSYECDIP(서열 번호 25; 632번~650번 아미노산)을 포함하는 펩티드가 IgA 반응성 에피토프인 것으로 동정되었다. S1 단백질의 아미노산 서열 YNSASFSTFKCYGVS(서열 번호 26; 354번~368번 아미노산), STGSNVFQTRAGCLI(서열 번호 27; 622번~636번 아미노산)을 포함하는 펩티드는 IgG 반응성 에피토프인 것으로 동정되었다. S1 단백질의 아미노산 서열 SSVLHSTQDLFLPFF(서열 번호 28; 30번~44번 아미노산) 및 LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAY(서열 번호 29; 226번~250번 아미노산)을 포함하는 펩티드는 IgM 반응성 에피토프인 것으로 동정되었다. 더욱이 본 발명자들은 서열 RTQLPPAYTNS(서열 번호 41), LTPGDSSSGWTAG(서열 번호 35), YQAGSTPCNGV(서열 번호 36) 및 YGFQPTNGVGYQ(서열 번호 37)을 가지는 펩티드가 SARS-CoV-2 환자 유래 항체와 반응성임을 보였다. 기타 다수의 간행물이 변이체를 디자인하는 지침으로서 당 업자에 의해 사용될 수 있다(Zhang et al. (2020) “Mining of epitopes on spike protein of SARS-CoV-2 from COVID-19 patients”, Cell Res 30, 702-704 (2020). https://doi.org/10.1038/s41422-020-0366-x; Poh, C.M., Carissimo, G., Wang, B. et al. “Two linear epitopes on the SARS-CoV-2 spike protein that elicit neutralising antibodies in COVID-19 patients”. Nat Commun 11, 2806 (2020). https :// doi . org /10.1038/s41467-020-16638-2: Wang et al. (2020) “SARS-CoV-2 Proteome Microarray for Mapping COVID-19 Antibody Interactions at Amino Acid Resolution”, ACS Cent. Sci. 2020, 6, 12, 2238-2249). 바람직한 구현예에서, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하고, 폴딩되며, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1의 연속 아미노산 적어도 150개, 200개, 250개, 300개, 400개, 500개 또는 600개를 포함하는 폴리펩티드가 사용된다.
바람직한 구현예에서, 변이체는 화학 변형, 예컨대 표지, 예컨대 동위원소 표지 또는 검출가능한 표지 또는 공유 변형, 예컨대 당화, 인산화, 아세틸화, 탈카복실화, 시트룰린화 및 하이드록실화 등을 추가로 포함할 수 있다. 당 업자는 폴리펩티드 변형을 위한 방법을 잘 알고 있다. 더욱이 변이체는 또한 기타 공지의 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 예컨대 인공 링커, 친화성 태그 및 기타 항원 등과의 융합에 의해 생성될 수도 있다. 예를 들어 서열 번호 3, 서열 번호 32, 서열 번호 34 및 서열 번호 38은 본 발명에 따른 융합 단백질이다.
본 발명에 따르면, 의료 디바이스 또는 진단 디바이스, 예컨대 진단상 유용한 담체는, 선택적으로 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있는 인공 링커와 함께, 친화성 태그를 포함하는 서열 번호 1의 재조합체 변이체를 세포, 예컨대 진핵생물 세포(예컨대 CHO 세포 또는 HEK293 세포) 또는 원핵생물 세포(예컨대 E.coli 세포) 내에서 발현시킨 다음, 발현된 변이체를, 친화성 태그와 특이적으로 결합하는 리간드, 즉 고상에 부동화된 리간드와 접촉시킨 후, 비특이적으로 결합한 세포 유래 물질이 제거되도록 이 고상을 세척하고 나서, 발현된 변이체를, 바람직하게는 과량의 비 부동화 리간드를 첨가하여 고상으로부터 용리시킴으로써 제조될 수 있다. 그 다음, 변이체는 디바이스상에 부동화될 수 있다. 선택적으로 친화성 태그는, 바람직하게는 부동화 이전에 변이체를 프로테아제, 바람직하게는 프로테아제 절단 부위를 인지하는 프로테아제와 접촉시켜 제거될 수 있다. 친화성 태그는 His, 18A, ACP, 알데히드, Avi, BCCP, 칼모듈린 결합 펩티드(CBP), 키틴 결합 도메인(CBD), E-태그, ELK16, FLAG, 플래쉬(flash), 폴리-글루타메이트, 폴리-아스파르테이트, GST, 녹색 형광 단백질, HA, 말토스 결합 단백질, myc, nus, NE, ProtA, ProtC, Tho1d4, S-태그, Snoop 태그, Spy 태그, Sof 태그, 스트렙타비딘, Strep-태그 II, T7 에피토프 태그, TAP, TC, 티오리독신(Thioredoxin), Ty, V5, VSV 및 Xpress 태그를 포함하는 태그 군으로부터 선택될 수 있다. 유용한 프로테아제로서는 TEV, 트롬빈, Faktor Xa 또는 엔테로펩티다아제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. (예컨대 서열 번호 1 또는 이의 변이체와 친화성 태그 사이에) 프로테아제 절단 부위를 포함하는 적합한 링커는 변이체에 포함될 수 있으며, 상업적으로 이용 가능한 발현 벡터, 예컨대 상기 변이체 발현에 사용될 수 있는 pET 벡터 계열(Novagen)의 암호화 서열의 일부일 수 있다.
본 폴리펩티드의 변이체는 생물 활성을 가진다. 바람직한 구현예에서, 이러한 생물 활성은 각각의 항체와 결합하는 능력이다. 바람직한 구현예에서, 변이체는 바람직하게는 SARS-CoV-2가 발병한 환자의 시료로부터 유래한, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA군 항체와 결합하는 능력을 가지는 에피토프를 포함하거나 변이체 자체가 이러한 능력을 가지는데, 여기서 이 에피토프는, 더욱 바람직하게는 적어도 5개, 6개, 7개 또는 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는 변이체는 기타 코로나바이러스로부터 유래한 서열 번호 1의 상동체, 바람직하게는 MERS(서열 번호 6), NL63(서열 번호 10), 229E(서열 번호 7), OC43(서열 번호 8) 및 HKU1(서열 번호 9)을 포함하는 군, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-1(서열 번호 11), MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1을 포함하는 군의 기타 코로나바이러스로부터 유래한 서열 번호 1의 상동체와 특이적으로 결합하지 않는데, 단 특이적 결합은, 바람직하게는 상기 개략적으로 기재된 바와 같이 Biacore 장치가 사용되어 정의 및 확정된다.
당업자는, 적합한 아미노산 서열을 기반으로 진단상 유용한 시약을 어떻게 만드는지를 잘 알고 있으며, 예컨대 화학 합성에 의한 선형 펩티드 및, 예컨대 재조합체 발현에 의한 폴리펩티드 둘 다를 제공할 수 있다. 구체적으로 당업자는, 입체구조적 에피토프 및 순차적 에피토프 둘 다가 존재하며, 서열 번호 1에 대한 항체와 같은 항체를 검출하는데 사용될 수 있는, 진단상 유용한 폴리펩티드를 수득하기 위해서는 발현 및 정제에 적합한 전략이 선택되어야 함을 알고 있다(예를 들어 문헌(Reischl, U., “Molecular Diagnosis of Infectious diseases”, Humana Press, 1998, 예컨대 챕터 12, 15, 16, 18 및 19)을 참조한다). 당업자는 또한 테스트 시스템용 재조합체 단백질의 유용성을 평가하는 방법을 잘 알고 있다(예를 들어 문헌(Reischl, U., Molecular Diagnosis of Infectious diseases, Humana Press, 1998, 예컨대 챕터 21~26)을 참조한다).
본 발명에 따른 예후, 진단, 방법 또는 키트를 위한 항체 또는 복합체의 검출은 면역확산기술, 면역전기영동기술, 광산란면역검정, 응집기술, 표지화 면역검정, 예컨대 방사능표지화 면역검정, 효소 면역검정, 예컨대 비색 검정, 화학발광 면역검정 및 면역형광기술을 포함하는 군의 검정을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법을 사용하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 복합체는 면역확산기술, 면역전기영동기술, 광산란면역검정, 응집기술, 표지화 면역검정, 예컨대 방사능표지화 면역검정, 화학발광면역검정, 면역형광 기술 및 면역검정 기술을 포함하는 군의 검정을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법이 사용되어 검출된다. 당업자는, 현재의 최신 기술(예컨대 문헌(Zane, H. D. (2001): Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, 구체적으로는 챕터 14))에 기재되어 있기도 한 이러한 방법을 잘 알고 있다. 바람직하게는 테스트 포맷은 ELISA이고, 웰을 포함하는 미세정량 평판이 진단상 유용한 담체로서 사용된다.
바람직하게는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 진단상 유용한 담체의 고상에 부동화된다. 이 폴리펩티드는 시료와 접촉할 때 고상에 직접 부동화될 수 있지만, 경쟁적 검정, 포착 가교 검정(capture bridge assay), 면역계측 검정, 고상상 군 특이적 2차 항체, 직접 또는 간접 군 포착 검정(class capture assay)도 또한 사용될 수 있다. 이러한 포맷 각각의 원리는 문헌(The Immunoassay Handbook, 제3판, David Wild, Elsevier 편저, 2005)에 상세히 기재되어 있다. 더욱 바람직하게는 고상은 ELISA용 미세정량 평판의 웰 또는 테스트 스트립이고, 가장 바람직하게는 ELISA용 미세정량 평판의 웰이다.
바람직한 구현예에서, 검출하고자 하는 항체가 서열 번호 1에 대한 또 다른 항체 또는 서열 번호 1에 특이적으로 결합하는 또 다른 리간드와 경쟁하는 경쟁적 검정 포맷이 사용된다. 서열 번호 1에 특이적으로 결합하는 리간드는 서열 번호 1에 결합하는 앱타머 또는 항체, 인간 ACE2 수용체(서열 번호 39) 또는 이의 변이체, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 천연 결합 파트너를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 방법은 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드와, 서열 번호 1에 특이적으로 결합하는 리간드, 바람직하게는 항체, 앱타머 및 ACE 수용체 또는 이의 변이체를 포함하는 군의 리간드를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 만일 검출하고자 하는 항체가 존재하면, 이 항체는 (또 다른 항체 또는 또 다른 리간드와 서열 번호 1의) 복합체가 형성되는 것을 방해하거나, 또는 서열 번호 1에 특이적으로 결합하는 리간드를 부분적으로나 완전히 대체하여, 이 복합체의 수를 줄일 것이다. 그 다음, 검출하고자 하는 항체를 포함하는 임의의 복합체는, 예컨대 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드에 부착되는 친화성 리간드 또는 검출하고자 하는 항체에 결합하는 분자, 예컨대 2차 항체에 부착되는 친화성 리간드가 사용되어 침전됨으로써 검출될 수 있다. 친화성 리간드의 예로서는 글루타치온 및 비오틴을 포함한다. 친화성 리간드의 결합 파트너는 친화성 리간드, 예컨대 GST 또는 스트렙타비딘이 각각 결합되어 있는 고상에 코팅될 수 있다. 그 다음, 침전된 임의의 복합체는, 바람직하게는 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 리간드에 부착되거나, 또는 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드에 부착되는 검출가능 표지 각각을 검출함으로써 검출될 수 있다. 특이적 경쟁 테스트가 문헌(Tan et al. (2020) “A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2-spike protein protein interation”, Nature Biotechnology 38 (1073-1078))에 발표된 바 있다.
대안적으로 복합체는, 만일 서열 번호 1에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 서열 번호 1 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 리간드가 담체 표면에 코팅되어 있다면, 상기 표면에 형성될 수 있다. 보통, 복합체 형성을 방해하는 IgA, IgM 및 IgG 군 항체의 존재 또는 부재는 이러한 포맷이 사용되어 검출될 것이다. 특이적 IgA 군 항체는, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 또는 2차 항체를 이용하여, 바람직하게는 IgA, IgM 및 IgG 군 항체를 포함하는 군의 이전의 관심 Ig 군 항체, 바람직하게는 Ig를 단리함으로써 검출될 수 있다. 당업자는 앱타머의 합성, 선택 및 용도(Thiviyanathan V, Gorenstein DG. “Aptamers and the next generation of diagnostic reagents”. Prote-omics Clin Appl. 2012;6(11-12):563-573. doi:10.1002/prca.201200042)와, 항체의 합성, 선택 및 용도(Hust M, Frenzel A, Schirrmann T, Diibel S. “Selection of recombinant antibodies from antibody gene libraries”. Methods Mol Biol. 2014;1101 :305-20; Hanack K, Messerschmidt K, Listek M. “Antibodies and Selection of Monoclonal Antibodies”. Adv Exp Med Biol. 2016;917:11-22; Harold F. Stills, “The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents”, 2012), 그리고 특이 표적에 결합하는 항체의 생성 및 선택(Lottspeich/Engels, Bioanalytic, Chapter 6 and references therein, Springer 2012)에 대해 잘 알고 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 만일 검출하고자 하는 항체가 시료중에 존재하면 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드, 예컨대 RBD와, 이 항체를 포함하는 복합체는 액체상 중에 형성될 수 있는데, 그 이유는 이 항체가, 각각이 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 결합 부위를 2개 이상 갖기 때문이다. 그 다음, 검출하고자 하는 항체를 포함하는 임의의 복합체는, 예를 들어 제1 폴리펩티드에 부착되는 친화성 리간드, 예컨대 글루타치온 또는 비오틴과, 예컨대 비드일 수 있는 고상에 코팅된 것으로서, 친화성 리간드, 예컨대 GST 또는 스트렙타비딘과 각각 결합하는 결합 파트너가 사용되어 침전됨으로써 검출될 수 있다. 그 다음, 바람직하게는 제2 폴리펩티드에 부착된 검출가능 표지를 검출함으로써, 침전된 임의의 복합체가 검출될 수 있다. 대안적으로, 만일 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 폴리펩티드가 상기 표면에 코팅되면, 이 복합체는 담체 표면에 형성될 수 있다. 대안적으로, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 각각은, 만일 이 두 폴리펩티드가 서로 가까이 인접하여 있을 때, 예를 들어 검출하고자 하는 항체에 의해 가교될 때에만 검출될 수 있는 상이한 표지 2개로 표지될 수 있다. 또한, 특이적 Ig 군 항체가 이전에 단리되지 않았다면, IgA, IgM 및 IgG 군 항체의 존재 또는 부재는 단백질 A 또는 단백질 G 또는 2차 항체가 사용되어, 바람직하게는 IgA, IgM 및 IgG 군 항체를 포함하는 군, 바람직하게는 IgA로 확인될 것이다. 바람직하게는 감염의 조기 단계에 IgG 항체가 아직 생성되지 않았으면, IgA 항체가 우세하게 검출되거나 단지 검출되기만 할 것이다.
임의의 폴리펩티드, 예컨대 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드 또는 2차 항체는 내인성 형태의 상기 폴리펩티드를 포함하는 조직, 체액 또는 세포, 더욱 바람직하게는 이 폴리펩티드를 과발현하는 세포, 이러한 세포의 미정제 또는 증량 용해물로부터, 본질적으로 순수할 수 있는 정제 및/또는 단리 폴리펩티드로서 임의의 정제 정도와 임의의 형태로 제공될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 원산 폴리펩티드로서, 본원에 사용된 바와 같은 “원산(native) 폴리펩티드”란 용어는, 폴딩된 폴리펩티드를 지칭하고, 더욱 바람직하게는 세포, 더욱 바람직하게는 원핵생물 또는 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포로부터 정제되어 폴딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드의 당화 형태가 사용될 수 있다. 2차 항체는, 예를 들어 친화성 리간드로서 단백질 A 또는 단백질 G를 기반으로 한 정제가 수행된 후에는 바람직하게는 순수(pure)하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라서 사용되거나 제공되는 임의의 폴리펩티드는 유의미한 농도의 변성 시약, 예컨대 티올 함유 화합물, 예컨대 DTT가 부재할 때, 폴딩된 상태로 사용되거나 제공된다.
바람직한 구현예에서, 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체의 존재 또는 부재가 검출된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, IgA의 존재 또는 부재만이 검출된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, IgM의 존재 또는 부재만이 검출된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, IgG의 존재 또는 부재만이 검출된다.
바람직한 구현예에서, IgA의 존재 또는 부재와, IgG의 존재 또는 부재가 검출된다. 더욱 바람직하게는 IgA 군 항체에 대한 2차 항체와, IgG 군 항체에 대한 2차 항체가 이 검출에 사용 또는 제공된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, IgM의 존재 또는 부재와, IgG의 존재 또는 부재가 검출된다. 더욱 바람직하게는 IgM군 항체에 대한 2차 항체와, IgG 군 항체에 대한 2차 항체가 이 검출에 사용 또는 제공된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, IgM의 존재 또는 부재와, IgA의 존재 또는 부재가 검출된다. 더욱 바람직하게는, IgM 군 항체에 대한 2차 항체와, IgA 군 항체에 대한 2차 항체가 이 검출에 사용 또는 제공된다.
바람직한 구현예에서, 항체, 예를 들어 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG의 존재 또는 부재는, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 사용되어 검출될 수 있지만, 이 폴리펩티드는 추가의 서열, 바람직하게는 인공 서열, 예컨대 링커 또는 결합 에피토프를 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 추가 서열은 서열 번호 1 또는 이의 변이체가 검출하고자 하는 항체와 특이적으로 결합하는 능력 또는 진단 신뢰성, 구체적으로 민감도 및/또는 특이성이 소실되는 것은 고사하고, 유의미하게 변경되지 않도록 선택된다. 예를 들어 서열 번호 1에 결합하여 에피토프를 마스킹(masking)하는 도메인 또는 이의 단편은 이 폴리펩티드에 융합되어서는 안되거나 존재해서는 안된다. 본 발명에 따르면, SARS-CoV-2 항원, 바람직하게는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 항원, 서열 번호 30 또는 이의 변이체를 포함하는 항원, 서열 번호 31 또는 이의 변이체를 포함하는 항원 및 서열 번호 33 또는 이의 변이체를 포함하는 항원을 포함하는 군의 항원, 바람직하게는 이 모든 항원에 대한 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 면역글로불린을 검출하는 2차 항체는 진단, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염의 조기 진단을 위해 검출될 수 있거나 사용될 수 있다. 서열 번호 30 또는 이의 변이체를 포함하는 항원, 서열 번호 31 또는 이의 변이체를 포함하는 항원 및 서열 번호 33 또는 이의 변이체를 포함하는 항원을 포함하는 군으로부터 선택되는 항원, 바람직하게 이 모든 항원은, 각각의 항원 또는 항원들에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위해 진단상 유용한 담체에 코팅될 수 있으며, 바람직하게는 공간상 격리될 수 있거나 혼합물 중에 있을 수 있으며, 시료와 접촉할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 서열 번호 1을 제외한, SARS-CoV-2 항원에 대한 항체를 검출하는 것에 더하여, 서열 번호 1에 대한 항체를 검출하는 것은, 검정, 구체적으로는 SARS-CoV-2 감염의 조기 단계 진단 또는 조기 단계 감별 진단의 전체 민감도를 증가시킬 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 물품, 방법 및 용도는, 서열 번호 1에 대한 항체의 존재 또는 부재를, 또 다른 SARS-CoV-2 항원 또는 기타 항원 1가지 이상, 바람직하게는 SARS-CoV-2 N 단백질, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 N 단백질, SARS-CoV-2 M 단백질 및 SARS-CoV-2 E 단백질을 포함하는 군, 가장 바람직하게는 서열 번호 1에 존재하는 것을 제외한 SARS-CoV-2 N 단백질, SARS-CoV-2 M 단백질, SARS-CoV-2 E 단백질 및 SARS-CoV-2 S 단백질 에피토프를 포함하는 군에 대한 항체와 구별할 수 있도록 구성된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는, 서열 번호 1에 대한 항체의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 때, 이러한 기타 SARS-CoV-2 항원 또는 기타 코로나바이러스 항원과 공간상 격리된다. 예를 들어 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 담체상에 단리되어 있을 수 있으며/있거나 순수할 수 있다. 예를 들어 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 블럿 또는 미세정량 웰 또는 비드상에 기타 항원과 공간상 격리되어 있을 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 물품, 방법 및 용도는, 검출된 항체가 어떤 면역글로불린 군에 속하는지를 확정되지 않고, 서열 번호 1에 대한 항체의 존재 또는 부재가 검출될 수 있도록 구성된다. 이는 종종 1개 이상의 항원, 예컨대 서열 번호 1에 대한 “총 항체(total antibody)”를 검출하는 것이라 지칭된다. IgA 및 IgG를 비롯한 총 항체의 검출은, 검정의 민감도를 증가시키는데, 그 이유는 조기 단계에 존재하는 IgA군 항체와, 후기 단계에 존재하는, 서열 번호 1에 대한 IgA 및 IgG 군 항체는 서열 번호 1에 대한 총 항체의 일부로서 검출되기 때문이다. 더욱 바람직하게는 기타 SARS-CoV-2 항원은 존재하지 않거나, 공간상 격리되어 있거나, 또 다른 SARS-CoV-2에 대한 항체는 서열 번호 1에 대한 항체에 의해 발생하는 신호와 구별될 수 있는 신호를 발생시키기 때문에, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 항체는, 이와 같은 또 다른 SARS-CoV-2 항원, 예컨대 N 단백질(서열 번호 30) 또는 S2 도메인(서열 번호 32)에 대한 항체와 구별될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 물품, 방법 및 용도는, 검출된 항체가 서열 번호 1과 결합하는지를 확정하지 않고, 서열 번호 1에 대한 항체, 또는 또 다른 SARS-CoV-2 항원, 예컨대 N 단백질 또는 S2 단백질에 대한 항체의 존재 또는 부재가 검출될 수 있도록 구성된다. 이는, N 단백질(서열 번호 30) 또는 이의 변이체, 또는 S2 도메인(서열 번호 32) 또는 이의 변이체와 함께, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 항원의 혼합물을 사용함으로써 달성될 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, S1 도메인 및 S2 도메인을 포함하는 전 스파이크 단백질(서열 번호 32)은, 선택적으로 N 단백질(서열 번호 30)과 함께 사용될 수 있다. 또한 조기 단계에 존재하는, 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체와, 후기 단계에 존재하는 서열 번호 1에 대한 IgA 및 IgG 군 항체는 서열 번호 1에 대한 총 항체로서 검출되기 때문에, IgA 및 IgG를 비롯하여 서열 번호 1에 대한 항체는 이러한 검정의 민감도를 증가시키고, 이로써 검정의 민감도는 증가한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 물품, 방법 및 용도는 검출된 항체가 어떤 면역글로불린 군에 속하는지를 확정하지 않고도, 서열 번호 1에 대한 항체의 존재 또는 부재가 검출될 수 있도록 구성된다. 이 절차는 종종 서열 번호 1과 같은 항원 1개 이상에 대한 “총 항체”의 검출 절차라고 지칭된다. 조기 단계에 존재하는 IgA군 항체는 서열 번호 1에 대한 항체의 일부로서 검출되므로, IgA 및 IgG를 비롯한 총 항체의 검출은 검정의 민감도를 증가시킨다.
바람직한 구현예에서, 서열 번호 1에 대한 항체의 부재는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는, 단리, 순수 및/또는 재조합체 폴리펩티드가 사용되어 검출될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 서열 번호 30에 의해 한정되는 SARS-CoV-2 N 단백질에 대한 항체의 존재 또는 부재는, 바람직하게는 IgA, IgG 및/또는 IgM 항체, 더욱 바람직하게 IgG 또는 IgM 항체, 가장 바람직하게는 IgG 항체에 더하여 확정된다. 이러한 목적으로 본 발명에 따른 담체는 서열 번호 30 또는 이의 변이체에 의해 한정되는 SARS-CoV-2 N 단백질을 포함하는 폴리펩티드로 코팅될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 서열 번호 31에 의해 한정되는 SARS-CoV-2 S1 도메인의 수용체 결합 도메인(RBD)에 대한 항체의 존재 또는 부재가 검출된다. 이러한 목적으로 본 발명에 따른 담체는 서열 번호 31 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드로 코팅될 수 있다.
바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 서열 번호 32에 의해 한정되는 SARS-CoV-2 S2 도메인에 대한 항체의 존재 또는 부재가 검출된다. 이러한 목적으로 본 발명에 따른 담체는 서열 번호 32 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 2차 항체는 항체 군 또는 면역글로불린 군, 바람직하게는 인간 항체 군, 바람직하게는 IgA 및/또는 IgG 및/또는 IgM 항체, 바람직하게는 IgA 항체의 항체 모두와 결합하는 항체이다. 2차 항체는, 통상 상기 군의 불변 도메인을 인지하거나, 상기 Ig 군 항체에 의해 공유되는 3D 구조 또는 서열에 걸쳐 다양한 에피토프와의 결합 부위들을 가지는 다가(polyvalent)이다. 2차 항체는, 통상 인간을 제외한 포유동물 또는 조류(bird), 바람직하게는 닭, 토끼, 마우스, 래트, 말, 돼지, 당나귀, 염소, 소, 낙타, 라마 또는 인간 이외의 영장류로부터 유래한다. 이처럼 다양한 동물은 시판되고 있다.
본 발명에 따르면, SARS-CoV-2 감염은 조기 단계, 바람직하게는 질병의 증상이 발현된 후 5일 이내에 증가한 감도로 검출될 수 있다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 진단 결과를 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 평가는 테스트된 개체를 위해 치료가 필요한지 여부를 결정하기 위해 수행된다. 진단 결과의 평가는, 진단 결과가 양성으로 나오면 전문의가 적당한 치료를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 중요한 점은, 평가를 제외한 본 발명의 방법은 하나의 장소, 예컨대 한 국가에서 수행될 수 있고, 진단 결과의 평가는 상이한 장소에서 수행될수 있다는 점이다.
상이한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 진단 또는 평가 결과를 상이한 장소에 이송하는 단계를 추가로 포함한다. 이 바람직한 구현예는, 선택적으로 평가 단계를 포함하는 본 발명의 방법이 하나의 장소, 예컨대 하나의 국가에서 수행되고, 진단 및 평가 결과 각각이 상이한 장소, 예컨대 상이한 국가로 이송되는 사례에 관한 것이다. 이송은, 당업자가 이용 가능한 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 이 수단으로서는 데이터의 전자 이송뿐 아니라, 판독 자료의 실물 이송을 포함한다. 이 바람직한 구현예에 따르면, 특히 양성 결과를 보인 사례의 환자를 치료하는 전문의 또는 임상의는 성공적 치료를 위해 적당한 단계를 취할 수 있다. 진단상 유용한 담체는, 바람직하게는 유리 슬라이드, 바람직하게는 현미경용 유리 슬라이드, 바이오칩, 마이크로어레이, 미세정량 평판, 측방 유동 디바이스, 테스트 스트립, 막, 예컨대 니트로셀룰로스 막, 바람직하게는 라인 블럿, 크로마토그래피 컬럼 및 비드를 포함하는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 미세정량 평판이다.
바람직한 구현예에서, 진단상 유용한 담체는 라인 블럿이다(Raoult, D., and Dasch, G. A. (1989), “The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gram-negative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1-2), 57-65; WO2013041540). 바람직한 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 “라인 블럿”이란 용어는, 항체를 특이적으로 포착하기 위한 수단 1가지 이상(바람직하게 이 수단은 각각 폴리펩티드임)이 코팅된 테스트 스트립, 더욱 바람직하게는 막 기반 테스트 스트립을 지칭한다. 만일 2가지 이상의 수단이 사용되면, 이 수단은, 바람직하게는 담체상에서 공간상 격리된다. 바람직하게는 밴드의 폭은 테스트 스트립 폭의 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%이다. 라인 블럿은, 이것이 적당한 조건, 구체적으로 인간 혈청의 존재하에 충분히 오래 시료와 접촉하였음, 또는 2차 항체와 접촉하였음을 각각 확인하기 위한 대조군 밴드 1개 이상을 포함할 수 있다. 라인 블럿은, 바람직하게는 니트로셀룰로스 막으로 제조된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 진단상 유용한 담체는 비드이다. 다수의 용도를 위한 다양한 비드, 주로 탄수화물, 예컨대 세파로스 또는 아가로스, 아니면 플라스틱을 주성분으로 하는 비드가 시판되고 있다. 비드는 특이적으로 항체를 포착하기 위한 수단을 부동화하기 위해 이용될 수 있는 활성 또는 활성화 가능한 화학기, 예컨대 카복실기 또는 토실기 또는 에스테르기를 함유할 수 있다. 바람직하게는 비드는 평균 직경이 0.1 μm 내지 10 μm, 0.5 μm 내지 8 μm, 0.75 μm 내지 7 μm 또는 1 μm 내지 6 μm인 비드이다. 비드는 직접 코팅될 수 있거나, 또는 친화성 리간드, 예컨대 비오틴 또는 글루카치온 및 스트렙타비딘 또는 GST 각각을 통해 항체를 특이적으로 포착하기 위한 수단을 통해 코팅될 수 있다. 예를 들어 비드는 비오틴 또는 글루타치온으로 코팅될 수 있으며, 항원은 스트렙타비딘 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라아제 또는 이의 변이체 각각과 융합될 수 있다. 바람직하게는 비드는, 비드 함량이 10% 내지 90%(w/w), 바람직하게는 20% 내지 80%, 바람직하게는 30% 내지 70%, 더욱 바람직하게는 40% 내지 60%인 수성 현탁액의 형태로 제공된다. 당업자는, 이러한 비드가, 예를 들어 Bio-Plex COOH 비드 MC10026-01 또는 171-506011로서 Bio-Rad에 의해 시판되고 있음을 잘 알고 있다(Diamindis, E. P., Chriopoulus, T. K., Immunoassays, 1996, Academic Press).
특히 바람직한 구현예에서, 비드는 자석의 도움을 받아 표면상에 용이하게 집약될 수 있는 상자성 비드이다. 이를 위해, 시판중인 상자성 비드는, 보통 상자성 무기물, 예컨대 산화철을 함유한다. 적합한 상자성 비드 다수가 시판되고 있다. 비드는 검출가능한 표지로 표지화될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상자성 비드는, 존재하던 완충제가 제거되고, 새로운 완충제가 첨가된 후, 여기에 자기장이 적용됨으로써 집약되어 부동화됨으로써, 완충제 중에서 사용, 세척 또는 항온처리된다. 이후, 새 완충제 중에 비드가 더 효율적으로 현탁되도록 만들기 위해 자기장은 적용이 중단된다. 완충제는 2차 항체를 포함하는 완충제, 항온 처리 완충제, 희석된 환자 시료를 비롯하여, 본 발명에 따라 사용되는 임의의 완충 용액일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항체는 화학발광 표지가 사용되어 검출된다. 바람직한 구현예에서, 이는, 바람직하게는 루시퍼라아제, 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제 및 베타-갈락토시다아제 또는 이의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 화학발광 효소로서, 자체가 소모되지 않고도 화학발광 기질을 전환시킬 수 있는 화학발광 효소이다(Kricka, L. J. (2003). “Clinical applications of chemiluminescence”. Analytica chimica acta, 500(1): 279-286). 또 다른 바람직한 구현예에서, 화학발광 표지는 신호 발생에 필요한 무기 화합물 및/또는 비 효소 유기 화합물을 포함하는 화학발광 기질 용액과 접촉하여 분해될 때 화학발광 신호를 발생시키는, 화학발광 반응을 촉매화하는 효소 활성을 가지지 않는 소형 유기 화합물이다. 바람직하게는 효소 활성을 가지지 않는 소형 유기 화합물은 아크리디늄 에스테르(Weeks, I., Beheshti, I., McCapra, F., Campbell, A. K., Woodhead, J. S. (1983) “Acridinium esters as high specific activity labels in immunoassay.” Clin Chem 29: 1474-1479)와, 루미놀 또는 이의 화학발광 유도체, 예컨대 이소루미놀을 포함하는 군으로부터 선택된다. 이러한 소형 유기 화합물은 2차 항체에 커플링될 수 있다. 루미놀의 경우, 기질 용액은 pH가 높은 H2O2를 포함한다. 아크리디늄 에스테르의 경우, H2O2 및 수산화나트륨의 혼합물이 종종 사용된다. 소형 유기 화합물은 화학발광 신호가 발생할 때 소모된다. 바람직한 구현예에서, 화학발광 표지의 화학발광은 화학발광 검출 반응 개시 후 1초 내지 60초, 바람직하게는 2초 내지 20초, 더욱 바람직하게는 3초 내지 15초 동안 검출된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 화학발광 표지의 화학발광은 적어도 0.5초, 1초, 1.5초, 2초, 2.5초 또는 3초 동안 검출된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 담체는 ELISA에 사용될 수 있는, 웰을 적어도 8개 포함하는 미세정량 평판이다. 웰 중 적어도 1개는 항체를 직접적으로나 간접적으로 특이 포착하는 수단, 바람직하게는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드로 코팅된다. 소정 농도의 표준물질 적어도 3개, 바람직하게는 4개, 더욱 바람직하게는 5개가 반정량 분석을 위한 교정 곡선을 확립하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법이 수행되면, 통상 교정 곡선에서 일정 범위에 걸친 다양한 농도만큼에 해당하는 표준물질이 가공되어 시료와 동시에 전개될 수 있다. 검출가능 표지, 예컨대 효소 활성 표지, 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다아제 활성 또는 알칼리성 포스파타아제 활성을 가지는 표지 또는 화학발광할 수 있는 효소를 포함하는 2차 항체가 제공될 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 담체는 마이크로어레이이다. 바람직한 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 “마이크로어레이”란 용어는, 공간상 격리된 항원 다수, 바람직하게는 적어도 20개, 바람직하게는 30개, 40개, 50개, 80개 또는 100개가 스포팅(spotting)된 칩을 지칭한다. 바람직하게는 각각의 항원은 서열 번호 1의 단편에 걸쳐있는, 더욱 바람직하게는 RBD(서열 번호 31)에 걸쳐있는 연속 아미노산 5개~25개, 바람직하게는 7개~15개를 포함하거나 이것들로 이루어진 펩티드이다. 표지, 바람직하게는 형광 표지를 포함하는 2차 항체가 검출에 사용될 수 있다. 바람직하게는 기타 항원, 더욱 바람직하게는 서열 번호 30(SARS-CoV-2 N 단백질) 및 서열 번호 33(SARS-CoV-2 S2 단백질)을 포함하는 폴리펩티드 군의 항원이 스포팅된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 현미경 면역형광 분석용 담체 위에 있거나 또는 그 일부인 유리 슬라이드가 사용된다. 세포, 바람직하게는 진핵생물 세포, 예컨대 HEK293 세포는 슬라이드 상에 놓인다. 이는 적재 완충제(mounting buffer)로 덮일 수 있다. 다양한 조성물과 방법이 현재 최신 기술 문헌, 예컨대 문헌(“Mountants and Antifades”Wright Cell Imaging Facility, Toronto Western Research Institute University Health Network 발행, (https://de.scribd.com/document/47879592/Mountants-Antifades), Krenek et al. (1989) “Comparison of antifading agents used in immunofluorescence”, J. Immunol. Meth 117, 91-97 및 Nairn et al. (1969) “Microphotometry in Immunofluorescence”, Clin. Exp. Immunol. 4, 697-705)에 기재되어 있다. 세포는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 발현, 바람직하게는 과발현한다. 담체는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 과발현하는 세포에 형질감염된 벡터와 동일하되, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산은 포함하지 않는 벡터가 형질감염된, 모의 형질감염 세포(mock-transfected cell)를 포함할 수 있다. 이러한 모의 형질감염 세포는 음성 대조군으로 사용될 수 있다. 또 다른 세포는 항체를 검출하기 위한 추가의 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 항원, 예컨대 N 단백질, S2 단백질 또는 RBD를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 항체를 검출하기 위해 면역형광이 이용될 수 있다. 당업자는 그 방법을 잘 알고 있다(Storch, W. B., “Immunofluorescence in Clinical Immunology: A Primer and Atlas”, Birkhauser, 2000; Wesseling JG, Godeke GJ, Schijns VE, Prevec L, Graham FL, Horzinek MC, Rottier PJ. “Mouse hepatitis virus spike and nucleocapsid proteins expressed by adenovirus vectors protect mice against a lethal infection”. J Gen Virol. 1993 Oct;74 (Pt10):2061-9. doi: 10.1099/0022-1317-74-10-2061. PMID: 8409930). 요약하면, 항원, 바람직하게는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는, 담체, 즉 상기 항체를 발현하는 세포일 수 있는 담체에 부동화된 다음, 시료와 접촉하게 되며, 그 후에는, 바람직하게는 형광 표지로 표지된 항체를 검출하기 위한 수단이 사용되어 형광에 의해 검출하고자 하는 항체가 검출된다. 바람직한 구현예에서, 세포는 폴리펩티드를 과발현하는 진핵생물 세포로서, 예컨대 HEK, Hela, CHO 및 Jurkat 세포 및 이의 파생 세포(derivative)를 포함하는 군으로부터 선택되는 세포이다. 바람직한 구현예에서, 세포는, 바람직하게는 이종의 강력한 프로모터 제어 하에 폴리펩티드를 과발현하는 재조합체 세포이다.
본 발명에 따르면, 항체를 검출하기 위해 측방 유동 디바이스가 사용될 수 있다. 당 업자는 이러한 목적의 측방 유동 디바이스를 잘 알고 있다(“Lateral Flow Immunoassay”, Raphael Wong, Harley Tse 편저, 2009, Springer; “Paper-based diagnostics: Current Status and Future applications”, Kevin J. Land, Springer 2019). 요약하면, 측방 유동 검정은 검출가능한 표지를 포함하는, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 막, 예컨대 니트로셀룰로스 막을 기반으로 할 수 있다. 만일 막이 시료와 접촉하게 되면, 검출하고자 하는 항체는 항원과 결합할 것이다. 형성된 복합체는 막상에서 모세관력에 의해 이동이 촉발될 것이고, 항체, 통상적으로는 검출될 면역글로불린 군 또는 항체 군들 또는 항체들, 예컨대 IgG 및/또는 IgA 및/또는 IgM과 결합하는 2차 항체를 검출하기 위한 수단을 포함하는 막 상 테스트 라인에 부동화될 것이다. 바람직하게는 나노입자 또는 비드, 예컨대 금 나노입자 또는 라텍스 비드가 표지로서 사용된다.
본 발명에 따르면, 폴리펩티드, 바람직하게는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 재조합체 단백질일 수 있는데, 여기서 본원에 사용된 바와 같은 “재조합체”란 용어는 임의의 생산 공정 단계에서 유전자 조작 접근법, 예컨대 이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 강력한 프로모터에 융합시켜, 세포나 조직 내에서 과발현시키는 방법에 의해 제조되었거나, 또는 폴리펩티드 자체의 서열을 조작하여 제조된 폴리펩티드를 지칭한다. 당업자는, 핵산 및 암호화된 폴리펩티드를 조작하기 위한 방법(예를 들어 문헌(Green M. R. and Sambrook, J. (2012), Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Fourth Edition, CSH or in Brown T. A. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall)에 기재됨)과, 원산 또는 재조합체 폴리펩티드를 제조 및 정제하기 위한 방법(예를 들어 문헌(Handbooks,,Strategies for Protein Purification", ,,Antibody Purification", published by GE Healthcare Life Sciences, and in Burgess, R. R., Deutscher, M. P. (2009): Guide to Protein Purification)에 기재됨)을 잘 알고 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드로서, 여기서 “단리된”이란 용어는, 폴리펩티드가 생물공학적 접근법 또는 합성에 의한 접근법이 사용되어 제조 당시의 상태에 비해 증량된 경우, 바람직하게는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색과 시각에 의한 관찰로 판단되었을 때, 폴리펩티드가 순수한 경우, 즉 각각의 액체 중 폴리펩티드 적어도 60 퍼센트, 70 퍼센트, 80 퍼센트, 90 퍼센트, 95 퍼센트 또는 99 퍼센트가 상기 폴리펩티드를 이루는 경우를 지칭한다. 바람직하게는 항체를 포착하기 위한 수단으로 사용된, 담체상 임의의 폴리펩티드는 순수하다.
바람직한 구현예에서, 생물물리학적 검출 방법이 사용되어 기타의 분자들과 분자 모집단을 구별하는데 사용될 수 있는 검출가능 표지는 본 발명에 따른 항체를 검출하기 위해 사용된다. 이 검출가능 표지는, 바람직하게는 형광 표지, 방사능 표지, 화학발광 표지, 중금속 표지, 예컨대 금 표지, 나노입자, 비드 또는 효소 활성 표지, 바람직하게는 비색 반응을 촉매화하는 표지를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 형광 표지는 Alexa 염료, FITC, TRITC 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 요오드-125는 방사능 표지로서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 효소 활성인 표지는 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 글루코스 옥시다아제, 베타 갈락토시다아제, 알칼리성 포스파타아제 및 루시퍼라아제를 포함하는 군으로부터 선택된다. 당 업자는 적합한 표지를 선택할 수 있고, 이 표지를 단백질, 핵산 및 기타 분자에 부착시킬 수 있으며(Has-sanzadeh L, Chen S, Veedu RN. “Radiolabeling of Nucleic Acid Aptamers for Highly Sensitive Disease-Specific Molecular Imaging.” Pharmaceuticals (Basel). 2018; 11 (4):106. Published 2018 Oct 15. doi:10.3390/ph11040106 Hassanzadeh L, Chen S, Veedu RN. “Radiolabeling of Nucleic Acid Aptamers for Highly Sensitive Disease-Specific Molecular Imaging.” Pharmaceuticals (Basel). 2018; 11 (4):106. Published 2018 Oct 15. doi:10.3390/ph11040106, Bioconjugate Techniques, 3rd Edition (2013) by Greg T. Hermanson, Obermaier C, Griebel A, Westermeier R. “Principles of protein labeling techniques.” Methods Mol Biol. 2015;1295:153-65), 표지된 분자로서 다양한 것들이 시판되고 있다.
본 발명에 따르면, 서열 번호 1에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 수단이 제공된다. 바람직한 구현예에서, 검출가능 표지를 포함하는 2차 항체는 IgA 및/또는 IgG 및/또는 IgM 군 항체, 바람직하게는 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1 및 또 다른 코로나바이러스 항원을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 퍼옥시다아제 활성을 가지는 단백질은 효소 활성 표지로서 사용될 수 있다. 바람직하게는 2차 항체는 포유동물 항체, 더욱 바람직하게는 인간 항체를 인지한다. 만일 하나의 Ig 군의 항체가 검출되면, 2차 항체 2개, 바람직하게는 IgA 군 항체에 결합하는 2차 항체 1개와 IgG 군 항체에 결합하는 2차 항체 1개가 사용될 수 있다. 2차 항체 2개는 혼합물로서 또는 별도의 항체로서 존재할 수 있는데, 바람직하게는 예를 들어 다수의 환자에서 IgA 군 항체는 IgG 군 항체보다 더 이른 시기에 출현한다는 사실에 입각하여 질환의 경과에 관한 정보를 수득하기 위해, 상이한 Ig 군의 항체, 예컨대 IgA, IgM 및 IgG 항체, 바람직하게는 IgG 및 IgA와 같은 항체의 별도 검출이 허용되도록 별도의 항체로서 존재할 수 있다. 대안적으로 1개를 초과하는 Ig 군의 항체, 예컨대 IgG, IgA 및 IgM를 포함하는 군의 항체와 결합하는 2차 항체 1개, 바람직하게는 IgG 및 IgA 군 항체와 결합하는 2차 항체 1개가 사용될 수 있다. 2차 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 2차 항체는 인간 이외의 포유동물로부터 유래하지만, 임의의 Ig 군 인간 항체, 바람직하게는 IgA, IgG 및/또는 IgM과 결합한다. 당업자는 2차 항체의 제조 및 용도를 잘 알고 있다(Kalyuzhny, A., “Immunohistochemistry, Essential Elements and Beyound”, Springer, 2017, 구체적으로 챕터 4; Howard, G. C., and Bethell, D. R., “Basic Methods in Antibody Production and Characterization”, 2000, CRC press). 선택적으로 표지, 예컨대 형광 표지를 가지는 2차 항체 다수, 예를 들어 FITC-표지화 2차 항체 Cat # H15101 , Cat # 62-8411 Cat # A24459, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 표지화 2차 항체 Cat # 31420, Cat # SA1-35467, Cat # SA1-35467, Cat # SA1-35467, 그리고 Thermo Fisher사의 다른 2차 항체가 시판되고 있다. 2차 항체 또는 앱타머의 표지된 단편도 또한 사용될 수 있다. 당업자는, 예를 들어 검출하고자 하는 항체 또는 항체들, 바람직하게는 IgG 및/또는 IgA 및/또는 IgM 항체에 특이적으로 결합할 때, 서열 번호 1에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수도 있는 앱타머의 합성, 선택 및 용도(Thiviyanathan V, Gorenstein DG. Aptamers and the next generation of diagnostic reagents. Proteomics Clin Appl. 2012;6(11-12):563-573.doi:10.1002/prca.201200042) 및 특이적 항체의 제조(Hust M, Frenzel A, Schirrmann T, Diibel S. Selection of recombinant antibodies from antibody gene libraries. Methods Mol Biol. 2014; 1101 :305-20; Hanack K, Messerschmidt K, Listek M. Antibodies and Selection of Monoclonal Antibodies. Adv Exp Med Biol. 2016;917:11-22; Harold F. Stills, in The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents, 2012)를 잘 알고 있다. 이러한 앱타머는 검출하고자 하는 항체 또는 항체들의 불변 영역 또는 기타 부분의 에피토프와 특이적으로 결합할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드, 바람직하게는 수용체 결합 도메인(서열 번호 31)은 서열 번호 1에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로 상기 폴리펩티드는 진단상 유용한 담체에 코팅될 수 있으며, 검출될 임의의 항체를 포착하는데 사용될 수 있다. 인간 항체는 1개를 초과하는 결합 부위를 가지므로, 포착된 항체의 항원 결합 부위 오직 1개만이 점유될 수 있다. 담체에 코팅되지 않은 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 또 다른 폴리펩티드의 후속 추가는, 이렇게 새로이 추가된 폴리펩티드가 또 다른 결합 부위를 점유하도록 유도할 수 있다. 이후, 코팅된 폴리펩티드, 검출하고자 하는 항체 및 다른 하나의 폴리펩티드를 포함하는 복합체가 검출될 수 있다. 더욱 바람직하게는 이 다른 하나의 폴리펩티드는 검출가능 표지를 운반하고, 이 표지는 복합체를 검출하는데 사용된다. 이 구현예에서, 모든 항체, 더욱 구체적으로 IgA, IgM 및 IgG 군 항체가 검출될 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 서열 번호 1 내 수용체 결합 도메인에 결합하는 서열 번호 39(ACE2) 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는, 선택적으로 ACE2 수용체에 결합하는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드와 함께, 서열 번호 1에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 그 다음, 경쟁적 검정 포맷이 이의 존재를 검출하는데 사용된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 변별적 면역글로불린 군에 결합하는 특이적 단백질은 검출가능 표지로 표지화될 수 있으며, 서열 번호 1에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들어 단백질 G, A 및 L은 IgG군 항체와 결합하는 세균 단백질인 반면(L. Bjorck, G. Kronvall: “Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent.” , Journal of Immunology. 133(2)/1984.), 자칼린(jacalin)(Abeam, ThermoFisher)은 IgA군 항체의 결합을 위해 사용될 수 있다(예를 들어 문헌(Choe et al., Materials (Basel). 2016 Dec; 9(12): 994; Wilkinson & Neville Vet Immunol Immunopathol. 1988 Mar;18(2):195-8)을 참조한다).
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 키트는, 바람직하게는 진단상 유용한 담체, 더욱 바람직하게는 미세정량 평판에 코팅된 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드와, 표준물질, 양성 대조군, 음성 대조군, 세척 완충제, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 바람직하게는 항체, 더욱 바람직하게는 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체와 특이적으로 결합하는 2차 항체(단 이 2차 항체는 검출가능 표지를 포함할 수 있음)의 존재를 검출하기 위한 수단, 시료 완충제, 검출 용액, 바람직하게는 크로모겐/기질 용액 및 정지 용액을 포함하는 군의 시약 1개 이상, 바람직하게는 모두와 및 보호용 호일을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 표준물질은 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 시약으로서, 바람직하게는 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체를 인지하는 2차 항체에 의해 인지된다. 표준물질은 서열 번호 1에 대한 IgA 항체일 수 있다. 대안적으로 표준물질은, 바람직하게는 변별적 면역글로불린 군들, 바람직하게는 IgA 및/또는 IgG 및/또는 IgM에 의해 공유되는 불변 영역 또는 기타 영역 또는 에피토프와, 가변 영역, 구체적으로 인공 항체로부터 유래하는 결합 부위를 포함하는 키메라 항체일 수 있다. 당업자는, 이러한 표준물질의 디자인, 제조 및 용도를 잘 알고 있다(Lutkecosmann S, Faupel T, Porstmann S, Porstmann T, Micheel B, Hanack K. “A cross-reactive monoclonal antibody as universal detection antibody in autoantibody diagnostic assays”. Clin Chim Acta. 2019 Dec;499:87-92. doi: 10.1016/j.cca.2019.09.003. Epub 2019 Sep 4. PMID: 31493374, Hackett J Jr, Hoff-Velk J, Golden A, Brashear J, Robinson J, Rapp M, Klass M, Ostrow DH, Mandecki W. “Recombinant mouse-human chimeric antibodies as calibrators in immunoassays that measure antibodies to Toxoplasma gondii”. J Clin Microbiol. 1998 May;36(5):1277-84. doi:, W02009081165A1). 바람직한 구현예에서, 양성 대조군은, SARS-CoV-2 발병 환자의 시료로부터 유래한 화합물, 예컨대 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA, IgG 및 IgM 군 항체를 포함하는 군의 항체, 더욱 바람직하게는 IgA를 포함하는 용액이다. 음성 대조군은 이러한 화합물이 결실된 시약으로서, 건강한 사람으로부터 유래한 혈청을 포함할 수 있다. 세척 완충제는 항온처리 후 비특이적 항체를 제거하기 위해 담체, 예컨대 미세정량 평판을 세척하는데 사용될 수 있는 것으로서, PBS일 수 있다. 항체의 존재를 검출하기 위한 수단은, 검출하고자 하는 항체 군, 바람직하게는 인간 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체에 결합하는 2차 항체일 수 있으며, 검출가능 표지, 바람직하게는 효소, 더욱 바람직하게는 퍼옥시다아제 활성을 가지는 효소로 표지된다. 시료 완충제는 환자의 시료를 희석하는데 사용될 수 있으며, PBS일 수 있다. 검출 용액은 표지된 2차 항체가 존재할 때 신호를 수득할 수 있으며, 바람직하게는 발색 용액, 더욱 바람직하게는 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘/H2O2이다. 정지 용액은 검출 용액의 반응을 정지시키기 위해 첨가될 수 있으며, 강산, 바람직하게는 0.5 M 황산을 포함할 수 있다. 보호용 호일은, 증발을 방지하기 위해 미세정량 평판과 같은 담체의 상단에 배치될 수 있다.
본 발명에 따른 임의의 시약은 보존제, 예컨대 아지드를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 진단 키트를 제조하기 위한, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드 또는 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA 군 항체의 용도가 제공된다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드 또는 항체는 이러한 키트의 구성성분의 하나로서 포장된다. 폴리펩티드 또는 항체는 키트 제조시 품질을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 항체는 진단상 유용한 담체에 코팅되어 있거나 분리되어 있는 키트의 구성성분인 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드의 반응성을 확인하기 위한 양성 대조군으로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 키트의 일부인, 서열 번호 1에 특이적으로 결합하는 항체의 반응성을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 제조 과정의 일환으로서 진단상 유용한 담체를 코팅하는 과정에 사용될 수 있다. 폴리펩티드와 항체 둘 다는 담체와 키트를 제조하는데 사용되는 완충 용액 중 항체 또는 폴리펩티드 농도 각각을 확정하거나, 세포가 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는지 아닌지를 검사하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 서열 번호 1에대한 항체, 바람직하게는 IgA군 항체는 SARS-CoV-2 감염을 진단하기 위해 사용되거나, 또는 본 발명에 따른 감별 진단을 위해 사용된다. 용도는 항체 자체를 검출하거나, 또는 서열 번호 1에 대한 기타 항체 또는 기타 SARS-CoV-2 항원에 대한 항체와 함께 항체를 검출하여, 진단 검정의 전체 민감도를 증가시키는 것에 관한 것일 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, IgA 군 항체는, 구체적으로 감염 조기 단계에 진단 검정의 민감도를 증가시키기 위해 사용된다. 이는, IgG 군 항체뿐 아니라, IgA 군 항체, 선택적으로는 서열 번호 1에 대한 IgM 군 항체, 또는 IgA만을 검출함으로써 달성될 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, IgG군 항체는, 구체적으로 기타 항원에 대한 항체, 예컨대 SARS-CoV-2의 N 단백질에 대한 IgG군 항체의 농도 감소를 보이는 기간에 걸친 진단 검정, 예컨대 SARS-CoV-2 감염 후기 단계 동안에 이루어진 진단 검정의 민감도를 증가시키기 위해 사용된다. 이는, 서열 번호 1에 대한 IgG 군 항체뿐 아니라, IgA 군 항체, 선택적으로는 IgM 군 항체, 또는 IgG만을 검출함으로써 달성될 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 항체는 상기 항체, 바람직하게는 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 바람직하게는 이 모두를 포함하는 표준물질을 사용하여 디바이스 또는 검정을 교정함으로써 진단을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 서열 번호 1에 대한 IgA 항체 및/또는 IgG 항체는 면역화의 후기 단계에 민감도를 증가시키기 위해 사용된다. 항체는 검정의 인증, 교정, 시약 또는 검정 재료, 예컨대 진단상 유용한 담체의 품질 확인을 위해 사용될 수 있거나, 또는 양성 대조군으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA군 항체는 진단 키트, 바람직하게는 SARS-CoV-2를 진단하기 위한 진단 키트로서, 서열 번호 1에 특이적으로 결합하는 IgA군 항체가 검출되는 진단 키트에 사용된다.
바람직하게는 감염의 조기 단계, 더욱 바람직하게는 질환의 증상이 발현된 후 5일 이내에 SARS-CoV-2 감염 검출의 민감도를 증가시키기 위한, 서열 번호 1에 대한 항체, 바람직하게는 IgA, IgM 및/또는 IgG 군 항체, 더욱 바람직하게는 IgA 군 항체의 용도가 제공된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 용도는 감염의 후기 단계에서의 용도일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및 IgG의 존재 또는 부재가 검출된다.
본 발명은, 구체적으로 이하 서열 목록 및/또는 본 발명의 명세서의 일부를 이루는 서열 목록에 기재된 서열을 비롯하여 다양한 신규 핵산 및 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이하 본원에 보인 임의의 서열과 서열 목록에 기재된 대응 서열이 상충되는 경우, 본 발명은 구체적으로, 그리고 개별적으로 각각의 서열 1개, 즉 이하 본원에 기재된 서열뿐 아니라 서열 목록에 기재된 서열에 관한 것임이 이해될 것이다.
서열 번호 1(S 단백질 유래 SARS-CoV-2 S1 도메인)
서열 번호 2(S 단백질 유래 SARS-
CoV
-2 S1 도메인,
실시예에서는
C-말단이 His 태깅된 채 세포내 발현됨)
서열 번호 3(S 단백질 유래 SARS-
CoV
-2 S1 도메인,
실시예들에서는
신호 펩티드가 절단된 후 C-말단이 His 태깅된 채 사용됨)
서열 번호 4(S 단백질 유래 SARS- CoV -2 S1 도메인, 서열 번호 2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 5(존재할 수 있는 SARS- CoV -2 S1 에피토프 ) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 6(S1[ MERS _ CoV ]) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 7(S1[ HCoV -229E]) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 8(S1[ HCoV -OC43]) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 9(S1[ HCoV - HKU1 ]) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 10(S1[ HCoV -NL63]) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 11(S1[SARS_ CoV ]) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 12(서열 번호 1의 단편) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 13(SARS-
CoV
-2
단리주
Wuhan
-
Hu
-1의 게놈,
Genbank
MN908947과 동일): [서열 목록에만 제공됨]
서열 번호 1의 30번~44번 아미노산인 서열 번호 14 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 48번~68번 아미노산인 서열 번호 15 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 110번~166번 아미노산인 서열 번호 16 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 200번~214번 아미노산인 서열 번호 17 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 226번~250번 아미노산인 서열 번호 18 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 256번~277번 아미노산인 서열 번호 19 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 328번~342번 아미노산인 서열 번호 20 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 399번~414번 아미노산인 서열 번호 21 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 434번~448번 아미노산인 서열 번호 22 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 550번~572번 아미노산인 서열 번호 23 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 590번~604번 아미노산인 서열 번호 24 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 632번~650번 아미노산인 서열 번호 25 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 354번~368번 아미노산인 서열 번호 26 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 622번~636번 아미노산인 서열 번호 27 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 30번~44번 아미노산인 서열 번호 28 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 1의 226번~250번 아미노산인 서열 번호 29 -서열 목록에만 제공됨
서열 번호 30 : SARS-
CoV
-2 N 단백질
서열 번호 31:
RBD
, SARS-
CoV
-2 S 단백질의 S1 도메인 유래 단편
서열 번호 32:
RBD
, C-말단이 His로 태깅된, SARS-
CoV
-2 S 단백질의 S1 도메인 유래 단편
서열 번호 33:
SARS-
CoV
-2 S 단백질의 S2 도메인
서열 번호 34:
실시예들에서
사용된 바와 같은
RBD
서열 번호 35(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성인 서열 번호 1 유래 펩티드)
LTPGDSSSGWTAG
서열 번호 36(SARS- CoV -2 항체와 반응성인 서열 번호 1 유래 펩티드)
YQAGSTPCNGV
서열 번호 37(SARS- CoV -2 항체와 반응성인 서열 번호 1 유래 펩티드)
YGFQPTNGVGYQ
서열 번호 38: His-태깅된
RBD
서열 번호 39: 인간
안지오텐신
전환 효소 2(
ACE2
)
서열 번호 40(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성인 서열 번호 1 유래 펩티드)
RTWLPPAYTNS
서열 번호 41(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성인 서열 번호 1 유래 펩티드)
RTQLPPAYTNS
서열 번호 42(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성인 서열 번호 1 유래 펩티드)
SGTNGTKRFDN
서열 번호 43(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성인 서열 번호 1 유래 펩티드)
서열 번호 44(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성이며,
GST와
융합되는 서열 번호 1 유래 펩티드)
서열 번호 45(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성이며,
GST와
융합되는 서열 번호 1 유래 펩티드)
서열 번호 46(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성이며,
GST와
융합되는 서열 번호 1 유래 펩티드)
서열 번호 47(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성이며,
GST와
융합되는 서열 번호 1 유래 펩티드)
서열 번호 48(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성이며,
GST와
융합되는 서열 번호 1 유래 펩티드)
서열 번호 49(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성이며,
GST와
융합되는 서열 번호 1 유래 펩티드, P1-P6)
서열 번호 50(C-말단이 His 태깅된 인간 ACE2의 세포외 도메인)
서열 번호 51(SARS- CoV -2 영국 변이체 B.1.1.7 돌연변이가 발생한 서열 번호 1) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 52(SARS- CoV -2 남아프리카 변이체 B.1.351 돌연변이가 발생한 서열 번호 1) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 53(SARS- CoV -2 브라질 변이체 P.1 돌연변이가 발생한 서열 번호 1) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 54(SARS- CoV -2 덴마크 밍크 변이체 돌연변이가 발생한 서열 번호 1) - 서열 목록에만 제공됨
서열 번호 55(SARS-CoV-2 항체와 반응성인 서열 번호 1 유래 펩티드)
NNLDSKVGG
서열 번호 56(SARS-
CoV
-2 항체와 반응성이며,
GST와
융합되는 서열 번호 1 유래 펩티드, P1-P6)
본 발명은 추가의 특징, 구현예, 양태 및 이점이 취하여질 수 있는 이하 실시예, 서열 및 도면에 의해 추가로 설명된다. 본원에 기재된 방법과 재료와 유사하거나 균등한 방법 및 재료 모두는 본 발명을 실시하거나 시험할 때 사용될 수 있는데, 단 적합한 방법과 재료가 본원에 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 전체로서 참고문헌으로 첨부되어 있다.
도 1은 환자 2명을 대상으로 모니터링된 서열 번호 1에 대한 항체(IgA, IgG) 수준과 N 단백질에 대한 항체(IgG, IgM) 수준의 경시적 변화를 보여준다(실시예 3 참조).
도 2는 SARS-CoV-2가 감염된 환자에서 항체의 또 다른 경시적 변화를 모니터링한 결과를 보여준다. 서열 번호 1에 대한 IgA군 항체(□), 서열 번호 1에 대한 IgG군 항체(△) 및 N 단백질에 대한 IgG군 항체(○)가 확정되었다.
도 3은 (A) 제1 단계에서는 항 His 태그와 함께 직접 항온처리되었거나(1 : 200) 환자 혈청(PS)과 함께 직접 항온처리되었고(1 : 100), 제2 단계에서는 항 마우스 lgG-FITC 또는 항 인간 lgG-FITC와 함께 항온처리된 HEK293 세포, 또는 (B) (A)에 기재된 바와 같은 2 단계 PS3 항온처리를 수행하기 앞서 PBS와 함께 30분 동안 항온처리된 HEK293 세포, 또는 (C) PBS와 함께 30분 동안 항온처리된 다음, 제1 단계에서는 PS3와 함께 항온처리되었고(1 : 100), 제2 단계에서는 항 인간 lgG-비오틴(1 : 200)과 함께 항온처리되었고, 제3 단계에서는 ExtrAvidin-FITC (1 : 2000)와 함께 항온처리된 HEK293 세포로서, 이 HEK293 세포들이 아세톤 고정 S1 발현 플라스미드 또는 대조군 플라스미드로 형질감염되어 사용되었을 때의 IFA를 보여준다.
도 4는 RBD 포함 융합 단백질이 사용되는 닷 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 IgG 항체, IgA 항체 및 IgM 항체 검출 결과를 보여준다.
도 5는 서열 번호 1 포함 폴리펩티드가 사용되는 닷 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 IgG 항체, IgA 항체 및 IgM 항체 검출 결과를 보여준다.
도 6은 서열 번호 1의 단편과 이의 융합 단백질이 사용되는 닷 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 IgM 항체 검출 결과를 보여준다.
도 7은 서열 번호 1의 단편과 이의 융합 단백질이 사용되는 닷 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 IgA 항체 검출 결과를 보여준다.
도 8은 서열 번호 1의 단편과 이의 융합 단백질이 사용되는 닷 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 IgG 항체 검출 결과를 보여준다.
도 9는 서열 번호 1의 단편과 이의 융합 단백질이 사용되는 닷 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 시간 의존적 IgM 항체 검출 결과를 보여준다.
도 10은 서열 번호 1의 단편과 이의 융합 단백질이 사용되는 닷 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 유래 시료로부터의 시간 의존적 IgG 항체 검출 결과를 보여준다.
도 11은 서열 번호 1의 단편과 이의 융합 단백질이 사용되는 닷 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 유래 시료로부터의 시간 의존적 IgA 항체 검출 결과를 보여준다.
도 12는 RBD를 포함하는 폴리펩티드가 사용된 웨스턴 분석을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 IgA 항체 검출 결과를 보여준다.
도 13은 RBD를 포함하는 폴리펩티드가 사용된 웨스턴 블럿을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 IgM 항체 검출 결과를 보여준다.
도 14는 RBD를 포함하는 폴리펩티드가 사용된 웨스턴 블럿을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 IgG 항체 검출 결과를 보여준다.
도 15는 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드가 사용되었을 때의 웨스턴 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 시간 의존적 IgA 항체 검출 결과를 보여준다.
도 16은 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드가 사용되었을 때의 웨스턴 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 시간 의존적 IgM 항체 검출 결과를 보여준다.
도 17은 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드가 사용되었을 때의 웨스턴 블럿 분석을 기반으로 한, 환자 시료로부터의 시간 의존적 IgG 항체 검출 결과를 보여준다.
실시예 1: ELISA 면역검정 시료를 사용한, 서열 번호 1에 대한 항체의 검출
감염 후 6일 내지 14일차에 Corman외 다수의 문헌(Corman et al. (2020) Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2)에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 SARS-CoV-2 양성으로 판명된 환자들로부터 시료 8개를 수득하였고, 감염후 더 이른 시점에 이러한 환자로부터 수득한 시료 14개를 입수할 수 있었다.
또한 MERS 감염 환자로부터 수득한 시료 18개, SARS-CoV-1 감염 환자로부터 수득한 시료 3개, NL63 감염 환자 4명으로부터 수득한 시료, 229E 감염 환자 3명으로부터 수득한 시료, OC43 감염 환자 6명으로부터 수득한 시료 및 HKU1 감염 환자 3명으로부터 수득한 시료를 포함하여 여러 코로나바이러스를 함유하는 시료 다수개도 입수할 수 있었다.
항원이 코팅된 미세정량 평판의 제조: 서열 번호 4를, 인공 신호 서열을 포함하고 C-말단이 His로 태깅된 pTriEx-1 플라스미드에 표준적 방식으로 클로닝하는 방법을 통하여, 서열 번호 2를 HEK293T 세포에서 발현시킨 결과, 서열 번호 2가 발현되었으며, 이후 신호 펩티드인 서열 번호 3을 제거하였다. 형질감염된 세포를 37℃ 및 8.5% CO2 하에, 10% 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코(Dulbecco) 개질 이글 배지 중에서 3일~5일 동안 배양하였다. 세포를 수집한 다음, 20 mM Tris-HCI(pH 7.4), 10% (w/v) 수크로스, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF 중에 재현탁하고 나서, 추후 사용시까지 -80℃에 보관하여 두었다.
서열 번호 3을 제조하기 위해, 세포 배양 상청액을 5 mmol/l 삼염화물(pH 8.0), 164 mmol/l 염화나트륨, 50 mmol/l 염화마그네슘, 20 mmol/l 이미다졸, 0,1% Triton X-100에 대해 조정한 다음, 4℃ 및 17,600 xg에서 30분 동안 원심분리하여 청징화한 후, 5 mmol/l 삼염화물(pH 8.0), 300 mmol/l 염화나트륨, 20 mmol/l 이미다졸로 평형화한 Nickel Rapid Run(Agarose Bead Technologies, Miami, FL, USA)에 적용하였으며, 이때 이미다졸은 그 농도를 150 mmol/l로 증가시키면서 용리를 진행하였다. 서열 번호 3을 함유하는 분획 모두를 풀링(pooling)하고 나서, 한외여과(VivaSpin, Sartori-us, Gottingen, Germany)로 농축하였다. 최종 제조물을, 추후 사용시까지 -80℃에 보관하여 두었다.
서열 번호 3의 최종 단백질 제조물을 16 mmol/l 디티오트레이톨로 처리하였거나 처리하지 않은 채, 70℃또는 실온에서 10분 동안 항온처리한 다음, SDS겔 전기영동 및 쿠마시 염색을 수행하였다. 질량 분광분석법으로 단백질 동일성을 인증하였다.
정제 단백질을 미세정량 ELISA에 사용하기 위해, 이 정제 단백질을 PBS로 희석하여 최종 농도 약 1.5 μg/ml로 만든 다음, 밤새도록 ELISA 미세정량 평판(Nunc, Roskilde, Denmark)을 코팅하는데 사용하였다.
실험 절차: 시료를 IgG 시료 완충제 중에 1 : 101로 희석한 다음, 미세정량 평판에 적용하고 나서, 시판 EUROIMMUN ELISA 테스트 키트에 대해 기재된 바와 같이 시판중인 시약들(예컨대 염 농도 및 pH가 본질적으로 생리적 수준인 완충제 El 2260-9601 G/A)을 사용하여 항온처리하였다. El 2260-9601 G/A 매뉴얼은 이하와 같았다. 요약하면, 37℃에서 60분: 세척 완충제를 사용하는 세척 단계 3회; 웰당 퍼옥시다아제 표지화 항인간 IgG 컨쥬게이트(토끼) 또는 항 인간 IgA 컨쥬게이트(토끼) 100 μl씩 첨가; 37℃에서 30분 동안 항온처리; EUROIMMUN 세척 완충제를 사용하는 세척 단계 3회; 웰당 크로모겐/기질 용액(TMB/H2O2) 100 μl씩 첨가; 실온에서 30분 동안 항온처리; 정지 용액(0.5 M 황산) 100 μl 첨가; 630 nm에서의 광학 밀도(참조치) 대비 450 nm에서의 광학 밀도 측정. 시판중인 표준물질(제품 번호 El 2606-9601 A, EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG)을 사용하여 교정을 수행하였다. 대조군 또는 환자 시료의 소광도를 표준물질의 소광도로 나누어 비를 산정하였다. 0.8 이하의 결과는 음성인 것으로 간주하였고, 0.8~1.1의 결과는 경계성인 것으로, 그리고 0.1을 초과하는 결과는 양성인 것으로 간주하였다.
결과: 1차 데이터를 표 1에 보였다.
표 1
결론
결과들은, 서열 번호 1에 대한 항체가, 인간 환자 유래 시료의 SARS-CoV-2 감염을 진단하는데 사용될 수 있음을 보여준다.
IgG 및 IgA 군 항체를 인지하는 2차 항체로 얻어진 데이터의 비교는, 적어도 질환의 조기 단계에 IgA 항체의 검출 민감도가 더 크고; 감염의 조기 단계, 즉 질병 발생 후 6일 이내에 채취한 환자 시료 14개 중 4개는, IgA 군 항체가 검출되면 양성이라고 올바르게 동정될 수 있었던 반면, 동일 시료 중 IgG가 검출되었음은 음성 결과를 제공하였음을 보여준다.
두 검정은, SARS-CoV-1 환자 유래 시료와의 교차 반응성을 보여주었으나, MERS, NL63, 229E, OC43 및 HKU1 감염된 환자 유래 시료와의 교차 반응성은 실질적으로 보이지 않았다. SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2 사이의 변별은, 상이한 시간 분석 Ig 군 시그니처, 구체적으로 SARS-CoV-1 감염의 경우 IgA군 항체의 후기 출현을 기반으로 가능하였다(Hsue, P. R., Huang, L. M., Chen, P. J., Kao, C. L., and Yang P. C. (2004) “Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutraliza-tion antibodies after infection with SARS-associated coronavirus”, Clinical Microbiology and Infection, 10(12), 1062-1066). SARS-CoV 사례들 중 그 어떤 것도 좀처럼 보고되지 않았는데, 그 이유는 SARS-CoV-2가 출현하였기 때문이다.
독립된 연구자들에 의해 추후 발행된 다양한 간행물은, 본 발명자들의 발견을 확인시켜 주었는데; Jaaskelainen외 다수는, SARS-CoV-2 IgG 항체, IgA 항체 및/또는 IgM 항체를 검출하기 위한 검정으로서, 상업상 이용 가능한 혈청학적 검정 6가지가 실시되었던 비교 연구로부터, 테스트된 검정 6가지 중 S1에 대한 IgA 검출을 기반으로 하는 EUROIMMUN 검정이 가장 큰 민감도를 제공하였다는 결론을 내렸다(Jaaskelainen, A. J., Kuivanen, S., Kekalainen, E., Ahava, M.J., Loginov, R., Kallio-Kokko, H., Vapalahti, O., Jarva, H., Kurkela, and Lappalainen, M. (2020), J. Clin. Virology 129, 104512). Okba외 다수도 유사한 결과를 얻었다(Okba et al., “Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2-Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease Patients”. Emerg Infect Dis. 2020 Jul;26(7):1478-1488, prepublished on medRxiv 2020.03.18.20038059). Beavis외 다수는, 본 발명에 따른 IgA 기반 검정의 민감도는 질환의 조기 단계에 월등한 반면, IgG 검정의 민감도는 후기 단계에 월등함을 확인하였다(Beavis, K. G., Mathushek, S. M., Abeleda, A. P. F., Bethel, C., Hunt, C., Gillen, S., Moran, A., and Tesic, V. (2020) Evalutaion of the EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA Assay for detection of IgA and IgG antibodies, J. Clin. Virology 129, 104468).
요약하면, 본 발명에 따른 검정은 진단상 유관한, 서열 번호 1에 대한 항체들의 조기 검출에 사용될 수 있다. 몇몇 환자에서는 증상 발현 이래 6일이 경과하기 이전에 진양성 결과가 확인될 수 있었다. 따라서 검정은 PCR 기반 검정이 사용될 수 있는 기간과 면역검정이 사용될 수 있는 기간 사이의 진단 갭을 없애거나 적어도 좁히는 것을 돕는다.
실시예
2: 서열 번호 1에 대한
IgA
항체의 검출을 위한
테스트간
관련성과 진단의 신뢰성을 추가로 특성규명하는 것을 목표로 하는 확장형 ELISA 연구
본 검정의 민감도를 확정하기 위해, EUROIMMUN 제품 번호 El 2606-9601 A를 사용하여 실시예 1에 기재된 검정과 유사한 검정을 기반으로 유럽인 환자 152명으로부터 얻은 166개 시료 중 IgA 항체의 존재 또는 부재를 검출하였다. 문헌(Corman VM, et al. “Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill 25(3): pii=2000045 (2020-01-23) based on a sample from an early stage of the infection”)에 따라 RT-PCR을 이용하여 대상체 시료, 즉 감염의 조기 단계에 얻은 시료 각각에서 SARS-CoV-2 감염을 확인하였다.
요약하면, 이 검정은 정제된 서열 번호 1을 포함하는 항원이 코팅된 미세정량 평판이 사용되는 ELISA를 기반으로 한다. 시료와 함께 항온처리를 수행하고, 생리적 완충제를 사용하여 광범위한 세척 단계를 수행한 후, 효소 활성 표지로 표지된, IgA에 대한 2차 항체를 사용하여 서열 번호 1에 대한 IgA 항체를 특이적으로 장식하고 나서, 발색 기질과 함께 항온처리하였다. 이에 대한 추가의 상세한 설명은 제품과 함께 제공된 매뉴얼(EUROIMMUN product no. El 2606-9601 A)로서, 본원에 참고문헌으로 인용된 매뉴얼에서 살펴볼 수 있다.
이하 감염 과정에서 얻은 시료를 기반으로 혈청학적 특성규명을 수행하였다.
서열 번호 1에 대한 IgA의 민감도 60.2%는 증상 발현 후 10일차 이내에 얻은 시료(또는 양성 RT-PCR에 의해 감염이 직접 검출된 후 10일차 이내에 얻은 시료)로 확정되었다. 10일차 이후에 얻은 시료들에 대한 민감도는 98.6%였다.
하지만 결과와 면역반응은 천차만별이었다. 예를 들어 환자 소수는 IgA, IgG 또는 IgM 반응을 전혀 보일 수 없었다.
종합하여 판단하였을 때, 이 추가 연구는 또한 서열 번호 1에 대해 생성된 IgA군 항체의 특이적 검출은 질환의 조기 단계에 이미 SARS-CoV-2 감염에 대해 특히 큰 민감도를 제공함을 일관되게 입증하였다.
실시예
3: ELISA에 의해 확인되는, SARS-
CoV
-2 환자에 있어 진단상 유관한 여러 항체의 경시적 지속성
서열 번호 1에 대한 항체(IgA, IgG) 수준 및 N 단백질에 대한 항체(IgG, IgM) 수준의 시간별 변화를, 환자 2명을 대상으로 모니터링하였다(도 1). 상기 두 경우 모두 질환의 경증 경과를 보였으나, RT-PCR에 의해 감염이 확인되었다. 통상의 특정 증상들, 예컨대 일시적 후각 상실이 관찰되었다. 본원에 참고문헌으로 인용된 제조자의 지침에 따라, EUROIMMUN 제품 El 2606-9601 A 및 El 2606-9601 G(항원은 S1 단백질로서, 각각 IgA 또는 IgG를 검출하기 위한 것), 그리고 El 2606-9601-2 G 및 El 2606-9601-2 M(항원은 N 단백질로서, 각각 IgG 또는 IgM을 검출하기 위한 것)을 사용하였다. 테스트 원리와 주요 구성성분을 실시예 2에 요약하여 두었으나; 어느 항체가 검출될 것이었는지에 따라서, 상이한 항원(항원으로서 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드 대신 N 단백질 사용) 및 (IgA, IgG 또는 IgM에 결합하는) 상이한 2차 항체를 사용하였다. 추가 정보는 El 2606-9601 A, El 2606-9601 G, El 2606-9601-2 G 및 El 2606-9601-2 M 제조자(EUROIMMUN)의 지침에서 얻을 수 있다.
4개월을 초과하는 기간에 걸친 질환의 경과를 모니터링하였다. 서열 번호 1에 대한 IgA 및 IgG와, N 단백질에 대한 IgG(IgM은 아님)가 처음에 검출되었다. 두 환자에서 서열 번호 1에 대한 IgA 또는 IgG 중 적어도 1가지는 4개월 후 검출될 수 있었던 반면, N 단백질에 대한 IgG는 결과가 양성이었던 1차 PCR(the first positive PCR) 이후 2개월 경과시에는 존재하지 않았거나, 단지 소량으로만 존재하였다.
이러한 결과는, 몇몇 환자들에서 서열 번호 1에 대한 항체가 적어도 N 단백질에 대한 항체보다 더 오랫동안 지속적으로 존재함을 보여준다. IgA 항체 수준은 IgG 항체 수준보다 더 빠르게 감소하지만, IgA 항체는 사라질지라도 처음에 신호가 더 컸던 관계로 여전히 우세할 수 있었다.
세 번째 환자에서의 시간에 따른 또 다른 변화를 모니터링한 결과를 도 2에 보였다. 본질적으로 동일한 방법을 이용하여 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체 역가(□), 서열 번호 1에 대한 IgG 군 항체 역가(△) 그리고 N 단백질에 대한 IgG 군 항체 역가(○)를 확정하였다. 도 2에서 명백히 확인되는 바와 같이, S1[서열 번호 1]에 대한 IgA 군 항체는 전체 모니터링 기간 동안, 즉 RT-PCR로 SAR-CoV-2에 감염되었음을 확인한 후 40일이 경과한 때조차 검출될 수 있었던 반면, 서열 번호 1 또는 SARS-CoV-2 N 단백질 중 어느 하나에 대한 IgG 군 항체의 수준은 컷-오프 수준 이하에 머물렀다(또는 이에 가까웠다). 그러므로 이러한 데이터는, 서열 번호 1 항원에 결합한 IgA 군 항체의 특이적 검출을 기반으로 한 본 검정의 민감도가 월등하였음을 추가로 확인시켜주었다.
실시예
4: 다양한 항체의 경시적
모니터링에
사용된, 서열 번호 1에 대한 항체의 검출을 위한 화학발광 기반 검정
제조자의 지침과, 디폴트 설정환경에 따라, 시약 카트리지(LS 1254-10010 G)를 포함한 EUROIMMUN Random Access RA 10 Analyzer(YG 0710-0101)를 사용하였다. 제조자의 지침에 따라 토실 활성화 상자성 비드(M-280, Invitrogen)를 코팅하였다. 요약하면, 37℃에서 비드를 코팅 완충제(0.1 M 인산나트륨, pH 7.4) 중에서 10분 동안 세척(IKA Roller 10(VWR사 공급))한 다음, 비드를 자력 농축한 후, 상청액을 제거하였다. 실시예 1에 따라 정제한 재조합체 폴리펩티드(서열 번호 3)를 동일한 완충제에 첨가한 다음, 여기에 3 M 황산암모늄을 첨가한 후, 동일한 조건 하에서 19시간 동안 항온처리하였으며, 이후 세척 완충제(PBS pH 7.4 0.1% BSA 0.2% Tween-20)를 사용하는 세척 단계를 2회 수행한 후, 동일 완충제 중에서 4시간 동안 차단(37℃(PBS pH 7.4 0.1% BSA 0.2% Tween-20)하고 나서, 다시 추가 세척을 2회 수행하였다. 비드를 동일 완충제 중에 적어도 16시간 동안 4℃에 보관하여 두었다.
상자성 비드를 시료 완충제(Tris-HCI EDTA 중 BSA/Tween-20, pH 7)와 혼합하여 검정을 수행하였다. 비드의 20 μl 현탁액(1 mg/ml)을, 시료 완충제 중 시료 총 200 μl 가운데 5 μl의 시료(즉 환자 혈액 시료)와 접촉시켰다. 비드를 10분 동안 항온처리한 후, 시료 완충제 중에서 3회 세척한 다음, 여기에 160 μl IgG/IgA 컨쥬게이트(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostik AG, LK 0711-10010, 본질적으로 아크리디늄에스테르로 표지된 IgG 또는 IgA 특이적 2차 항체)를 첨가한 후, 37 ℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 세척 단계를 3회 수행한 후, 여기에 알칼리성 과산화수소를 신속하게 첨가한 다음, 혼합하여, 발광을 촉발하였으며, 이후 10초 동안의 즉각 발광 검출을 실시하였다. 결과는 표 2에 보였다.
표 2
이러한 결과는, 서열 번호 1에 대한 항체가 화학발광을 이용하여 검출될 수 있음을 보여준다. ELISA에 의해 얻어진 결과들간에는 명백한 상관관계가 존재하였다. 따라서, 화학발광은 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있었다.
실시예
5: 서열 번호 2를 발현하는
HEK
-S1 세포를 사용한 간접
면역형광검정
(IFA)
IFA는 서열 번호 1에 대한 항체의 검출에 사용될 수 있음을 입증하기 위해, SARS-CoV-2 S1 단백질을 발현하는 재조합체 HEK293 세포 또는 HEK293 대조군 세포의 바이오칩 어레이와 슬라이드를 사용하여 IFA를 수행하였다.
각각의 바이오칩 모자이크를, 1 : 100 PBS 희석 혈청 시료 35 μl와 함께 실온에서 30분 동안 항온처리한 다음, PBS-Tween으로 세척한 후, PBS-Tween에 5분 동안 침지시켰다. 제2 단계에서, 플루오레세인이소티오시안산염(FITC)-표지화 염소 항 인간 IgG(EUROIMMUN Medizinische Labordi-agnostika AG, Lubeck)를 적용하고 나서, 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 슬라이드를 PBS-Tween 플러쉬로 다시 세척한 후, PBS-Tween에 5분 동안 침지시켰다. 슬라이드를 PBS-완충 DABCO 함유 글리세롤(전계당 약 10 μL)에 매립하고 나서, 형광현미경으로 관찰하였다. 대안적으로는, 슬라이드를 PBS와 함께 30분 동안 항온처리한 후, 다시 혈청과 함께 항온처리한 다음, 항 인간 lgG-비오틴(1 : 200, 109-065-098, Dianova)과 함께 30분 동안 항온처리하고 나서, 전술된 바와 같은 세척 단계를 수행하고, 30분 동안 ExtrAvidin-FITC(1 : 2000, E2761, Sigma-Aldrich)와 함께 항온처리를 수행한 다음, 세척 단계를 또 수행함으로써, 슬라이드에 결합한 인간 IgG를 검출하였다. 대조군이 형질감염된 세포와 대조군시료의 형광 세기와 직접 비교해가며 얻은, 형질감염된 세포의 형광 세기를 기반으로, 시료를 양성과 음성으로 분류하였다. EUROStar II 현미경(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Liibeck, Germany)을 사용하여 2명의 독립된 관찰자가 결과를 평가하였다. 달리 명시되어 있지 않으면, 시약은 Merck(Darmstadt, Germany) 또는 Sigma-Aldrich(Heidelberg, Germany)로부터 입수하였다.
S1 IgG ELISA-양성 환자 혈청(PS)의 혈청은 S1(서열 번호 2)과 양성 반응을 보였지만, 대조군 형질감염 HEK 세포와는 그렇지 않았던 반면(도 3), S1 IgG ELISA-음성 대조군 혈청 49개는 그 어느 것도 반응을 보이지 않았다. 환자 혈청 신호의 세기는, HEK-S1 세포를 PBS와 함께 항온처리한 후, 혈청과 항온처리한 다음, 인간 IgG 항체를 항 인간 lgG-비오틴/ExtrAvidin-FITC로 검출하였을 때 개선되었다. HEK-S1 IFA에서 S1 IgG ELISA-양성 환자 혈청 24개 중 모두 합쳐 15개는 항 인간 lgG-비오틴/ExtrAvidin-FITC와 양성 반응을 보였다.
따라서 IFT는 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법이다.
실시예
6: 백신 투여 연구
생리적 PBS 중 재조합체 S1 단백질(서열 번호 3) 12.86 μg을 건강한 대상체의 사두근에 주사 투여하였다(1일차). 제조자의 지침에 따라 백반 보조제(성인용 Twinrix, EMRA-MED Arzneimittel GmbH)를 적용하였다. 9일차, 21일차 및 28일차에 생리적 PBS 중 S1 단백질 12.86 μg을 대상체에 또 주사 투여하였고, 염화나트륨 용액 500 mI 중 Imject 백반 보조제(Thermo Scientific Imject Alum Adjuvant Alaun) 10 mI도 주사 투여하였다. 10일차, 23일차 및 29일차에 혈액 시료를 채혈하였다.
제조자의 지침에 따라, 혈청분석 키트(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, El 2606-9601 A, El 2606-9601 G, El 2606-9601-2 G 및 El 2606-9601-2 M; 실시예 2 및 실시예 3 참조)를 사용하여 건강한 대상체로부터 채혈한 혈청 시료 중 서열 번호 1(S1) 및 N 단백질에 대한 IgG 항체 및 IgA 항체의 존재를 확정하였다.
표 3: S1 단백질을 사용하여 백신 투여된
대상체에
있어 SARS-
CoV
-2 항원에 대한 항체
양성 대조군 및 음성 대조군으로서, SARS-CoV-2 감염이 된 환자 유래 시료(즉 SARS-CoV-2에 대한 항체가 존재할 것으로 예측되는 시료) 및 건강한 혈액 공여자 유래 시료(즉 SARS-CoV-2에 대한 항체가 존재하지 않을 것으로 예측되는 시료)를 사용하였다(표 4 및 표 5를 각각 참조한다).
증상 발현(보통 감염후 5일차~6일차)후 17일차 및 19일차에 SARS-CoV-2 감염이 된 환자(양성 대조군) 2명으로부터 시료를 수득하였다. 확정된 항체 역가를 표 4에 보였다.
표 4: SARS-
CoV
-2 감염이 된 환자 2명에 있어 SARS-
CoV
-2 항원에 대한 항체
그 어떤 백신도 투여받지 않은 4명의 건강한 대상체(음성 대조군)에서 시료를 수득하였다. 항체 역가를 표 5에 보였다.
표 5: 건강한
대상체에
있어 SARS-
CoV
-2 항원에 대한 항체
이러한 결과는, 서열 번호 1 또는 이의 변이체로 백신 투여된 대상체는 서열 번호 1에 대한 항체의 검출을 기반으로 하는 검정을 통해 감염 대상체 또는 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하지 않는 백신이 처리된 대상체와 구별될 수 있었음을 보여준다. 백신에 포함된 S1에 대한 항체는 두 경우 다에서 검출될 수 있었던 반면, N 단백질에 대한 항체는 오로지 감염된 환자에서만 검출되었고, 백신 투여된 대상체에서는 검출되지 않았다.
실시예
7:
RBD
및 S1에 대한 항체의, 닷
블럿을
사용한 검출
시약: RBD 항원(서열 번호 34) 및 S1 항원(서열 번호 3)은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득하였다. 결과가 양성이었던 PCR 테스트(1075, 1076, 1078, 1079, 1080, 1084, 1085, 1098, 1099, 1100)에 의해 확인되는 바와 같이, SARS-CoV-2가 감염된 환자로부터 유래한 시료의 희석 완충제(1x 보편적 완충제 중 3% 소 혈청 알부민; 10x 농축물, 제품 번호 20125896) 중 희석액을 준비하였다. 건강한 혈액 공여자로부터 유래한 시료(BS01, BS10, BS25, BS32, BS43)를 추가 음성 대조군으로 사용하였다.
양성 대조군으로 사용된 모노클로날 항체 AK78, AK76 및 AK80은 각각 모노클로날 항 His 태깅 항체였다(Lindner P, Bauer K, Krebber A, Nieba L, Kremmer E, Krebber C, Honegger A, Klinger B, Mocikat R, Pliickthun A. “Specific detection of his-tagged proteins with recombinant anti-His tag scFv-phosphatase or scFv-phage fusions.” Biotechniques. 1997 Jan;22(1):140-9).
스트립에 항원 용액(2.69 mg ml-1) 1 μl을 옮겨 블럿 스트립을 제조하였다. 막은 0.22 μm 질산셀룰로스 막(Sartorius)이었다.
IgA, IgG 및 IgM에 대한 2차 항체(각각 “항 인간-lgA-AP““항 인간-lgG-AP“및 “항 인간-lgM-AP“)는 EUROIMMUN(NBT/BCIP에서의 제품 번호 10 123964와 같은, 알칼리성 포스파타아제 표지화 항 인간 IgA/G/M(염소), 제품 번호 ZD 1129 A/G/M)으로부터 구입하였다.
방법: 블럿 스트립을 세척 완충제(1x 보편적 완충제 중 3% 소 혈청 알부민(10x 농축물, 제품 번호 20125896)) 중에서 15분 동안 항온처리하여 차단시키고 나서, 이 스트립을 적당히 희석한 시료 중에서 3시간 동안 항온처리한 다음(실온), 세척 완충제를 사용하여 세척 단계를 3회 수행한 후, 이 스트립을 적당히 희석한 시료 중에서 30분 더 항온처리하였으며, 이후 세척 단계를 3회 반복 수행한 후, NBT/BCIP 용액 중에서 10분 동안 항온처리하여 염색을 수행하였는데, 이때 염색은 이 스트립을 탈염수에서 3회 철저히 세척함으로써 정지되었다.
결과: 도 4 및 5는, 시료와 대조군에 대한 닷 블럿 분석 결과를 보여준다. 시료 대신 모노클로날 항체를 사용하였을 때 양성 결과가 얻어졌고, 음성 대조군이 사용될 경우에는 신호가 없었던 것으로 판단하건대, 검정은 성공적으로 확립될 수 있었다.
S1 및 RBD는 둘 다 IgM 항체, IgA 항체 및 IgG 항체를 검출하는데 사용될 수 있었지만, S1이 사용될 때 반응은, 일반적으로 약간 더 강하였는데, 이는 RBD 및 이에 측접하는 서열 둘 다 에피토프 또는 그 일부를 함유함을 암시한다. 더욱이 항원-항체 상호작용의 일부는 항원의 폴딩에 의해 영향받을 수 있다.
흥미로운 점은, 환자 1085에서는 IgG 항체를 제외하고 IgA 항체 및 IgM 항체가 검출될 수 있었다는 점인데, 이는, 구체적으로 IgG에 더하여 IgA 항체의 검출이 민감도를 향상시킨다는 ELISA 기반 결과를 확인시켜준다. IgG 항체가 아직 검출되지 않았을 때 이 질환 조기 단계의 환자를 검사할 수 있었다. 반대로, IgA 항체가 소멸된 후 질환 후기 단계에 채취된 환자 1100 시료에서는 오로지 IgG 항체만이 검출될 수 있었다.
IgA 항체 및 IgG 항체는, 일반적으로 IgM 항체보다 더 강력한 신호를 보였다.
실시예
8:
RBD
및 S1으로부터 유래한 펩티드에 대한 항체의, 닷
블럿을
사용한 검출
pET24d 플라스미드 기반 표준 방법을 이용하여 37℃에서 3시간 동안 카나마이신 및 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지 중에서 펩티드 P1(RTQLPPAYTNS, 서열 번호 41), P2(SGTNGTKRFDN, 서열 번호 42), P3(LTPGDSSSGWTAG, 서열 번호 35), P4(NNLDSKVGG, 서열 번호 55), P5(YQAGSTPCNGV, 서열 번호 36), P6(YGFQPTNGVGYQ, 서열 번호 37)와, P1~P6을 포함하는 융합체(서열 번호 56)를, 이.콜라이 Rosetta(DE3)pLacl 세포에 의해 프로테아제 절단 부위(P1(서열 번호 43), P2(서열 번호 44), P3(서열 번호 45), P4(서열 번호 46), P5(서열 번호 47), P6(서열 번호 48)를 포함하는 융합체; P1~P6을 포함하는 융합체(서열 번호 49)의 서열)를 포함하는 N-말단 His 태그 융합체로서 발현시켰다(IPTG 유도 이용). 세포를 수집한 다음, 인산염 완충 염수 중에 재현탁하고 나서, 추후 사용시까지 -20℃에 보관하여 두었다.
도 6, 도 7 및 도 8은, P1~P6 구조체를 이용한 닷 블럿 검정의 결과를 보여준다. RBD의 일부인 P6은, IgA, IgM 또는 IgG가 검출되었는지 여부에 관계없이 가장 강력한 반응을 보였지만, P1, P2(IgM 제외), P3 및 P4(IgM 제외) 및 P5는 약간의 반응성을 보일 수 있었다. IgG 및 IgA와의 반응은, 일반적으로 IgM과의 반응보다 더 강했다.
몇몇 환자로부터 유래한 시료(1개 초과)와 함께 시간별 변화를 보인 시료들은, 닷 블럿이 환자를 모니터링하는데 사용될 수 있음을 입증하였다. 예를 들어 환자 SK1586(3군데 시점)은 제1 시료(1.3i)와 가장 강력한 IgM 반응을 보였던 반면, 제2 시료(1.11.i) 및 제3 시료(1.19)가 사용되면 신호는 더 약하였는데, 특히 P3에 관하여 그러하였다(도 9). 만일 펩티드 P1과 P6이 IgA를 검출하는데 사용되면, 동일 시료는 더 강한 반응을 보였다(도 10). 만일 IgG 항체가 검출되면, 반응은 일반적으로 더 강하였지만, 시간 의존적 반응은 동일 시료, 특히 펩티드 P6 및 P1과, P1~P6을 포함하는 융합 단백질을 사용하여 모니터링될 수 있었다(도 11). 실시예 7 및 8은, 서열 번호 1에 대한 항체가 닷 블럿 및 서열 번호 1의 다양한 단편이 사용되어 검출될 수 있었음을 보여준다.
실시예 9: RBD 및 S1에 대한 항체의, 웨스턴 블럿을 이용한 검출
RBD(서열 번호 34) 또는 S1(서열 번호 3) 2 pg을 사용하여 비환원성 SDS PAGE를 진행하였다. 단백질 10 μl를 포함하는 시료를, NuPAGE-PP(NuPage LDS 시료 완충제(4x), Firma Fisher Scientific GmbH) 4 μl 및 EU-PBS(인산염 완충 염수) 1 μl와 혼합한 후, 70℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 생성된 용액 12 μl를 비환원성 2D 겔(NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1 .0 mm x 2 D, Fisher Scientific GmbH) 레인마다 적용한 다음, 전개 완충제(NuPage MOPS SDS Running Buffer, Fisher Scientific GmbH) 중에서 전기영동시켰다. 분리된 단백질 밴드를, 60분 동안 400 mA에서 니트로셀룰로스 막에 옮겼다(PowerPac HC Power Supply, Firma Bio-Rad). 폰소S(PonceauS)를 사용하여 막 스트립을 염색한 다음, 50 mM Tris 중에서 세척하였으나, 어떤 경우에는 세척 완충제(1x 보편적 완충제 중 3% 소 혈청 알부민(10x 농축물, 주문 번호: 20125896)) 중에서 15분 동안 차단시킨 다음, 적당히 희석한 시료 중에서 스트립을 3시간 동안 항온처리하고 나서(실온), 세척 완충제를 사용하는 세척 단계를 3회 실시한 다음, 스트립을 적당히 희석한 시료 중에서 30분 더 항온처리하였으며, 이후 세척 단계를 3회 더 실시하고 나서, NBT/BCIP 용액 중에서 10분 동안 항온 처리하여 염색을 진행하였는데, 이때 염색은 이 스트립을 탈염수에서 3회 철저히 세척함으로써 정지되었다.
결과: 양성 대조군(이전의 항 His 항체) 및 SARS-CoV-2 감염 환자 유래 양성 시료는, RBD 단량체에 더하여 이량체, 삼량체 및 사량체가 검출되었음을 보였다. IgA군 항체를 검출하는 2차 항체가 혈청 6개와 사용되었을 때에는 약한 반응이 검출되었고, 또 다른 혈청 3개와 사용되었을 때에도 약한 반응이 검출되었으나, 혈청 1개와 사용되었을 때에는 강한 반응이 검출되었다. 만일 상이한 시점에 수득한 시료 2개 이상이 이용 가능하고 반응성이면, 예를 들어 시료 SK159822.1i~2.4i뿐 아니라 시료 6i 및 61i 및 7i 및 7.1i에서는 IgA 항체 농도 감소가 관찰되었다(도 12).
IgG 군 항체의 검출에 대해 말하자면, ELISA에 의해 판단하건대 양성이었던 시료 모두는 반응을 보였다(도 13). 두 방법의 결과를 기반으로 하였을 때 시료 SK1606 169i는 음성이었다.
IgM 군 항체의 검출에 관해 말하자면, 만일 상이한 시점에 수득한 시료 2개 이상이 이용 가능하다면, 몇몇 경우, 특히 SK15862.2~SK15862.16뿐아니라 SK159986i 내지 SK1599861i에서는 항체의 농도 감소가 확인되었다(도 14). 만일 RBD보다 S1이 항원으로서 사용되면, 결과는 거의 동일하였다(도 15, 16 및 17).
웨스턴 블럿팅은 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법이라는 결론이 내려진다.
실시예
10:
RBD에
대한
IgA
,
IgM
및
IgG
항체의, 경쟁적 테스트 포맷을 이용한 검출
달리 상반되게 명시되지 않는 한, 이하 실험에서는 제조자의 지침에 따라 EUROIMMUN SARS-CoV-2 NeutraLISA 키트(El 2606-9601-4)를 사용하였다.
요약하면, 재조합에 의해 인간 세포주 HEK293에서 발현되는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 S1 도메인(서열 번호 3)으로 코팅한 미세정량 평판을 사용하였다. 본 분석의 제1 단계에서, 대조군과 시료들(대상체의 혈액 시료들)을, 가용성 비오틴화 인간 ACE2(서열 번호 50)를 함유하는 시료 완충제로 희석하고 나서, 미세정량 평판 중 시약이 담긴 웰 내에서 항온처리하였다. 시료 중에 존재하는 중화 항체는, 코팅된 SARS-CoV-2 S1 스파이크 단백질의 결합 부위에 대해 ACE2와 경쟁하였다. 후속 세척 단계에서 미결합 ACE2 및 미결합 시료를 제거하였다. 결합 ACE2를 검출하기 위해, 비오틴화 ACE2로서, 미세정량 평판상 항원에 부동화한 ACE2와 결합하고, 제3 단계에서 발색 반응을 촉매화할 퍼옥시다아제 표지화 스트렙타비딘을 사용하여 2차 항온처리를 수행하였다. 발색된 색상의 진하기는 시료 중 중화 항체 농도에 반비례하였다(표 6 참조).
표 6
결과는, 양성 시료의 희석율이 증가하면(즉 중화 항체 농도가 감소하면), 발색되는 색상은 진해지도록 유도됨을 보여준다. 대조적으로, 만일 음성 시료가 사용되면, 신호는 컸지만, 시료의 희석율과는 상관이 없었다.
이는, 본 검정이 시료 중 RBD에 대한 중화 항체를 검출하고 정량하기 위해 사용될 수 있음을 확인시켜주는 것이다.
실시예
11: SARS-
CoV
-2 항원 S1 및 N 단백질에 대한 항체의, ELISA에 의한 검출
COVID-19 독일인 환자 43명이 감염된 후 상이한 시점에 이들 각각으로부터 취한 몇몇 시료들을 포함하는 패널을 사용하여, 항체의 경시적 존재 또는 부재를 검출하였다. 모든 혈청을 대상으로 SARS-CoV-2 스파이크 도메인의 S1 도메인(서열 번호 3)에 대한 항체(IgA 및 IgG ELISA 키트, EUROIMMUN, 실시예 1 및 3의 제품과 동일한 제품)와, N 단백질에 대한 항체(IgG 및 IgM ELISA 키트, EUROIMMUN, 실시예 2 및 3의 제품과 동일한 제품)에 대해 테스트를 수행하였다.
질병 발생 후 10일 초과~21일 미만의 기간에, SARS-CoV-2의 S1에 대한 IgG 항체 및 IgA 항체는 시료 중 70.4% 및 88.9%으로 검출되었던 반면에, N 단백질에 대한 IgG 및 IgM은 각각 86.2% 및 50%로 검출되었다. 환자 6명에서는 S1에 대한 IgA 항체가, 검출될 수 있는 첫 번째 항체였던 반면, 단지 2명의 사례자에서는 S1에 대한 항체로서 IgA 이외의 항체가 처음 검출되는 항체였다. 환자 30명에서는 N 단백질에 대한 IgM 항체는 그 어느 때라도 관찰할 수 없었다.
질환 발생 후 60일을 초과한 시점에는, SARS-CoV-2의 S1에 대한 IgG 항체 및 IgA 항체가 시료 중 85.1% 및 80.5%로 검출되었던 반면, N 단백질에 대한 IgG 및 IgM은 각각 81.4% 및 0% 검출되었다. 환자 4명에서는 S1에 대한 IgG가 검출될 수 있었지만, N 단백질에 대한 IgG는 그렇지 않았다. 대조적으로, 환자 단 1명에서는 N 단백질에 대한 IgG가 검출될 수 있었지만, S1에 대한 IgG는 그렇지 않았다.
이러한 결과는 S1에 대한 IgA의 검출이, SARS-CoV-2, 특히 자체의 S1 단백질 에 대한 항체 반응의 조기 검출을 위한, 민감도가 가장 큰 검정임을 확인시켜 주는 것이다. 대조적으로, S1에 대한 IgG의 검출은 감염의 후기 단계에서 특히 민감하였다. 두 검정은, 선택적으로 오랜 기간에 걸쳐 증가한 민감도에 대한 추가 검정과 아울러, 민감도 증가를 위해 하나의 반응 또는 별도 반응으로 S1에 대한 IgA 검출 및 S1에 대한 IgG 검출과 통합될 수 있다.
실시예
12: SARS-
CoV
-2 감염 후기 단계 동안 SARS-
CoV
-2 항원 S1 단백질 및 N 단백질에 대한 항체의, ELISA에 의한 검출
실시예 11에서의 방법과 동일한 방법을 사용하여, SARS-CoV-2 감염이 된 환자 15명으로 이루어진 또 다른 코호트로부터 (질환 발생 후 21일차 또는 이보다 더 후반에) 시료를 수득하여, N 단백질에 대한 IgG 항체 및 IgM 항체의 존재와, S1 단백질에 대한 IgA 항체 및 IgG 항체의 존재에 대해 테스트하였다. 결과를 표 7에 보였다.
표 7
이 추가 코호트에 대한 연구는, 만일 S1 단백질에 대한 항체가 검출된다면, 진단의 민감도는 SARS-CoV-2 감염 후기 단계에 가장 컸음을 확인시켜주었다.
실시예
13: SARS-
CoV
-2 항원 S1 단백질 및 N 단백질에 대한 항체의 검출 특이성
예를 들어 기타 인간 병원성 코로나바이러스, 기타 병원체에 대한 항체 또는 류머티즘성 인자(rheumatoid foctor)들에 대해 양성이었던 환자 시료 210개를 분석하여, 항 SARS-CoV-2 ELISA(IgA, El 2606-9601 A, 제조자의 지침에 따라 수행, 실시예 2 및 3에 더욱 상세히 기재됨)의 특이성을 확정하였다. 추가로, SARS-CoV-2 발생 전(2020년 1월 이전)에 수득한 혈액 공여자, 어린이 및 임신부 시료 1052개를 분석하였다. 경계 범위에 있는 결과(n=9)는 특이성을 산정하는데 포함시키지 않았다. 이는, 표 8에 보인 바와 같이 98.3%의 특이성을 달성하였다.
항 SARS-CoV-2 ELISA(IgG, El 2606-9601 G, 제조자의 지침에 따라 수행, 실시예 2 및 3에 더욱 상세히 기재됨)의 특이성을 동일한 방식으로 확정하였는데, 즉 양성 환자 시료 222개와, 혈액 공여자, 어린이 및 임신부 시료 1052개를 기반으로 특이성을 확정하였다. 이는, 표 8에 보인 바와 같이 98.3%의 특이성을 달성하였다.
표 8
<110> EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG
<120> Methods and reagents for diagnosis of SARS-CoV-2 infection
<130> PI-21K1067EP
<150> EP 20158348.1
<151> 2020-02-19
<150> EP 20158626.0
<151> 2020-02-20
<150> EP 20158821.7
<151> 2020-02-21
<150> DE 202020003564.5
<151> 2020-08-20
<150> DE 202020104982.8
<151> 2020-08-28
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 670
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S1 domain from S Protein
<400> 1
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
660 665 670
<210> 2
<211> 695
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S1 domain from S Protein, C-terminally his-tagged
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
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500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Leu Glu His
675 680 685
His His His His His His His
690 695
<210> 3
<211> 680
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S1 domain from S Protein, C-terminally his-tagged, as
after cleavage of signal peptide
<400> 3
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
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195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
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Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
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610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
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660 665 670
His His His His His His His His
675 680
<210> 4
<211> 2088
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S1 domain from S Protein, nucleotide sequence encoding
SEQ ID NO: 2
<400> 4
atgttcgtat tccttgttct gctgcctttg gttagcagtc agtgtgtcaa cctgacaact 60
cgcacgcaac tgccgccagc ttacaccaac tctttcacaa gaggcgtcta ctacccggac 120
aaagtgtttc gctcatcagt gctgcactct acacaagatt tgtttctgcc attcttctct 180
aacgtaacct ggtttcacgc gattcatgtg tctgggacaa atgggaccaa gcgcttcgac 240
aaccccgtgc tgccattcaa tgacggggtg tattttgcct ccaccgagaa atccaatatc 300
atccgaggat ggattttcgg tactacgctg gactctaaaa cgcagtctct cttgatcgtt 360
aataacgcca caaatgttgt cattaaggtg tgcgagtttc agttctgtaa tgatcccttt 420
ctgggtgtgt attaccacaa gaataacaag tcatggatgg aaagcgagtt tcgcgtgtac 480
tcaagtgcca ataactgcac attcgagtat gtgtcccagc ctttcctgat ggatctcgaa 540
ggcaaacagg ggaacttcaa gaatctgcgc gagttcgtgt ttaagaacat cgacggttat 600
ttcaagatct acagcaaaca tacacccatt aacctggtca gggatctccc tcagggattc 660
tccgccctgg aacccttggt ggacttgccc attgggatta acatcactag attccagacc 720
ctgctggccc ttcaccgttc ctatcttact cctggcgaca gtagcagtgg atggaccgca 780
ggagcagccg cttactatgt aggctatctg cagccacgga ccttcctcct caagtacaat 840
gaaaatggta ccataactga tgctgtggac tgcgctctgg atccactctc cgaaactaaa 900
tgcaccctta aaagcttcac ggtcgaaaag ggaatctacc agacaagtaa ctttcgggta 960
caacccactg agtccatcgt gcggtttcct aacatcacaa atctctgccc ctttggtgaa 1020
gtgtttaacg ccactaggtt cgcttctgtt tatgcgtgga atcggaagag gatttccaat 1080
tgcgtggcag actactctgt cctgtataat agcgctagct tcagcacctt caaatgttac 1140
ggggtaagcc caactaaact gaacgacctc tgttttacca acgtgtatgc cgatagcttt 1200
gtcatacgag gagatgaggt tcgtcagatt gctcctggcc aaacggggaa aatcgcagac 1260
tacaactaca agcttcccga cgacttcaca ggatgcgtga tcgcgtggaa ctcaaataat 1320
ctggatagca aggttggtgg caattataac tacctgtatc gactgttcag gaaaagcaac 1380
ctcaaaccct ttgagcgcga catcagcacc gagatatacc aagccggttc aacaccttgc 1440
aatggggtgg aagggtttaa ctgctatttc ccacttcaga gctatgggtt tcagccaacc 1500
aatggagtcg gctaccagcc ctatcgggtg gtagtcctgt cctttgagct gttgcatgcg 1560
cctgccacag tctgtggccc taagaagagt acgaatctgg tgaagaacaa gtgcgtcaac 1620
ttcaatttta acggcttgac tggaacagga gttctgaccg agtccaacaa gaaattcctt 1680
ccttttcagc agtttggaag ggatatagcc gacactaccg atgccgttcg ggatccacag 1740
acactggaga ttctggacat tactccgtgc tcatttggcg gtgtatctgt catcacacct 1800
gggaccaata cctcaaatca ggtggctgtg ctctaccagg atgtgaattg taccgaagtt 1860
ccagtggcaa ttcatgccga tcaactgact cccacctgga gagtgtacag tactggcagt 1920
aacgtgtttc agacaagagc tggctgtctc ataggcgcag aacacgtcaa caacagctat 1980
gagtgtgaca ttccgatcgg cgcaggcatc tgtgcatcct accagacgca aaccaactct 2040
cccagaagag ccaggctcga gcaccaccat caccatcacc atcactaa 2088
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> possible SARS-CoV-2 S1 epitope
<400> 5
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
1 5 10
<210> 6
<211> 734
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1 [MERS_CoV]
<400> 6
Tyr Val Asp Val Gly Pro Asp Ser Val Lys Ser Ala Cys Ile Glu Val
1 5 10 15
Asp Ile Gln Gln Thr Phe Phe Asp Lys Thr Trp Pro Arg Pro Ile Asp
20 25 30
Val Ser Lys Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Arg Thr Tyr Ser
35 40 45
Asn Ile Thr Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Pro Tyr Gln Gly Asp His
50 55 60
Gly Asp Met Tyr Val Tyr Ser Ala Gly His Ala Thr Gly Thr Thr Pro
65 70 75 80
Gln Lys Leu Phe Val Ala Asn Tyr Ser Gln Asp Val Lys Gln Phe Ala
85 90 95
Asn Gly Phe Val Val Arg Ile Gly Ala Ala Ala Asn Ser Thr Gly Thr
100 105 110
Val Ile Ile Ser Pro Ser Thr Ser Ala Thr Ile Arg Lys Ile Tyr Pro
115 120 125
Ala Phe Met Leu Gly Ser Ser Val Gly Asn Phe Ser Asp Gly Lys Met
130 135 140
Gly Arg Phe Phe Asn His Thr Leu Val Leu Leu Pro Asp Gly Cys Gly
145 150 155 160
Thr Leu Leu Arg Ala Phe Tyr Cys Ile Leu Glu Pro Arg Ser Gly Asn
165 170 175
His Cys Pro Ala Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Phe Ala Thr Tyr His Thr
180 185 190
Pro Ala Thr Asp Cys Ser Asp Gly Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Ser Leu
195 200 205
Asn Ser Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Arg Asn Cys Thr Phe Met Tyr
210 215 220
Thr Tyr Asn Ile Thr Glu Asp Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Ile Thr
225 230 235 240
Gln Thr Ala Gln Gly Val His Leu Phe Ser Ser Arg Tyr Val Asp Leu
245 250 255
Tyr Gly Gly Asn Met Phe Gln Phe Ala Thr Leu Pro Val Tyr Asp Thr
260 265 270
Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln Ser
275 280 285
Asp Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro Leu
290 295 300
Thr Phe Leu Leu Asp Phe Ser Val Asp Gly Tyr Ile Arg Arg Ala Ile
305 310 315 320
Asp Cys Gly Phe Asn Asp Leu Ser Gln Leu His Cys Ser Tyr Glu Ser
325 330 335
Phe Asp Val Glu Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp Phe
355 360 365
Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys Arg
370 375 380
Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser Leu
385 390 395 400
Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala Ile
405 410 415
Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Pro
420 425 430
Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile Ser
435 440 445
Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile Leu
450 455 460
Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys Tyr
465 470 475 480
Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr Glu
485 490 495
Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser Ile
500 505 510
Val Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln Leu
515 520 525
Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr Val
530 535 540
Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln Tyr
545 550 555 560
Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn Asp
565 570 575
Thr Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr Ser Leu Tyr
580 585 590
Gly Val Ser Gly Arg Gly Val Phe Gln Asn Cys Thr Ala Val Gly Val
595 600 605
Arg Gln Gln Arg Phe Val Tyr Asp Ala Tyr Gln Asn Leu Val Gly Tyr
610 615 620
Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Arg Ala Cys Val Ser Val
625 630 635 640
Pro Val Ser Val Ile Tyr Asp Lys Glu Thr Lys Thr His Ala Thr Leu
645 650 655
Phe Gly Ser Val Ala Cys Glu His Ile Ser Ser Thr Met Ser Gln Tyr
660 665 670
Ser Arg Ser Thr Arg Ser Met Leu Lys Arg Arg Asp Ser Thr Tyr Gly
675 680 685
Pro Leu Gln Thr Pro Val Gly Cys Val Leu Gly Leu Val Asn Ser Ser
690 695 700
Leu Phe Val Glu Asp Cys Lys Leu Pro Leu Gly Gln Ser Leu Cys Ala
705 710 715 720
Leu Pro Asp Thr Pro Ser Thr Leu Thr Pro Arg Ser Val Arg
725 730
<210> 7
<211> 521
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1 [HCoV-229E]
<400> 7
Cys Gln Thr Thr Asn Gly Leu Asn Thr Ser Tyr Ser Val Cys Asn Gly
1 5 10 15
Cys Val Gly Tyr Ser Glu Asn Val Phe Ala Val Glu Ser Gly Gly Tyr
20 25 30
Ile Pro Ser Asp Phe Ala Phe Asn Asn Trp Phe Leu Leu Thr Asn Thr
35 40 45
Ser Ser Val Val Asp Gly Val Val Arg Ser Phe Gln Pro Leu Leu Leu
50 55 60
Asn Cys Leu Trp Ser Val Ser Gly Leu Arg Phe Thr Thr Gly Phe Val
65 70 75 80
Tyr Phe Asn Gly Thr Gly Arg Gly Asp Cys Lys Gly Phe Ser Ser Asp
85 90 95
Val Leu Ser Asp Val Ile Arg Tyr Asn Leu Asn Phe Glu Glu Asn Leu
100 105 110
Arg Arg Gly Thr Ile Leu Phe Lys Thr Ser Tyr Gly Val Val Val Phe
115 120 125
Tyr Cys Thr Asn Asn Thr Leu Val Ser Gly Asp Ala His Ile Pro Phe
130 135 140
Gly Thr Val Leu Gly Asn Phe Tyr Cys Phe Val Asn Thr Thr Ile Gly
145 150 155 160
Asn Glu Thr Thr Ser Ala Phe Val Gly Ala Leu Pro Lys Thr Val Arg
165 170 175
Glu Phe Val Ile Ser Arg Thr Gly His Phe Tyr Ile Asn Gly Tyr Arg
180 185 190
Tyr Phe Thr Leu Gly Asn Val Glu Ala Val Asn Phe Asn Val Thr Thr
195 200 205
Ala Glu Thr Thr Asp Phe Cys Thr Val Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Asp
210 215 220
Val Leu Val Asn Val Ser Gln Thr Ser Ile Ala Asn Ile Ile Tyr Cys
225 230 235 240
Asn Ser Val Ile Asn Arg Leu Arg Cys Asp Gln Leu Ser Phe Asp Val
245 250 255
Pro Asp Gly Phe Tyr Ser Thr Ser Pro Ile Gln Ser Val Glu Leu Pro
260 265 270
Val Ser Ile Val Ser Leu Pro Val Tyr His Lys His Thr Phe Ile Val
275 280 285
Leu Tyr Val Asp Phe Lys Pro Gln Ser Gly Gly Gly Lys Cys Phe Asn
290 295 300
Cys Tyr Pro Ala Gly Val Asn Ile Thr Leu Ala Asn Phe Asn Glu Thr
305 310 315 320
Lys Gly Pro Leu Cys Val Asp Thr Ser His Phe Thr Thr Lys Tyr Val
325 330 335
Ala Val Tyr Ala Asn Val Gly Arg Trp Ser Ala Ser Ile Asn Thr Gly
340 345 350
Asn Cys Pro Phe Ser Phe Gly Lys Val Asn Asn Phe Val Lys Phe Gly
355 360 365
Ser Val Cys Phe Ser Leu Lys Asp Ile Pro Gly Gly Cys Ala Met Pro
370 375 380
Ile Val Ala Asn Trp Ala Tyr Ser Lys Tyr Tyr Thr Ile Gly Ser Leu
385 390 395 400
Tyr Val Ser Trp Ser Asp Gly Asp Gly Ile Thr Gly Val Pro Gln Pro
405 410 415
Val Glu Gly Val Ser Ser Phe Met Asn Val Thr Leu Asp Lys Cys Thr
420 425 430
Lys Tyr Asn Ile Tyr Asp Val Ser Gly Val Gly Val Ile Arg Val Ser
435 440 445
Asn Asp Thr Phe Leu Asn Gly Ile Thr Tyr Thr Ser Thr Ser Gly Asn
450 455 460
Leu Leu Gly Phe Lys Asp Val Thr Lys Gly Thr Ile Tyr Ser Ile Thr
465 470 475 480
Pro Cys Asn Pro Pro Asp Gln Leu Val Val Tyr Gln Gln Ala Val Val
485 490 495
Gly Ala Met Leu Ser Glu Asn Phe Thr Ser Tyr Gly Phe Ser Asn Val
500 505 510
Val Glu Leu Pro Lys Phe Phe Tyr Ala
515 520
<210> 8
<211> 745
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1 [HCoV-OC43]
<400> 8
Ala Val Ile Gly Asp Leu Lys Cys Thr Ser Asp Asn Ile Asn Asp Lys
1 5 10 15
Asp Thr Gly Pro Pro Pro Ile Ser Thr Asp Thr Val Asp Val Thr Asn
20 25 30
Gly Leu Gly Thr Tyr Tyr Val Leu Asp Arg Val Tyr Leu Asn Thr Thr
35 40 45
Leu Phe Leu Asn Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Arg Asn
50 55 60
Met Ala Leu Lys Gly Ser Val Leu Leu Ser Arg Leu Trp Phe Lys Pro
65 70 75 80
Pro Phe Leu Ser Asp Phe Ile Asn Gly Ile Phe Ala Lys Val Lys Asn
85 90 95
Thr Lys Val Ile Lys Asp Arg Val Met Tyr Ser Glu Phe Pro Ala Ile
100 105 110
Thr Ile Gly Ser Thr Phe Val Asn Thr Ser Tyr Ser Val Val Val Gln
115 120 125
Pro Arg Thr Ile Asn Ser Thr Gln Asp Gly Asp Asn Lys Leu Gln Gly
130 135 140
Leu Leu Glu Val Ser Val Cys Gln Tyr Asn Met Cys Glu Tyr Pro Gln
145 150 155 160
Thr Ile Cys His Pro Asn Leu Gly Asn His Arg Lys Glu Leu Trp His
165 170 175
Leu Asp Thr Gly Val Val Ser Cys Leu Tyr Lys Arg Asn Phe Thr Tyr
180 185 190
Asp Val Asn Ala Asp Tyr Leu Tyr Phe His Phe Tyr Gln Glu Gly Gly
195 200 205
Thr Phe Tyr Ala Tyr Phe Thr Asp Thr Gly Val Val Thr Lys Phe Leu
210 215 220
Phe Asn Val Tyr Leu Gly Met Ala Leu Ser His Tyr Tyr Val Met Pro
225 230 235 240
Leu Thr Cys Asn Ser Lys Leu Thr Leu Glu Tyr Trp Val Thr Pro Leu
245 250 255
Thr Ser Arg Gln Tyr Leu Leu Ala Phe Asn Gln Asp Gly Ile Ile Phe
260 265 270
Asn Ala Glu Asp Cys Met Ser Asp Phe Met Ser Glu Ile Lys Cys Lys
275 280 285
Thr Gln Ser Ile Ala Pro Pro Thr Gly Val Tyr Glu Leu Asn Gly Tyr
290 295 300
Thr Val Gln Pro Ile Ala Asp Val Tyr Arg Arg Lys Pro Asn Leu Pro
305 310 315 320
Asn Cys Asn Ile Glu Ala Trp Leu Asn Asp Lys Ser Val Pro Ser Pro
325 330 335
Leu Asn Trp Glu Arg Lys Thr Phe Ser Asn Cys Asn Phe Asn Met Ser
340 345 350
Ser Leu Met Ser Phe Ile Gln Ala Asp Ser Phe Thr Cys Asn Asn Ile
355 360 365
Asp Ala Ala Lys Ile Tyr Gly Met Cys Phe Ser Ser Ile Thr Ile Asp
370 375 380
Lys Phe Ala Ile Pro Asn Gly Arg Lys Val Asp Leu Gln Leu Gly Asn
385 390 395 400
Leu Gly Tyr Leu Gln Ser Phe Asn Tyr Arg Ile Asp Thr Thr Ala Thr
405 410 415
Ser Cys Gln Leu Tyr Tyr Asn Leu Pro Ala Ala Asn Val Ser Val Ser
420 425 430
Arg Phe Asn Pro Ser Thr Trp Asn Lys Arg Phe Gly Phe Ile Glu Asp
435 440 445
Ser Val Phe Lys Pro Arg Pro Ala Gly Val Leu Thr Asn His Asp Val
450 455 460
Val Tyr Ala Gln His Cys Phe Lys Ala Pro Lys Asn Phe Cys Pro Cys
465 470 475 480
Lys Leu Asn Gly Ser Cys Val Gly Ser Gly Pro Gly Lys Asn Asn Gly
485 490 495
Ile Gly Thr Cys Pro Ala Gly Thr Asn Tyr Leu Thr Cys Asp Asn Leu
500 505 510
Cys Thr Pro Asp Pro Ile Thr Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Cys Pro Gln
515 520 525
Thr Lys Ser Leu Val Gly Ile Gly Glu His Cys Ser Gly Leu Ala Val
530 535 540
Lys Ser Asp Tyr Cys Gly Gly Asn Ser Cys Thr Cys Arg Pro Gln Ala
545 550 555 560
Phe Leu Gly Trp Ser Ala Asp Ser Cys Leu Gln Gly Asp Lys Cys Asn
565 570 575
Ile Phe Ala Asn Phe Ile Leu His Asp Val Asn Ser Gly Leu Thr Cys
580 585 590
Ser Thr Asp Leu Gln Lys Ala Asn Thr Asp Ile Ile Leu Gly Val Cys
595 600 605
Val Asn Tyr Asp Leu Tyr Gly Ile Leu Gly Gln Gly Ile Phe Val Glu
610 615 620
Val Asn Ala Thr Tyr Tyr Asn Ser Trp Gln Asn Leu Leu Tyr Asp Ser
625 630 635 640
Asn Gly Asn Leu Tyr Gly Phe Arg Asp Tyr Ile Ile Asn Arg Thr Phe
645 650 655
Met Ile Arg Ser Cys Tyr Ser Gly Arg Val Ser Ala Ala Phe His Ala
660 665 670
Asn Ser Ser Glu Pro Ala Leu Leu Phe Arg Asn Ile Lys Cys Asn Tyr
675 680 685
Val Phe Asn Asn Ser Leu Thr Arg Gln Leu Gln Pro Ile Asn Tyr Phe
690 695 700
Asp Ser Tyr Leu Gly Cys Val Val Asn Ala Tyr Asn Ser Thr Ala Ile
705 710 715 720
Ser Val Gln Thr Cys Asp Leu Thr Val Gly Ser Gly Tyr Cys Val Asp
725 730 735
Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ser Arg Gly
740 745
<210> 9
<211> 744
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1 [HCoV-HKU1]
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Leu Ala Leu Lys Gly Ser Ile Tyr Leu Ser Thr Leu Trp Tyr Lys Pro
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Asn Arg Arg Tyr Gly Phe Gly Ser Phe Asn Leu Ser Ser Tyr Asp Val
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Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
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Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
435 440 445
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
450 455 460
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
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cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg 660
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ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc 900
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gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1080
ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1140
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aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040
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aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2580
agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2640
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actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000
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agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420
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aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600
acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660
gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720
tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780
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gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140
agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200
gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260
gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500
agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560
gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620
tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680
agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740
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agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220
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gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520
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cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640
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tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
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aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
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tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720
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atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900
ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960
gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020
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tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260
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ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
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cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740
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taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
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tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
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ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340
tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400
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ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060
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acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc 9180
tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
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cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca 9720
tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt 9780
tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840
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taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960
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gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatt tcttggtaca 10260
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taaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg 10380
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ttttaacata gattatgact gtgtctcttt ttgttacatg caccatatgg aattaccaac 10560
tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca 10620
aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta 10680
cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740
ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat 10800
actaggacct ctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa 10860
agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga 10920
tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt 10980
gaaaagaaca atcaagggta cacaccactg gttgttactc acaattttga cttcactttt 11040
agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt 11100
accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa 11160
gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
ggtctatatg cctgctagtt gggtgatgcg tattatgaca tggttggata tggttgatac 11280
tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact 11340
aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat 11400
gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc 11460
catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat 11520
gtttttggcc agaggtattg tttttatgtg tgttgagtat tgccctattt tcttcataac 11580
tggtaataca cttcagtgta taatgctagt ttattgtttc ttaggctatt tttgtacttg 11640
ttactttggc ctcttttgtt tactcaaccg ctactttaga ctgactcttg gtgtttatga 11700
ttacttagtt tctacacagg agtttagata tatgaattca cagggactac tcccacccaa 11760
gaatagcata gatgccttca aactcaacat taaattgttg ggtgttggtg gcaaaccttg 11820
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tgctgtagat gctgctaaag cttacaaaga ttatctagct agtgggggac aaccaatcac 13140
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ggcttcgatg tcgaggggtg tcatgctact agagaagctg ttggtaccaa tttaccttta 18360
cagctaggtt tttctacagg tgttaaccta gttgctgtac ctacaggtta tgttgataca 18420
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cacctcatac cacttatgta caaaggactt ccttggaatg tagtgcgtat aaagattgta 18540
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catggctttg agttgacatc tatgaagtat tttgtgaaaa taggacctga gcgcacctgt 18660
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tcaccttttg aattagaaga ttttattcct atggacagta cagttaaaaa ctatttcata 20460
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gattttgttg aaataataaa atcccaagat ttatctgtag tttctaaggt tgtcaaagtg 20580
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ttttacccaa aattacaatc tagtcaagcg tggcaaccgg gtgttgctat gcctaatctt 20700
tacaaaatgc aaagaatgct attagaaaag tgtgaccttc aaaattatgg tgatagtgca 20760
acattaccta aaggcataat gatgaatgtc gcaaaatata ctcaactgtg tcaatattta 20820
aacacattaa cattagctgt accctataat atgagagtta tacattttgg tgctggttct 20880
gataaaggag ttgcaccagg tacagctgtt ttaagacagt ggttgcctac gggtacgctg 20940
cttgtcgatt cagatcttaa tgactttgtc tctgatgcag attcaacttt gattggtgat 21000
tgtgcaactg tacatacagc taataaatgg gatctcatta ttagtgatat gtacgaccct 21060
aagactaaaa atgttacaaa agaaaatgac tctaaagagg gttttttcac ttacatttgt 21120
gggtttatac aacaaaagct agctcttgga ggttccgtgg ctataaagat aacagaacat 21180
tcttggaatg ctgatcttta taagctcatg ggacacttcg catggtggac agcctttgtt 21240
actaatgtga atgcgtcatc atctgaagca tttttaattg gatgtaatta tcttggcaaa 21300
ccacgcgaac aaatagatgg ttatgtcatg catgcaaatt acatattttg gaggaataca 21360
aatccaattc agttgtcttc ctattcttta tttgacatga gtaaatttcc ccttaaatta 21420
aggggtactg ctgttatgtc tttaaaagaa ggtcaaatca atgatatgat tttatctctt 21480
cttagtaaag gtagacttat aattagagaa aacaacagag ttgttatttc tagtgatgtt 21540
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caatggtact aagaggtttg ataaccctgt cctaccattt aatgatggtg tttattttgc 21840
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gccttttctt atggaccttg aaggaaaaca gggtaatttc aaaaatctta gggaatttgt 22140
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<213> Artificial Sequence
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Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe
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<220>
<223> 632-650 of SEQ ID NO1
<400> 25
Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys
1 5 10 15
Asp Ile Pro
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 354-368 of SEQ ID NO1
<400> 26
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 622-636 of SEQ ID NO1
<400> 27
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 30-44 of SEQ ID NO1
<400> 28
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe
1 5 10 15
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 226-250 of SEQ ID NO1
<400> 29
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
1 5 10 15
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr
20 25
<210> 30
<211> 419
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 30
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 31
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RBD, a fragment from S1 domain from SARS-CoV-2 S protein
<400> 31
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 32
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RBD, a fragment from S1 domain from SARS-CoV-2 S protein, with
C-terminal His tag
<400> 32
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Leu
210 215 220
Glu His His His His His His His His
225 230
<210> 33
<211> 588
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S2 domain from SARS-CoV-2 S protein
<400> 33
Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn
20 25 30
Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys
35 40 45
Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys
50 55 60
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg
65 70 75 80
Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val
85 90 95
Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe
100 105 110
Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser
115 120 125
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
130 135 140
Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu
165 170 175
Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala
195 200 205
Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
210 215 220
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
225 230 235 240
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
245 250 255
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
260 265 270
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
275 280 285
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
290 295 300
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
305 310 315 320
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
325 330 335
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
340 345 350
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
355 360 365
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
370 375 380
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
385 390 395 400
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
405 410 415
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
420 425 430
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
435 440 445
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
450 455 460
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
465 470 475 480
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
485 490 495
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
500 505 510
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
515 520 525
Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met
530 535 540
Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys
545 550 555 560
Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser
565 570 575
Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
580 585
<210> 34
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RBD as used in the examples
<400> 34
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gly Pro Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg
20 25 30
Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
35 40 45
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
50 55 60
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
65 70 75 80
Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe
85 90 95
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
100 105 110
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
115 120 125
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
130 135 140
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
145 150 155 160
Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile
165 170 175
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
180 185 190
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
195 200 205
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
210 215 220
Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn
225 230 235 240
Lys Cys Val Asn Phe Leu Glu His His His His His His His His
245 250 255
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
<400> 35
Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly
1 5 10
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
<400> 36
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
1 5 10
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
<400> 37
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
1 5 10
<210> 38
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-tagged RBD
<400> 38
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gly Pro Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg
20 25 30
Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
35 40 45
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
50 55 60
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
65 70 75 80
Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe
85 90 95
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
100 105 110
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
115 120 125
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
130 135 140
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
145 150 155 160
Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile
165 170 175
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
180 185 190
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
195 200 205
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
210 215 220
Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn
225 230 235 240
Lys Cys Val Asn Phe Leu Glu His His His His His His His His
245 250 255
<210> 39
<211> 805
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val
740 745 750
Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg
755 760 765
Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile
770 775 780
Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp
785 790 795 800
Val Gln Thr Ser Phe
805
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
<400> 40
Arg Thr Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
<400> 41
Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
<400> 42
Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 43
<211> 143
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
<400> 43
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala
115 120 125
Tyr Thr Asn Ser Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
130 135 140
<210> 44
<211> 264
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
with GST fusion
<400> 44
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Met Ser His His His His His
115 120 125
His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg
130 135 140
Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp Ala Gln Gly
145 150 155 160
Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu
165 170 175
Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr Asn His Met
180 185 190
Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu
195 200 205
Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln
210 215 220
Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly
225 230 235 240
Arg Met Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Ser Gly Thr
245 250 255
Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn
260
<210> 45
<211> 147
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
with GST fusion
<400> 45
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
115 120 125
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp
130 135 140
Thr Ala Gly
145
<210> 46
<211> 139
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
with GST fusion
<400> 46
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
115 120 125
Gly Gly Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
130 135
<210> 47
<211> 143
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
with GST fusion
<400> 47
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
115 120 125
Cys Asn Gly Val Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
130 135 140
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<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
with GST fusion
<400> 48
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn
115 120 125
Gly Val Gly Tyr Gln Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
130 135 140
Gln
145
<210> 49
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
with GST fusion, P1-P6
<400> 49
Met Ser His His His His His His His His Ser Pro Met Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu
20 25 30
Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His
35 40 45
Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala
65 70 75 80
Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val
85 90 95
Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser
100 105 110
Leu Gln Ser Gly Ile Glu Gly Arg Met Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala
115 120 125
Tyr Thr Asn Ser Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Leu
130 135 140
Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Asn Asn Leu Asp
145 150 155 160
Ser Lys Val Gly Gly Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
180 185
<210> 50
<211> 773
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-terminally His-tagged extracellular domain of human ACE2
<400> 50
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
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Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
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210 215 220
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His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
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385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
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Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser His His His His
740 745 750
His His His His Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
755 760 765
Ile Glu Trp His Glu
770
<210> 51
<211> 648
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO1 with mutations of SARS-CoV-2 U.K. variant B.1.1.7
<400> 51
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn
50 55 60
Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys
65 70 75 80
Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys
85 90 95
Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys
100 105 110
Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr
115 120 125
His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser
130 135 140
Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met
145 150 155 160
Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val
165 170 175
Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro
180 185 190
Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro
195 200 205
Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu
210 215 220
Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly
225 230 235 240
Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg
245 250 255
Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val
260 265 270
Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser
275 280 285
Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln
290 295 300
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
305 310 315 320
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
325 330 335
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
340 345 350
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
355 360 365
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
370 375 380
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
385 390 395 400
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
405 410 415
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
420 425 430
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
435 440 445
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
450 455 460
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
465 470 475 480
Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
485 490 495
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
500 505 510
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
515 520 525
Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro
530 535 540
Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Asp Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg
545 550 555 560
Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly
565 570 575
Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala
580 585 590
Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His
595 600 605
Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn
610 615 620
Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn
625 630 635 640
Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile His
645
<210> 52
<211> 650
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO1 with mutations of SARS-CoV-2 South African variant
B.1.351
<400> 52
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro
645 650
<210> 53
<211> 650
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO1 with mutations of SARS-CoV-2 Brazilian variant P.1
<400> 53
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro
645 650
<210> 54
<211> 648
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO1 with mutations of SARS-CoV-2 Mink Variant from Denmark
<400> 54
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn
50 55 60
Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys
65 70 75 80
Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys
85 90 95
Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys
100 105 110
Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr
115 120 125
His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser
130 135 140
Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met
145 150 155 160
Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val
165 170 175
Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro
180 185 190
Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro
195 200 205
Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu
210 215 220
Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly
225 230 235 240
Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg
245 250 255
Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val
260 265 270
Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser
275 280 285
Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln
290 295 300
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Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
340 345 350
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385 390 395 400
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
405 410 415
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
420 425 430
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO: 1-derived peptide reactive with SARS-CoV-2 antibodies
with GST fusion, P1-P6
<400> 56
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35 40 45
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50 55 60
Gly Tyr Gln
65
Claims (15)
- 환자의 혈액 시료에서 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체의 유무를 검출하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 정보제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2는, GenBank에 승인 코드 MN908947으로 기탁된 게놈 및 전체 게놈 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80 퍼센트의 서열 동일성을 보이는 이의 유도체에 의해 특징지어지는 바이러스인 방법.
- 제2항에 있어서, 시료를 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로,
상기 폴리펩티드는,
a) 인공 링커, 친화성 태그 및 또 다른 항원을 포함하는 그룹으로부터의 하나 이상에 선택적으로 융합된 서열 번호 1의 전장 서열로 구성되거나,
b) 상기 변이체는 서열 번호 1의 전장 서열보다 짧은 절단된 서열 번호 1이며, 상기 절단은 N-말단, C-말단 또는 둘 다에 있고, 선택적으로 인공 링커, 친화성 태그 및 또 다른 항원을 포함하는 그룹으로부터의 하나 이상에 융합되고,
(i) 서열 번호 1의 연속 아미노산 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 600개를 포함하는 서열 번호 1의 단편을 포함하고/거나,
(ii) 서열 번호 1의 참조 단편에 대해 적어도 80 퍼센트, 85 퍼센트, 90 퍼센트, 92 퍼센트, 94 퍼센트, 95 퍼센트, 96 퍼센트, 97 퍼센트, 98 퍼센트 또는 99 퍼센트의 동일성을 갖는, 적어도 200개의 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호 1의 단편을 포함하고,
상기 변이체는 SARS-CoV-2를 앓고 있는 환자의 시료에서 서열 번호 1에 대한 항체에 결합하는 능력을 가진 방법. - 제3항에 있어서, 면역계측 검정(immunometric assay) 또는 군 포착 검정(class capture assay)을 사용하는 것인 방법.
- 환자로부터 채취한 혈액 시료에서 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및 IgG 군 항체의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 정보제공 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2는, GenBank에 승인 코드 MN908947으로 기탁된 게놈 및 전체 게놈 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80 퍼센트의 서열 동일성을 보이는 이의 유도체에 의해 특징지어지는 바이러스인 방법.
- 제6항에 있어서, 시료를 서열 번호 1 또는 그 변이체를 포함하고, 진단에 유용한 담체에 코팅된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법으로,
상기 폴리펩티드는,
a) 인공 링커, 친화성 태그 및 또 다른 항원을 포함하는 그룹으로부터의 하나 이상에 선택적으로 융합된 서열 번호 1의 전장 서열로 구성되거나,
b) 상기 변이체는 서열 번호 1의 전장 서열보다 짧은 절단된 서열 번호 1이며, 상기 절단은 N-말단, C-말단 또는 둘 다에 있고, 선택적으로 인공 링커, 친화성 태그 및 또 다른 항원을 포함하는 그룹으로부터의 하나 이상에 융합되고,
(i) 서열 번호 1의 연속 아미노산 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 600개를 포함하는 서열 번호 1의 단편을 포함하고/거나,
(ii) 서열 번호 1의 참조 단편에 대해 적어도 80 퍼센트, 85 퍼센트, 90 퍼센트, 92 퍼센트, 94 퍼센트, 95 퍼센트, 96 퍼센트, 97 퍼센트, 98 퍼센트 또는 99 퍼센트의 동일성을 갖는, 적어도 200개의 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호 1의 단편을 포함하고,
상기 변이체는 SARS-CoV-2를 앓고 있는 환자의 시료에서 서열 번호 1에 대한 항체에 결합하는 능력을 가진 방법. - 제7항에 있어서, 포착 가교 검정(capture bridge assay)이 사용되는 방법.
- 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드로 코팅된 담체 및 서열 번호 1에 대한 IgA 군 항체의 존재를 검출하기 위한 수단을 포함하는 키트로서,
상기 폴리펩티드는,
a) 인공 링커를 포함하는 그룹으로부터의 하나 이상에 선택적으로 융합된 서열 번호 1의 전장 서열로 구성되거나,
b) 상기 변이체는 서열 번호 1의 전장 서열보다 짧은 절단된 서열 번호 1이며, 상기 절단은 N-말단, C-말단 또는 둘 다에 있고, 선택적으로 인공 링커, 친화성 태그 및 또 다른 항원을 포함하는 그룹으로부터의 하나 이상에 융합되고,
(i) 서열 번호 1의 연속 아미노산 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 600개를 포함하는 서열 번호 1의 단편을 포함하고/거나,
(ii) 서열 번호 1의 참조 단편에 대해 적어도 80 퍼센트, 85 퍼센트, 90 퍼센트, 92 퍼센트, 94 퍼센트, 95 퍼센트, 96 퍼센트, 97 퍼센트, 98 퍼센트 또는 99 퍼센트의 동일성을 갖는, 적어도 200개의 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호 1의 단편을 포함하고,
상기 변이체는 SARS-CoV-2를 앓고 있는 환자의 시료에서 서열 번호 1에 대한 항체에 결합하는 능력을 가지며,
상기 키트는 추가로 표준물질, 양성 대조군, 음성 대조군, 세척 완충제, 시료 완충제, 검출 용액, 정지 용액, 보호용 호일 및 서열 번호1에 대한 항체를 포함하는 그룹으로부터의 하나 이상의 시약을 포함하며,
상기 키트는 환자의 혈액 시료에서 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및 IgG 군 항체의 존재 또는 부존재 검출용인 키트. - 제9항에 있어서, 상기 키트는 포착 가교 검정(capture bridge assay)에 기반한 것인 키트.
- 서열 번호 1 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드로 코팅된 담체 및 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및 IgG 군 항체의 존재를 검출하기 위한 수단을 포함하는 키트로서,
상기 폴리펩티드는,
a) 인공 링커를 포함하는 그룹으로부터의 하나 이상에 선택적으로 융합된 서열 번호 1의 전장 서열로 구성되거나,
b) 상기 변이체는 서열 번호 1의 전장 서열보다 짧은 절단된 서열 번호 1이며, 상기 절단은 N-말단, C-말단 또는 둘 다에 있고, 선택적으로 인공 링커, 친화성 태그 및 또 다른 항원을 포함하는 그룹으로부터의 하나 이상에 융합되고,
(i) 서열 번호 1의 연속 아미노산 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 600개를 포함하는 서열 번호 1의 단편을 포함하고/거나,
(ii) 서열 번호 1의 참조 단편에 대해 적어도 80 퍼센트, 85 퍼센트, 90 퍼센트, 92 퍼센트, 94 퍼센트, 95 퍼센트, 96 퍼센트, 97 퍼센트, 98 퍼센트 또는 99 퍼센트의 동일성을 갖는, 적어도 200개의 연속 아미노산을 포함하는 서열 번호 1의 단편을 포함하고,
상기 변이체는 SARS-CoV-2를 앓고 있는 환자의 시료에서 서열 번호 1에 대한 항체에 결합하는 능력을 가지며,
상기 키트는 추가로 표준물질, 양성 대조군, 음성 대조군, 세척 완충제, 시료 완충제, 검출 용액, 정지 용액, 보호용 호일 및 서열 번호 1에 대한 항체를 포함하는 그룹으로부터의 하나 이상의 시약을 포함하며,
상기 키트는 환자의 혈액 시료에서 서열 번호 1에 대한 IgA, IgM 및 IgG 군 항체의 존재 또는 부존재 검출용인 키트 - 제11항에 있어서, 상기 키트는 면역계측 검정(immunometric assay) 또는 군 포착 검정(class capture assay)을 기반으로 하는 키트.
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- 삭제
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