CN117144063B - 一种12种呼吸道病原体荧光pcr熔解曲线试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种12种呼吸道病原体荧光PCR熔解曲线试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明提供的用于检测12种呼吸道病原体的荧光PCR熔解曲线试剂盒，所述12种呼吸道病原体为：新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、博卡病毒、百日咳鲍特菌、肺炎支原体、肺炎衣原体；所述试剂盒包括检测12种呼吸道病原体的引物探针组和检测人核糖核酸酶P的引物探针组。本发明可实现一次反应同时检测12种类型的呼吸道病原体，检测全面、效率高、特异性好、灵敏度高，解决了现有技术中单重荧光PCR需要单孔单检，步骤繁琐的问题。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种12种呼吸道病原体荧光PCR熔解曲线试剂盒。
背景技术
呼吸道感染是临床常见疾病，呼吸道病原体来源极为复杂，包括病毒如呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、流感病毒(FLu)、副流感病毒(PIV)、偏肺病毒(MPV)、鼻病毒(RHV)、细菌如百日咳杆菌以及肺炎支原体、肺炎衣原体等其他病原体，且传播迅速，临床表现相似，患者均表现为发热和呼吸道感染症状，单从临床表现很难区分感染病原体，以致某些患者病情加重错过最佳治疗时机。在没有明确的病原微生物学诊断情况下，对严重的下呼吸道感染患者通常在最初的治疗中会使用经验性的广谱抗菌药物来缓解症状。一旦确定病原体，临床医师应调整或停止这种经验性治疗。但是，在患者反应良好或没有检测到导致感染的病原体时，临床医师则通常会继续进行经验性治疗，最终导致广谱抗菌药物的滥用。此外，在没有微生物病原学检查的情况下，临床医师可能会错误地将症状归类为非感染性炎症反应，并经验性使用激素类药物治疗，这可能会导致再次感染。因此，快速、准确地识别病原体可以进行精准治疗，减少广谱抗菌药物的滥用和院内感染的传播，并促进患者康复。
病原体的培养作为呼吸道病原体检测的金标准，特异性高、成本低，但对于一些难以培养的病原体(如病毒、衣原体)来说，时效性和敏感性较差。因此这些病原体的分离培养不适用于常规检测。涂片检测的优点是快速、直观、成本低，临床易于开展，但缺点是敏感性偏低，并且非常依赖于检验工作人员的经验。免疫学检测是通过血清学来检测抗原和(或)抗体的检测方法。免疫学检测操作简便、成本低，缺点是敏感性低、易漏检，存在窗口期。
分子生物学技术可快速、准确地识别病原体并及时诊断感染性疾病，与传统的分离培养、涂片检测和免疫学检测等方法学相比有着明显的优势。常用的呼吸道病原体分子检测手段有普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR。单重PCR是最早建立的PCR方法，只针对单个DNA模板进行检测，因此只能检测一种病原体，而目前市面上采用多重PCR方法的产品，目前仅能同时检测少数几种病原体，并且操作时间较长，操作繁琐。
探针熔解曲线技术又称为后PCR技术，利用能与靶核酸序列特异性结合的检测探针，在扩增程序后加上一个熔解程序，通过逐渐提高温度，使荧光标记探针与靶核酸形成的双链发生熔解，形成一个具有特定熔点(TM值)的熔解峰，根据熔点的不同可对多个靶核酸进行区分，使得单一荧光通道的可检测靶标数增多。分子信标探针是熔解曲线常用的一种，其他的还有线性双标记探针、单标记探针、非标记探针等。
但是普通的分子信标探针，因其为颈环结构导致在没有模板存在时，其自身的熔解曲线有一个明显的较宽且较深的负峰，若一个通道放入三条颈环结构的分子信标探针时，这三条颈环结构的分子信标探针的负峰会融合为一个更深更宽的负峰，这严重影响了目的峰的出峰，导致多重探针的灵敏度降低，因此，需要一种能够克服以上问题的引物探针来使得检测结果更加准确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测12种呼吸道病原体的荧光PCR溶解曲线试剂盒，可实现一次反应同时检测12种类型的呼吸道病原体，检测全面、效率高、特异性好、灵敏度高，解决了现有技术中单重荧光PCR需要单孔单检，步骤繁琐的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测12种呼吸道病原体的荧光PCR熔解曲线试剂盒，所述12种呼吸道病原体为：新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、博卡病毒、百日咳鲍特菌、肺炎支原体、肺炎衣原体；所述试剂盒包括检测12种呼吸道病原体的引物探针组和检测人核糖核酸酶P的引物探针组。
优选的，所述甲型流感病毒包括H1N1、H5N1、H7N9、H3N2型；所述乙型流感病毒包括victoria、Yamagata型，所述呼吸道合胞病毒包括A、B型；所述副流感病毒包括1、2、3、4型；所述鼻病毒包括A、B、C型；所述人偏肺病毒包括A、B型。
优选的，所述新型冠状病毒通过ORF1ab基因和N基因检测。
优选的，检测所述新型冠状病毒的ORF1ab基因的引物序列如SEQ ID NO：1～2所示；探针序列如SEQ ID NO：3所示；
检测所述新型冠状病毒的N基因的引物序列如SEQ ID NO：4～5所示；探针序列如SEQ ID NO：6所示；
检测所述甲型流感病毒的引物序列如SEQ ID NO：7～9所示；探针序列如SEQ IDNO：10所示；
检测所述乙型流感病毒的引物序列如SEQ ID NO：11～12所示；探针序列如SEQ IDNO：13所示；
检测所述呼吸道合胞病毒A型的引物序列如SEQ ID NO：14～15所示；
检测所述呼吸道合胞病毒B型的引物序列如SEQ ID NO：16～17所示；
检测所述呼吸道合胞病毒A型、B型的探针序列如EQ ID NO：18所示；
检测所述副流感病毒1型的引物序列如SEQ ID NO：19～20所示；探针序列如SEQID NO：21所示；
检测所述副流感病毒2型的引物序列如SEQ ID NO：22～23所示；探针序列如SEQID NO：24所示；
检测所述副流感病毒3型的引物序列如SEQ ID NO：25～26所示；探针序列如SEQID NO：27所示；
检测所述副流感病毒4型的引物序列如SEQ ID NO：28～29所示；探针序列如SEQID NO：30所示；
检测所述鼻病毒A型的引物序列如SEQ ID NO：31～32所示；
检测所述鼻病毒B型的引物序列如SEQ ID NO：33～34所示；
检测所述鼻病毒C型的引物序列如SEQ ID NO：35～36所示；
检测所述鼻病毒的A、B、C型的探针序列如SEQ ID NO：37所示；
检测所述人偏肺病毒的引物序列如SEQ ID NO：38～39所示；探针序列如SEQ IDNO：40所示；
检测所述腺病毒的引物序列如SEQ ID NO：41～42所示；探针序列如SEQ ID NO：43所示；
检测所述博卡病毒的引物序列如SEQ ID NO：44～45所示；探针序列如SEQ ID NO：46所示。
检测所述百日咳鲍特菌的引物序列如SEQ ID NO：47～48所示；探针序列如SEQ IDNO：49所示；
检测所述肺炎支原体的引物序列如SEQ ID NO：50～51所示；探针序列如SEQ IDNO：52所示；
检测所述肺炎衣原体的引物序列如SEQ ID NO：53～54所示；探针序列如SEQ IDNO：55所示；
检测所述人核糖核酸酶P的引物序列如SEQ ID NO：56～57所示；探针序列如SEQID NO：58所示；
优选的，检测所述新型冠状病毒的ORF1ab基因、腺病毒、鼻病毒、肺炎支原体的探针的5’端标记ROX，3’端标记BHQ2；检测所述新型冠状病毒的N基因、甲型流感病毒、肺炎衣原体的探针的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1；检测所述乙型流感病毒、副流感病毒、百日咳鲍特菌的探针的5’端标记HEX，3’端标记BHQ1；检测所述人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、人核糖核酸酶P、博卡病毒的探针的5’端标记CY5，3’端标记BHQ3。
优选的，所述多重荧光PCR反应体系如下：
2×buffer，其成分包含：50～60mM Tris-HCl，18～22mM(NH4)2SO4，55～65mMTMAC，4～6％DMSO，2.5～3.5mM MgCl2，0.15～0.25mM dNTPs；
1.5～2.5U的5×Onestep U；
阳性质粒或提取后样本加5～25μL，加入RNase free water补至20～55μL；
引物浓度为25～300nM，探针浓度为27～80nM。
优选的，所述多重荧光PCR反应的程序为：逆转录50～60℃8～12min，预变性90～100℃4～6min，50个循环扩增步骤：变性90～100℃15～25s，退火50～60℃25～35s，延伸70～75℃25～35s，之后90～100℃变性1.5～2.5min，25～35℃保温2.5～3.5min，从40℃-80℃进行熔解曲线分析。
优选的，所述12种呼吸道病原体对应的熔解温度及荧光通道类型如下，根据荧光通道的类型和熔解温度，判断感染的病毒类型：
所述新型冠状病毒的N基因的Tm值为54.41-58.37℃，FAM通道；
所述甲型流感病毒的Tm值为65.17-69.41℃，FAM通道；
所述肺炎衣原体的Tm值为72.65-76.39℃，FAM通道；
所述乙型流感病毒的Tm值为55.31-58.78℃，HEX通道；
所述副流感病毒的Tm值为61.58-69.67℃，HEX通道；
所述百日咳杆菌的Tm值为70.53-73.84℃，HEX通道；
所述新型冠状病毒的ORF1ab基因的Tm值为47.28-50.82℃，ROX通道；
所述腺病毒的Tm值为57.17-60.42℃，ROX通道；
所述鼻病毒的Tm值为63.17-66.67℃，ROX通道；
所述肺炎支原体的Tm值为72.65-76.04℃，ROX通道；
所述人偏肺病毒的Tm值为54.48-58.17℃，CY5通道；
所述呼吸道合胞病毒的Tm值为62.62-66.73℃，CY5通道；
所述人核糖核酸酶P的Tm值为68.80-72.29℃，CY5通道；
所述博卡病毒的Tm值为73.98-76.68℃，CY5通道。
本发明提供的用于检测12种呼吸道病原体的荧光PCR溶解曲线试剂盒，在前期针对每一种病原体设计了各种二级结构的TaqMan探针，优化选取基线比较平缓，有模板存在时目的峰较高的探针进行了多重实验，优化筛选后得到目前12种病原体引物探针，各探针不会相互干扰、特异性好、灵敏度高，并且熔解曲线基线平缓，有利于规避非特异峰、阴性熔解峰等的影响，结果判读更准确高效。
附图说明
图1为实施例1新型冠状病毒溶解峰及阴性溶解曲线；
图2为实施例1偏肺病毒、博卡病毒的溶解峰及阴性溶解曲线；
图3为实施例1甲型流感病毒、鼻病毒、副流感病毒的溶解峰及阴性溶解曲线；
图4为实施例1乙型流感病毒、腺病毒、合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳鲍特菌的溶解峰及阴性溶解曲线；
图5为实施例3特异性检测的溶解曲线；
图6为对比例1中普通分子信标溶解峰及阴性熔解曲线；
图7为对比例1中本发明体系的溶解峰及阴性熔解曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测12种呼吸道病原体的荧光PCR溶解曲线试剂盒，可以检测12种呼吸道病原体，其中包括7种RNA病毒(新型冠状病毒、甲型流感病毒(包括H1N1、H5N1、H7N9、H3N2)、乙型流感病毒(包括victoria型和Yamagata型)、呼吸道合胞病毒(A型和B型)、副流感病毒(1、2、3、4型)、鼻病毒(A、B、C型)和人偏肺病毒(A、B型))，2种DNA病毒(腺病毒和博卡病毒)、1种细菌(百日咳鲍特菌)以及肺炎支原体、肺炎衣原体。所述试剂盒包括检测12种呼吸道病原体的引物探针组和检测人核糖核酸酶P的引物探针组。如下表1所示：
表1 12种呼吸道病原体和人核糖核酸酶P的引物探针组
在样本采集中，临床检测样本由临床医师根据实际情况进行标本采集，可检测的标本包括，鼻拭子、咽拭子。采集方法如下：
(1)请病人先用生理盐水漱口。
(2)拭子放入生理盐水中湿润。
(3)鼻拭子采集：以拭子测量鼻孔到耳根的距离并以手指做标记，将拭子以垂直鼻子(面部)方向插入鼻孔，直至手指触及鼻子，使拭子在鼻内停留15-30秒，然后轻轻旋转3次；也可以咽拭子采集：由检查者用压舌板辅助，将咽拭子越过舌根，到达咽峡部病变处，反复涂抹数次，取出时避免接触舌及口腔黏膜等处。
(4)将采集后的拭子投入病毒运送培养基中，折断拭杆，使其完全置于管中。
(5)旋紧管盖，做好标记，放入塑料袋密封好。
(6)短期保存于4℃或冰上。
采用市场上在售的核酸提取试剂盒对临床样本的核酸进行提取，提取后的DNA/RNA立刻进行检测或储存于-80℃冰箱用于后续检测。
多重荧光PCR反应体系如下：
2×buffer(55mM Tris-HCl，20mM(NH4)2SO4，60mM TMAC和5％DMSO，3.0mM MgCl2，0.2mM dNTPs)以及2.0U的5×Onestep U(诺唯赞)，引物探针浓度参考表2。阳性质粒或样品模板10μL，加RNase free water补齐至50uL。注意每次检测都要设置阳性对照和阴性对照。
各引物探针的终浓度如表2所示：
表2多重反应体系中各引物探针终浓度
检测方法的扩增程序为：逆转录55℃10min，预变性95℃5min，50个循环扩增步骤(变性95℃20s，退火55℃30s，延伸72℃30s)，之后95℃变性2min，30℃保温3min，从40℃-80℃进行熔解曲线分析，实验在宏石SLAN96P实时荧光PCR仪上进行。
结果判读，根据熔解曲线峰图和内标扩增情况，确定样本中是否存在待检的呼吸道病原体，根据荧光通道的类型和熔解温度，来判断感染的病毒类型。各类型病毒对应的熔解温度如表3所示。
表3 12种呼吸道病原体及人核糖核酸酶P检测结果的判读标准
(1)使用本发明试剂盒对含有新型冠状病毒及对照DNA(人RNase P基因)的质控品进行检测，质控品采购自国家标准物质中心，用到的引物探针序列为SEQ ID NO：1～6、56～58。结果如图1所示，图1的阴性孔中无熔解峰，表明此样本有效；在Cy5通道70.2℃处有明显熔解峰，对应人核糖核酸酶P(内参基因)；在FAM通道56.3℃处有明显熔解峰，对应新型冠状病毒N基因，同时在ROX通道48.5℃处有明显熔解峰，对应新型冠状病毒orf1ab基因，因此结果表明该样本为新型冠状病毒感染。
(2)使用本发明试剂盒对含有偏肺病毒、博卡病毒及对照DNA(人RNase P基因)的质控品进行检测，质控品采购自国家标准物质中心。用到的引物探针序列为SEQ ID NO：38～40、44～46、56～58，结果如图2所示，图2的阴性孔中无熔解峰，表明此样本有效；在Cy5通道56.5℃、70.9℃和75.3℃三处共有三个明显熔解峰，分别对应偏肺病毒、人核糖核酸酶P和博卡病毒。
(3)使用本发明试剂盒对含有甲型流感病毒、鼻病毒、副流感病毒及对照DNA(人RNase P基因)的质控品进行检测，质控品采购自国家标准物质中心。用到的引物探针序列为SEQ ID NO：7～10、31～37、19～30、56～58，结果如图3所示，图3的阴性孔中无熔解峰，表明此样本有效；在Cy5通道70.2℃处有明显熔解峰，对应人核糖核酸酶P(内参基因)；ROX通道中，在64.1℃处有明显熔解峰，对应鼻病毒；Hex通道中65.1℃处有明显熔解峰，对应副流感病毒(1、2、3、4型中的一种)；Fam通道中64.8℃处有明显熔解峰，对应甲型流感病毒(H3N2、H1N1、H7N9、H3N2中的一种)。
(4)使用本发明试剂盒对含有乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳鲍特菌及对照DNA(人RNase P基因)的质控品进行检测，质控品采购自国家标准物质中心。用到的引物探针序列为SEQ ID NO：11～13、41～42、14～18、50～52、53～55、56～58，结果如图4所示，图4的阴性孔中无熔解峰，表明此样本有效；在Cy5通道64.1℃和70.2℃处有两个明显熔解峰，分别对应合胞病毒和人核糖核酸酶P；ROX通道中，在58.8℃和74.1℃处共有两个明显熔解峰，分别对应腺病毒(1型、2型、3型、4型、5型、7型、55型中的一种)和肺炎支原体；在Hex通道56.6℃和72.0℃处有两个明显熔解峰，分别对应乙型流感病毒(victoria或yamagata型)和百日咳鲍特菌；Fam通道中73.9℃处有明显熔解峰，对应肺炎衣原体。
实施例2
灵敏度实验
针对12种呼吸道病原体分别设置不同浓度质粒，质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，通过该检测试剂盒进行多重PCR检测，将各个病原体的质粒分别按照比例稀释至10000copies/mL、1000copies/mL、100copies/mL、10copies/mL总计4个浓度梯度作为反应模板，按照该试剂盒加样后上机检测，试剂盒检测结果如表4所示，结果显示本发明设计的引物探针组合具有较强的灵敏度。甲型流感病毒、乙型流感病毒、博卡病毒、新型冠状病毒、鼻病毒、偏肺病毒的检测灵敏度达到100copies/mL，肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、百日咳鲍特菌、副流感1、2、3、4型的检测灵敏度达到1000copies/mL。
表4各类型病原体灵敏度试验结果
表4(续)各类型病原体灵敏度试验结果
实施例3
特异性实验
使用本发明的试剂盒对核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的病原体(如冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、肠病毒A、B型、肠病毒C型(EV-C95)、肠病毒D型(EV-D70)、人间质肺病毒、新生隐球菌、化脓性性链球菌、鲍曼不动杆菌、肺孢子虫、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原体、EB病毒、人巨细胞病毒、烟曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、诺如病毒、轮状病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒等)进行多重PCR检测，以上病原体均采购自广州邦德盛有限公司，结果如图5所示，从图5中可以看出，各个通道均未出现非特异熔解峰，证明本发明组合物有很好的特异性，且可以看出本发明的引物探针组合基线很平缓，有利于规避阴性熔解峰的影响。
对比例1
普通分子信标探针体系：以新型冠状病毒N基因为例，使用引物SEQ ID NO.4和SEQID NO.5，根据引物之间的靶特异序列设计颈环分子信标探针，其探针序列为nCovN-MB：5’-CGAGCAACTAATCAGACAAGGAACGCTCG-3’(SEQ ID NO：59)，下划线的碱基为分子信标探针的茎序列。其5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ2淬灭基团。以本发明体系中新型冠状病毒N基因的探针进行对比。
利用上述分子信标探针进行PCR反应，该PCR反应体系共计20μL，包括：引物探针0.2μL，10copies/μLnCoV模板5μL，Mix反应液3.2μL以及Rnase free water 11.6μL。PCR反应程序条件同本发明试剂盒。
实验结果如图6-7所示，可以看出，普通分子信标体系中，其基线呈一个向下的负峰型，其负峰较深，最深处荧光值为-176.83，其溶解峰值为104.01；本发明体系中，基线很平缓呈一条直线型，其溶解峰较高，峰值为203.72，由此可看出本发明基线平缓，不会对目的峰产生影响，目的峰值显著高于分子信标体系。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种用于检测12种呼吸道病原体的荧光PCR熔解曲线试剂盒，其特征在于，所述12种呼吸道病原体为：新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、博卡病毒、百日咳鲍特菌、肺炎支原体、肺炎衣原体；所述试剂盒包括检测12种呼吸道病原体的引物探针组和检测人核糖核酸酶P的引物探针组；
所述甲型流感病毒包括H1N1、H5N1、H7N9、H3N2型；所述乙型流感病毒包括victoria、Yamgata型，所述呼吸道合胞病毒包括A、B型；所述副流感病毒包括1、2、3、4型；所述鼻病毒包括A、B、C型；所述人偏肺病毒包括A、B型；
所述新型冠状病毒通过ORF1ab基因和N基因检测；
检测所述新型冠状病毒的ORF1ab基因的引物序列如SEQ ID NO：1～2所示；探针序列如SEQ ID NO：3所示；
检测所述新型冠状病毒的N基因的引物序列如SEQ ID NO：4～5所示；探针序列如SEQID NO：6所示；
检测所述甲型流感病毒的引物序列如SEQ ID NO：7～9所示；探针序列如SEQ ID NO：10所示；
检测所述乙型流感病毒的引物序列如SEQ ID NO：11～12所示；探针序列如SEQ ID NO：13所示；
检测所述呼吸道合胞病毒A型的引物序列如SEQ ID NO：14～15所示；
检测所述呼吸道合胞病毒B型的引物序列如SEQ ID NO：16～17所示；
检测所述呼吸道合胞病毒A型、B型的探针序列如EQ ID NO：18所示；
检测所述副流感病毒1型的引物序列如SEQ ID NO：19～20所示；探针序列如SEQ IDNO：21所示；
检测所述副流感病毒2型的引物序列如SEQ ID NO：22～23所示；探针序列如SEQ IDNO：24所示；
检测所述副流感病毒3型的引物序列如SEQ ID NO：25～26所示；探针序列如SEQ IDNO：27所示；
检测所述副流感病毒4型的引物序列如SEQ ID NO：28～29所示；探针序列如SEQ IDNO：30所示；
检测所述鼻病毒A型的引物序列如SEQ ID NO：31～32所示；
检测所述鼻病毒B型的引物序列如SEQ ID NO：33～34所示；
检测所述鼻病毒C型的引物序列如SEQ ID NO：35～36所示；
检测所述鼻病毒的A、B、C型的探针序列如SEQ ID NO：37所示；
检测所述人偏肺病毒的引物序列如SEQ ID NO：38～39所示；探针序列如SEQ ID NO：40所示；
检测所述腺病毒的引物序列如SEQ ID NO：41～42所示；探针序列如SEQ ID NO：43所示；
检测所述博卡病毒的引物序列如SEQ ID NO：44～45所示；探针序列如SEQ ID NO：46所示；
检测所述百日咳鲍特菌的引物序列如SEQ ID NO：47～48所示；探针序列如SEQ ID NO：49所示；
检测所述肺炎支原体的引物序列如SEQ ID NO：50～51所示；探针序列如SEQ ID NO：52所示；
检测所述肺炎衣原体的引物序列如SEQ ID NO：53～54所示；探针序列如SEQ ID NO：55所示；
检测所述人核糖核酸酶P的引物序列如SEQ ID NO：56～57所示；探针序列如SEQ IDNO：58所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测12种呼吸道病原体的荧光PCR熔解曲线试剂盒，其特征在于，检测所述新型冠状病毒的ORF1ab基因、腺病毒、鼻病毒、肺炎支原体的探针的5’端标记ROX，3’端标记BHQ2；检测所述新型冠状病毒的N基因、甲型流感病毒、肺炎衣原体的探针的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1；检测所述乙型流感病毒、副流感病毒、百日咳鲍特菌的探针的5’端标记HEX，3’端标记BHQ1；检测所述人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、人核糖核酸酶P、博卡病毒的探针的5’端标记CY5，3’端标记BHQ3。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测12种呼吸道病原体的荧光PCR熔解曲线试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应的程序为：逆转录50～60℃8～12min，预变性90～100℃4～6min，50个循环扩增步骤：变性90～100℃15～25s，退火50～60℃25～35s，延伸70～75℃25～35s，之后90～100℃变性1.5～2.5min，25～35℃保温2.5～3.5min，从40℃-80℃进行熔解曲线分析。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种用于检测12种呼吸道病原体的荧光PCR熔解曲线试剂盒，其特征在于，所述12种呼吸道病原体对应的熔解温度及荧光通道类型如下，根据荧光通道的类型和熔解温度，判断感染的病毒类型：
所述新型冠状病毒的N基因的Tm值为54.41-58.37℃，FAM通道；
所述甲型流感病毒的Tm值为65.17-69.41℃，FAM通道；
所述肺炎衣原体的Tm值为72.65-76.39℃，FAM通道；
所述乙型流感病毒的Tm值为55.31-58.78℃，HEX通道；
所述副流感病毒的Tm值为61.58-69.67℃，HEX通道；
所述百日咳杆菌的Tm值为70.53-73.84℃，HEX通道；
所述新型冠状病毒的ORF1ab基因的Tm值为47.28-50.82℃，ROX通道；
所述腺病毒的Tm值为57.17-60.42℃，ROX通道；
所述鼻病毒的Tm值为63.17-66.67℃，ROX通道；
所述肺炎支原体的Tm值为72.65-76.04℃，ROX通道；
所述人偏肺病毒的Tm值为54.48-58.17℃，CY5通道；
所述呼吸道合胞病毒的Tm值为62.62-66.73℃，CY5通道；
所述人核糖核酸酶P的Tm值为68.80-72.29℃，CY5通道；
所述博卡病毒的Tm值为73.98-76.68℃，CY5通道。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 儿童呼吸道感染性疾病病原体多重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用;刘文锋;中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）(第3期);E069-56页 * |
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