CN111394513B - 新型冠状病毒SARS-CoV-2荧光定量PCR检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测样品中新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的引物和探针组，其包括快速筛选引物和探针以及确证引物和探针。在具体实施方案中，所述快速筛选引物和探针的序列如SEQ ID NOs：4‑6所示，所述确证引物和探针如SEQ ID NOs：1‑3所示。本发明还提供了所述引物和探针组用于制备检测样品中新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的试剂的用途。

Description

新型冠状病毒SARS-CoV-2荧光定量PCR检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及人呼吸道病毒检测领域，特别是可用于新型冠状病毒SARS-CoV-2所致疾病检测的荧光定量PCR方法、引物和探针组及其应用。

背景技术

下呼吸道感染是全世界发病率和死亡率的主要原因。2016年，下呼吸道感染导致5岁以下的儿童死亡652572人，成人中超过70岁中有1080958例死亡，并且在全球各个年龄段的人群中有2377697例死亡。不断出现的新型呼吸道病毒对人类的危害极大。(参见GBD2016Lower Respiratory Infections Collaborators.Estimates of the global,regional,and national morbidity,mortality,and aetiologies of lowerrespiratory infections in 195countries,1990-2016:a systematic analysis forthe Global Burden of Disease Study 2016.Lancet Infect Dis.2018Nov；18(11):1191-1210.doi:10.1016)。

在过去的几十年中，我们已经发现几种新出现的病毒引起的呼吸道感染流行，其中大部分起源于动物。这些新型感染包括严重的急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)以及流行性甲型H1N1和禽流感(AI)病毒，已严重威胁全球健康和经济。(参见Park S,Park JY,Song Y,How SH,Jung KS；Respiratory InfectionsAssembly of the APSR.Emerging respiratory infections threatening publichealth in the Asia-Pacific region:A position paper of the Asian PacificSociety of Respirology.Respirology.2019Jun；24(6):590-597.doi:10.1111)。

冠状病毒(CoV)是一大类病毒，可引起各种疾病，从普通感冒到更严重的疾病，例如最具代表性的中东呼吸综合征(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征(SARS-CoV)。冠状病毒是人畜共患病毒，这意味着它们可能在动物和人之间传播。详细的调查发现，SARS-CoV是从果子狸传播给人类的，而MERS-CoV是从单峰骆驼传播给人类的。冠状病毒常见的感染迹象包括呼吸道症状，如发热、咳嗽、呼吸急促和呼吸困难。在更严重的情况下，感染会导致肺炎，严重的急性呼吸道综合症、肾衰竭甚至死亡(参见https://www.who.int/health-topics/coronavirus)。

新型冠状病毒SARS-CoV-2属于冠状病毒科β属。针对该病毒导致的临床疾病，迫切需要开发灵敏、快速、特异、稳定和便于使用的诊断方法，第一时间提供准确、特异性的快速检测探针引物，对于该疾病的防控极为重要，在临床应用中能够为明确病原、早期诊断提供依据，促进早期合理治疗，减少经验性抗生素使用增加的耐药负担，及时控制病情。

荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模板的量。当在荧光定量PCR检测系统中引入内参基因，其同时与目的基因检测，计算出一个待测样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的相对变化。

研发一种能够快速准确检测新型冠状病毒SARS-CoV-2且简单的方法具有重要意义。此外，仍然需要设计性能更优的引物和探针，以快速、特异、灵敏、精确检测新型冠状病毒SARS-CoV-2。

发明内容

在本发明中，我们成功设计了针对新型冠状病毒SARS-CoV-2基因的特异性引物和探针组，包括快速筛选引物和探针以及确证引物和探针。实验证明，所述引物和探针组能够特异性扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2样本，具有较好的灵敏度和特异度。

第一方面，本发明提供了用于检测样品中新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物和探针组，其包括快速筛选引物和探针，所述快速筛选引物与SARS-CoV-2N蛋白基因序列或其互补序列中的一段互补，从而特异性扩增N蛋白基因；所述快速筛选探针特异性结合SARS-CoV-2N蛋白基因内部序列。

特别地，所述引物和探针组还包括确证引物和探针，所述确证引物与SARS-CoV-2Orf1b区域序列或其互补序列中的一段互补，从而特异性扩增Orf1b区域；所述确证探针特异性结合SARS-CoV-2Orf1b区域序列。

第二方面，本发明提供了一种PCR试剂盒，所述试剂盒包括第一方面的引物和探针组。

第三方面，本发明提供了第一方面的引物和探针组或第二方面的PCR试剂盒用于制备检测样品中新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂的用途。

使用本发明的引物和探针组可取得以下有益效果：第一，本发明的检测方法快速准确，特异性强，能够大大减少检测时间，节省人力成本；第二，本发明根据病毒的保守序列设计的特异性引物及探针能够扩增出高度特异性片段，重复稳定性好；第三，本发明建立的方法可以及时对临床样品进行诊断，从而减少该病毒性肺炎带来的损失。第四，本发明可以用于实验室对病毒的鉴别，快速特异性检测新型冠状病毒SARS-CoV-2并与其他病原体区分。

附图说明

图1为实施例3中采用反应二体系时的扩增曲线图。

图2为实施例3中采用反应一体系时的扩增曲线图。

图3为采用反应一体系进行扩增后的凝胶电泳图。

图4为采用反应二体系进行扩增后的凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明提供了用于检测样品中新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物和探针组，其包括快速筛选引物和探针，所述快速筛选引物与SARS-CoV-2N蛋白基因序列或其互补序列中的一段互补，从而特异性扩增N蛋白基因；所述快速筛选探针特异性结合SARS-CoV-2N蛋白基因内部序列。优选地，所述快速筛选引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NOs:4-6所示。

在一个具体实施方案中，所述引物和探针组还包括确证引物和探针，所述确证引物与SARS-CoV-2Orf1b区域序列或其互补序列中的一段互补，从而特异性扩增Orf1b区域；所述确证探针特异性结合SARS-CoV-2Orf1b区域序列。优选地，所述确证引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NOs:1-3所示。

本发明还提供了一种PCR试剂盒，其包括上文所述检测样品中新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物和探针组。在一个具体实施方案中，所述试剂盒还包括酶混合物、PCR缓冲液和无核酸酶的水。在另一个具体实施方案中，所述试剂盒为实时荧光定量PCR试剂盒。

本发明还提供了上文所述引物和探针组或PCR试剂盒用于制备检测样品中新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂的用途。在一个具体实施方案中，所述样品为呼吸道感染患者临床样品。优选地，所述样品包括痰液、鼻咽拭子、肺泡灌洗液。

下面结合优选实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册(Sambrook,et al.New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述方法或试剂制造商提供的方法。

本发明所使用的试剂及提取试剂盒等均为市售。

实施例1探针和引物的设计合成

根据新型冠状病毒SARS-CoV-2的保守区域序列，利用软件Primer3和blast设计实时荧光定量PCR引物以及TaqMan探针。设计方法如下：针对靶向的目标基因，使用滑动窗口法设计TaqMan探针，窗口宽度设置为120个核苷酸，步长为1个核苷酸，穷举全部可能的探针序列。使用以下条件筛选探针：1)探针序列长度20-35个核苷酸；2)探针序列Tm值为70±2℃；3)探针序列的GC含量40％-70％。确定TaqMan探针后，使用软件设计与之匹配的引物，引物需满足以下条件：1)长度18-35个核苷酸，上、下游引物长度相差不超过4个核苷酸；2)引物Tm值为60±2℃，上、下游引物Tm相差不超过2℃；3)引物自身不形成环状发卡结构；4)引物自身不形成二聚体；5)上下游引物的扩增子大小为100-220个核苷酸。设计好的多对引物与探针进行blast在线比对以及匹配实验，选择所得特异性较好且Ct值较低的引物对。

荧光标记物为FAM和BHQ1。两组正向引物、反向引物和探针分别命名为：(第一组)SARS-CoV-2-F1、SARS-CoV-2-R1、SARS-CoV-2-P1-FAM；(第二组)SARS-CoV-2-F2、SARS-CoV-2-R2、SARS-CoV-2-P2-FAM。其中，第二组的引物用于特异性扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2N蛋白基因序列，探针特异性结合SARS-CoV-2N蛋白基因内部序列，探针5’端和3’端的荧光标记物分别为FAM和BHQ1；第一组的引物用于特异性扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2Orf1b区域序列，探针特异性结合SARS-CoV-2Orf1b区域序列，探针5’端和3’端的荧光标记物分别为FAM和BHQ1。

上述所有引物和探针由擎科生物合成，OPC级别纯化。具体设计的扩增所用引物及探针序列如表1所示。

表1

实施例2模板的制备

选取200μl含有新型冠状病毒SARS-CoV-2的临床样本(痰液、鼻咽拭子、或肺泡灌洗液)，加入600μl Trizol LS裂解10min，然后加入800μl无水乙醇混合。RNA提取按照Direct-zol^TMRNA MiniPrep操作说明进行。最后取5μl RNA模板进行后续检测。

实施例3实时PCR检测

针对该种病原同时进行以下两组反应。在扩增反应体系中，对探针浓度、引物浓度和退火温度进行优化，建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序。最终确定如下的反应体系和反应条件。

反应一：使用快速筛选引物和探针的反应体系包括5μlSARS-CoV-2RNA、25×RT-PCR酶混合物1μl、引物(SARS-CoV-2-F250μM)0.2μl、引物(SARS-CoV-2-R2 50μM)0.2μl、探针SARS-CoV-2-P2-FAM(20μM)0.2μl、无核酸酶的水5.9μl、总体系25μl；

反应过程为：50℃15min，95℃3min，随后95℃15s、60℃30s+plate read，共进行40个循环。

当使用该反应体系时，两例SARS-CoV-2临床阳性样本和一例阴性对照样本的扩增曲线图及扩增结果电泳图如图2和图3所示。从图2中可以看出，两例新型冠状病毒SARS-CoV-2的临床阳性样本均得到明显的扩增曲线，而阴性对照样本则无扩增曲线出现。图3显示，新型冠状病毒SARS-CoV-2的临床阳性样本通过本发明的引物组可以扩增出200bp左右大小的目标条带(泳道2)，而阴性对照样本则无扩增条带(泳道1)。

反应二：使用确证引物和探针的反应体系包括5μl SARS-CoV-2RNA、25×RT-PCR酶混合物1μl、引物(SARS-CoV-2-F1 50μM)0.2μl、引物(SARS-CoV-2-R1 50μM)0.2μl、探针SARS-CoV-2-P1-FAM(20μM)0.2μl、无核酸酶的水5.9μl，总体系25μl。反应过程同上。

当使用该反应体系时，两例SARS-CoV-2临床阳性样本和一例阴性对照样本的扩增曲线图及扩增结果电泳图如图1和图4所示。从图1中可以看出，两例新型冠状病毒SARS-CoV-2的临床阳性样本均得到明显的扩增曲线，而阴性对照样本则无扩增曲线出现。图4显示，新型冠状病毒SARS-CoV-2的临床阳性样本通过本发明的引物组可以扩增出200bp左右大小的目标条带(泳道2)，而阴性对照样本则无扩增条带(泳道1)。

本发明中实时荧光定量PCR反应体系由25μl的反应体系组成，反应在BIO-RADCFX96 PCR仪上孔板中进行，每个样品做两次平行实验，均得到相同的扩增结果。

实施例4实时荧光定量PCR检测的特异性试验

通过呼吸道病原体筛查试剂盒(Fast Track Diagnostics FTlyo Respiratorypathogens 33)对收集到的临床呼吸道样本进行多种病原体检测，筛选出人冠状病毒NL63、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、人冠状病毒HKU1阳性样本。利用本发明所提供的引物及探针组对上述筛选出的阳性样本、中东呼吸综合征冠状病毒的阳性样本(申请人自采集)以及新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性样本进行检测。上述试剂盒具体检测的病原种类及对应的试剂成分如表2所示。

表2

通过实验发现，利用本发明所提供的引物及探针，检测后仅有新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性样本具有扩增曲线，而其他人冠状病毒阳性样本检测结果均无扩增曲线。这证明本发明设计的引物及探针能够特异性扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2样本。

实施例5实时荧光定量PCR检测的灵敏度和可重复性试验

以世界卫生组织(World Health Organization,WHO)官网发布的《实时RT-PCR对冠状病毒2019的诊断检测》(参见https://www.who.int/publications-detail/laboratory-testing-for-2019-novel-coronavirus-in-suspected-human-cases-20200117)和中国疾病预防控制中心(Chinese Center for Disease Control andPrevention,CDC)发布的“新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列”(参见http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html)为参照，将本发明中的新型冠状病毒SARS-CoV-2快速检测的探针/引物组及检测方法与上述相比较。选取梯度拷贝数的新型冠状病毒SARS-CoV-2标准品进行三次重复比较分析，CT≤35视为检出阳性，结果提示，本发明的SARS-CoV-2荧光定量PCR方法的阳性检出率优于WHO及CDC发布的方法(表3)。

表3.三种SARS-CoV-2荧光定量PCR方法的阳性检出率比较

序列表

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 新型冠状病毒SARS-CoV-2荧光定量PCR检测方法及其应用

<130> CP1200039/CB

<141> 2020-03-23

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1

acggtgacat ggtaccacat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 2

ctaagttggc gtatacgcgt 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 3

tacacaatgg cagacctcgt ctatgc 26

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 4

aacacaagct ttcggcagac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 5

acctgtgtag gtcaaccacg 20

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 6

cagcgcttca gcgttcttcg gaatgtcgc 29

Claims (9)

1.用于检测样品中新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物和探针组，其包括快速筛选引物和探针，所述快速筛选引物与SARS-CoV-2N蛋白基因序列或其互补序列中的一段互补，从而特异性扩增N蛋白基因；所述快速筛选探针特异性结合SARS-CoV-2N蛋白基因内部序列；

其中所述快速筛选引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NOs:4-6所示。

2.权利要求1的引物和探针组，其还包括确证引物和探针，所述确证引物与SARS-CoV-2Orf1b区域序列或其互补序列中的一段互补，从而特异性扩增Orf1b区域；所述确证探针特异性结合新型冠状病毒SARS-CoV-2Orf1b区域序列。

3.权利要求2的引物和探针组，其中所述确证引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NOs:1-3所示。

4.一种PCR试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项的引物和探针组。

5.权利要求4的试剂盒，所述试剂盒还包括酶混合物、PCR缓冲液和无核酸酶的水。

6.权利要求4或5的试剂盒，所述试剂盒为实时荧光定量PCR试剂盒。

7.权利要求1-3中任一项的引物和探针组、或权利要求4-6中任一项的试剂盒用于制备检测样品中新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂的用途。

8.权利要求7的用途，其中所述样品为呼吸道感染患者临床样品。

9.权利要求8的用途，其中所述样品包括痰液、鼻咽拭子、肺泡灌洗液。

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