KR102267326B1

KR102267326B1 - 코로나 바이러스 진단방법 및 진단용 키트

Info

Publication number: KR102267326B1
Application number: KR1020200035908A
Authority: KR
Inventors: 조상래; 문영호; 한진일; 류지언; 이윤영
Original assignee: 주식회사 젠큐릭스
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2021-06-22

Abstract

본 발명은 코로나 바이러스 진단방법 및 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CRISPR/CAS를 이용한 코로나 바이러스 진단 방법, 코로나 바이러스 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 코로나 바이러스 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, CRISPR/Cas를 이용하여 코로나바이러스를 검출할 수 있어, 검출되는 대상인 코로나바이러스의 존재유무를 간단하고도 신속 정확하게 확인할 수 있어 코로나바이러스 진단에 드는 시간과 비용을 줄이고 코로나바이러스 감염 확산의 조기 차단에 기여할 수 있다.

Description

코로나 바이러스 진단방법 및 진단용 키트{Method and kit for detecting coronavirus}

본 발명은 코로나 바이러스 진단방법 및 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CRISPR/CAS를 이용한 코로나 바이러스 진단 방법, 코로나 바이러스 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 코로나 바이러스 진단용 키트에 관한 것이다.

바이러스의 호흡기 감염으로 인한 호흡기 질환은 가장 발병률이 높은 질병으로 모든 감염 질환의 절반 정도를 차지하고 있다. 호흡기 바이러스 감염(respiratory virus infection)은 주로 소아, 노인 면역저하 환자에게 많이 발생하며 가장 많이 알려져 있는 대표적 호흡기 감염 바이러스에는 아데노바이러스(adenovirus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus, PIV), RS 바이러스 (respiratory syncytial virus, RSV), 라이노바이러스(rhinovirus), 코로나바이러스 (coronavirus)등이 있다.

호흡기 바이러스 중 코로나바이러스는 4개의 속(genus)으로 구분이 되며, 알파, 베타 속은 사람과 동물에게 감염이 되며, 감마, 델타 속은 동물에게만 감염이 된다. 사람에게 감염 가능한 코로나바이러스는 총 6종으로 알려져 있다. 이 중 4종(229E, OC43, NL63, HKU1)은 감기의 원인이 되는 바이러스로 알려져 있으며 나머지 2종은 사람에게 중증 폐렴을 일으킬 수 있는 바이러스로 MERS 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV)와 SARS 코로나바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS-CoV)이다.

2019년 12월 중국 후베이성(Hubei Province) 우한시(Wuhan City)에서 발생한 폐렴 환자에서 최초 확인된 신종 호흡기 바이러스는 광범위한 확산성을 가져 의료 시스템에 심각한 영향을 주었다. 2019년 발생한 신종 코로나바이러스(novel coronavirus)는 기존의 메르스(MERS-CoV)와 사스(SARS-CoV) 바이러스와 다른 계열로 확인되었으며, 인간을 감염시키는 7번째 코로나바이러스 종으로 확인되었다(Ref 1). 해당 바이러스는‘SARS-CoV-2’라 명명되었으며 ‘Coronavirus Disease 2019 (COVID-19)’라 질병의 원인이 된다.

호흡기 바이러스 감염의 초기 증상은 바이러스에 상관없이 비슷한 증상과 징후를 나타내기 때문에 임상적 증상만으로는 원인을 감별하기 어렵고, 전염성이 매우 높기 때문에 단기간에 대유행을 일으킬 수도 있다. 따라서 호흡기 바이러스의 감염을 조기에 진단하여 원인 바이러스를 확인하고 적절한 감염 관리 대책을 세우는 것은 대규모 감염을 막고 조기 치료를 위해 필요하다.

한국등록특허공보 10-2018201호 한국등록특허공보 10-1800366호 한국공개특허공보 10-2019-0063512호

Zhu, Na, et al. "A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019." New England Journal of Medicine (2020)

이에 본 발명의 발명자들은 2019 신종 코로나 바이러스(2019 novel coronavirus, SARS-CoV-2)를 진단하기 위한 방법을 연구하던 중, RT-RPA와 CRISPR/Cas 기술을 활용하여 2019 신종 코로나 바이러스 감염을 진단할 수 있는 방법을 개발하고, 이 방법이 코로나바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 것으로 실증하여 이에 적합한 코로나바이러스 진단용 조성물 및 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 코로나바이러스 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 (a) 검체로부터 추출한 샘플의 표적부위를 증폭하는 단계; (b) CRISPR/Cas 단백질, crRNA 및 reporter DNA를 포함하는 조성물과 상기에서 증폭한 샘플을 혼합하는 단계; 및 (c) reporter DNA의 절단여부를 검출하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 코로나바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 코로나바이러스 진단용 조성물을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.

그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코로나바이러스 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 (a) 검체로부터 추출한 샘플의 표적부위를 증폭하는 단계; (b) CRISPR/Cas 단백질, crRNA 및 reporter DNA를 포함하는 조성물과 상기에서 증폭한 샘플을 혼합하는 단계; 및 (c) reporter DNA의 절단여부를 검출하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코로나바이러스 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코로나바이러스 진단용 조성물을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 진단용 키트를 제공한다.

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술의 하나를 제공한다; Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

코로나바이러스 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 하기 단계를 포함하는 코로나바이러스 검출 방법:

(a) 검체로부터 추출한 샘플의 표적부위를 증폭하는 단계;

(b) CRISPR / Cas 단백질, crRNA 및 reporter DNA를 포함하는 조성물과 상기에서 증폭한 샘플을 혼합하는 단계; 및

(c) reporter DNA의 절단여부를 검출하는 단계

를 제공한다.

본 발명의 코로나바이러스 진단 방법을 각 단계별로 설명하면 다음과 같다.

(a)단계 : 검체로부터 추출한 샘플의 표적부위를 증폭하는 단계;

(a)단계는 코로나바이러스 감염여부를 진단하고자 하는 검체로부터 핵산을 추출하여 코로나바이러스와 관련된 표적부위를 증폭하는 단계이다.

상기에서 “검체”란 시험, 검사, 분석 등에 쓰는 물질이나 생물을 말하는 것으로서, 본 발명에서 기관 흡인액(tracheal aspirate) 또는 객담과 기관지내시경 검체와 같은 하기도 검체와 상기도 검체를 채취하여 검사가 시행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “증폭”은 PCR, RT-PCR, 등온증폭법으로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있으며, 바람직하게는 등온증폭법일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 RT-RPA일 수 있다.

상기에서 “PCR(Polymerase chain reaction)”은 중합효소 연쇄반응으로서, 2개의 프라이머 사이에 낀 DNA부분을 시험관내에서 대량으로 증폭시킬 수 있는 방법이다. DNA합성효소(DNA polymerase)가 DNA 합성하는데 있어 프라이머를 필요로 하는데, 이 프라이머에서 5‘ → 3’방향으로 DNA를 합성하는 것을 이용하여, DNA 외가닥의 변성, 프라이머의 결합, 중합효소에 의한 상보성 DNA의 합성을 반복하는 것으로서 목적하는 유전자 영역만을 시험관내에서 증식시킨다.

상기에서 “RT-PCR(Real time PCR)”은 실시간 중합효소 연쇄반응으로서, 반응이 완료된 후에 최종산물의 양을 알 수 있는 일반 PCR과 달리 RT-PCR은 PCR이 진행하는 동안 DNA분자가 증폭되는 과정을 정량적으로 관찰할 수 있으나, 일반적으로 검사시간에 수 시간이 소요되며 정교한 thermo cycling 기기를 필요로 하기에 즉석 현장실험을 수행하기에는 적합하지 못하다는 단점이 있다.(Journal of Apiculture 31(1) : 41~50 (2016))

상기“RPA(Recombinase polymerase amplification)”는 재조합효소-중합효소 증폭법으로서, 박테리오파지 T4 재조합효소를 이용하여 DNA 이중가닥의 해리를 유도한 후, 단일가닥이 된 DNA에 단일가닥결합단백질이 결합함으로써 DNA 중합효소 및 특정 프라이머의 결합을 용이하게 하는 동시에, 결합된 DNA 중합효소와 프라이머에 의해 특정 DNA를 증폭시키는 방법이다. 이는 PCR의 경우와 같이 표적 기질(target template)과 한 쌍의 프라이머(oligonucleotide)를 사용하여 특정 염기서열의 DNA를 증폭시킬 수 있으나, PCR의 경우와 달리 재조합효소를 이용하기 때문에 95℃ 이상 고온의 변성과정(denaturation; DNA 이중가닥을 단일가닥으로 떨어뜨리는 과정) 없이 효소가 작용할 수 있는 일정 온도(37℃-42℃)의 범위에서 빠른 시간(20분 이내) 이내에 등온조건으로 증폭반응을 일으킬 수 있다는 장점이 있다(Piepenburg et al., 2006).

RPA 증폭산물의 길이는 500 nt(nucleotides)를 넘지 않는 것을 권장하고 있으며 일반적으로 100~250 nt. 사이의 증폭산물의 길이를 가진다. RPA 의 primer 길이는 PCR과는 다르게 최소 30 nucleotides의 길이를 권장하면 일반적으로 32~35 nt. 길이를 주로 사용 한다. 또한 PCR처럼 서열 상 GC의 비율(GC%)과 Tm (melting temperature)값에 민감하지 않음으로 RPA의 primer는 GC%(20~70%), Tm(50~100℃)에 수렴하면 된다.(Analyst, 2019, 144, 31)

상기 “RT-RPA(Reverse Transcription RPA)”는 역전사-재조합효소-중합효소 증폭법으로서, DNA를 주형으로 다루는 RPA와는 달리 RT-RPA는 RNA를 주형으로 다룰 수 있다

(b)단계 : CRISPR / Cas 단백질, crRNA 및 reporter DNA를 포함하는 조성물과 상기에서 증폭한 샘플을 혼합하는 단계

(b)단계는 상기 (a)단계에서 증폭한 산물을 CRISPR/Cas 단백질, crRNA 및 reporter DNA를 포함하는 조성물과 혼합하는 단계이다.

상기 혼합물은 특정 유전자의 DNA를 인식하는 가이드 RNA (crRNA)와 Cas 핵산분해효소(Nuclease)를 이용한 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas 단백질 시스템의 유전자 편집기술에 기반한다. CRISPR/Cas 시스템은 박테리아에서 약 50%, 고세균류(archaea)에서 약 90%정도에서 발견되는 일종의 면역 시스템으로 외부 DNA를 선택적으로 절단하여 감염을 막고 일부를 흡수하는 기능을 한다. 현재 다양한 종에서 각기 다른 특성을 가진 CRISPR/Cas 시스템이 발견되고 있으며 이를 응용한 기술 또한 발전되고 있다. CRISPR/Cas 시스템 중 CRISPR/Cas12는 기존 CRISPR/Cas9 시스템과 달리 표적 DNA 부위에 결합했을 때, 주변에 존재하는 비표적 단일가닥 DNA를 무작위적으로 절단하는 활성(trans cleavage activity, collateral cleavage activity)을 가진다. 이러한 특성을 이용하여 상기 (a)단계와 같은 1차 증폭과정의 피코몰(pM, 10-12 M) 감도가 아토몰(aM, 10-18 M) 수준까지 증대시킬 수 있기 때문에, 이를 이용하여 다양한 분자진단으로의 활용이 가능하다.

본 발명의 “crRNA(CRISPR RNA)”는 일종의 가이드 RNA로서 표적 상보적 서열이 존재하여 특정 염기서열을 찾아내는 것이다. 본 발명에서는 SARS-CoV-2를 특이적으로 인식해 Cas12a 단백질을 활성화시키며 활성화된 CRISPR/Cas 단백질이 탐지 DNA를 절단한다.

(c)단계: reporter DNA의 절단여부를 키트를 이용하여 검출하는 단계

(c)단계는 상기 (b)단계에서 혼합한 물질을 코로나바이러스 진단용 키트를 사용하여 reporter DNA의 절단여부를 검출하고, 그 결과를 판독하여 코로나바이러스 존재유무를 확인하는 단계이다.

상기 키트에는 증폭된 RNA 산물을 넣는 sample pad, sample pad에 가까운 line인 control line, 멀리 있는 line인 test line이 포함되어 있는 ‘스트립’이 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 증폭 산물에 표적 부위가 존재한다면 crRNA가 표적부위와 상보적으로 결합하고 Cas 단백질은 활성화 되어 reporter DNA의 서열을 자른다. 그 결과 reporter DNA의 양 말단에 각각 붙어 있는 FAM과 biotin 부위는 분리되게 되고, 분리여부를 이용하여 측방 유동(lateral flow) 검출 스트립의 밴드 유무에 따라 양성/음성 여부를 확인한다.

Test line에 밴드가 나타날 경우 양성, Test line에 밴드가 나타나지 않고 control line에만 밴드가 나타날 경우 음성으로 판정한다.

본 발명에서“CRISPR/Cas 단백질”은 CRISPR/Cas12a, CRISPR/Cas12b, CRISPR/Cas12c, CRISPR/Cas12d 및 CRISPR/Cas12e로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있고, 바람직하게는 CRISPR/Cas12a일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 Cas12는 기존의 Cas9과 비교하여 훨씬 더 정확도가 높고 안정적인 것으로 확인되었다. 이에 본 발명의 발명자들은 기존의 Cas9 단백질이 아닌 Cas12단백질을 사용하여 코로나바이러스 진단의 정확도를 높였다.

(Gen : CRISPR-Cas12a More Precise Than CRISPR-Cas9(2018.08.03.), Nature Communications, IF 12.353(2018.07.17))

본 발명에서 “형광물질”은 VIC, HEX(hexachlorofluorescein), FAM(fluorescein amidite), EverGreen dye로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서 “등온증폭법(Isothermal amplification)”은 일정한 반응온도 조건하에서 목적으로 삼는 핵산배열(주형)을 증폭시키는 방법을 말하는 것으로서, 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA), 루프 매개 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 헬리카제-종속 증폭(helicasedependent amplification, HDA), 회전환 증폭(rolling circle amplification, RCA), 다중치환증폭(multiple displacement amplification, MDA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA), 핵산 서열-기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) 중 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA)일 수 있다.

본 발명에서 “프라이머” 및 “crRNA”는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 진단을 위해 설계한 것이다. SARS-CoV-2 바이러스는 RNA 바이러스로 전사 과정 중 발생하는 오류 및 바이러스의 RNA Dependant Polymerase(RdRP)가 복제 중에 주형(template) 일부를 건너뛰는 현상(jumping)으로 인해 바이러스의 돌연변이 비율이 높다. 이러한 높은 돌연변이 발생률은 해당 바이러스의 검출을 어렵게 만들기에 해당 바이러스의 검출을 위해서는 바이러스의 잘 보존된 서열을 기반으로 한 프라이머의 설계가 요구된다.

본 발명의 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프라이머 쌍에서 선택된 프라이머 쌍일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 쌍 일 수 있다.

본 발명에서‘진단용 키트’에는 상기 프라이머를 유효성분으로 포함하는 조성물과 검출용 측방 유동(lateral flow) 스트립이 포함될 수 있다.

상기 측방 유동 스트립은 증폭 산물을 넣는 곳인 샘플 패드, 골드 나노입자와 결합시킨 항체가 고정화 되어있는 검출패드, 검출패드와 샘플 패드의 사이에 있으며 다른 한 종의 항체가 고정화 되어있는 접합체 패드, 검출패드의 끝에 붙어 이동한 시료를 흡수하는 흡습패드를 포함할 수 있다.

측방 유동 스트립의 원리 및 사용법과 관련하여, 검사하고자 하는 샘플을 샘플패드에 흡수시켜서 검출패드를 따라 이동하게 하면 샘플에 항원이 있을 경우, 접합체 패드에 있는 골드 나노입자가 결합된 항체와 결합한 후 검출패드를 따라 지나가면서 검사선(test line)에 고정된 항체와 결합하여 검사선에 골드 나노입자의 색이 나타나고, 항원이 결합되지 않은 항체는 대조선(control line)과 결합하여 대조선에 골드 나노입자의 색이 나타난다.

따라서 검사선과 대조선 모두에 선이 생기면 양성, 대조선에만 선이 생기면 음성으로 판정한다.

본 발명에 따르면, CRISPR/Cas를 이용하여 코로나바이러스를 검출할 수 있어, 검출되는 대상인 코로나바이러스의 존재유무를 간단하고도 신속 정확하게 확인할 수 있다. 따라서 코로나바이러스 진단에 드는 시간과 비용을 줄이고 코로나바이러스 감염 확산의 조기 차단에 기여할 수 있다.

도 1은 SARS-CoV-2 검출을 위한 시험 과정을 도식화 한 것이다.
도 2은 SARS-CoV-2 전체 서열 내 진단 검사를 위한 표적 부위를 나타내는 것이다.
도 3는 SARS-CoV-2의 검출을 위한 프라이머 및 표적 후보 부위를 나타내는 것이다.
도 4은 SARS-CoV-2 RdRP 유전자 부위(180 bp)의 클로닝을 나타낸 것이다.
도 5는 핵산 증폭 산물(amplicon) 크기에 따라 증폭 산물을 비교한 것이다.
도 6는 lateral flow의 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 양성 대조물질을 이용한 SARS-CoV-2 검출 시험 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: SARS-CoV-2 검출용 프라이머의 설계

SARS-CoV-2 검출용 프라이머 설계를 위해 먼저, SARS-CoV-2 및 이와 서열 유사성이 높은 SARS-CoV로 확정된 바이러스 중 그 서열이 완전히 분석된 서열 46개 및 SARS-CoV로 알려진 4개의 전체 유전체 서열을 기반으로 하여, SARS-CoV-2 및 SARS-CoV에서 잘 보존되어 있으면서도 SARS-CoV-2 특이적 서열을 포함하고 있는 지역을 조사하였다. 조사에 사용된 SARS-CoV-2 서열 46개 및 SARS-CoV 서열 4개의 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

Virus	GenBank	Collection Date	Locality
SARS-CoV-2	MN908947	Dec-2019	China
	LC522972	Jan-2020	Japan
	LC522973	Jan-2020	Japan
	LC522974	Jan-2020	Japan
	LC522975	Jan-2020	Japan
	LR757995	Jan-2020	China: Wuhan
	LR757996	Jan-2020	China: Wuhan
	LR757998	Dec-2019	China: Wuhan
	MN938384	Jan-2020	China: Shenzhen
	MN975262	Jan-2020	China
	MN985325	Jan-2020	USA: WA
	MN988668	Jan-2020	China
	MN988669	Jan-2020	China
	MN988713	Jan-2020	USA: IL
	MN994467	Jan-2020	USA: CA
	MN994468	Jan-2020	USA: CA
	MN996527	Dec-2019	China: Wuhan
	MN996528	Dec-2019	China: Wuhan
	MN996529	Dec-2019	China: Wuhan
	MN996530	Dec-2019	China: Wuhan
	MN996531	Dec-2019	China: Wuhan
	MN997409	Jan-2020	USA: AZ
	MT007544	Jan-2020	Australia: Victoria
	MT019529	Dec-2019	China: Wuhan
	MT019530	Dec-2019	China: Wuhan
	MT019531	Dec-2019	China: Wuhan
	MT019532	Dec-2019	China: Wuhan
	MT019533	Jan-2020	China: Wuhan
	MT020880	Jan-2020	USA: WA
	MT020881	Jan-2020	USA: WA
	MT027062	Jan-2020	USA: CA
	MT027063	Jan-2020	USA: CA
	MT027064	Jan-2020	USA: CA
	MT039873	Jan-2020	China: Hangzhou
	MT039887	Jan-2020	USA: WI
	MT039888	Jan-2020	USA: MA
	MT039890	Jan-2020	South Korea
	MT044257	Jan-2020	USA: IL
	MT044258	Jan-2020	USA: CA
	MT049951	Jan-2020	China: Yunnan
	MT066175	Jan-2020	Taiwan
	MT066176	Feb-2020	Taiwan
	MT072688	Jan-2020	Nepal
	MT093571	Feb-2020	Sweden
	MT093631	Jan-2020	China
SARS-CoV	AY278489	-	-
	AY390556	-	China: Guangzhou
	AY485277	-	-
	AY508724	-	-

그 결과 도 2에 나타낸 것처럼 ORF1ab 지역의 RdRP 단백질을 암호화 (coding)하고 있는 지역으로, 인간 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV등의 보존된 서열 부위가 있어 컨센서스(consensus) 프라이머를 디자인하기에 용이한 SARS-CoV-2 바이러스의 표준 서열(NC_045512.2) 기준 14941~15120 부위를 표적으로 결정하였다.

상기 과정에 의해 디자인된 프라이머는 검사에 최적화 된 증폭 크기를 찾기 위해 다양한 크기의 증폭산물(amplicon)이 도출 될 수 있도록 하기 표 2와 같이 다양한 프라이머의 조합을 구성하였다.

번호	Amplicon 크기	Primer Sequence
1	86bp	Forward: tcaatgagttatgaggatcaagatgcact Reverse: tacttaagattcatttgagttatagtagg
2	153bp	Forward: taataaatggggtaaggctagactttattatga Reverse: acggtgcgagctctattctttgcactaatggc
3	117bp	Forward: taataaatggggtaaggctagactttattatga Reverse: tacttaagattcatttgagttatagtagg
4	119bp	Forward: tcaatgagttatgaggatcaagatgcact Reverse: acggtgcgagctctattctttgcactaatggc

실시예 2. 양성대조군 (Positive Control) 주형의 제조 및 In vitro 전사

바이러스의 검출 여부를 확인하기 위해서 양성 대조군의 설정을 필요로 하였고, 이를 위해 European Virus Archive - GLOBAL (EVAg)에서 공개한 SARS-CoV-2 RdRP 유전자 부위의 서열 중 앞선 실시예 1의 표적 부위를 포함하는 양성대조군 RNA 서열을 Bionics 사에 합성 의뢰하여 양성 대조군으로 사용할 RNA 서열을 합성하였다. 해당 RNA 서열에 대한 DNA를 합성한 후, 하기 도 3에 나타낸 것처럼 pBluescript SK(+) 벡터에 KpnI과 HindⅢ 제한효소를 통해 클로닝하였으며, 이를 주형으로 In vitro transcription (IVT) 함으로써 양성 대조군을 합성하였다.

실시예 3: 역전사-재조합효소-중합효소 증폭

기존의 RT-PCR 방법과 달리 별다른 장비 없이도 상대적으로 낮고 일정한 온도(37-42 ℃)에서 빠른 반응 시간(20분 이내) 내에 높은 검출 민감도의 구현이 가능한 RT-RPA를 이용하여 시료 내의 표적부위를 증폭하였다.

RT-RPA (Reverse Transcription-Recombinase Polymerase Amplification)는 TwistAmp® Basic (TABAS03KIT, TwistDx, UK) RPA 키트와 ProtoScript®Ⅱ Reverse Transcriptase (M0368L, New England BioLabs, USA) 역전사 시약을 섞어 한번에 반응이 이루어지게 하였다. 반응액 조성은 하기 표 3에 기재하였다.

RT-RPA 반응액 조성
시약	양
Primer Free Rehydration buffer	29.5 ㎕
Forward Primer (10 μM)	2.4 ㎕
Reverse Primer (10 μM)	2.4 ㎕
RNase Inhibitor (40 U/㎕)	0.5 ㎕
Reverse Transcription Buffer	5 ㎕
Reverse Transcriptase (200 U/㎕)	0.1 ㎕
Template and water	7.6 ㎕
MgOAc (280 mM)	2.5 ㎕
Total	50㎕

RT-RPA 반응은 one step으로 42℃에서 25분 반응을 하였고, 증폭 산물은 아가로스 젤 상에서 전기영동하여 하기 도 5에 나타낸 것과 같이 표적 유전자의 검출 유무를 사이즈(예상 크기: 153 bp)를 통해 확인하였다.

검출의 최적화된 증폭 산물(amplicon)의 크기를 확인하기 위하여 다양한 증폭 사이즈를 갖도록 시험을 하였고, 그 결과 RPA 증폭에 최적화 된 증폭 산물의 크기는 150bp 근처인 것을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 153bp를 가지는 증폭 산물이 되도록 프라이머 쌍을 진단 검사 개발에 사용하였다.

실시예 4: 크리스퍼 유전자 가위 반응을 이용한 SARS-CoV-2의 검출

SARS-CoV-2 검출시험을 위해 먼저, SARS-CoV-2를 특이적으로 인식해 Cas12a 단백질을 활성화시키기 위한 가이드 RNA인 crRNA를 제작하였다.

SARS-CoV-2만이 가지는 특이적 서열을 이용해 Cas12a 단백질 중 asCas12a, LbCas12a 두 가지 Cas12 단백질을 사용할 경우의 crRNA를 디자인하였고, 그 서열을 하기 표 4에 나타내었다.

Cas12a	Complete crRNA sequence
asCas12a	UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCAUAUACAAAACGUAAUGUCAU
LbCas12a	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAUAUACAAAACGUAAUGUCAU

앞선 실시예 3을 통해 증폭된 핵산 산물과 Cas12a와의 반응을 위한 시약 조성은 하기 표 5에 나타내었다.

CRISPR/Cas12a 반응을 위한 시약 조성
시약	양
NEBuffer 2.1	2 ㎕
RNase Inhibitor (40 U/㎕)	1 ㎕
LbCas12a (1 μM)	1 ㎕
crRNA (1 μM)	1 ㎕
ssDNA (10 μM)	4 ㎕
RT-RPA Product	1 ㎕
Nuclease-free Water	10 ㎕
Total	20 ㎕

상기 반응에서 Cas12a의 활성화 여부는 crRNA와의 상보성 유무를 통해 결정된다. 증폭산물 내에 존재하는 표적 부위와 crRNA가 상보적으로 결합하면 Cas12a 단백질은 활성화 되어 reporter DNA의 서열을 자르고, 그 결과 reporter DNA의 양 말단에 각각 붙어 있는 FAM과 biotin 부위는 분리되게 된다.

이러한 FAM과 biotin의 분리여부를 이용하여 측방 유동 (later flow) 검출 스트립의 밴드의 유무에 따라 양성/음성 여부를 확인하였다. reporter DNA의 서열은 하기 표 6에 나타내었다.

Name	Sequence	Fluorophore (Absorption/Emission)
ssDNA-FQ reporter	/56-FAM/TTATT/3IABkFQ/	495/517 nm

상기에서 준비한 crRNA, 시약, CRISPR/Cas12a 반응은 37 ℃에서 20분 수행되었고, 반응 종료 후 Milenia HybriDetect 1 (MILENIA01, TwistDx, UK) Lateral flow strip에 직접 반응 결과물을 삽입하였다. 상온에서 2분 후 스트립 상에 밴드 형성 여부를 통해 결과를 확인하였다.

스트립에서 증폭 산물을 넣는 곳을 sample pad, sample pad에 가까운 line은 control line, 멀리 있는 line은 test line이라 하며,

Test line에 밴드가 나타날 경우‘SARS-CoV-2’양성이라고 판정하였고, Test line에 밴드가 나타나지 않고 control line에만 밴드가 나타날 경우 음성으로 판정하였다. 이를 하기 도 6에 나타내었다.

Test line과 control line 모두에서 band가 나타나지 않았을 경우를 ‘Invalid’로 판정하였고, 이는 정확한 결과 판정을 위해 재시험이 요구되는 것으로 하였다.

상기 시험에서 양성 검체의 경우 test line과 control line 모두에서 밴드가 나타나는게 원칙이나 활성화 된 Cas12a 단백질에 의해 reporter가 완전히 잘리는 경우 test line에만 밴드가 나타날 수도 있다. 상기 시험의 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

Test line	Control line	Interpretation
+	+	SARS-CoV-2 positive
+	-	SARS-CoV-2 positive
-	+	Negative
-	-	Invalid

실시예 5: RNA 양성 대조물질을 이용한 SARS-CoV-2 검출 시험

검체로부터 추출과정을 거쳐 순수하게 분리된 RNA를 등온 증폭하였고, 검사에 필요한 충분한 양의 증폭된 SARS-CoV-2의 표적 부위를 포함하는 핵산 시료를 확보하였다. 본 시험에서는 실제 환자의 시료 대신에 양성 대조물질을 활용하여 검출법의 성능을 확인하였다.

RT-RPA 및 CRISPR를 이용한 검출 실험을 위해 상기 실시예 2에서 준비된 RNA 양성대조물질은 써모피셔 사이언티픽사의 나노드랍(Nanodrop)으로 정량한 후 RNA 유전자 카피 수를 계산하였다. 또한 상기 실시예 2에서 합성된 RNA 양성 대조물질을 10³copies/㎕가 되도록 준비하여 후속 RT-RPA 실험의 주형으로 사용하였다.

RT-RPA 증폭실험은 TwistAmp® Basic (TABAS03KIT, TwistDx, UK) RPA 키트와 ProtoScript®Ⅱ Reverse Transcriptase (M0368L, New England BioLabs, USA) 역전사 시약을 사용하였으며 상기 표 3의 RT-RPA 조성을 이용하여 시험을 수행하였다. 또한 반응 당 10³copies/㎕의 농도가 되도록 준비된 RNA 양성대조물질(주형)을 상기 반응 조성액에 첨가하였다.

이후 증폭 산물은 Cas12 및 SARS-CoV-2를 표적으로 하는 crRNA와 반응하여 Cas12a를 활성화 시키며 활성화 된 Cas12a 단백질은 biotin과 FAM이 양쪽 끝 말단에 부착된 reporter DNA의 핵산 서열을 잘라 biotin 부위와 FAM 부위를 분리시켰고, 이러한 절단이 있을 경우 핵산 검출용 측방 유동 (lateral flow) 스트립의 test line 및 control line에 밴드가 형성되었다.

이와는 다르게 증폭 산물에 표적 부위가 없거나 증폭이 되지 않았을 경우 Cas12a 단백질은 비활성화가 되어 reporter DNA의 핵산 서열을 자르지 못하였고 이 경우 측방 유동 스트립에 시료 주입 시 control line에서만 band가 형성되었다.

이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.

이상의 결과를 통해, 본 발명이 스트립에 밴드가 나타나는 부위나 밴드의 개수에 따라 코로나바이러스의 존재여부를 확인할 수 있는 것으로 판단해 볼 수 있었다.

본 발명이 제공하는 코로나바이러스 진단방법은 검출되는 대상인 코로나바이러스의 존재유무를 간단하고도 신속 정확하게 확인할 수 있다. 따라서 코로나바이러스 진단에 드는 시간과 비용을 줄이고 코로나바이러스 감염 확산의 조기 차단에 기여할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

<110> Gencurix Inc. <120> Method and kit for detecting coronavirus <130> NP20-0012 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov-2 Primer 1(forward) <400> 1 tcaatgagtt atgaggatca agatgcact 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov-2 Primer 1(reverse) <400> 2 tacttaagat tcatttgagt tatagtagg 29 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov-2 Primer 2(forward) <400> 3 taataaatgg ggtaaggcta gactttatta tga 33 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov-2 Primer 2(reverse) <400> 4 acggtgcgag ctctattctt tgcactaatg gc 32 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov-2 Primer 3(forward) <400> 5 taataaatgg ggtaaggcta gactttatta tga 33 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov-2 Primer 3(reverse) <400> 6 tacttaagat tcatttgagt tatagtagg 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov-2 Primer 4(forward) <400> 7 tcaatgagtt atgaggatca agatgcact 29 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sars-Cov-2 Primer 4(reverse) <400> 8 acggtgcgag ctctattctt tgcactaatg gc 32 <210> 9 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asCas12a crRNA <400> 9 uaauuucuac ucuuguagau gcauauacaa aacguaaugu cau 43 <210> 10 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LbCas12a crRNA <400> 10 uaauuucuac uaaguguaga ugcauauaca aaacguaaug ucau 44

Claims

i) 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프라이머 쌍에서 선택된 프라이머 쌍 및 ii) 서열번호 9 또는 서열번호 10의 가이드 RNA를 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 진단용 조성물이며,
상기 코로나바이러스의 진단은 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2의 동시 진단이며, 등온 증폭 반응 및 이와 연속되는 크리스퍼 유전자 가위 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 진단용 조성물.
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제1항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 진단용 키트.
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