CN110791578A

CN110791578A - 用于百日咳博德特氏杆菌的crispr检测引物组及其用途

Info

Publication number: CN110791578A
Application number: CN201911190860.5A
Authority: CN
Inventors: 许腾; 曾伟奇; 杨敏玲; 徐学中; 刘足; 李永军; 王小锐; 苏杭
Original assignee: Guangzhou Weiyuan Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Vision Gene Technology Co ltd; Guangzhou Weiyuan Medical Equipment Co ltd; Guangzhou Weiyuan Medical Laboratory Co ltd; Shenzhen Weiyuan Medical Technology Co ltd
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2039-11-28
Also published as: CN110791578B

Abstract

本发明涉及一种用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组及其用途，属于CRISPR技术的基因检测技术领域。该引物组包括扩增引物对和crRNA；所述扩增引物对用于扩增百日咳博德特氏杆菌如SEQ ID NO.1所示序列；所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述向导序列与所述SEQ ID NO.1序列中的靶向序列片段相匹配。采用该引物组以CRISPR技术检测百日咳博德特氏杆菌，缩短了百日咳的检测时间，可在60min内完成检测。本发明通过筛选得到了特定的序列组合作为引物组进行检测，具有灵敏性高、特异性强的优势，其检测限可达3copies。并且采用该引物组对百日咳博德特氏杆菌进行CRISPR检测，摆脱了对qPCR仪等复杂变温扩增仪器的依赖，具有广阔的应用前景。

Description

用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组及其用途

技术领域

本发明涉及基于CRISPR技术的基因检测技术领域，特别是涉及一种用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组及其用途。

背景技术

百日咳(pertussis/whooping cough)是由百日咳博德特氏杆菌(Bordetellapertussis)引起的急性呼吸道感染，表现为剧烈持续性的咳嗽。百日咳虽然被认为是一种儿童疾病，但在所有年龄段均可发病。在发展中国家，百日咳仍然是婴儿发病和死亡的重要病因；在发达国家推广百日咳免疫计划之前，百日咳是最常见的发病和死亡的感染病之一。由于百日咳疫苗的推广与覆盖，世界范围内的百日咳发病率有所下降，但近年来百日咳发病率呈现显著上升趋势，儿童的百日咳发病率逐年升高，被称之为百日咳重现(reemergence of pertussis)。百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)只感染人类，是引起人类疾病的最重要的博德特菌。同属的副百日咳博德特氏杆菌在人类中引起的疾病与百日咳类似，但程度较轻，且副百日咳博德特氏杆菌不表达百日咳博德特氏杆菌毒素的编码基因，一般被认为是类百日咳综合征。

目前百日咳的诊断仍面临诸多问题。有典型的百日咳临床症状，诊断并不难，但对于年长儿童和成人，临床上很难将百日咳博德特氏杆菌和副百日咳博德特氏杆菌引起的感染和其它呼吸道感染鉴别开来。常规检测难以为百日咳诊断提供特异的线索，鼻咽分泌物的培养仍是诊断百日咳的金标准，但细菌培养需要特殊培养基，培养周期长，敏感性低。鼻咽分泌物的直接荧光抗体试验(Direct Fluorescent-Antibody assay，DFA)是一种简单快速的检测方法，但敏感度受检测者等多种因素影响，文献报道敏感度为18％～78％。往往需要培养、PCR或者血清学检查支持诊断。百日咳毒素(Pertussis Toxin，PT)抗体检测法具有较高灵敏性，但会受到百日咳病程和疫苗接种的影响，由于百日咳细菌感染后通常需要足够的时间才能产生免疫反应，血清学方法往往对于病程晚期的百日咳临床诊断才更有意义。PCR检测具有更高的灵敏度和检测速度更快，但标本采集、运输等环节以及患者使用抗生素治疗等因素可导致鼻咽拭子标本中百日咳博德特氏杆菌含量的减少，会影响到PCR核酸检测的敏感性。近年来开发的LAMP(Loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增技术)更为简单、经济，时间上比qPCR快2.5倍，当敏感度相同时，LAMP的特异度优于PCR。

重组酶-聚合酶扩增(RPA)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和具有链置换功能的DNA聚合酶，在室温(最佳反应温度为37℃)下即可获得可检测级别的扩增核酸。但是，原理上其单级扩增反应的本质并未改变，相较于目前市场上多数的实时定量PCR(qPCR)检测方式，并不能有实质性的灵敏度提升。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组及其用途，采用该引物组以CRISPR技术检测百日咳博德特氏杆菌，缩短了百日咳的检测时间，可在60min内完成检测。

一种用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组，包括扩增引物对和crRNA；所述扩增引物对用于扩增百日咳博德特氏杆菌如SEQ ID NO.1所示序列；所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述向导序列与所述SEQ ID NO.1序列中的靶向序列片段相匹配。

上述引物组可应用于CRISPR-Cas系统中，其检测原理为：Cas蛋白在crRNA的引导下，靶向目标序列后启动其自身的“附带切割”活性，如果同时在体系中加入荧光报告分子(常用的报告分子是一段寡核苷酸序列，一端带有一个发光基团，一端带有一个淬灭基团，正常情况下由于淬灭作用，完整的报告分子不会被检测到，当寡核苷酸分子被水解后，游离的荧光信号可以被检测到)，借用Cas酶附带切割活性，可以实现待检序列信息向荧光信号的转化。并且通过RPA与CRISPR-Cas的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联”(Cas酶完成)的两级放大，从而超越qPCR这种单级扩增的灵敏度。

本发明人针对百日咳博德特氏杆菌的保守序列进行设计，从而将CRISPR技术应用于检测百日咳博德特氏杆菌中，与传统检测方法相比，缩短了百日咳的检测时间，可在60min内完成检测。

在其中一个实施例中，所述扩增引物对选自：SEQ ID NO.2-3所示序列的引物对1，SEQ ID NO.4-5所示序列的引物对2，SEQ ID NO.6-7所示序列的引物对3，SEQ ID NO.8-9所示序列的引物对4，SEQ ID NO.10-11所示序列的引物对5；所述锚定序列针对Cas13a蛋白设计，所述向导序列选自：SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.14所示序列。

在其中一个实施例中，所述扩增引物对为引物对1，所述crRNA选自：SEQ ID NO.15所示序列。发明人在前期研究基础上发现，待检测的SEQ ID NO.1所示序列中平均GC含量高达70％，这使得按照常规的RPA引物及crRNA设计条件来设计引物时存在更大的难度，经过多番筛选和比对，发明人筛选出以上述crRNA和扩增引物对配合，具有较好的检测效果。

本发明还公开了上述的用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组在开发和/或制备具有百日咳博德特氏杆菌感染诊断和/或预后评估用途的产品中的应用。

可以理解的，上述产品可以是试剂盒，也可以是一体化检测设备等。

本发明还公开了一种用于检测百日咳博德特氏杆菌的试剂盒，包括上述的用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组。

在其中一个实施例中，该试剂盒还包括Cas蛋白，信号报告探针和RNA聚合酶。所述Cas蛋白可来源于Cas12a，如LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a等，也可来源于Cas13a，如LshCas13a、LbuCas13a和LwCas13a等，但需根据不同来源蛋白调整其锚定序列和其它试剂成分。

信号报告探针又称信号报告试剂，其特点为在序列的5’标记荧光报告基团，3’标记淬灭基团。信号报告试剂的阳性信号有多种选择，包括荧光、吸光值、显色反应等，但信号报告的条件都是基于Cas蛋白的酶活性。具体信号报告探针的选择可根据其它试剂进行调整选择。

本发明还公开了一种非诊断治疗目的百日咳博德特氏杆菌检测方法，包括以下步骤：

样本提取：取待测样本，提取其中DNA；

RPA扩增：以上述的扩增引物，通过RPA方法扩增上述提取得到的待测样本DNA，得扩增产物；

CRISPR反应检测：取上述扩增产物，加入信号报告探针、Cas13a蛋白、RNA聚合酶和上述的crRNA，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，即得。

上述检测步骤均在恒温条件完成，无需复杂的温度改变，从而摆脱了对Q-PCR仪等精密仪器的依赖，具有较为广阔的应用前景。

本发明公开了一种非诊断治疗目的百日咳博德特氏杆菌检测方法，包括以下步骤：

样本提取：取待测样本，提取其中DNA；

一步检测：在上述提取得到的样本DNA中加入上述的扩增引物对、RNA聚合酶、crRNA、Cas13a蛋白、RNA聚合酶和信号报告试剂，同时进行RPA扩增、体外逆转录和CRISPR反应检测，读取检测信号，即得。

上述反应步骤不仅是在恒温条件完成，无需复杂的温度改变，并且还将RPA扩增、体外逆转录和CRISPR反应检测步骤融合到一步反应，极大的简化了实验操作，具有极佳的应用前景。

在其中一个实施例中，所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。

在其中一个实施例中，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组，采用该引物组以CRISPR技术检测百日咳博德特氏杆菌，缩短了百日咳的检测时间，可在60min内完成检测。并且，本发明通过筛选得到了特定的序列组合作为引物组进行检测，具有灵敏性高、特异性强的优势，其检测限可达3copies，且在特异性实验中仅有百日咳博德特氏杆菌DNA能够被检出，能够区分同属的副百日咳博德特氏杆菌，符合临床检测要求。

并且采用该引物组对百日咳博德特氏杆菌进行CRISPR检测，无需复杂的温度改变，从而摆脱了对qPCR仪等复杂变温扩增仪器的依赖，使得CRISPR-Cas技术在百日咳的即时诊断方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例中引物的筛选结果图；

图2为实施例中crRNA的筛选结果图；

图3为实施例中引物对1和crRNA-1组合两步法结果图；

图4为实施例中引物对1和crRNA-2组合两步法结果图；

图5为实施例中引物对1和crRNA-1组合一步法结果图；

图6为实施例中引物对1和crRNA-2组合一步法结果图；

图7为实施例中特异性实验结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例所用原料，除特别说明外，均为市售购得，其中：Cas13a为LwCas13a。

实施例1

百日咳博德特氏杆菌CRISPR检测引物序列的设计。

1、靶标序列选定。

随着分子生物学的发展，已有学者应用PCR等方法对百日咳博德特氏杆菌进行基因检测研究，此类研究大多针对百日咳基因插入序列IS481、IS1002，百日咳毒素(PT)和目的基因BD485等片段。其中，插入序列IS481在基因组内有238个拷贝，占全基因组大小的6.2％，这一特征可大大的提高检测的灵敏度。然而经研究发现，在会引起类百日咳综合征的霍氏博德特氏杆菌的基因组中也存在IS481插入序列，但通常与百日咳博德特氏菌感染并存。本发明人经过大量的文献调研和实践统计发现，单独霍氏博德特氏杆菌病例并无报道，且临床上感染该菌引物的症状相似，用药指导也无特殊处理，因此在充分考虑检测灵敏度和对临床用药指导的综合需求后，认为选用IS481插入序列对霍氏博德特氏杆菌的非特异性检出对临床不会产生影响，最后选定百日咳博德特氏杆菌IS481序列作为百日咳博德特氏杆菌的检测目标序列。SEQ ID NO.1序列如下：

5’-TCACCGACATCCACCCCGACGAGCGCTTCCCCAGCGCCGTCCAGTTCCTCAAGGACGCAGTGGCCTACTACCAGCGCCTGGGCGTGACCATCCAGCGCTTGCTCACCGACAATGGCTCGGCCTTTCGCAGCCGCGCCTTCGCCGCGCTGTGCCATGAGCTGGGCATCAAGCACCGCTTTACCCGACCTTACCGCCCACAGACCAATGGCAAGGCCGAACGCTTCATCCAGTCGGCCTTGCGTGAGTGGGCTTACGCTCACACCTACCAGAACTCCCAACACCGAGCCGATGCCATGAAATCCTGGCTACACCACTACAACTGGCATCGACCCCACCAAGGCATCGGGCGCGCTGTACCCATCTCCAGACTCAACCTGGACGAATACAACCTATTGACAGTTCA-3’(SEQ ID NO.1)。

以下实施例中的标准待检样本为插入了上述百日咳博德特氏杆菌IS481序列的质粒。质粒以pUC19作为载体，插入了上述百日咳博德特氏杆菌IS481序列后转载并保存在大肠杆菌工程菌中。质粒的的制备委托第三方合成公司(广州艾基生物技术有限公司)合成。

2、扩增引物对和crRNA的设计。

针对上述保守序列，设计多条crRNA和相应的扩增引物对进行对比，下表列出部分示例性引物序列。

表1.基于Cas13a的crRNA和扩增引物对

实施例2

1、RPA扩增引物的扩增效率筛选。

为了筛选Cas13a的RPA扩增引物，以上述实施例1中携带插入了百日咳博德特氏杆菌IS481序列质粒作为标准待检样本，其中质粒浓度为1000copies/μl，，筛选引物包括上述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5。

1.1方法。

1)RPA扩增

RPA反应体系为50μL：其中包括RPA上游引物0.5-2.5μL(浓度10μM)，RPA下游引物0.5-2.5μL(浓度10μM)，RPA酶预混液41.5μL，醋酸镁0.5-2μL(浓度280mM)，待测样本基因组DNA 2-5μL。

上述RPA酶预混液中含有：磷酸肌酸(浓度20-80mM)、肌酸激酶(浓度50-150mM)、dNTPs(浓度100-300μM)、ATP(浓度20-80mM)、DTT(浓度1-10mM)、醋酸钾(浓度50-200mM)、重组酶uxsX(50-300ng/μL)、uxsY(10-100ng/μL)、单链结合蛋白(200-1000ng/μL)、Bsu聚合酶(10-100ng/μL)。

反应条件：恒温37℃反应10-30min。

2)T7转录和CRISPR反应体系

反应体系：上述RPA扩增产物(25μL)，LwCas13a蛋白1μL(浓度1-5μM)，crRNA-1为1μL(浓度1-5μM)，T7 RNA Polymerase mix 0.2-2μL，NTP mix 1-10μL，信号报告探针1μL(浓度1-10μM)。

反应条件：37℃反应10-30min，每1min读取FAM荧光值。

本实施例中阳性信号为荧光信号(选用来自生工生物工程(上海)股份有限公司的RNase Alert)，RNA探针的序列特点为：FAM-UUUUUUUUUUUUUU-BHQ1。即在反应体系中加入一条两端分别连接荧光物质和淬灭剂的RNA，当Cas13a蛋白在crRNA的帮助下，识别具有靶向序列的靶向RNA后，被激活的Cas13a酶可以降解该带有信号的RNA探针，从而释放荧光信号，实现检测。

1.2结果

使用ABI7500荧光检测仪，对上表1中引物对1-5所示的引物对组合进行了检测筛选，最终选出一组扩增效率好的引物对1，筛选结果如图1所示，图中纵坐标为荧光信号强度。

结果表示，采用引物对1具有最佳的扩增效率。

2、crRNA检测效率筛选

2.1方法

本实验中从靶标序列内设计多条crRNA进行优化、筛选。根据百日咳博德特氏杆菌IS481保守序列设计了包括表1所列多条特异性crRNA。并以最佳引物对1配合RPA筛选最佳crRNA。以两步法分别进行RPA扩增和CRISPR反应检测，具体如下：

1)RPA扩增体系：

反应条件：恒温37℃反应10-30min。

2)T7转录和CRISPR反应体系：

反应体系：上述RPA扩增产物(25μL)，LwCas13a蛋白1μL(浓度1-5μM)，crRNA 1μL(浓度1-5μM)，T7 RNA Polymerase mix 0.2-2μL，NTP mix 1-10μL，信号报告探针1μL(浓度1-10μM)。

反应条件：37℃反应10-30min，每1min读取FAM荧光值。

2.2结果

使用ABI7500荧光检测仪，对上表1中crRNA进行检测筛选，结果如图2所示，图中纵坐标为荧光信号强度，显示crRNA-1和crRNA-2的信号均较理想。

本实施例中，以百日咳博德特氏杆菌质粒DNA为模板对不同引物及crRNA进行了检测筛选，最终选出一组扩增效率高，特异性强的引物与2条crRNA组合，用于百日咳的检测，序列分别为：SEQ ID NO:15所示的crRNA-1和SEQ ID NO:16所示的crRNA-2、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的RPA扩增引物对1。

实施例3

本实施例基于RPA扩增、T7体外转录和Cas13a进行灵敏度检测。

以带有百日咳博德特氏杆菌IS481保守序列的质粒为模板，并计算稀释为3000copies/μL、300copies/μL、30copies/μL、3copies/μL、0copy/μL共5个梯度作为灵敏度检测的模板。

1、方法。

1)两步法。

参照上述实施例2中的方法，进行RPA扩增后，再进行T7转录和CRISPR反应。

2)一步法。

反应体系：上游引物(0.1-0.6μM)，RPA下游引物((0.1-0.6μM))，RPA酶预混液41.5μL，醋酸镁(10-20mM)，探针(50-400nM)，NTP混合液(0.2-6mM)，T7 RNA聚合酶预混液(1μl，来自NEB公司)，Cas13a蛋白(浓度根据不同细菌来源的Cas13a蛋白进行调整)，向导RNA(crRNA，浓度为Cas13a蛋白摩尔浓度的一半)，RNA酶抑制剂(0.5μl，来自NEB公司)，信号报告试剂(RNA探针，50-400nM)，待测样本基因组DNA 2-5μL,用灭菌的去离子水补齐至60μl。。

其中一步法和两步法均用引物对1分别配对crRNA-1和crRNA-2组合对体系灵敏度进行检测，实验设阴性对照。

反应条件：37℃反应30-60min，每1min读取FAM荧光值。

2、结果。

使用ABI7500荧光检测仪，对扩增产物进行荧光检测。结果显示，采用两步法检测，crRNA-1和crRNA-2的检测限均为3copies，如图3-4。

而采用一步法检测时，crRNA-1检测限为3copies，如图5，crRNA-2的检测限为300copies，如图，6。综合结果，确定选用引物对1和crRNA-1序列组合作为本方法最佳的引物序列组合。

实施例4

本实施例基于RPA扩增、T7体外转录联合Cas13a，检测百日咳博德特氏杆菌的特异性验证。

以百日咳博德特氏杆菌DNA、副百日咳博德特氏杆菌DNA、霍氏博德特氏杆菌DNA、肺炎支原体DNA、肺炎链球菌DNA、化脓性链球菌DNA、耶氏肺孢子虫DNA、大肠杆菌DNA、结核分枝杆菌DNA、金黄色葡萄球菌DNA、B-族链球菌DNA、酵母DNA、黄曲霉DNA作为检测模板各样本稀释至10⁴copies/μL，以无核酸酶水代替模板DNA作为阴性质控，测试该检测的特异性。

1、方法。

模板DNA的准备：

百日咳博德特氏杆菌DNA、副百日咳博德特氏杆菌DNA、霍氏博德特氏杆菌DNA、肺炎支原体DNA、肺炎链球菌DNA、化脓性链球菌DNA、耶氏肺孢子虫DNA、大肠杆菌DNA、结核分枝杆菌DNA、金黄色葡萄球菌DNA、B-族链球菌DNA、酵母DNA、黄曲霉DNA均是通过各自核酸提取试剂盒提取，并通过NanoDrop One/OneC微量核酸浓度测定仪来测定，并分别计算并稀释为10⁴copies/μL。

检测体系：

参照上述实施例2中的方法(两步法)，进行RPA扩增后，再进行T7转录和CRISPR反应。

2、结果

使用ABI 7500荧光检测仪，对扩增产物进行荧光检测。实验结果如图7显示，只有百日咳博德特氏杆菌和霍氏博德特氏杆菌DNA能够被特异性检出，其它样本没有明显信号。

表明本实施例基于RPA扩增、T7体外转录联合Cas13a检测百日咳博德特氏杆菌方法具有较好的特异性。

实施例5

一、一种用于检测百日咳博德特氏杆菌的试剂盒，包括：

(1)RPA扩增体系：

RPA扩增引物对1：

正向：5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCCAGTCGGCCTTGCGTGAGTGGGCTTACGCT-3’(SEQID NO:2)，浓度为10μM；

反向：5’-TGTATTCGTCCAGGTTGAGTCTGGAGATGGGTACA-3’(SEQ ID NO:3)，浓度为10μM；

RPA酶预混液：磷酸肌酸(浓度20-80mM)、肌酸激酶(浓度50-150mM)、dNTPs(浓度100-300μM)、ATP(浓度20-80mM)、DTT(浓度1-10mM)、醋酸钾(浓度50-200mM)、重组酶uxsX(50-300ng/μL)、uxsY(10-100ng/μL)、单链结合蛋白(200-1000ng/μL)、Bsu聚合酶(10-100ng/μL)；

醋酸镁：浓度280mM。

(2)CRISPR反应体系：

crRNA-1：5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGUGGUGUAGCCAGGAUUUCAUGGCAU-3’(SEQ ID NO:15)，浓度为1-5μM；

LwCas13a蛋白：浓度为1-5μM；

T7 RNA Polymerase mix：市售；

NTP mix 1-10μL：浓度为每种NTP 20mM；

信号报告探针：5’6-FAM-UUUUUUUUUUUUUU-BHQ1-3’，浓度为1-10μM。

二、采用上述试剂盒进行百日咳博德特氏杆菌的检测方法(两步法)

(1)检测样本的DNA提取

检测样本可以是百日咳博德特氏杆菌菌株，也可以是临床样本(主要包括组织样本、痰液、脑脊液、胸腹水、尿液、脓液、血液样本等)或是其它科研实验样本。

(2)通过RPA技术对病原体核酸进行扩增

以上述RPA扩增进行扩展，扩增程序为：恒温37℃反应15-30min。

(3)T7转录和CRISPR反应

以上述CRISPR反应体系进行反应，反应条件为：37℃反应10-30min，每1min读取FAM荧光值。

(4)结果分析：

上述检测过程中，由于在反应体系中加入两端分别连接荧光物质和淬灭剂的信号报告探针，当Cas13a蛋白在crRNA的帮助下，识别具有靶向序列的靶向RNA后，被激活的Cas13a酶可以降解该带有信号的RNA，从而释放荧光信号，实现检测。

使用ABI7500荧光检测仪，得到的累积荧光值作为信号强度，按照以下标准进行分析判定：

阴性判断标准：荧光量小于或等于阴性对照荧光量的2倍。

阳性判断标准：荧光量大于阴性对照荧光量的2倍。

其中，阴性对照组为每个实验组对应设置的以加入同时以DEPC处理水(生工生物工程(上海)股份有限公司)的阴性信号组。

三、采用上述试剂盒进行百日咳博德特氏杆菌的检测方法(一步法)

(1)检测样本的DNA提取

同上述两步法。

(2)将上述RPA扩增体系，以及T7转录和CRISPR反应体系一同加入进行一步反应，反应条件为：37℃反应30-60min，每1min读取FAM荧光值。

(3)结果分析：

同上述两步法。

实施例6

以上述实施例5的试剂盒进行临床样品的检测。

以上述实施例5中的试剂盒及一步法检测55例临床疑似百日咳博德特氏杆菌感染的临床样本，样本提取核酸后分别进行本检测方法检测及一代测序检测。

其中一代测序方法为双脱氧链终止法(Sanger)，测序目标序列仍然选择插入序列IS481。

选用的引物对为：

BP Sequencing F：CTGCTGCACATCGACATCAAGAAG(SEQ ID NO.18)

BP Sequencing R：GGTTGTATTCGTCCAGGTTGAGTC(SEQ ID NO.19)

按照常规方法进行测序。

结果如下表所示。

表2不同方法对临床样品检测结果

注：a表示qPCR验证结果为阳性，与本案方法检测结果一致；b表示qPCR验证结果为阴性，与本案方法检测结果一致。

上述结果显示，有2例样本本案方法检测结果为阴性，而一代测序结果为阳性，经qPCR复核，此2例样本检测结果为阳性，与本案方法检测结果一致。另外有4例样本本案检测结果为阳性，一代测序结果为阴性，经qPCR复核，此4例样本检测结果为阴性，与本案方法检测结果一致。

上述结果说明本发明检测方法与一代测序具有较高的检测效果一致性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州微远基因科技有限公司

<120> 用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组及其用途

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 403

<212> DNA

<213> 百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)

<400> 1

tcaccgacat ccaccccgac gagcgcttcc ccagcgccgt ccagttcctc aaggacgcag 60

tggcctacta ccagcgcctg ggcgtgacca tccagcgctt gctcaccgac aatggctcgg 120

cctttcgcag ccgcgccttc gccgcgctgt gccatgagct gggcatcaag caccgcttta 180

cccgacctta ccgcccacag accaatggca aggccgaacg cttcatccag tcggccttgc 240

gtgagtgggc ttacgctcac acctaccaga actcccaaca ccgagccgat gccatgaaat 300

cctggctaca ccactacaac tggcatcgac cccaccaagg catcgggcgc gctgtaccca 360

tctccagact caacctggac gaatacaacc tattgacagt tca 403

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggg atccagtcgg ccttgcgtga gtgggcttac gct 53

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtattcgtc caggttgagt ctggagatgg gtaca 35

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taatacgact cactataggg ttacgctcac acctaccaga actcccaaca ccga 54

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actgtcaata ggttgtattc gtccaggttg agtct 35

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg tcatccagtc ggccttgcgt gagtgggctt ac 52

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtattcgtcc aggttgagtc tggagatggg taca 34

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taatacgact cactataggg cgaacgcttc atccagtcgg ccttgcgtga gt 52

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taggttgtat tcgtccaggt tgagtctgga gat 33

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taatacgact cactataggg tcatccagtc ggccttgcgt gagtgggctt a 51

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gttgtattcg tccaggttga gtctggagat 30

<210> 12

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

uaguggugua gccaggauuu cauggcau 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gccttggtgg ggtcgatgcc agttgtag 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tacagcgcgc ccgatgcctt ggtggggt 28

<210> 15

<211> 67

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agugguguag ccaggauuuc 60

auggcau 69

<210> 16

<211> 67

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg ccttggtggg gtcgatgcca 60

gttgtag 69

<210> 17

<211> 67

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaact acagcgcgcc cgatgccttg 60

gtggggt 69

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctgctgcaca tcgacatcaa gaag 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggttgtattc gtccaggttg agtc 24

Claims

1.一种用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组，其特征在于，包括扩增引物对和crRNA；所述扩增引物对用于扩增百日咳博德特氏杆菌如SEQ ID NO.1所示序列；所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述向导序列与所述SEQ ID NO.1序列中的靶向序列片段相匹配。

2.根据权利要求1所述的用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组，其特征在于，所述扩增引物对选自：SEQ ID NO.2-3所示序列的引物对1，SEQ ID NO.4-5所示序列的引物对2，SEQ ID NO.6-7所示序列的引物对3，SEQ ID NO.8-9所示序列的引物对4，SEQ IDNO.10-11所示序列的引物对5；所述锚定序列针对Cas13a蛋白设计，所述向导序列选自：SEQID NO.12-SEQ ID NO.14所示序列。

3.根据权利要求2所述的用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组，其特征在于，所述扩增引物对为引物对1，所述crRNA选自：SEQ ID NO.15所示序列。

4.权利要求1-3任一项所述的用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组在开发和/或制备具有百日咳博德特氏杆菌感染诊断和/或预后评估用途的产品中的应用。

5.一种用于检测百日咳博德特氏杆菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的用于百日咳博德特氏杆菌的CRISPR检测引物组。

6.根据权利要求5所述的用于检测百日咳博德特氏杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括Cas蛋白，信号报告探针和RNA聚合酶。

7.一种非诊断治疗目的百日咳博德特氏杆菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

样本提取：取待测样本，提取其中DNA；

RPA扩增：以权利要求1-3任一项中所述的扩增引物，通过RPA方法扩增上述提取得到的待测样本DNA，得扩增产物；

CRISPR反应检测：取上述扩增产物，加入信号报告探针、Cas13a蛋白、RNA聚合酶和权利要求1-3任一项中的crRNA，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，即得。

8.一种非诊断治疗目的百日咳博德特氏杆菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

样本提取：取待测样本，提取其中DNA；

一步检测：在上述提取得到的样本DNA中加入权利要求3中的扩增引物对、RNA聚合酶、crRNA、Cas13a蛋白、RNA聚合酶和信号报告试剂，同时进行RPA扩增、体外逆转录和CRISPR反应检测，读取检测信号，即得。

9.根据权利要求8所述的百日咳博德特氏杆菌检测方法，其特征在于，所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。

10.根据权利要求9所述的百日咳博德特氏杆菌检测方法，其特征在于，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。