CN113308569A

CN113308569A - 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN113308569A
Application number: CN202110496471.6A
Authority: CN
Inventors: 段昆; 付雪; 高晓庆; 施慧玲; 韩序; 王珺
Original assignee: Hangzhou Jieyi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Jieyi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2041-05-07
Also published as: CN113308569B

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒核酸的恒温扩增CRISPR检测试剂盒。试剂盒主要包括：1)耐高温的扩增酶，2)扩增缓冲液；3)检测酶；4)检测缓冲液；5)矿物油；6)C‑tube(能在一管中将上下液体试剂分开的反应管)。本试剂盒可以检测咽拭子，痰液等样本中的新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的N基因的RNA，具有单管、一步、快速、特异性高、灵敏度高、扩增产物为RNA不易发生污染等特点。本试剂盒能在1小时左右完成检测反应，灵敏度可以高达3copies/每反应，或者140copies/mL的样本。本发明能为临床上诊断新型冠状病毒感染提供分子水平的判断依据和帮助。

Description

一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的分子检测技术，具体涉及病毒RNA的等温扩增和CRISPR/Cas蛋白检测的分子检测技术及其相应的检测试剂盒。本发明实现了在单管中一步法对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA的恒温扩增和CRISPR/Cas13a检测。

背景技术：

冠状病毒(Coronavirus)是一类可以在动物和人之间传播的人畜共患单链正义RNA病毒。目前已经发现有7种冠状病毒可以感染人类，引起人类的呼吸道感染疾病。人类冠状病毒229E，人类冠状病毒OC43，人类冠状病毒NL63和人类冠状病毒HKU1这四种冠状病毒可以引起症状较轻，类似普通感冒症状的疾病；而2003年爆发的SARS严重急性呼吸综合征，2012年爆发的MERS中东呼吸综合征和目前全球爆发COVID-19新型冠状病毒肺炎分别是由其冠状病毒SARS-CoV，MERS-CoV，SARS-CoV-2引起的三种较严重传染性肺部疾病。

新型冠状病毒SARS-CoV-2是在人类中发现的一种新的冠状病毒，新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β属型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径约为60-140nm。其基因组特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。目前认为新型冠状病毒SARS-CoV-2的传播途径主要是由呼吸道的分泌物的进行飞沫传播，或者是接触到患者的病毒而引起感染。人群普遍易感，潜伏期一般为不超过14天，多为3-7天。多数以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者在感染新型冠状病毒后可无明显临床症状，目前认为无症状患者也具有传播疾病的能力。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状。重型病例多在一周后出现呼吸困难和/低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。

目前临床上对新型冠状病毒的感染的诊断，主要是依据临床特征表现、肺部的影像学资料和实验室的诊断结果相结合方法来判断，而其中实验室的新型冠状病毒的核酸的检测结果是目前最终确诊新型冠状病毒的感染的最明确的标准。目前实验室的检测新型冠状病毒的方法主要分为新型冠状病毒核酸的检测和新型冠状病毒抗体的检测即血清学检测两大类。

新型冠状病毒血清学的检测目前主要是基于常用的胶体金法、酶联免疫法和化学发光法检测新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体，虽然IgM抗体在早期便可以产生，但是其新型冠状病毒感染早期诊断的灵敏度较低，新型冠状病毒IgG抗体产生后，可以较长时存在于血清中，在康复的患者中依旧可以检测到。目前新型冠状病毒血清学的检测其灵敏度和特异性都比较有限，不能作为新型冠状病毒感染确诊和排除的唯一依据，不适用于人群的筛查，可作为新型冠状病毒核酸检测补充检测手段。

新型冠状病毒核酸检测，目前主要检测方法有：1)荧光定量PCR，2)等温扩增检测法，3)病毒基因测序方法。荧光定量PCR是利用一对特异性引物在耐高温DNA聚合酶实现靶标核酸的分子的扩增，并在荧光探针或者荧光染料结合下，产生产生荧光报告信号的方法。在检测RNA靶标时，该方法中还应加入逆转酶，进行逆转录反应将RNA转变为DNA。荧光定量PCR法是目前分子诊断中最常用的方法，也是分子诊断中认可的金标准方法。但是荧光定量PCR方法同样存在很多缺点，该方法实施过程中需要昂贵且精密的荧光定量PCR仪器，需要较为严格的PCR实验室环境，对实验人员的要求也比较高，虽然荧光定量PCR是闭管反应检测的，但是其在实施过程中产生污染的风险一直存在，一旦发生后果严重，且难以消除。目前新型冠状病毒核酸的检测的主要方法就是荧光定量PCR-探针法。

与荧光定量PCR方法需要的循环的变温过程相比，近些年来分子诊断技术同样发展了许多等温扩增检测方法，例如，环介导等温扩增技术(LAMP)，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)核酸序列依赖的扩增技术(NASBA/TMA)，LAMP，RPA和NASBA/TMA这些等温扩增技术完成扩增后往往都是需要结合特异性的荧光报告探针来完成检测信号的报告。

LAMP技术是利用4对引物和具链置换活性的DNA聚合酶在65℃左右恒温的条件下，实现DNA靶标的扩增；LAMP法检测的低浓度核酸的灵敏度往往不足，特别是在弱信号情况下，信号分辨率和检测特异性也很难保证。如果LAMP法扩增后需要开盖检测的话，污染和假阳性也很难控制。重组酶聚合酶扩增技术RPA是利用重组酶，DNA聚合和单链结合蛋白SSB在ATP存在的情况下利用一对引物实现靶标DNA的扩增，RPA技术往往在37-42℃的恒温反应下，就可以达到最佳的扩增条件，在室温下也可以直接反应，RPA的技术的优势在于反应的时间短，一般在15分钟内就可以完成扩增反应。但是RPA的缺点也很明显，RPA的扩增反应系统涉及的酶系统和反应体系比较复杂，要达到高灵敏度的检测时对扩增引物的筛选也比较麻烦，另外在常温就可以反应RPA即使全过程闭管反应，产生污染的风险也是比较高的。核酸序列依赖的扩增技术NASBA/TMA利用逆转录酶、RNA酶H和T7 RNA聚合酶三种酶在一对特异性引物的作用下完成对单链RNA扩增的一种方法，其主要扩增后的产物为主要为反义单链RNA。NASBA/TMA方法的优点是反应体系简单，反应产物为RNA，不易产生污染。但是目前的NASBA/TMA在加入扩增酶前，需要在65℃下进行RNA二级结构的变性和引物的结合，再将温度降低到41℃，加入扩增酶继续反应，这样增加了扩增反应操作的复杂性，不利于大规模的应用。目前也有一些新型冠状病毒核酸检测是通过等温扩增检测方法来进行的。

病毒基因测序方法这里指的是病毒基因组的二代或者三代测序，这种方法的可以直接得到病毒的基因序列，准确性非常高，新型冠状病毒就是通过在这种方法发现的。但是这种方法，操作比较复杂，耗时较长，需要精密的测序仪，测序成本较贵，目前不适合作为常规的诊断检测方法。

本发明提供了一种基于RNA恒温扩增CRISPR检测的新新型冠状病毒检测的方法，即CNAD(CRISPR-mediated Nucleic Acid Detection)技术，该技术主要是通过逆转录酶，耐高温的T7 RNA聚合酶和耐高温的RNA酶H，在50℃恒温下一步实现对单链RNA的扩增，并结合CRISPR/Cas13a蛋白实现一步单管的检测反应。相比于目前的荧光定量PCR和其他等温扩增检测技术，本试剂盒不需要精密的荧光定量PCR仪器，扩增检测产物为RNA，不易产生污染，实现了一步法将RNA靶标等温扩增和CRISPR/Cas13a检测在单管中闭管完成扩增检测，具有容易部署等特点。

发明内容：

本发明提供了一种基于RNA恒温扩增CRISPR检测的新新型冠状病毒检测试剂盒，相比于目前的荧光定量PCR，本试剂盒不需要精密的荧光定量PCR仪器，扩增检测产物为RNA，不易产生污染，可实现在实验条件比较差的地区或者户外、现场快速完成核酸的检测。本发明为新型冠状病毒核酸检测提供了一种快速，方便，灵敏度高，可以现场完成检测的方法。

本发明首次实现了一种一步法将RNA靶标等温扩增和CRISPR/Cas13a检测在单管中闭管完成扩增和检测的方法。

一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)扩增酶：主要包含逆转录酶AMV，耐高温T7 RNA聚合酶和耐高温RNA酶H；

(2)N扩增缓冲液：主要包含一对新型冠状病毒N基因扩增引物，dNTP，NTP，ITP，DTT，二甲基亚砜DMSO，氯化镁，氯化钾，山梨醇和牛血清白蛋白BSA；

(3)内标扩增缓冲液：一对人18S RNA基因的扩增引物，dNTP，NTP，ITP，DTT，Tris-HCl二甲基亚砜DMSO，氯化镁，氯化钾，山梨醇和牛血清白蛋白BSA；

(4)检测酶：包含Cas13a，T7 RNA聚合酶和RNA酶抑制剂；

(5)N检测缓冲液：主要包括新型冠状病毒的N基因的crDNA，荧光报告探针，NTP，DTT，氯化钠和氯化镁；

(6)内标检测缓冲液，主要包括内标18S rRNA基因的crDNA，荧光报告探针，NTP，DTT，氯化钠，氯化镁和聚乙二醇4000；

(7)矿物油；

(8)C-tube，带有硅胶膜隔层，能在一管中将上下液体试剂分开的反应管；

(9)阳性对照：含有人源细胞和含有新型冠状病毒N基因片段序列的假病毒的PBS溶液；

(10)阴性对照：含有人源细胞的PBS溶液。

进一步地，扩增的新型冠状病毒N基因的片段序列如SEQ IN NO.1所示；经过扩增酶在N扩增缓冲液中扩增后产物的RNA序列如SEQ ID NO.2所示；试剂盒中扩增的内标基因18S rRNA的片段序列如SEQ ID NO.3所示，经过扩增酶在内标扩增缓冲液中扩增后产物的RNA序列如SEQ ID NO.4所示：

SEQ ID NO.1:ctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtct；

SEQ ID NO.2:agacauuuugcucucaagcugguucaaucugucaagcagcagcaaagcaagagcagcaucaccgccauugccagccauucuagcaggagaaguuccccuacugcugccuggaguugaauuucuugaacuguugcgacuacgugaugaggaacgagaagag；

SEQ ID NO.3:gagcggtcggcgtcccccaacttcttagagggacaagtggcgttcagccacccgagattgagcaataacaggtctgtgatgcccttagatgtccggggctgcacgcgcgctacactgactggctcagcgtgtgcctaccctacgccggcaggcgcgggtaacccgttgaacc；

SEQ ID NO.4:gagcggucggcgucccccaacuucuuagagggacaaguggcguucagccacccgagauugagcaauaacaggucugugaugcccuuagauguccggggcugcacgcgcgcuacacugacuggcucagcgugugccuacccuacgccggcaggcgcggguaacccguugaac。

进一步地，所述N扩增缓冲液中的新型冠状病毒N基因扩增引物序列如下：

N-FW(SEQ ID NO.5)：ctcttctcgttcctcatcacgta

NT7-RV(SEQ ID NO.6)：aattctaatacgactcactatagggagaagacattttgctctcaagctggt。

所述内标扩增缓冲液中的人18S RNA基因的扩增引物序列如下：

18S-FW(SEQ ID NO.7)：gagcggtcggcgtcccccaactt

18ST7-RV(SEQ ID NO.8)：aattctaatacgactcactatagggagaggttcaacgggttacccgcgcct。

进一步地，所述N检测缓冲液中的新型冠状病毒N基因crDNA序列如SEQ ID NO.9所示，N基因crDNA经过检测酶在N检测缓冲液中反应后，产生的N基因crRNA序列如SEQ IDNO.10所示；所述内标检测缓冲液中的内标18S rRNA基因的crDNA序列如SEQ ID NO.11所示，内标18S rRNA基因的crDNA经过检测酶在内标检测缓冲液中反应后，生成的内标18SrRNA基因的crRNA序列如SEQ ID NO.12所示；

SEQ ID NO.9：Taatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaactgatgctgctcttgctttgctgctgctt；

SEQ ID NO.10：ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacugaugcugcucuugcuuugcugcugcuu；

SEQ ID NO.11：taatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacggctgcacgcgcgctacactgactggct；

SEQ ID NO.12：ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacggcugcacgcgcgcuacacugacuggcu。

进一步地，N检测缓冲液和内标检测液中的荧光报告探针为一段单链的RNA序列的探针，5’端FAM荧光基团修饰，3’端BHQ1荧光淬灭基团修饰，并且两段均有甲基化的修饰，其序列如SEQ ID NO.13所示：

SEQ ID NO.13：FAM-/i2OMeA/AUGGC/i2OMeA/-BHQ1。

进一步地，扩增引物NT7-RV和18ST7-RV的序列中的5’端都包含一段含有T7启动子的序列SEQ ID NO.14，用于在T7 RNA聚合酶的作用下产生RNA，

SEQ ID NO.14：aattctaatacgactcactatagggaga。

进一步地，N基因的crDNA和内标18S rRNA基因的crDNA的5’端都包含一段T7启动子的序列SEQ ID NO.15，用于T7 RNA聚合酶的作用下产生crRNA，SEQ ID NO.15:aatacgactcactataggg。

进一步地，本发明试剂盒每个反应中的各个试剂组成如下：

(1)扩增酶：逆转录酶AMV 0.5-100U/反应，耐高温T7 RNA聚合酶1-1000U/反应，耐高温RNA酶H 0.02-5U/反应，20-300mM Potassium Phosphate,pH 7.5，1-10mMDithiothreitol(DTT)，20-50％(v/v)甘油，0.01％-1％Triton X-100，20-100mM Tris-HC1(pH 7.5)，0.01-0.5mM EDTA，20-200mM NaCl，20～200mM KCl；

(2)N扩增缓冲液/内标扩增缓冲液：10-100mM Tris-HCl pH7.5-pH8.5，扩增引物0.1～2μM，dNTP 0.1-10mM，NTP 0.2-20mM，ITP 0.1-5mM，1～10mM DTT，0-25％(v/v)二甲基亚砜DMSO，2-50mM氯化镁，20-100mM氯化钾，0.01M-0.5M山梨醇，牛血清白蛋白BSA 0.1-100μg/反应；

(3)检测酶：Cas13a蛋白1ng-10μg/反应，T7 RNA聚合酶1～1000U/反应，RNA酶抑制剂1～200U/反应，20-100mM Tris-HC1(pH 7.5)，1-10mM Dithiothreitol(DTT)，20-50％(v/v)甘油，0.01％-1％Triton X-100，0.01-0.5mM EDTA，20-600mM NaCl；

(4)N检测缓冲液/内标检测缓冲液：N基因的crDNA 1ng-100ng，内标基因的crDNA1ng-100ng，荧光报告探针0.01-2μM，0.1-20mM NTP，1-20mM DTT，20-100mM氯化钠，1-50mM氯化镁，0-50mM氯化钾，1-50mM氯化镁，1％-25％(v/v)聚乙二醇4000；

(5)矿物油：矿物油5-100μL/反应；

(6)C-tube：C-tube是带有硅胶膜隔层，并且硅胶隔层中心位置有能开合的十字孔反应管；C-tube能在一管中将上下液体试剂分开，并且在扩增反应完成后可以通过瞬时离心将硅胶膜上层的液体离心到硅胶膜下方。

进一步地，所述阳性对照为PBS溶液中含有10³-10⁵个人源细胞和10³-10⁶个含有新型冠状病毒N基因片段序列的假病毒；阴性对照：为PBS溶液中含有10³-10⁵个人源细胞。

进一步地，所述试剂盒分成A盒和B盒两个部分，A盒部分是扩增检测试剂部分包括扩增酶，N扩增缓冲液，内标扩增缓冲液，检测酶，N检测缓冲液，内标检测缓冲液，矿物油，阳性对照和阴性对照，储存在-15到-25℃之间；B盒部分是反应管C-tube，室温存放。

本发明试剂盒的主要优点在于：

(1)不需要昂贵且精密的荧光定量PCR仪器；

(2)反应的全过程中都不易产生污染；

(3)灵敏度高；

(4)特异性高；

(5)实现了RNA靶标等温扩增和CRISPR/Cas13a检测的单管一步闭管反应检测。

(6)可以实现在实验条件比较差的地区或者户外、现场快速完成核酸的检测。

附图说明：

图1为本发明试剂盒实施过程的流程图。

图2为说明新型冠状病毒灵敏度检测的结果，灵敏度达到140copies/ml。

图3为说明新型冠状病毒毒灵敏度检测的结果，灵敏度达到3copies/反应。

图4为说明新型冠状病毒特异性的检测的结果，特异性高，常见的病原体均是阴性的信号。

图5为临床咽拭子样本咽拭子检测的结果，其中P1-P8为新型冠状病毒阳性的咽拭子样本，N1-N5为新型冠状病毒阴性的咽拭子样本，检测均符合临床的诊断结果。

图6为临床痰液样本检测的结果，其中SP1-SP8为新型冠状病毒阳性的痰液样本，N1-N5为新型冠状病毒阴性的痰液样本，检测均符合临床的诊断结果。

具体实施方式：

结合以下具体实施例对本发明提供的方法进行更详细的说明，这些实施例应理解成对本发明的具体说明和阐述，不应理解成为本发明范围的限制。以下实施例中所用到的的试剂组分除特别说明外，均为本发明试剂盒中的组分。本领域的专业人员在本发明基础上的修改或者改动，这些等价修改的方式同样落在本发明权利要求书中所述的权利要求范围。

新型冠状病毒核酸检测试剂盒，每个反应中的各个试剂组成如下：

扩增酶：逆转录酶AMV 4U/反应，耐高温T7 RNA聚合酶20U/反应，耐高温RNA酶H0.2U/反应，200mM Potassium Phosphate,pH 7.5，5mM Dithiothreitol(DTT)，50％(v/v)甘油，0.1％Triton X-100，20mM Tris-HC1(pH 7.5)，0.5mM EDTA，100mM NaCl，20mM KCl；

(1)N扩增缓冲液/内标扩增缓冲液：40mM Tris-HCl pH7.4，扩增引物0.2μM，dNTP1mM，NTP 2mM，ITP 0.5mM，5mM DTT，15％(v/v)二甲基亚砜DMSO，12mM氯化镁，70mM氯化钾，50mM山梨醇，牛血清白蛋白BSA 1μg/反应；

其中，N扩增缓冲液中的新型冠状病毒N基因扩增引物序列如下：

N-FW(SEQ ID NO.5)：ctcttctcgttcctcatcacgta

NT7-RV(SEQ ID NO.6)：aattctaatacgactcactatagggagaagacattttgctctcaagctggt。

内标扩增缓冲液中的人18S RNA基因的扩增引物序列如下：

18S-FW(SEQ ID NO.7)：gagcggtcggcgtcccccaactt

18ST7-RV(SEQ ID NO.8)：aattctaatacgactcactatagggagaggttcaacgggttacccgcgcct。

(2)检测酶：Cas13a蛋白0.3μg/反应，T7 RNA聚合酶20U/反应，RNA酶抑制剂20U/反应，40mM Tris-HC1(pH 7.5)，10mM Dithiothreitol(DTT)，50％(v/v)甘油，0.1％TritonX-100，1mM EDTA，600mM NaCl；

(3)N检测缓冲液/内标检测缓冲液：N基因的crDNA 15ng，内标基因的crDNA15ng，荧光报告探针0.04μM，0.5mM NTP，10mM DTT，60mM氯化钠，8mM氯化镁，10mM氯化钾，

(4)矿物油：矿物油10μL/反应；

(5)C-tube：C-tube是带有硅胶膜隔层，并且硅胶隔层中心位置有能开合的十字孔反应管；C-tube能在一管中将上下液体试剂分开，并且在扩增反应完成后可以通过瞬时离心将硅胶膜上层的液体离心到硅胶膜下方。

实施例1：本发明试剂盒灵敏度的检测

1.检测样本核酸的准备：

1)以新型冠状病毒的培养物的灭活后30000copies/mL的浓度为S1样本，依次用PBS按照1:3比例梯度稀释后为S2样本10000copies/mL，S3样本约3000copies/mL，S4样本约1000copies/mL，S5样本约300copies/mL，S6样本约140copies/mL，S7样本约40copies/mL，S8样本约15copies/mL，NC样本为PBS溶液。上述S1-S8样本和NC样本经过核酸提取后，成为该实施例中试剂盒要检测的核酸样本溶液。核酸体过程采用的是本公司(杭州杰毅生物技术有限公司)配套的病原物生物核酸提取试剂盒，(货号MD002)。

2)通过带有T7启动子AATACGACTCACTATAGGG序列(SEQ ID NO.15)的N基因的DNA序列，经过体外转录得到N基因RNA产物(SEQ ID NO.16)，RNA经过纯化，浓度测量，体外RNA转录试剂使用的是HiScribeT7 Quick High Yield RNA Synthesis kit(New EnglandBiolabs)，RNA纯化试剂盒使用的是RNA Clean&Concentrator-5kit(Zymo Research)。纯化后的RNA用ddH₂O依次按照1:10稀释成1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL；然后在稀释成要检测的浓度10fg/μL(约1.7x10⁴copies/μL)，1fg/μL(约1.7x10³copies/μL)，100ag/μL(约170copies/μL)，10ag/μL(约17copies/μL)，3.3ag/μL(约6copies/μL)，1ag/μL(约1.7copies/μL)。

2.扩增和检测具体的实施步骤：

1)将试剂盒中的N检测buffer/内标检测buffer于室温解冻，并将各组分混匀。

2)扩增反应液配制：按照下表及检测样本的数量，在不同的无核酸酶离心管中取相应量的N扩增buffer和扩增酶预混、相应量的内标扩增buffer和扩增酶预混，配制成N扩增反应液和内标扩增反应液；

3)检测反应液：按照下表及检测样本的数量，在不同的无核酸酶离心管中取相应量的N检测buffer和检测酶预混、相应量的内标检测buffer和检测酶预混，配制成N检测反应液和内标检测反应液。

4)吸取3.5μL步骤2)中N扩增反应液或内标扩增反应液，用枪头穿过C-tube的硅胶膜十字孔，将扩增反应液加入至C-tube底部，再向反应孔底部加入8μL矿物油，然后吸取1.5μL待测RNA核酸样本溶液，用枪头穿过硅胶膜十字孔，加入到矿物油层下方，瞬时离心C-tube，保证液体全部位于管底。

5)吸取45μL步骤3)中N检测反应液或内标检测反应液，加在对应靶点反应管的C-tube管盖内的凹槽内，小心盖好管盖后(此时切记不可离心)放在等温扩增反应设备(如PCR仪或者恒温金属浴)中50℃，反应50min。本反应等温扩增反应设备为本公司(杭州杰毅生物技术有限公司)生产的恒温金属浴(货号MI-960)。

6)等待50℃恒温反应完后，取下C-tube，在迷你离心机上瞬时离心，将检测反应液离心至管底，离心后的C-tube放入恒温金属浴中，37℃至少孵育15min。

7)孵育结束后，放入核酸扩增分析仪器中读取荧光值，为了确保检测结果的准确，孵育结束后的样本需在1个小时内，完成荧光值的检测读取。

本发明的试剂盒的荧光读取仪器设备适用于杭州杰毅生物技术有限公司生产的核酸扩增分析仪器FMS-800M。

3.阳性参考值的设定

1)N基因的阳性参考值设定：

荧光值≥4200判定为阳性样本；荧光值≤4000判定为阴性样本；4000＜荧光值＜4200建议重新检测，荧光值>4000判定为阳性样本，荧光值<4000判定为阴性。

2)内标基因的参考值设定：

阳性判断值：荧光值≥4500；阴性判断值：荧光值<4500。

4.检测结果的解释

1)若内标荧光值≥4500情况下：

①N基因靶点荧光值≥4200，表示新型冠状病毒(2019-nCoV)N基因阳性；

②N基因靶点荧光值≤4000，表示新型冠状病毒(2019-nCoV)N基因阴性；

③N基因靶点荧光值在4000～4200之间时，需要重复实验，若重做结果荧光值＞4000，该样本判断为新型冠状病毒(2019-nCoV)N基因阳性，否则为阴性。

2)若内标荧光值<4500情况下：

②N基因靶点荧光值＜4200，需重新提取样本核酸后检测。

3.对于阳性样本及病毒培养物，内标检测结果不作要求。

该实施列1的检测结果见附图图2和图3，说明本发明新冠病毒检测的试剂盒的灵敏度可以达到约140copies/mL的样本或者3copies/每反应。

实施例2：本发明试剂盒特异性的检测

1.检测样本核酸的准备：

1)以新型冠状病毒的培养物灭活后的样本为阳性对照PC样本，以常见的呼吸道或肺部感染的病原体样本作为特异性的干扰样本进行测试，这些病原体样本包括嗜肺军团菌L.pneumophila，肺炎克雷伯菌K.pneumoniae，肺炎链球菌S.pneumoniae，流感嗜血杆菌H.influenzae，肺炎支原体M.pneumoniae，肺炎衣原体C.pneumoniae，百日咳杆菌B.pertussis，人冠状病毒-OC43 hCoV-OC43，人冠状病毒-NL63 hCoV-NL63，人冠状病毒-HKU-1hCoV-HKU-1，人冠状病毒-229E hCoV-229E，MERS假病毒MERS Armored RNA，腺病毒3型Adenovirus type 3，副流感2型Parainfluenza type 2，呼吸道合胞病毒A型RSV-A，禽流感病毒H7N9 Influenza A H7N9，禽流感病毒H5N1 Influenza A H5N1，乙型流感病毒(Victoria系)Influenza B(Victoria)，甲型H1N1(2009)流感病毒Influenza A H1N1(2009)，甲型H3N2流感病毒Influenza A H3N2，EB病毒EBV，同样也包括新型冠状病毒的阳性对照样本PC和阴性对照样本NC，上述样本经过核酸提取后，成为该实施例中试剂盒要检测的核酸样本溶液。核酸体过程采用的是本公司(杭州杰毅生物技术有限公司)配套的病原物生物核酸提取试剂盒，(货号MD002)。

2.扩增和检测具体的实施步骤，检测结果的判定和解释均与实施例1相同。

该实施列2的检测结果见图4，说明本发明新冠病毒检测的试剂盒的特异性高，在常见的其他呼吸道或肺部感染的病原体中均不会产生信号。

实施例3：本发明试剂盒对临床咽拭子样本的检测

1.检测样本核酸的准备：

1)以临床上确认诊断为新型冠状病毒感染的患者咽拭子样本，取8个咽拭子阳性样本提取好的核酸样本溶液，编号P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8；5个咽拭子阴性样本提取好的核酸样本溶液，编号N1，N2，N3，N4，N5，作为检测核酸样本。上述咽拭子核酸样本溶液均是由临床咽拭子样本经过QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit病毒RNA提取试剂盒(货号52904)进行核酸提取后的核酸样本溶液。

2.该实施例中扩增和检测具体的实施步骤，检测结果的判定和解释均与实施例1相同。

该实施列3的检测结果见图5，说明本发明新冠病毒检测试剂盒检测临床咽拭子样本与临床确认的诊断结果均符合。

实施例4：本发明试剂盒对临床痰液样本的检测

1.检测样本核酸的准备：

1)以临床上确认诊断为新型冠状病毒感染的痰液样本，取8个痰液阳性样本提取好的核酸样本溶液，编号SP1，SP2，SP3，SP4，SP5，SP6，SP7，SP8；5个痰液阴性样本提取好的核酸样本溶液，编号SN1，SN2，SN3，SN4，SN5，作为检测核酸样本。上述痰液核酸样本溶液均是由临床的痰液样本经过QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit病毒RNA提取试剂盒(货号52904)进行核酸提取后的核酸样本溶液。

该实施列4的检测结果见图6，说明本发明新冠病毒检测试剂盒检测临床痰液样本与临床确认的诊断结果均符合。

序列表

<110> 杭州杰毅生物技术有限公司

<120> 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 160

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒N基因(Novel coronavirus N gene)

<400> 1

ctcttctcgt tcctcatcac gtagtcgcaa cagttcaaga aattcaactc caggcagcag 60

taggggaact tctcctgcta gaatggctgg caatggcggt gatgctgctc ttgctttgct 120

gctgcttgac agattgaacc agcttgagag caaaatgtct 160

<210> 2

<211> 160

<212> RNA

<213> 新型冠状病毒N基因(Novel coronavirus N gene)

<400> 2

agacauuuug cucucaagcu gguucaaucu gucaagcagc agcaaagcaa gagcagcauc 60

accgccauug ccagccauuc uagcaggaga aguuccccua cugcugccug gaguugaauu 120

ucuugaacug uugcgacuac gugaugagga acgagaagag 160

<210> 3

<211> 172

<212> DNA

<213> 内标基因18s rrna(Internal standard gene)

<400> 3

gagcggtcgg cgtcccccaa cttcttagag ggacaagtgg cgttcagcca cccgagattg 60

agcaataaca ggtctgtgat gcccttagat gtccggggct gcacgcgcgc tacactgact 120

ggctcagcgt gtgcctaccc tacgccggca ggcgcgggta acccgttgaa cc 172

<210> 4

<211> 172

<212> RNA

<213> 内标基因18S rRNA(Internal standard gene)

<400> 4

gagcggucgg cgucccccaa cuucuuagag ggacaagugg cguucagcca cccgagauug 60

agcaauaaca ggucugugau gcccuuagau guccggggcu gcacgcgcgc uacacugacu 120

ggcucagcgu gugccuaccc uacgccggca ggcgcgggua acccguugaa cc 172

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcttctcgt tcctcatcac gta 23

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aattctaata cgactcacta tagggagaag acattttgct ctcaagctgg t 51

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagcggtcgg cgtcccccaa ctt 23

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aattctaata cgactcacta tagggagagg ttcaacgggt tacccgcgcc t 51

<210> 9

<211> 84

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒n基因crdna序列(Novel coronavirus n gene cdna sequence)

<400> 9

taatacgact cactataggg gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaactgat 60

gctgctcttg ctttgctgct gctt 84

<210> 10

<211> 65

<212> RNA

<213> 新型冠状病毒N基因crRNA序列(Crrna sequence of novel coronavirus Ngene)

<400> 10

ggauuuagac uaccccaaaa acgaagggga cuaaaacuga ugcugcucuu gcuuugcugc 60

ugcuu 65

<210> 11

<211> 84

<212> DNA

<213> 内标18S rRNA基因crDNA序列(Crdna sequence of internal standard gene)

<400> 11

taatacgact cactataggg gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacggct 60

gcacgcgcgc tacactgact ggct 84

<210> 12

<211> 65

<212> RNA

<213> 内标18S rRNA基因crRNA序列(Crdna sequence of internal standard gene)

<400> 12

ggauuuagac uaccccaaaa acgaagggga cuaaaacggc ugcacgcgcg cuacacugac 60

uggcu 65

<210> 13

<211> 5

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

auggc 5

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aattctaata cgactcacta tagggaga 28

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aatacgactc actataggg 19

<210> 16

<211> 981

<212> RNA

<213> 新型冠状病毒N基因RNA(Novel coronavirus n gene rna)

<400> 16

augucugaua auggacccca aaaucagcga aaugcacccc gcauuacguu ugguggaccc 60

ucagauucaa cuggcaguaa ccagaaugga gaacgcagug gggcgcgauc aaaacaacgu 120

cggccccaag guuuacccaa uaauacugcg ucuugguuca ccgcucucac ucaacauggc 180

aaggaagacc uuaaauuccc ucgaggacaa ggcguuccaa uuaacaccaa uagcagucca 240

gaugaccaaa uuggcuacua ccgaagagcu accagacgaa uucguggugg ugacgguaaa 300

augaaagauc ucaguccaag augguauuuc uacuaccuag gaacugggcc agaagcugga 360

cuucccuaug gugcuaacaa agacggcauc auauggguug caacugaggg agccuugaau 420

acaccaaaag aucacauugg cacccgcaau ccugcuaaca augcugcaau cgugcuacaa 480

cuuccucaag gaacaacauu gccaaaaggc uucuacgcag aagggagcag aggcggcagu 540

caagccucuu cucguuccuc aucacguagu cgcaacaguu caagaaauuc aacuccaggc 600

agcaguaggg gaacuucucc ugcuagaaug gcuggcaaug gcggugaugc ugcucuugcu 660

uugcugcugc uugacagauu gaaccagcuu gagagcaaaa ugucugguaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaacugucac uaagaaaucu gcugcugagg cuucuaagaa gccucggcaa 780

aaacguacug ccacuaaagc auacaaugua acacaagcuu ucggcagacg ugguccagaa 840

caaacccaag gaaauuuugg ggaccaggaa cuaaucagac aaggaacuga uuacaaacau 900

uggccgcaaa uugcacaauu ugcccccagc gcuucagcgu ucuucggaau gucgcgcauu 960

ggcauggaag ucacaccuuc g 981

Claims

1.一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(4)检测酶：包含Cas13a，T7 RNA聚合酶和RNA酶抑制剂；

(7)矿物油；

(10)阴性对照：含有人源细胞的PBS溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，扩增的新型冠状病毒N基因的片段序列如SEQ IN NO.1所示；经过扩增酶在N扩增缓冲液中扩增后产物的RNA序列如SEQ ID NO.2所示；试剂盒中扩增的内标基因18S rRNA的片段序列如SEQ ID NO.3所示，经过扩增酶在内标扩增缓冲液中扩增后产物的RNA序列如SEQ ID NO.4所示；

SEQ ID NO.4:gagcggucggcgucccccaacuucuuagagggacaaguggcguucagccacccgagauugagcaauaacaggucugugaugcccuuagauguccggggcugcacgcgcgcuacacugacuggcucagcgugugccuacccuacgccggcaggcgcggguaAcccguugaacc。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述N扩增缓冲液中的新型冠状病毒N基因扩增引物序列如下：

N-FW(SEQ ID NO.5)：ctcttctcgttcctcatcacgta

NT7-RV(SEQ ID NO.6)：aattctaatacgactcactatagggagaagacattttgctctcaagctggt。

所述内标扩增缓冲液中的人18S RNA基因的扩增引物序列如下：

18S-FW(SEQ ID NO.7)：gagcggtcggcgtcccccaactt

18ST7-RV(SEQ ID NO.8)：aattctaatacgactcactatagggagaggttcaacgggttacccgcgcct。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述N检测缓冲液中的新型冠状病毒N基因crDNA序列如SEQ ID NO.9所示，N基因crDNA经过检测酶在N检测缓冲液中反应后，产生的N基因crRNA序列如SEQ ID NO.10所示；所述内标检测缓冲液中的内标18S rRNA基因的crDNA序列如SEQ ID NO.11所示，内标18S rRNA基因的crDNA经过检测酶在内标检测缓冲液中反应后，生成的内标18S rRNA基因的crRNA序列如SEQ ID NO.12所示；

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，N检测缓冲液和内标检测液中的荧光报告探针为一段单链的RNA序列的探针，5’端FAM荧光基团修饰，3’端BHQ1荧光淬灭基团修饰，并且两段均有甲基化的修饰，探针序列如SEQ ID NO.13所示：

SEQ ID NO.13：FAM-/i2OMeA/AUGGC/i2OMeA/-BHQ1。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，扩增引物NT7-RV和18ST7-RV的序列中的5’端都包含一段含有T7启动子的序列SEQ ID NO.14，用于在T7RNA聚合酶的作用下产生RNA，

SEQ ID NO.14：aattctaatacgactcactatagggaga。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，N基因的crDNA和内标18S rRNA基因的crDNA的5’端都包含一段T7启动子的序列SEQ ID NO.15，用于T7 RNA聚合酶的作用下产生crRNA，

SEQ ID NO.15:aatacgactcactataggg。

8.根据权利要求1-7任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，每个反应中的各个试剂组成如下：

(1)扩增酶：逆转录酶AMV 0.5-100U/反应，耐高温T7 RNA聚合酶1-1000U/反应，耐高温RNA酶H 0.02-5U/反应，20-300mM Potassium Phosphate,pH 7.5，1-10mM Dithiothreitol(DTT)，20-50％(v/v)甘油，0.01％-1％Triton X-100，20-100mM Tris-HC1(pH 7.5)，0.01-5mM EDTA，20-200mM NaCl，20～200mM KCl；(2)N扩增缓冲液/内标扩增缓冲液：10-100mMTris-HCl pH7.5-pH8.5，扩增引物0.1～2μM，dNTP 0.1-10mM，NTP 0.2-20mM，ITP 0.1-5mM，1～10mM DTT，0-25％(v/v)二甲基亚砜DMSO，2-50mM氯化镁，20-100mM氯化钾，0.01M-0.5M山梨醇，牛血清白蛋白BSA 0.1-100μg/反应；

(3)检测酶：Cas13a蛋白1ng-10μg/反应，T7 RNA聚合酶1～1000U/反应，RNA酶抑制剂1～200U/反应，20-100mM Tris-HC1(pH 7.5)，1-10mM Dithiothreitol(DTT)，20-50％(v/v)甘油，0.01％-1％Triton X-100，0.01-5mM EDTA，20-600mM NaCl；

(4)N检测缓冲液/内标检测缓冲液：N基因的crDNA 1ng-100ng，内标基因的crDNA 1ng-100ng，荧光报告探针0.01-2μM，0.1-20mM NTP，1-20mM DTT，20-100mM氯化钠，1-50mM氯化镁，0-50mM氯化钾，1-50mM氯化镁，1％-25％(v/v)聚乙二醇4000；

(5)矿物油：矿物油5-100μL/反应；

9.根据权利要求1所述的试剂盒，所述阳性对照为PBS溶液中含有10³-10⁵个人源细胞和10³-10⁶个含有新型冠状病毒N基因片段序列的假病毒；阴性对照：为PBS溶液中含有10³-10⁵个人源细胞。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒分成A盒和B盒两个部分，A盒部分是扩增检测试剂部分包括扩增酶，N扩增缓冲液，内标扩增缓冲液，检测酶，N检测缓冲液，内标检测缓冲液，矿物油，阳性对照和阴性对照，储存在-15到-25℃之间；B盒部分是反应管C-tube，室温存放。