CN111926117A - SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了SARS‑CoV‑2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法。本发明的检测方法包括：(a)提供一含靶标核酸分子的待检测的样本；(b)将所述待检测的样本与切割试剂或含所述切割试剂的切割缓冲液进行混合，从而形成一检测体系，其中，所述的切割试剂包括：2个向导ssDNA、基因编辑酶(Ago)、和第一报告核酸分子，所述第一报告核酸分子带有荧光基团和淬灭基团，并且，所述的2个向导ssDNA之间彼此相邻；和(c)对所述检测体系进行荧光检测，从而获得荧光信号值，其中，所述检测体系中检测到荧光信号值，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；而所述检测体系中没有检测到荧光信号值，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子。本发明的方法可高灵敏度、准确性的检测靶标核酸分子。

Description

SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及SARS-CoV-2病毒核酸等温 快速检测试剂盒及检测方法。

背景技术

目前，新冠病毒，尤其是低丰度病毒的精准和定量检测对于病人确诊、后 续控制和治疗都具有积极影响。自病毒基因组测序结果推出后，针对特定核酸 序列开发检测产品成为关注点。到目前为止，已有七家体外诊断公司的产品投 入市场，还有二十余家企业也相继推出检测产品。实时荧光PCR(逆转录PCR) 法是检测COVID-19病毒核酸的一种临床标准。逆转录PCR即逆转录-聚合酶 链反应，其原理是，提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板， 采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进 行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。从临床应用效果看，核酸诊断 试剂盒比常规基因组测序分析具有成本和时间上的优势，但因其多基于荧光 PCR方法，仍然还存在检测时间较长(2小时左右)、价格高(200元/次)、设备昂 贵(Q-PCR仪器30-60万元)，及操作人员专业要求高等问题，因此，目前确诊 和疑似病人的诊断仍是后续防控和治疗的局限因素。开发新型传染病的诊断新 技术、研制与其配套的POCT(即时现场检测)仪器，实现快速(低于1小时)、低 价、灵敏等基层也能推广应用的产品，是急需攻克的科研难题。

一步法逆转录LAMP核酸扩增技术的原理:逆转录LAMP即逆转录和Loop- MediatedIsothermal Amplification(环介导等温扩增)的结合，专门用于快速扩增 RNA。LAMP是2000年才出现的一种新颖的等温核酸扩增方法。它利用4或6条 模板专一的特异引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在等温条件下(63℃左右) 15-60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至 优于逆转录PCR技术，同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观 察等过程，不依赖任何专门的仪器设备。目前已成功应用于人类及动植物、细 菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的快速检测。近日，逆转录LAMP法(逆转录环介导等温扩增法)也应用到了SARS-CoV-2病毒核酸检测中。但逆转录LAM P法检测新型冠状病毒还存在假阳性高、可靠性差等问题。

并且基于CRISPR系统的核酸检测技术也仍存在许多限制因素，例如CRI SPR对检测基因序列的限制、多重检测难以实现、crRNA设计相对复杂且合成 价格昂贵等，仍然成为其进入市场的限制。

因此，本领域迫切需要开发快速、简便、高效、高灵敏并且高准确性的检测 SARS-CoV-2的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、简便、高效、高灵敏并且高准确性的检测 SARS-CoV-2的方法。

在本发明第一方面，提供了一种靶标核酸分子的检测方法，包括步骤：

(a)提供一含靶标核酸分子的待检测的样本，所述靶标核酸分子包括单链 DNA；

(b)将所述待检测的样本与切割试剂或含所述切割试剂的切割缓冲液进行混 合，从而形成一检测体系，其中，所述的切割试剂包括：2个向导ssDNA、基因 编辑酶(Ago)、和第一报告核酸分子，所述第一报告核酸分子带有荧光基团和淬 灭基团，并且，所述的2个向导ssDNA之间彼此相邻；和

(c)对所述检测体系进行荧光检测，从而获得荧光信号值，其中，所述检测 体系中检测到荧光信号值，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；而所述检测体系 中没有检测到荧光信号值，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子。

在另一优选例中，所述的待检测的样本包括未经扩增的样本以及经过扩增(或 核酸扩增)的样本。

在另一优选例中，所述的待检测的样本是经过扩增而获得的样本。

在另一优选例中，所述扩增选自下组：PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连 接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA, SPIA,NEAR,TMA、SMAP2、或其组合。

在另一优选例中，所述各向导ssDNA中的5'端的第一位核苷酸为T。

在另一优选例中，所述向导ssDNA的长度各自独立地为10-60nt，较佳地，10-40nt，更佳地，13-20nt。

在另一优选例中，所述向导ssDNA可相同或不同。

在另一优选例中，所述向导ssDNA的长度可相同或不同。

在另一优选例中，所述向导ssDNA为磷酸化的单链DNA分子。

在另一优选例中，所述的向导ssDNA为5'-磷酸化的单链DNA分子；和/或 3'-磷酸化的单链DNA分子。

在另一优选例中，所述基因编辑酶Ago选自下组：PfAgo(Pyrococcus furiosusAgo)、MfAgo(Methanocaldococcus fervens Ago)、TcAgo(Thermogladius calderae Ago)、TfAgo(Thermus filiformis Ago)、AaAgo(Aquifex aeolicus Ago)、 TpAgo(Thermusparvatiensis Ago)、或其组合。

在另一优选例中，所述基因编辑酶Ago包括PfAgo(Pyrococcus furiosus Ago)。

在另一优选例中，所述的Ago包括野生型和突变型的Ago。

在另一优选例中，所述基因编辑酶的工作温度为87-99℃。

在另一优选例中，所述的靶标核酸分子(或其扩增产物)被所述基因编辑酶Ago 切割后，产生次级向导ssDNA。

在另一优选例中，所述次级向导ssDNA的长度为10-60nt，较佳地，10-40nt， 更佳地，15-17nt。

在另一优选例中，所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸(第一报告核 酸分子)的序列是互补的。

在另一优选例中，所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸(第一报告核 酸分子)的序列互补结合后，引导所述基因编辑酶Ago对所述荧光报告核酸(第一 报告核酸分子)进行切割，从而产生可检测的信号(如荧光)。

在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述荧光报告 核酸的5'端、3'端。

在另一优选例中,所述荧光基团选自下组：FAM、HEX、CY3、CY5、ROX、 VIC、JOE、TET、Texas Red、或其组合。

在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：TAMARA、BHQ、DABSYL、或 其组合。

在另一优选例中，所述的荧光报告核酸(第一报告核酸分子)的长度为 9-100nt，较佳地10-60nt，更佳地15-40nt。

在另一优选例中，所述的靶标核酸分子选自下组：病原微生物的核酸分子、 基因突变的核酸分子、和特异靶标核酸分子。

在另一优选例中，所述的病原微生物包括病毒、细菌、衣原体、支原体。

在另一优选例中，所述病毒包括植物病毒或动物病毒。

在另一优选例中，所述的病毒包括：冠状病毒、流感病毒、HIV、肝炎病毒、 副流感病毒。

在另一优选例中，所述病毒为冠状病毒。

在另一优选例中，所述病毒选自下组：SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov、或其组合。

在另一优选例中，所述的靶标核酸分子包括野生型或突变型的DNA。

在另一优选例中，所述的靶标核酸分子包括单链cDNA。

在另一优选例中，所述的靶标核酸分子包括由RNA逆转录或扩增而获得的 DNA，如cDNA等。

在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括SARS-CoV-2病毒中存在单碱基突 变。

在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括SARS-CoV-2病毒ORF1ab,N,E基 因等的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)突变型。

在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括SARS-CoV-2病毒S基因表达的刺 突蛋白(spike protein)序列的第614位的突变，氨基酸突变类型为D614G，即第 614位氨基酸由天冬氨酸(D)变成了甘氨酸(G)。

在另一优选例中，所述靶标核酸分子还包括在核苷酸水平，SARS-CoV-2病毒 的第23,403位核苷酸从A突变为G的突变型。

在另一优选例中，所述靶标核酸分子还包括在核苷酸水平，SARS-CoV-2病毒 的T8782C,G11083T,G26144T,C28144T的突变型。

在另一优选例中，所述方法用于检测靶位点处的核酸是否在SNP、点突变、缺 失、和/或插入。

在另一优选例中，所述方法用于对病毒进行分型检测，即判断病毒是野生型 还是突变型。

在另一优选例中，当用于对病毒进行分型检测时，所述切割试剂还包括额外 的2个报告核酸分子(第二报告核酸分子和第三报告核酸分子)。

在另一优选例中，所述的第二报告核酸分子、第三报告核酸分子的长度各 自独立地为9-200nt，较佳地10-60nt，更佳地15-40nt。

在另一优选例中，所述第二报告核酸分子与野生型的病毒所产生的次级向导ssDNA的序列互补结合后，引导基因编辑酶Ago对第二报告核酸分子进行切割， 从而产生可检测的信号(如荧光)。

在另一优选例中，所述第三报告核酸分子与野生型的病毒所产生的次级向导ssDNA的序列不能互补结合，因此基因编辑酶Ago对第三报告核酸分子不进行 切割，从而不能产生可检测的信号(如荧光)。

在另一优选例中，所述第二报告核酸分子与突变型的病毒所产生的次级向导ssDNA的序列不能互补结合，因此基因编辑酶Ago对第二报告核酸分子不进行 切割，从而不能产生可检测的信号(如荧光)。

在另一优选例中，所述第三报告核酸分子与突变型的病毒所产生的次级向导ssDNA的序列互补结合后，引导基因编辑酶Ago对第二报告核酸分子进行切割， 从而产生可检测的信号(如荧光)。

在另一优选例中，在步骤(c)中所述荧光检测采用酶标仪或者荧光分光光度计 进行检测。

在另一优选例中，所述的检测体系中还含有缓冲液或缓冲剂。

在另一优选例中，所述的待检测的样本是用选自下组的引物进行扩增所获得 的待检测的样本。

在另一优选例中，所述的引物是选自下组的任一引物对：

在另一优选例中，所述的向导ssDNA选自下组：

其中P为寡核苷酸5'端磷酸化修饰。

在另一优选例中，所述的待检测的样本是用选自下组样本制备的核酸样本： 咽喉拭子、肺泡灌洗液、鼻拭子、尿液、粪便、体液、或其组合。

在另一优选例中，所述的方法是体外方法。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。

本发明第二方面提供了一种用于靶标核酸分子的检测试剂盒，所述试剂盒包 括：

(a)用于扩增靶标核酸分子的扩增试剂，所述扩增试剂包括：用于扩增靶标核 酸分子的引物对，所述引物对用于进行基于所述靶核酸分子的特异性扩增反应，从 而产生特异的核酸扩增产物；

(b)切割试剂或含所述切割试剂的切割缓冲液，其中所述的切割试剂包括：2 个向导ssDNA、基因编辑酶(Ago)、和第一报告核酸，所述第一报告核酸带有荧 光基团和淬灭基团，并且，所述的2个向导ssDNA之间彼此相邻。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二报告核酸、第三报告核酸。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：

(c)用于逆转录反应的逆转录试剂，所述的逆转录试剂包括：逆转录酶或具备 逆转录酶活性的Bst酶(或其突变体)。

在另一优选例中，所述试剂盒含有以下优选的试剂组合：

针对SARS-CoV-2ORF1a：

引物对1:SEQ ID No:1-6；

荧光报告核酸：SEQ ID No.59；

ssDNA：SEQ ID No:49和50；

针对SARS-CoV-2ORF1b基因：

引物对3:SEQ ID No:13-18；

荧光报告核酸：SEQ ID No.60；

ssDNA：SEQ ID No:51和52；

针对SARS-CoV-2N基因：

引物对5:SEQ ID No:25-30；

荧光报告核酸：SEQ ID No.62；

ssDNA：SEQ ID No:55和56；

针对RNase P内参基因：

引物对7:SEQ ID No:37-42；

荧光报告核酸：SEQ ID No.63和64；

ssDNA：SEQ ID No:57和58。

本发明第三方面提供了一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包 括：

(i)第一容器以及位于第一容器内的向导ssDNA，所述向导ssDNA为2个，并 且所述的2个向导ssDNA之间彼此相邻；

(ii)第二容器以及位于第二容器内的基因编辑酶(Ago)；

(iii)第三容器以及位于第三容器内的第一报告核酸，所述第一报告核酸带有 荧光基团和淬灭基团；

(iv)第四容器以及位于第四容器内的用于扩增靶标核酸分子的扩增试剂；和

(v)任选的第五容器以及位于第五容器内的缓冲液；

(vi)任选的PCR管和与PCR对应的内衬管；

其中，所述的靶标核酸分子包括单链DNA。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第六容器，以及位于第六容器的第二报 告核酸和第三报告核酸。

在另一优选例中，所述扩增试剂包括：用于扩增靶标核酸分子的引物对，所 述引物对用于进行基于所述靶核酸分子的特异性扩增反应，从而产生特异的核酸扩 增产物。

在另一优选例中，所述的位于第五容器内的缓冲液包括：用于扩增反应的缓 冲液和用于酶进行酶切的缓冲液。

在另一优选例中，所述用于扩增反应的缓冲液包括：Bst buffer(Tris-Hcl，EDTA，NaCl或KCl)、MgSO₄、dNTP、DNase/RNase free H₂O。

在另一优选例中，所述的用于酶进行酶切的缓冲液包括Bst buffer或Reactionbuffer(Tris-Hcl，EDTA，NaCl或KCl)、MnCl₂、DNase/RNase free H₂O。

在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器、第五 容器、第六容器中的任何二个、三个、四个或全部可以是相同或不同容器。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了改良内衬管和PCR管组合的侧视图，包括3D透视示意图，俯视 截面示意图，侧视截面图；1为PCR管体，2为内衬管管体，3为内衬管反应腔， 4为PCR管反应腔，5为温变相固体层；

图2显示了逆转录LAMP-RADAR偶联的“一管式”核酸快速检测示意图；

图3显示了逆转录LAMP-RADAR检测原理图；

图4显示了SARS-CoV-2病毒LAMP-RADAR检测灵敏度；

图5显示了部分SARS-CoV-2临床样品荧光实时检测示意图；

图6显示了SARS-CoV-2双重LAMP-RADAR特异性实验结果；

图7显示了SARS-CoV-2LAMP-RADAR分型检测原理示意图；

图8显示了SARS-CoV-2基因序列D614G突变位点。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种针对靶标核酸分子(比如 新冠病毒SARS-CoV-2的靶标核酸分子)的灵敏度高、操作简便、检测成本低、 耗时短、准确性高的核酸检测方法。本发明对靶标核酸分子进行逆转录环介导 等温扩增反应(逆转录LAMP)，然后利用Ago酶的特性，即在首次由2个邻近 且无间隔序列的初级向导ssDNA(guidessDNA)介导剪切后，在合适的反应温度 (如约90-98度)下，断裂的5'核酸片段可再次被Ago酶利用去剪切与之互补的 荧光报告核酸链，从而根据荧光来判断样本中是否含有靶标核酸分子。结果表 明，本发明方法可以对靶标核酸分子进行快速且高灵敏度、高准确度的检测， 从而为病原体检测、基因分型、病程监测等提供帮助。在此基础上完成了本发 明。

术语

术语“LAMP”是环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification), 是一种适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。

术语“PCR”是聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction)，是一种适用于靶标核酸扩增的技术。

如本文所用，术语“二次切割”指在本发明检测方法中，在初级向导ssDNAs 存在下，本发明Ago酶对目标核酸序列进行剪切，形成新的5'磷酸化的核酸序 列(次级向导ssDNAs)；然后，次级向导ssDNA继续在PfAgo酶的作用下，引 导PfAgo酶对与次级向导ssDNAs互补的荧光报告核酸进行剪切。这种先针对 目标核酸序列进行特异性切割(第一次切割)，后对荧光报告核酸进行特异性切 割(第二次切割)，被定义为“二次切割”。在本发明中，第一次切割和第二次切 割都是特异性切割。

Ago酶

在本发明和检测方法中，一个核心成分是基因编辑酶，例如Ago酶。

在本发明中，优选的Ago酶是PfAgo酶，其来自于古菌Pyrococcus furiosus， 基因长度2313bp，氨基酸序列由770个氨基酸组成。

PfAgo酶的酶切特性为：该酶可利用5'磷酸化的寡聚核苷酸作为向导 ssDNA指导该酶对目标核酸序列的精确剪切；剪切位点位于与向导ssDNA的 第10与11位核苷酸对应的目标核酸(ssDNA)之间的磷酸二酯键。

通常，PfAgo酶的优选工作温度为95±2度。

向导ssDNA

在本发明的检测方法中，一个核心成分是向导ssDNA，尤其是2个ssDNA， 并且彼此之间邻近，且彼此之间无间隔碱基或间隔序列。

在本发明中，优选的向导ssDNAs均为长度为10-60nt，较佳地，10-40nt， 更佳地，13-20nt的寡聚核苷酸，其5'第一个核苷酸均为胸腺嘧啶(T)，可被磷酸 化修饰。

报告核酸分子

在本发明的检测方法中，一个核心成分是携带报告分子的报告核酸。

在一优选实施方式中，本发明的报告核酸分子是分别携带荧光基团和淬灭 基团的核酸分子。例如，在5'端标记荧光基团(F)，3'端标记淬灭基团(Q)。

在本发明中，荧光报告核酸分子是根据次级向导ssDNAs的产生位置所决 定的；由初级向导ssDNAs对目标核酸序列进行剪切，形成新的5'磷酸化的核 酸序列，称之为次级向导ssDNAs，荧光报告核酸覆盖次级向导ssDNAs的所 有位置。

检测方法

在本发明还提供了基于基因编辑酶Ago，比如Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)的核酸检测方法。

在本发明方法中，基于PfAgo酶的剪切活性，可根据靶标核酸分子(比如单 链DNA，优选经扩增后的靶标核酸分子)设计出2个向导ssDNA，这2个向导 ssDNA彼此相邻，并且无间隔序列，向导ssDNA靶向于靶标核酸分子并介导 PfAgo酶对靶标核酸分子进行剪切以形成新的次级向导ssDNA。次级向导 ssDNA继续在PfAgo酶的作用下，引导PfAgo酶对与次级向导ssDNAs互补的 荧光报告核酸进行剪切，从而达到对靶标核酸分子的检测。本发明的方法可大 幅度提高靶标核酸检测的灵敏度和准确性。

在本发明中，根据向导ssDNAs的设计要求，可通过特殊设计使PfAgo酶 可以选择性地对存在部分位点存在差异的核酸序列进行选择性剪切，从而实现 分型检测。

在本发明中，当用于区分不同分型，在向导ssDNAs设计时，将不同分型 对应的突变位点置于向导ssDNAs的第10、11两位，由于pfAgo酶的选择特 异性，连续两点突变时可抑制剪切活性，从而达到了对不同分型的检测。

在本发明中，可以在PfAgo酶的剪切体系中同时加入多种靶标核酸分子和 向导ssDNAs，结合带有不同荧光基团的报告核酸，能达到对目的核酸的多重 检测。

本发明方法非常适合用于检测痕量核酸。通过结合逆转录LAMP以及具有 特定序列的向导ssDNA，本发明可以检测低浓度核酸模板(220copies/mL)的靶 标核酸分子。

在本发明中，所用于扩增反应的扩增引物，其Tm值通常65±10度左右， 扩增片段大小约为90-200bp。优选地，扩增引物设计时应避开待检测区段。

试剂盒

本发明还提供了一种用于靶标核酸分子的检测试剂盒。

在一优选实施方式中，本发明的试剂盒包括：(a)用于扩增靶标核酸分子的 扩增试剂，所述扩增试剂包括：用于扩增靶标核酸分子的引物对，所述引物对用于 进行基于所述靶核酸分子的特异性扩增反应，从而产生特异的核酸扩增产物；

(b)切割试剂或含所述切割试剂的切割缓冲液，其中所述的切割试剂包括：2 个向导ssDNA、基因编辑酶(Ago)、和第一报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧 光基团和淬灭基团，并且，所述的2个向导ssDNA之间彼此相邻。

在一优选实施方式中，本发明的试剂盒包括：

(i)第一容器以及位于第一容器内的向导ssDNA，所述向导ssDNA为2个，并 且所述的2个向导ssDNA之间无间隔序列；

(ii)第二容器以及位于第二容器内的基因编辑酶(Ago)；

(iii)第三容器以及位于第三容器内的第一报告核酸，所述第一报告核酸带有 荧光基团和淬灭基团；

(iv)第四容器以及位于第四容器内用于扩增靶标核酸分子的扩增试剂；和

(v)任选的第五容器以及位于第五容器内的缓冲液；

(vi)任选的第六容器以及位于第六容器内的第二报告核酸和第三报告核酸， 所述第二报告核酸、第三报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；

(vi)任选的PCR管和与PCR对应的内衬管(内衬管如图1-3所示)；

其中，所述的靶标核酸分子包括单链DNA。

应用

本发明特别适合检测微量靶标核酸分子，以及多重检测，具有广泛的应用性。

在本发明中，靶标核酸分子可以是DNA，也可以是RNA。当靶标核酸分子是 RNA时，可通过逆转录转变为cDNA再进行检测。

本发明在疾病监控方面，可对疾病做到预测、预防等积极主动管理，做到 早期发现早期治疗，或提早预测提早预防。由于本发明的检测灵敏度和准确性 非常高，适合进行早期诊断，对症下药，节省患者治疗时间，提高治疗成功率。 本发明减少高额医疗成本浪费，和争取治疗黄金时机。

在环境监控方面，本发明可便捷、快速的对环境污染物中的核酸分子进行 准确鉴定，提供有效的环境检测数据。

本发明的主要优点包括：

(1)检测谱系广泛：本发明具有广泛的核酸检测谱，可实现对病毒、细菌、遗 传病疾病基因的高效检测；

(2)灵敏度高：PfAgo特异性核酸级联反应体系，可在低浓度核酸模板(100copies/mL)下检测，具有稳定性、可靠性；

(3)时间短：45分钟内即可实现目标基因的检测；

(4)可靠性高：本发明避免了LAMP技术中环引物间的非特异性配对导致的假 阳性，提高检测准确性；

(5)POCT系统：新型冠状病毒等目标核酸的“一管式”一步操作检测，应用便携 式等温荧光系统，符合POCT理念；

(6)多重检测：本发明还可在单管反应体系中实现多重检测，显著降低体系复 杂性和使用成本。

(7)突变容错度高：可检测出扩增区域出现单碱基或双碱基突变的病毒。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条 件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

在本发明中，所有序列的编号均指具体的序列，其不带有任何修饰。

实施例1

检测试剂的制备和检测方法

在本实施例中，提供了本发明SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒的 及其使用方法。

1.1检测试剂和试剂盒

在本实施例中，以检测SARS-CoV-2病毒的ORF1b基因为例，相应的特异性 目标核酸序列为：

5'-ATGCACTTTTCGCATATACAAAACGTAATGTCATCCCTACTATAACTCAA ATGAATCTTAAGTATGCCATTAGTGCAAAGAATAGAGCTCGCACCGTAGCTGGT GTCTCTATCTGTAGTACTATGACCAATAGACAGTTTCATCAAAAATTATTGAAAT CAATAGCCGCCACTAGAGGAGCTACTGTAGTAATTGGAACAAGCAAATTCTATGGTGGTTGGCACAACATGTTAAAAACTGTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTCACC TTATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGATAGAGCCATGCCTAACATGCTTAGAA TTATGGCCTCACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACA CCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCAT GTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCAC AACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAAGCTGTCACGGCCAATGTT AATGCACTTTTATCTACTGATGGTAACAAAATTGCCGATAAGTATGTCCGCAAT TTACAACACAGACTTTATGAGTGTCTCTATAGAAATAGAGATGTTGACACAGAC TTTGTGAATGAGTTTTACGCATATTTGCGTAAACATTTCTCAATGATGATACTCT CTGACGATGCTGTTGTGTGTTTCAATAGCACTTATGCATCTCAAGGTCTAGTGGC TAGCATAAAGAACTTTAAGTCAGTTCTTTATTATCAAAACAATGTTTTTATGTCTGAAGCAAAATGTTGGACTGAGACTGACCTTACTAAAGGACCTCATGAATTTTGC TCTCAACATACAATGCTAGTTAAACAGGGTGATGATTATGTGTACCTTCCTTACC CAGATCCATCAAGAATCCTAGGGGCCGGCTGTTTTGTAGATGATATCGTAAAAA CAGATGGTACACTTATGATTGAACG-3'，SEQ ID NO.：65。

基于本发明方法，相应的检测试剂包括：

(1)、扩增引物，具体序列如下：

(2)、特异性guide ssDNA(gDNA)，具体序列如下：

2019-nCoV ORF 1b-gDNA 1	5'-P-TTGATGAGGTTCCACC-3'	SEQ ID NO.51
			2019-nCoV ORF 1b-gDNA 4	5'-P-TCAGTTGTGGCATCTC-3'	SEQ ID NO.52

(3)、与特异性guide ssDNA(gDNA)相应的荧光报告核酸，具体序列如下：

(4)、LAMP扩增缓冲液：Bst buffer(Tris-Hcl，EDTA，NaCl或KCl)，MgSO₄， dNTP,DNase/RNase free H₂O。

(5)、Ago酶切缓冲液：Bst buffer或Reaction buffer(Tris-Hcl，EDTA，NaCl或KCl)，MnCl₂，DNase/RNase free H₂O。

(6)、扩增酶：Bst聚合酶、反转录酶。

(7)、切割酶：PfAgo。

(7)、PCR管和与PCR管对应的内衬管。

1.2检测方法

本发明SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒的检测方法具体操作步骤 如下：

(1)、所述的扩增引物、gDNA干粉用DNase/RNase free H₂O溶解制成100uM 的储存液；所述的荧光报告核酸干粉用DNase/RNase free H₂O溶解制成10uM的储 存液；

(2)、用Bst酶、Ago酶切缓冲液扩增引物配制成25ul扩增反应预混液；

(3)、将15ul待检核酸样品加入扩增反应预混液，扩增反应体系为40ul；

(4)、用PfAgo、LAMP扩增缓冲液、gDNA、荧光报告核酸配制成20ul酶切反 应体系；

(5)、分别将扩增体系和酶切体系转移至PCR管和内衬管中，放入荧光定量PCR 仪中进行反应(62℃扩增30min，95℃酶切30min，每分钟检测一次信号)。

实施例2

检测试剂的制备和检测方法(不使用内衬管)

在本实施例中，提供了本发明SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒的 及其使用方法。

1.1检测试剂和试剂盒

在本实施例中，以检测SARS-CoV-2病毒的ORF1b基因为例，相应的特异性 目标核酸序列参照实施例1。

基于本发明方法，相应的检测试剂包括：

(1)、扩增引物，具体序列如下：

(2)、特异性guide ssDNA(gDNA)，具体序列如下：

2019-nCoV ORF 1b-gDNA 1	5'-P-TTGATGAGGTTCCACC-3'	SEQ ID NO.51
			2019-nCoV ORF 1b-gDNA 4	5'-P-TCAGTTGTGGCATCTC-3'	SEQ ID NO.52

(3)、与特异性guide ssDNA(gDNA)相应的荧光报告核酸，具体序列如下：

(4)、LAMP扩增缓冲液：Bst buffer(Tris-Hcl，EDTA，NaCl或KCl)，MgSO₄， dNTP,DNase/RNase free H₂O。

(5)、Ago酶切缓冲液：Bst buffer或Reaction buffer(Tris-Hcl，EDTA，NaCl 或KCl)，MnCl₂，DNase/RNase free H₂O。

(6)、扩增酶：Bst聚合酶、反转录酶。

(7)、切割酶：PfAgo。

(8)、PCR管。

1.2检测方法

本发明SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒的检测方法具体操作步骤 如下：

(1)、所述的扩增引物、gDNA干粉用DNase/RNase free H₂O溶解制成100uM 的储存液；所述的荧光报告核酸干粉用DNase/RNase free H₂O溶解制成10uM的储 存液；

(2)、用Bst酶、Ago酶切缓冲液扩增引物配制成25ul扩增反应预混液；

(3)、将15ul待检核酸样品加入扩增反应预混液，扩增反应体系为40ul；

(4)、将扩增体系放入荧光定量PCR仪中进行反应，62℃扩增30min；

(5)、用PfAgo、LAMP扩增缓冲液、gDNA、荧光报告核酸配制成20ul酶切反 应体系，将酶切反应体系加入到反应完成的扩增体系中，再放入荧光定量PCR仪 中，95℃酶切30min，每分钟检测一次信号。

实施例3

针对不同浓度的待检标准品进行检测

按3倍倍比稀释的原则对待检标准品(SEQ ID NO.：65)进行稀释，分别稀释成18000copies/mL，6000copies/mL，2000copies/mL，670copies/mL，220copies/mL，70copies/mL的标准品稀释液，分别吸取140ul标准品稀释液进行核酸提取(QIAamp ViralRNA Mini Kit)。将15ul核酸提取样品、阴性对照(H2O)和阳性对照(目标片段 质粒)加入到实施例2中的扩增体系中，每个浓度梯度分别做3组，每组做7个重 复，计算每组的检出率，实验按实施例3步骤进行操作。

结果如图4所示，18000copies/mL，6000copies/mL，2000copies/mL， 670copies/mL均稳定检出，阴性对照和阳性对照成立。

结果表明，本发明SARS-CoV-2病毒最低检测限可达670copies/mL。

实施例4

临床样品的双重检测

使用6个经2种荧光RT-PCR方法确诊的临床样品。

需要说明的是，RNase P内参基因是作为内部质控的人类基因组的部分基因。

双重反应体系的配置：向实施例2中的扩增体系中加入RNase P内参基因扩增 引物(引物对7)，向酶切体系中加入RNase P gDNA(SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58) 和RNaseP荧光报告核酸(SEQ ID NO.64)，反应条件参照实施例2。

结果如图5所示，当检测目标核酸为ORF1b基因和RNase P基因时，FAM和 VIC同时产生荧光信号。结果表明本发明的方法可用于单管双重检测。

实施例5

特异性检测

以21种常见呼吸道病原体全长核酸样品、人类基因组全长核酸样品和 SARS-CoV-2全长核酸样品为待检核酸样品，参照实施例4进行体系配置和扩增、 酶切反应。

结果如图6所示，21种常见呼吸道病原体全长核酸样品均未产生信号，人类 基因组全长核酸样品产生VIC信号，SARS-CoV-2全长核酸样品产生FAM信号。 结果表明本发明的方法特异性良好。

实施例6

突变毒株的分型检测

新冠病例现D614G突变，感染力或增强近10倍，如图8所示，D614A>G即 A变G。

该突变毒株具有较强的致病性，不排除有爆发可能性，对此，本发明设计分 型检测。因为常规RT-PCR，ddPCR，做单碱基分型比较困难，荧光PCR通过MGB 探针可能也能实现区分，需通过复杂的探针设计，验证等。本发明可灵活设计对已 知突变进行区分检测，具体原理如图7所示。

结合本发明的技术(LAMP-RADAR)对SARS-CoV-2病毒D614G突变与 SARS-CoV-2病毒核酸序列进行区分检测，具体设计如下：

在原有设计(双guide DNA)基础上，另外设计两个Reporter。一组gDNA保留 对原SARS-CoV-2检测位点的设计，另两个Reporter相对于二级gDNA的10或11 位引入一个或连续两个mismatch，这样保障二级gDNA相对与新设计的Reporter 至少有一个mismatch。Reporter详细设计如下(Reporter以FAM探针和VIC探针 为例)：设计D614(野生型)次级gDNA与FAM探针只有一个mismatch，与VIC 探针有连续2点mismatch，从而在D614(野生型)次级gDNA介导下，PfAgo只 切FAM探针，不切VIC探针；而G614(突变型)次级gDNA与FAM探针有连 续2点mismatch，与VIC探针只有一个mismatch，从而在G614(突变型)次级 gDNA介导下，PfAgo只切VIC探针，不切FAM探针。基于以上设计，根据 两个Reporter的荧光信号产生情况，来判断D614型和G614型，达到对D614G 的分型检测。

合成reporter对应序列设计如下：

D614-FAM-11G：5'FAM-CTGTGCAGTTAACGTCCTGATAAAGAACAG(SEQ ID NO.66)-BHQ13'

D614-FAM-11C:5'FAM-CTGTGCAGTTAACCTCCTGATAAAGAACAG(SEQ ID NO.67)-BHQ13'

D614-FAM-11T:5'FAM-CTGTGCAGTTAACTTCCTGATAAAGAACAG(SEQ ID NO.68)-BHQ13'

G614-VIC-11T:5'VIC-CTGTGCAGTTAACTCCCTGATAAAGAACAG(SEQ ID NO.69)-BHQ13'

G614-VIC-11G:5'VIC-CTGTGCAGTTAACGCCCTGATAAAGAACAG(SEQ ID NO.70)-BHQ13'

G614-VIC-11C:5'VIC-CTGTGCAGTTAACCCCCTGATAAAGAACAG(SEQ ID NO.71)-BHQ13'

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法

<130> P2020-0673

<160> 71

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atcagtacta gtgcctgtg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

tgttgtctgt actgccgt 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

tagttgtgat caactccgcg aatgcactta caccgcaaac 40

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

agcacaagtt gtaggtattt gtacatgcca catagatcat ccaaat 46

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

cagctgatgc acaatcgttt tta 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

ccttttaagt cacaaaatcc tttag 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gaatttagca aaaccagcta ct 22

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

gtgttgtctg tactgccg 18

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

cgtttttaaa cgggtttgcg gtatacgaca tcagtactag tgc 43

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

tgtaaaaccc acagggtcat tagcccaaat cctaaaggat tttgtg 46

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

tgcagcccgt cttacacc 18

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

caagttgtag gtatttgtac atact 25

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

tgttcttgct cgcaaaca 18

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

gtgttgtaaa ttgcggacat 20

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

acacatgacc atttcactca atactagctt gtcacaccgt ttc 43

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

catttgtcaa gctgtcacgg cgcaattttg ttaccatcag tag 43

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

acactcatta gctaatc 17

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

caatgttaat gcactttt 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

cgcaaacata caacgtgttg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

gtgttgtaaa ttgcggacat 20

<210> 21

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

acacatgacc atttcactca atactgcttg tcacaccgtt tct 43

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

catttgtcaa gctgtcacgg cggcaatttt gttaccatca gt 42

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

cacactcatt agctaatcta t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

caatgttaat gcacttttat c 21

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

tctgccgaaa gcttgtgtt 19

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

cgtagtcgca acagttcaag 20

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

gccaacaaca acaaggccaa actcagtacg tttttgccga gg 42

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

gcatcaccgc cattgccagc caactccagg cagcagtag 39

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

gctgctgagg cttctaagaa g 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

attctagcag gagaagttcc c 21

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

tctgccgaaa gcttgtgtt 19

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

cagtcaagcc tcttctcgt 19

<210> 33

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 33

ccaacaacaa caaggccaaa ctggcagtac gtttttgccg ag 42

<210> 34

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

accgccattg ccagccattc taacgtagtc gcaacagttc a 41

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

tgctgctgag gcttctaaga a 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

gttcccctac tgctgcctgg a 21

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

ttgatgagct ggagcca 17

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

caccctcaat gcagagtc 18

<210> 39

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

gtgtgaccct gaagactcgg ttttagccac tgactcggat c 41

<210> 40

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

cctccgtgat atggctcttc gtttttttct tacatggctc tggtc 45

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

atgtggatgg ctgagttgtt 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 42

catgctgagt actggacctc 20

<210> 43

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 43

ggagccagag accgaca 17

<210> 44

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 44

ctcaggaagg cccacta 17

<210> 45

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 45

ttacttgggt gtgaccctga agacacggga gccactgact 40

<210> 46

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 46

aagaaaaggc ctgttccctg gaaggccacc aagagacaat 40

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 47

tggatggctg agttgttgcg 20

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 48

gcccaaagga ctctgcattg a 21

<210> 49

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 49

tgtatgtgga aaggtt 16

<210> 50

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 50

tgtctgtacc gtctgc 16

<210> 51

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 51

ttgatgaggt tccacc 16

<210> 52

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 52

tcagttgtgg catctc 16

<210> 53

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 53

taggtggaac ctcatc 16

<210> 54

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 54

tggagatgcc acaact 16

<210> 55

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 55

tcttgacaga ttgaac 16

<210> 56

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 56

tcttgctttg ctgctg 16

<210> 57

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 57

tactcagcat gcgaag 16

<210> 58

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 58

tgccatatca cggagg 16

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 59

agtctgtacc gtctgcggta tgtggaaagg 30

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 60

cagttgtggc atctcctgat gaggttccac 30

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 61

gtggaacctc atcaggagat gccacaactg 30

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 62

ctcttgcttt gctgctgctt gacagattga 30

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 63

ctcagcatgc gaagagccat atcacggagg 30

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 64

ctcagcatgc gaagagccat atcacggagg 30

<210> 65

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 65

atgcactttt cgcatataca aaacgtaatg tcatccctac tataactcaa atgaatctta 60

agtatgccat tagtgcaaag aatagagctc gcaccgtagc tggtgtctct atctgtagta 120

ctatgaccaa tagacagttt catcaaaaat tattgaaatc aatagccgcc actagaggag 180

ctactgtagt aattggaaca agcaaattct atggtggttg gcacaacatg ttaaaaactg 240

tttatagtga tgtagaaaac cctcacctta tgggttggga ttatcctaaa tgtgatagag 300

ccatgcctaa catgcttaga attatggcct cacttgttct tgctcgcaaa catacaacgt 360

gttgtagctt gtcacaccgt ttctatagat tagctaatga gtgtgctcaa gtattgagtg 420

aaatggtcat gtgtggcggt tcactatatg ttaaaccagg tggaacctca tcaggagatg 480

ccacaactgc ttatgctaat agtgttttta acatttgtca agctgtcacg gccaatgtta 540

atgcactttt atctactgat ggtaacaaaa ttgccgataa gtatgtccgc aatttacaac 600

acagacttta tgagtgtctc tatagaaata gagatgttga cacagacttt gtgaatgagt 660

tttacgcata tttgcgtaaa catttctcaa tgatgatact ctctgacgat gctgttgtgt 720

gtttcaatag cacttatgca tctcaaggtc tagtggctag cataaagaac tttaagtcag 780

ttctttatta tcaaaacaat gtttttatgt ctgaagcaaa atgttggact gagactgacc 840

ttactaaagg acctcatgaa ttttgctctc aacatacaat gctagttaaa cagggtgatg 900

attatgtgta ccttccttac ccagatccat caagaatcct aggggccggc tgttttgtag 960

atgatatcgt aaaaacagat ggtacactta tgattgaacg 1000

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 66

ctgtgcagtt aacgtcctga taaagaacag 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 67

ctgtgcagtt aacctcctga taaagaacag 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 68

ctgtgcagtt aacttcctga taaagaacag 30

<210> 69

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 69

ctgtgcagtt aactccctga taaagaacag 30

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 70

ctgtgcagtt aacgccctga taaagaacag 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 71

ctgtgcagtt aaccccctga taaagaacag 30

Claims (10)

1.一种靶标核酸分子的检测方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一含靶标核酸分子的待检测的样本，所述靶标核酸分子包括单链DNA；

(b)将所述待检测的样本与切割试剂或含所述切割试剂的切割缓冲液进行混合，从而形成一检测体系，其中，所述的切割试剂包括：2个向导ssDNA、基因编辑酶(Ago)、和第一报告核酸分子，所述第一报告核酸分子带有荧光基团和淬灭基团，并且，所述的2个向导ssDNA之间彼此相邻；和

(c)对所述检测体系进行荧光检测，从而获得荧光信号值，其中，所述检测体系中检测到荧光信号值，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；而所述检测体系中没有检测到荧光信号值，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待检测的样本包括未经扩增的样本以及经过扩增(或核酸扩增)的样本。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各向导ssDNA中的5'端的第一位核苷酸为T。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述向导ssDNA的长度各自独立地为10-60nt，较佳地，10-40nt，更佳地，13-20nt。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述向导ssDNA为磷酸化的单链DNA分子。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑酶Ago选自下组：PfAgo(Pyrococcus furiosus Ago)、MfAgo(Methanocaldococcus fervens Ago)、TcAgo(Thermogladius calderae Ago)、TfAgo(Thermus filiformis Ago)、AaAgo(Aquifexaeolicus Ago)、TpAgo(Thermus parvatiensis Ago)、或其组合。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一报告核酸分子的长度为9-100nt，较佳地10-60nt，更佳地15-40nt。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶标核酸分子选自下组：病原微生物的核酸分子、基因突变的核酸分子、和特异靶标核酸分子。

9.一种用于靶标核酸分子的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a)用于扩增靶标核酸分子的扩增试剂，所述扩增试剂包括：用于扩增靶标核酸分子的引物对，所述引物对用于进行基于所述靶核酸分子的特异性扩增反应，从而产生特异的核酸扩增产物；

(b)切割试剂或含所述切割试剂的切割缓冲液，其中所述的切割试剂包括：2个向导ssDNA、基因编辑酶(Ago)、和第一报告核酸，所述第一报告核酸带有荧光基团和淬灭基团，并且，所述的2个向导ssDNA之间彼此相邻。

10.一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(i)第一容器以及位于第一容器内的向导ssDNA，所述向导ssDNA为2个，并且所述的2个向导ssDNA之间彼此相邻；

(ii)第二容器以及位于第二容器内的基因编辑酶(Ago)；

(iii)第三容器以及位于第三容器内的第一报告核酸，所述第一报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；

(iv)第四容器以及位于第四容器内的用于扩增靶标核酸分子的扩增试剂；和

(v)任选的第五容器以及位于第五容器内的缓冲液；

(vi)任选的PCR管和与PCR对应的内衬管；

其中，所述的靶标核酸分子包括单链DNA。

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