CN113201578A

CN113201578A - 一种新型高温Argonaute蛋白TpsAgo表征及应用

Info

Publication number: CN113201578A
Application number: CN202110474666.0A
Authority: CN
Inventors: 冯雁; 孙莹璎; 郭翔; 叶星宇; 李忠磊
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-04-29
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2041-04-29
Also published as: CN113201578B; WO2022228351A1

Abstract

本发明提供了一种新型高温Argonaute蛋白的表征及应用。具体地，本发明提供了一种核酸切割体系，其特征在于，所述核酸切割体系包括：(a)向导DNA(gDNA)；(b)可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)；和(c)任选的报告核酸，其中若所述报告核酸被剪切，所述的剪切是可以被检测出的。并且，本发明还提供了基于本发明的可编程核酸内切酶TpsAgo的一种富集和检测低丰度目标核酸的体系和方法。本发明所提供的检测体系和方法能够特异性地针对低丰度的核酸进行有效富集和高效检测，并且本发明的可编程核酸内切酶TpsAgo具有强大的基因操作潜力。

Description

一种新型高温Argonaute蛋白TpsAgo表征及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型高温Argonaute蛋白TpsAgo表征及应用。

背景技术

Argonaute(Ago)蛋白最早在一项描述拟南芥的突变体的研究中被提及。Ago蛋白是真核RNA干扰(RNAi)途径的关键参与者，可以在转录后调节基因表达，从而防御宿主入侵的RNA病毒并保护基因组完整性。目前已报道的Ago蛋白主要分为真核Ago(eAgo)和原核Ago(pAgo)两类。

原核Ago可以结合单链的guide DNA或RNA，催化与guide互补配对的靶标DNA或RNA的剪切。与CRISPR/Cas系统不同，原核Ago在对靶标核酸链进行剪切时，不需要PAM序列，它可以结合与靶标核酸互补的guide DNA或RNA，在靶标的任意互补对应的位置进行剪切。

来源于古菌的高温Ago蛋白可在70℃以上发挥剪切活性，目前已表征的高温Ago一般可以在高温条件下，结合单链guide DNA或RNA，剪切靶标单链DNA，少数也可以剪切靶标单链RNA。

近年来“液体活检”的概念正在兴起，其基本思想为运用血液等体液样本替代肿瘤组织样本行病理学、分子生物学的检测，通过检测患者体液样本(主要是血液)中的肿瘤循环DNA来获取肿瘤基因突变信息已经成为一种趋势。循环肿瘤DNA虽然是一种很好的肿瘤组织替代样本，但是，由于循环肿瘤DNA含量稀少，检测循环肿瘤DNA需要极灵敏的技术。目前的检测技术主要依赖于二代测序及数字PCR技术，但是他们均在灵敏度、运行成本方面具有一定局限性。

因此，本领域迫切需要开发一种高特异性、高灵敏度的低丰度突变DNA的富集及检测方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高特异性、高灵敏度的低丰度突变DNA的富集及检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种核酸切割体系，所述核酸切割体系包括：

(a)向导DNA(gDNA)；

(b)可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)；和

(c)任选的报告核酸，其中若所述报告核酸被剪切，所述的剪切是可以被检测出的。

在另一优选例中，所述核酸切割体系的温度为65-90℃，较佳地为70-85℃，更佳地为75-85℃。

在另一优选例中，所述的可编程核酸内切酶Argonaute选自下组：TtAgo、TpsAgo、SeAgo、RsAgo、KpAgo、hAgo1、hAgo2、MpAgo、TpAgo、PfAgo、MjAgo、MfAgo、NgAgo、LrAgo、AaAgo、CbAgo、CpAgo、IbAgo、KmAgo。

在另一优选例中，所述的可编程核酸内切酶Argonaute来源于嗜热菌(Thermusparvatiensis)，所述的可编程核酸内切酶Argonaute是可编程核酸内切酶TpsAgo。

在另一优选例中，所述的TpsAgo包括野生型和突变型的TpsAgo。

在另一优选例中，所述野生型的可编程核酸内切酶TpsAgo的氨基酸序列如NCBI序列号WP_060384876.1所示。

在另一优选例中，所述的向导DNA的5’端具有选自下组的修饰：5’-P、5’-OH、5’-Biotin、5’-NH₂C₆、5’-FAM，或5’-SHC₆。

在另一优选例中，所述的向导DNA是5’端磷酸化或5’端羟基化的单链DNA分子。

在另一优选例中，所述的向导DNA是5’端磷酸化的单链DNA分子。

在另一优选例中，所述的向导DNA与所述报告核酸之间具有反向互补的片段。

在另一优选例中，所述的向导DNA的长度为5-30nt，较佳地10-24nt，更佳地为16-24nt，更佳地为16-21nt。

在另一优选例中，所述向导DNA是5’端磷酸化的单链DNA分子，其长度为16nt-21nt。

在另一优选例中，所述向导DNA是5’端羟基化的单链DNA分子，其长度为16nt-24nt。

在另一优选例中，所述向导DNA的5’端第一个核苷酸为磷酸化修饰的胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)。

在另一优选例中，所述的报告核酸是单链核酸，包括单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)。

在另一优选例中，当所述的向导DNA是5’端磷酸化的单链DNA分子时，所述的报告核酸是单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)。

在另一优选例中，当所述的向导DNA是5’端羟基化的单链DNA分子时，所述的报告核酸是单链DNA。

在另一优选例中，当所述报告核酸被剪切，所述的剪切能够通过电泳法被检测出。

在另一优选例中，所述的电泳法是用16％的核酸Urea-PAG电泳检测法。

在另一优选例中，所述的报告核酸的长度为10-100nt，较佳地20-70nt，更佳地30-60nt，更佳地40-50nt，最佳地45nt。

在另一优选例中，所述报告核酸是荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和/或淬灭基团。

在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述荧光报告核酸的5’端、3’端。

在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团分别位于所述荧光报告核酸与所述向导DNA的互补区域的两侧。

在另一优选例中，所述荧光基团包括：FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、TET、5-TAMRA、ROX、Texas Red-X，或其组合。

在另一优选例中，所述猝灭基团包括：BHQ、TAMRA、DABCYL、DDQ，或其组合。

在另一优选例中，所述的荧光报告核酸是仅具有荧光基团的单链DNA分子，所述的荧光基团是FAM。

在另一优选例中，所述的核酸切割体系还：(d)二价金属离子。

在另一优选例中，所述的二价金属离子为Mn²⁺或Co²⁺，优选地为Mn²⁺。

在另一优选例中，所述核酸切割体系中，二价金属离子的浓度为80μM-3mM，较佳地100μM-2mM，更佳地250μM-2mM。

在另一优选例中，所述的核酸切割体系还包括：(e)缓冲液。

在另一优选例中，所述缓冲液中，NaCl的浓度为0-4800mM，较佳地为40-1600mM，更佳地为80-800mM，更佳地为80-400mM。

在另一优选例中，所述缓冲液的pH值为7-9，较佳地为8.0。

在另一优选例中，当在所述gDNA与报告核酸的反向互补区域中，从5’端起第2、3、4、6、8、10、11、13、14或16位(较佳地为第2、4、10、11、13或14位，更佳地为第2、10或13位)中的任一个的碱基存在与所述报告核酸的错配时，会显著降低所述可编程核酸内切酶Argonaute的剪切率。

在另一优选例中，所述的显著降低所述可编程核酸内切酶Argonaute的剪切率是指：相同反应条件下，所述可编程核酸内切酶Argonaute的剪切率降低≥80％，较佳地降低≥85％，更佳地降低≥90％。

在另一优选例中，所述的向导DNA与所述的荧光报告核酸的序列互补结合后，引导所述TeAgo酶对所述荧光报告核酸进行切割，从而产生可检测的信号(如荧光)。

在另一优选例中，所述的核酸切割体系中，所述报告核酸的浓度为0.4μM-4μM，较佳地0.6μM-2μM，更佳地0.8μM-1μM，最佳地为0.8μM。

在另一优选例中，所述的核酸切割体系中，所述可编程核酸内切酶Ago的浓度为10nM-10μM，较佳地50nM-1μM，更佳地100nM-500nM，最佳地为200nM。

在另一优选例中，所述的核酸切割体系中，所述向导DNA的浓度为10nM-10μM，较佳地100nM-3μM，更佳地1μM-2.5μM，最佳地为2μM。

在另一优选例中，所述的报告核酸是质粒DNA，并且所述的向导DNA(gDNA)包括正向gDNA和反向gDNA；

其中，所述的正向gDNA与所述质粒DNA的一条链可形成第一反向互补区，所述反向gDNA与所述质粒DNA的另一条链可形成第二反向互补区。

在另一优选例中，在所述质粒DNA中，所述第一反向互补区与所述第二反向互补区的距离为≤200bp，较佳地为≤50bp，更佳地为≤1bp。

在另一优选例中，所述的质粒DNA为质粒pUC19。

在另一优选例中，所述的质粒DNA是超螺旋状态的。

在另一优选例中，所述的质粒DNA是超螺旋状态的，并且所述质粒DNA的GC含量(剪切位点附近80bp的GC含量)为20％-35％，较佳地25％-32％，更佳地为29％。

在另一优选例中，所述的质粒DNA是超螺旋状态的，并且所述质粒DNA的GC含量(剪切位点附近80bp的GC含量)为55％-75％，较佳地62％-68％，更佳地为65％。

在本发明的第二方面，提供了一种富集低丰度目标核酸的反应体系，所述反应体系用于对一核酸样本同时进行依赖解旋酶等温扩增技术(Helicase-dependentisothermal DNA amplification)和核酸切割反应，从而获得扩增-切割反应产物；

其中，所述的核酸样本含有第一核酸和第二核酸，其中，所述的第一核酸为所述目标核酸，而所述的第二核酸为非目标核酸；

所述的核酸切割反应用于特异性切割非目标核酸，但不切割所述目的核酸；

所述的扩增-切割反应体系含有(i)进行等温扩增反应所需的试剂和(ii)如本发明第一方面所述的核酸切割体系。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)的浓度为20-200nM，较佳地为30-150nM，更佳地为40-100nM，最佳地为50nM。

在另一优选例中，所述的进行等温扩增反应所需的试剂包括tHDA试剂盒(购自NewEngland Biolabs公司)。

在另一优选例中，所述的进行等温扩增反应所需的试剂还包括目标核酸的扩增引物对。

在另一优选例中，所述的目标核酸的扩增引物对中的各引物的浓度为10-300nM，较佳地为50-200nM，更佳地为100nM。

在另一优选例中，所述目标核酸的浓度为0.1-100nM，较佳地为0.5-50nM，更佳地为1nM。

在另一优选例中，所述gDNA包括正向gDNA和反向gDNA；

其中，所述正向gDNA是指与目标核酸具有相同序列片段的gDNA，所述反向gDNA是指与目标核酸具有反向互补序列片段的gDNA。

在另一优选例中，所述反应体系中还包括：二价金属离子。

在另一优选例中，所述的二价金属离子为Mn²⁺。

在另一优选例中，所述反应体系中，二价金属离子的浓度为50μM-2000μM，较佳地100μM-1000μM，更佳地为250μM。

在另一优选例中，所述反应体系的反应温度(反应程序)为：65℃，1.5-2h。

在另一优选例中，所述的目标核酸选自下组：野生型EGFR序列片段、EGFR L861Q突变型序列片段。

在另一优选例中，所述的野生型EGFR序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在另一优选例中，所述EGFR L861Q突变型序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述的正向gDNA和反向gDNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和8所示。

在另一优选例中，所述EGFR L861Q突变型序列片段的扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和10所示。

在本发明的第三方面，提供了一种富集低丰度目标核酸的方法，包括步骤：

(a)提供一核酸样本，所述的核酸样本含有第一核酸和第二核酸，其中，所述的第一核酸为所述目标核酸，而所述的第二核酸为非目标核酸，

并且，所述目标核酸在所述的核酸样本中的丰度为F1a；

(b)对所述核酸样本中的核酸为模板，在扩增-切割反应体系中进行等温扩增和核酸切割反应，从而获得扩增-切割反应产物；

其中，所述的核酸切割反应用于特异性切割非目标核酸，但不切割所述目的核酸；

并且，所述的扩增-切割反应体系含有(i)进行等温扩增反应所需的试剂和(ii)如本发明第一方面所述的核酸切割体系；

其中，所述目标核酸在所述的扩增-切割反应产物中的丰度为F1b，

其中，F1b/F1a的比值≥5(较佳地为≥10)。

在另一优选例中，所述的目标核酸和非目标核酸仅相差一个碱基。

在另一优选例中，当1％≤F1a≤10％时，F1b/F1a的比值≥10，当0.1％≤F1a≤0.5％时，F1b/F1a的比值≥100，当F1a≤0.1％时，F1b/F1a的比值≥200。

在另一优选例中，所述的核酸样本包括直接加热裂解的核酸样本、直接裂解酶蛋白酶处理的核酸样本、经过抽提的核酸样本、经PCR预扩增的核酸样本或任意含核酸的样品。

在另一优选例中，所述的目标核酸为含突变的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的突变选自下组：核苷酸的插入、缺失、取代、或其组合。

在另一优选例中，所述的非目标核酸(或第二核酸)为野生型核苷酸序列、高丰度的核苷酸序列、或其组合。

在另一优选例中，所述的非目标核酸在所述的核酸样本中的丰度为F2a。

在另一优选例中，F1a+F2a＝100％。

在另一优选例中，所述的F2a/F1a的比值≥20，较佳地≥50，更佳地≥100，最佳地≥1000或≥5000。

在另一优选例中，所述的非目标核酸在所述的扩增-切割反应产物中的丰度为F2b。

在另一优选例中，F1b+F2b＝100％。

在另一优选例中，所述的F1b/F2b≥0.5，较佳地≥1，更佳地≥2，最佳地≥3或≥5。

在另一优选例中，所述的F1b/F1a的比值≥200，较佳地≥500，更佳地≥1000，最佳地≥2000或≥5000或更高。

在另一优选例中，F1a≤0.5％，较佳地≤0.2％，更佳地≤0.1％，最佳地≤0.01％。

在另一优选例中，F1b≥10％，较佳地≥30％，更佳地≥50％，最佳地≤70％。

在另一优选例中，所述的“进行等温扩增反应所需的试剂”包括：解旋酶、DNA聚合酶。

在另一优选例中，所述的“进行等温扩增反应所需的试剂”还包括：dNTP、Mg²⁺、等温扩增缓冲液。

在另一优选例中，所述核酸切割体系中的gDNA与目标核酸(即第一核酸)的靶定区域的核酸序列形成第一互补结合区；并且所述核酸切割体系中的gDNA还与非目标核酸(即第二核酸)的靶定区域的核酸序列形成第二互补结合区。

在另一优选例中，在第一互补结合区中含有至少2个不匹配的碱基对。

在另一优选例中，在第二互补结合区中含有0或1个不匹配的碱基对。

在另一优选例中，在第二互补结合区中含有1个不匹配的碱基对。

在另一优选例中，在第一互补结合区中含有至少2个不匹配的碱基对，从而导致所述复合物不切割所述目标核酸；而在第二互补结合区中含有1个不匹配的碱基对，从而导致所述复合物切割所述非目标核酸。

在另一优选例中，目标核酸(即第一核酸)的靶定区域与非目标核酸(即第二核酸)的靶定区域是相对应的。

在另一优选例中，在扩增-切割反应体系中，作为模板的核酸的数量为0.1-100nM。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(c)对所述扩增-切割反应产物进行检测，从而测定所述目标核酸的存在与否和/或数量。

在另一优选例中，步骤(c)中的检测包括定量检测、定性检测、或其组合。

在另一优选例中，所述的定量检测选自下组：TaqMan荧光定量PCR、桑格测序、q-PCR、ddPCR、化学发光法、高分辨率熔解曲线法、NGS等；优选地为选自TaqMan荧光定量PCR、桑格测序。

在另一优选例中，所述的第一核酸包括n种不同的核酸序列，其中n为≥1的正整数。

在另一优选例中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更大。

在另一优选例中，n为2-1000，较佳地3-100，更佳地3-50。

在另一优选例中，所述方法是非诊断性和非治疗性的。

在另一优选例中，所述的核酸样本包括来自试样的核酸，其中所述试样选自下组：血液、细胞、血清、唾液、体液、血浆、尿液、前列腺液、支气管灌洗液、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、腹腔液及粪便等或其组合。

在另一优选例中，所述低丰度目标核酸选自下组：野生型EGFR序列片段、EGFRL861Q突变型序列片段。

在本发明的第四方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)如本发明第二方面所述的富集低丰度目标核酸反应体系或用于配制所述反应体系的试剂；

(ii)用于检测低丰度目标核酸的检测试剂；和

(ii)使用说明书，所述说明书描述了如本发明第三方面所述的方法。

在另一优选例中，所述的试剂盒包括：

(a)第一容器以及位于所述第一容器的向导DNA；

(b)第二容器以及位于第二容器的可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)；和

(c)第三容器以及位于第三容器的核酸扩增反应试剂。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：

(d)第四容器以及位于第四容器的低丰度目标核酸的检测试剂。

在另一优选例中，所述的低丰度目标核酸的检测试剂包括：引物、探针等。

在另一优选例中，所述的低丰度目标核酸的检测试剂包括：TaqMan荧光定量PCR所需的引物和探针，或桑格测序所需试剂。

在另一优选例中，所述的低丰度目标核酸的检测试剂包括桑格测序所需试剂。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：

(e)第五容器以及位于第五容器的二价金属离子。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：

(f)第六容器以及位于第六容器的缓冲液。

在另一优选例中，所述第一容器、第二容器、第三容器、第四容器、第五容器和第六容器可以是相同或不同的容器。

在本发明的第五方面，提供了一种可编程核酸内切酶Argonaute的用途，用于制备检测靶标分子的试剂或试剂盒，或用于制备检测低丰度目标核酸的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述可编程核酸内切酶Argonaute来源于嗜热菌(Thermusparvatiensis)；或是其具备相同或相似功能的同源类似物。

在另一优选例中，所述的TpsAgo包括野生型和突变型的TpsAgo。

在另一优选例中，所述的可编程核酸内切酶Argonaute具有选自下组的氨基酸序列：

(i)如NCBI序列号WP_060384876.1所示的氨基酸序列；和

(ii)在如NCBI序列号WP_060384876.1所示序列的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至10个氨基酸残基(较佳地1至5个氨基酸残基，更佳地1至3个氨基酸残基)，从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如NCBI序列号WP_060384876.1所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性；并且所获得的氨基酸序列具备与(i)相同或相似的功能。

本发明的目的是提供一种具有多重引导链和底物链剪切偏好性的新型高温核酸酶。

为了实现上述目的，本发明提供了一种高温Argonaute——TpsAgo的蛋白，该蛋白具有高温核酸酶活性，其是以一株分离自印度北部热泉水(90-98℃)的嗜热菌Thermusparvatiensis RL为出发菌株，为目前报道的分子量较小的高温Ago蛋白。

另一方面，本发明提供了一种高温Argonaute，TpsAgo蛋白的基因，该基因编码如上所述的高温核酸酶TpsAgo的蛋白。

本发明通过对TpsAgo蛋白的基因进行挖掘、序列比对后，构建了重组质粒pET28a—TpsAgo，该重组质粒转化大肠杆菌(DE3)，实现了TpsAgo的异源表达，后经Ni-NTA重力柱纯化得到了重组菌株所产Ago蛋白。

本发明所得到的新型高温Ago蛋白分子量约为76kDa，该酶可同时利用5′-磷酸化的gDNA和5′-羟基化的gDNA介导单链DNA靶标核酸的剪切，也可以利用5′-磷酸化的gDNA介导单链RNA靶标核酸的剪切。最适反应温度范围在65℃-90℃之间；可利用Mn²⁺、Co²⁺作为活性离子，100μM Mn²⁺可使其保持较高活性；该酶对NaCl浓度具有一定耐受性，耐受范围在0-3200mM之间；该酶可利用16nt-21nt的5’-P gDNA以及16nt-24nt的5’-OH gDNA；该酶对gDNA5’末端第一个碱基具有偏好性，由剪切动力学结果可以看出，更偏好第一个羟基是T和G的gDNA；该酶可利用多种5’末端修饰的gDNA，如5’-P、5’-OH、5’-Biotin、5’-NH₂C₆、5’-FAM、5-SHC₆如；该酶对target与gDNA间的单点错配具有较低的容忍度，这将在SNV基因检测中有一定的应用前景。该酶除了可以剪切单链DNA，还可以剪切质粒DNA，可以在pUC19质粒的29％GC含量和65％GC含量的位置，将超螺旋DNA剪切为线性DNA。该酶具有良好的单点错配及双点错配区分性，可结合等温扩增技术，通过“边扩增边剪切”的偶联反应，对EGFR L861Q等突变基因进行富集并检测。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了TpsAgo的系统进化分析(A)以及多重序列比对(B)的结果。

图2显示了SDS-PAGE电泳分析TpsAgo蛋白的结果。其中，由左至右的泳道分别为蛋白Marker、菌体裂解上清、菌体裂解沉淀、纯化的TpsAgo。

图3显示了TpsAgo的剪切活性的测定结果。

图4显示了5’-磷酸化gDNA(A)和5’-羟基化gDNA(B)的长度对TpsAgo剪切活性的影响。

图5显示了TpsAgo反应所需的最适温度范围的结果图。

图6显示了二价金属离子类型(A)及浓度(B)对TpsAgo剪切活性的影响的结果。

图7显示了TpsAgo所能耐受的NaCl温度范围的结果。

图8显示了TpsAgo对gDNA 5’碱基末端第一个碱基的偏好性的结果。

图9显示了TpsAgo对gDNA 5’修饰的高容忍度的结果。

图10显示了TpsAgo针对gDNA与Target之间不同位点的单点错配可以区分剪切的结果。

图11显示了TpsAgo剪切pUC19质粒29％GC(A、B)和65％GC(C、D)含量位置的结果。

其中，OC代表开环质粒(质粒一条链断开)；LIN代表线性化质粒(质粒双链断开)；SC代表超螺旋质粒。

图12显示了TpsAgo对SNV突变基因富集的正反向gDNAs设计原理。

图13显示了TpsAgo结合等温扩增技术对EGFR L861Q SNV基因的富集测序结果(A表示不加TpsAgo，B表示加入50nM TpsAgo)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种灵敏度高、特异性好、通量高的低丰度突变DNA的富集及检测方法。具体地，发明人通过体外表达和纯化分离获得了核酸酶TpsAgo，并且通过大量的摸索实验，获得了其最优的反应参数，从而提供了一种基于TpsAgo的富集低丰度目标核酸的方法和相应的检测方法。本发明具有非侵入性、易操作、快速等优势，能更好地进行人液态活检中低丰度突变基因的检测，本发明技术可广泛应用于涉及核酸检测的分子诊断各个领域，如肿瘤液态活检，感染性疾病如重大传染性和病原体感染性疾病(病毒、病原菌)检测领域等领域。在此基础上完成了本发明。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以使开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”或“由…构成”。

“转导”、“转染”、“转化”或本文用到的术语指的是将外源多核苷酸传递导至宿主细胞，转录和翻译产生多肽产物的过程，包括利用质粒分子将外源多核苷酸引入宿主细胞(例如大肠杆菌)。

“基因表达”或“表达”指的是基因转录，翻译和翻译后修饰产生基因的RNA或蛋白产物的过程。

“多核苷酸”指的是任意长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核苷酸(DNA)，核糖核苷酸(RNA)，其杂合序列和类似物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，比如甲基化或加帽的核苷酸或核苷酸类似物。本文使用的术语多核苷酸指可互换的单链和双链分子。除非另有说明，本文描述的任意实施例里的多核苷酸包括双链的形式和已知的或可预测的构成双链形式的两条互补的单链。

保守氨基酸的取代是本领域已知的。在一些实施例中，潜在的取代氨基酸在以下组的一个或多个内：甘氨酸，丙氨酸；和缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和脯氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸赖氨酸，精氨酸和组氨酸；和/或苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸；蛋氨酸和半胱氨酸。此外，本发明还提供了允许来自不同基团的氨基酸取代的非保守的氨基酸取代。

本领域技术人员将容易理解本文所述的所有参数，尺寸，材料和构造的含义。实际参数，尺寸，材料和/或配置取决于使用本发明说明的特定应用。本领域技术人员能够理解，实施例或权利要求仅是通过示例的方式给出的，并且在等效物或权利要求的范围内，本发明的实施例可涵盖的范围不限于具体描述和要求的范围。

本文的定义和使用的所有定义应被理解为超过词典定义或通过引用并入的文档中的定义。

本文所发明的所有参考文献，专利和专利申请都相对于其所引用的主题通过引用并入，在某些情况下可能包含整个文档。

应当理解，对于本文所述的包括一个以上步骤的任何方法，步骤的顺序不一定限于这些实施例中描述的顺序。

Ago酶

Argonaute蛋白属于PIWI(P element-induced wimpy testis)蛋白超家族，其由PIWI结构域的存在而界定，广泛存在于生活的所有领域，能够结合siDNA或siRNA指导链来特异性沉默或剪切互补核酸靶标链。研究表明，Ago在生物体细胞免疫防御及代谢调控中发挥重要作用，并可能具有人工基因编辑的应用潜力，因此针对Ago蛋白的功能研究成为生物学研究中新关注点。

Ago蛋白最初是在真核生物中发现的，是RNA干扰(RNAi)途径的关键参与者。真核Argonaute蛋白(eAgos)作为多蛋白RNA诱导沉默复合物(RISC)的核心，能够结合siRNA分子作为指导链，剪切互补的靶标RNA，直接沉默靶标RNA的翻译；或通过与靶标RNA结合，募集其他沉默因子来促进其降解，进而间接沉默靶标RNA。因此，eAgos可以在转录后调节基因表达，保护其宿主不受入侵RNA病毒的侵害，并通过降低转座子的流动性保持基因组的完整性。

Argonaute蛋白还存在于原核生物中。对一些原核Ago(pAgos)蛋白(主要来自嗜热细菌和古菌)的结构和生化研究表明，它们在体外可以发挥核酸内切酶作用，在体内可以发挥宿主防御作用。pAgos可以结合siDNA指导链来特异性剪切和指导链互补配对的DNA靶标链。截至2018年，已报道的pAgos主要来源于高温宿主，多用于基因检测。常温条件下活性很低，无法作为基因编辑的工具。2019年至今，陆续报道了一些来源于常温宿主的pAgos，能在常温条件下发挥DNA指导的DNA剪切活性，并且能够剪切GC含量较低的质粒。

如本文所用，术语“可编程核酸内切酶Thermus parvatiensis”、“核酸酶Thermusparvatiensis”、“TpsAgo酶”可互换使用，指本发明第一方面中所述的酶。

野生型的TpsAgo酶具有如NCBI序列号WP_060384876.1所示的氨基酸序列。

本发明的TpsAgo酶还可包含其保留了功能活性的突变形式。所述的突变形式可含有在如NCBI序列号WP_060384876.1所示序列的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至10个氨基酸残基(较佳地1至5个氨基酸残基，更佳地1至3个氨基酸残基)，从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如NCBI序列号WP_060384876.1所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性；并且所获得的氨基酸序列具备与野生型TpsAgo酶相同或相似的功能。

“边扩增边剪切”的偶联反应

在本发明中，在采用TpsAgo-gDNA复合物进行“边扩增边剪切”的偶联反应时，可以采用相应切割酶和相应扩增酶的合适条件下进行所述反应，只要该条件下所述的切割酶和扩增酶能够发挥其相应功能。

本发明的研究表明，对于通过所述偶联反应来富集突变型dsDNA信号，一些关键因素主要包括以下几个方面：

①富集反应体系中初始模板浓度：野生型(wild type，wt)和突变型(mutanttype，mut)总浓度(nM～fM))：优选为0.1-100nM。

②富集反应体系中初始TpsAgo蛋白浓度：优选为20-100nM；

③富集反应体系中初始gDNAs浓度：优选为200-2000nM；

④TpsAgo蛋白与gDNAs间摩尔浓度比例：优选为1：5～1：20；

富集低丰度目标核酸的反应体系

如本文所用，术语“富集低丰度目标核酸的反应体系”、“本发明富集体系”可互换使用，指本发明第二方面中所述的用于富集低丰度目标核酸的反应体系。

在本发明中，提供了一种富集低丰度目标核酸的反应体系，该体系基于上述“边扩增边剪切”的偶联反应的计数原理，用于对一核酸样本同时进行核酸扩增反应和核酸切割反应，从而获得扩增-切割反应产物。

在具体的实施方式中，在富集体系中，所述的核酸样本含有第一核酸和第二核酸，其中，所述的第一核酸为所述目标核酸，而所述的第二核酸为非目标核酸；所述的核酸切割反应用于特异性切割非目标核酸，但不切割所述目的核酸。

在本发明的富集体系中，所述的扩增-切割反应体系含有(i)进行核酸扩增反应所需的试剂和(ii)本发明基于可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)的核酸切割体系。

在本发明富集体系中，在富集之前，所述低丰度目标核酸的浓度为0.5-5nM，较佳地为0.8-2nM，更佳地为1nM。

在另一优选例中，所述反应体系中，所述可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)的浓度为20-200nM，较佳地为30-150nM，更佳地为40-100nM。

在另一优选例中，所述的进行等温扩增反应所需的试剂包括One-Step tHDA试剂盒(购自NEB公司(New England Biolabs)。

另外，所述的进行等温扩增反应所需的试剂还包括目标核酸的扩增引物对。优选地，所述的目标核酸的扩增引物对中的各引物的浓度为10-300nM，较佳地为50-200nM，更佳地为100nM。

在本发明富集体系中，所述gDNA包括正向gDNA和反向gDNA；其中，所述正向gDNA是指与目标核酸具有相同序列片段的gDNA，所述反向gDNA是指与目标核酸具有反向互补序列片段的gDNA。

在一个优选的实施方式中，所述反应体系中还包括二价金属离子。优选地，所述的二价金属离子为Mn²⁺。并且所述二价金属离子的浓度为50μM-2000μM，较佳地100μM-1000μM，更佳地为250μM。

在富集目标核酸的过程中，优选地，所述反应体系的反应温度(反应程序)为：65℃，1.5-2h。

本发明富集和检测低丰度目标核酸的方法

如本文所用，术语“本发明富集方法”、“富集低丰度目标核酸的方法”、“本发明富集核酸的方法”可互换使用，均是指本发明第三方面所述的用于富集低丰度目标核酸的方法。

本发明提供了一种富集低丰度目标核酸的方法，包括步骤：(a)提供一核酸样本，所述的核酸样本含有第一核酸和第二核酸，其中，所述的第一核酸为所述目标核酸，而所述的第二核酸为非目标核酸，并且，所述目标核酸在所述的核酸样本中的丰度为F1a；(b)对所述核酸样本中的核酸为模板，在扩增-切割反应体系中进行等温扩增和核酸切割反应，从而获得扩增-切割反应产物；其中，所述的核酸切割反应用于特异性切割非目标核酸，但不切割所述目的核酸；并且，所述的扩增-切割反应体系含有(i)进行等温扩增反应所需的试剂和(ii)本发明的核酸切割体系；其中，所述目标核酸在所述的扩增-切割反应产物中的丰度为F1b；其中，F1b/F1a的比值≥5(较佳地为≥10)。

在一个优选的实施方式中，所述的目标核酸和非目标核酸仅相差一个碱基。

优选地，当1％≤F1a≤10％时，F1b/F1a的比值≥10，当0.1％≤F1a≤0.5％时，F1b/F1a的比值≥100，当F1a≤0.1％时，F1b/F1a的比值≥200。

如本文所用，术语“本发明检测方法”、“检测低丰度目标核酸的方法”可互换使用，是指基于本发明第三方面所述的富集低丰度目标核酸的方法，对被富集的低丰度目标核酸进行检测的方法。

本发明提供了一种检测低丰度目标核酸的方法，所述的方法基于上述富集低丰度目标核酸的方法步骤，进一步地包括：(c)对所述扩增-切割反应产物进行检测，从而测定所述目标核酸的存在与否和/或数量。

所述步骤(c)中的检测包括定量检测、定性检测、或其组合。

优选地，所述的定量检测选自下组：TaqMan荧光定量PCR、桑格测序、q-PCR、ddPCR、化学发光法、高分辨率熔解曲线法、NGS等；更加优选地，选自TaqMan荧光定量PCR、桑格测序。

本发明所述的检测方法是可以是非诊断性和非治疗性的。

在实际的应用中，所述的核酸样本包括来自试样的核酸，其中所述试样选自下组：血液、细胞、血清、唾液、体液、血浆、尿液、前列腺液、支气管灌洗液、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、腹腔液及粪便等或其组合。

在本发明具体的实施方式中，所述低丰度目标核酸可以是EGFR L861Q突变型序列片段。

试剂盒

基于本发明的富集和检测低丰度目标核酸的方法，本发明进一步地提供了一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，包括：(i)本发明富集低丰度目标核酸反应体系或用于配制所述反应体系的试剂；(ii)用于检测低丰度目标核酸的检测试剂；和(ii)使用说明书，所述说明书描述了本发明的检测方法。

在具体的实施方式中，所述的试剂盒包括：(a)第一容器以及位于所述第一容器的向导DNA；(b)第二容器以及位于第二容器的可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)；和(c)第三容器以及位于第三容器的核酸扩增反应试剂。

优选地，所述的试剂盒还含有：(d)第四容器以及位于第四容器的低丰度目标核酸的检测试剂。所述的低丰度目标核酸的检测试剂包括：引物、探针等。在一个实施方式中，所述的低丰度目标核酸的检测试剂包括：TaqMan荧光定量PCR所需的引物和探针，或桑格测序所需试剂。

优选地，所述的试剂盒还含有：(e)第五容器以及位于第五容器的二价金属离子。优选地，所述的试剂盒还包括：(f)第六容器以及位于第六容器的缓冲液。

在本发明的各个实施方式中，上述各容器可以是相同或不同的容器。

本发明的主要优点包括：

1)本发明所述的TpsAgo蛋白对靶标DNA与gDNA间的单点或双点错配具有较好的区分性，利用这种性质，可以将其运用到低丰度突变型基因的富集与检测中，实现对肿瘤早期突变基因的检测。

2)TpsAgo可利用多种5’端修饰的gDNA剪切互补DNA。

3)TpsAgo可耐受高浓度NaCl。

4)TpsAgo可剪切多种靶标核酸，包括单链DNA，单链RNA，双链DNA。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：TpsAgo基因序列的获得

在数据库中，对已知的PfAgo的氨基酸序列进行相似性检索，选取部分序列一致性较高的氨基酸序列，采用MEGA软件进行分析，构建同源进化树，选取TpsAgo作为候选酶。获得TpsAgo(WP_060384876.1)的氨基酸序列和对应的编码该蛋白的基因序列(NZ_CP014142.1)。将该基因序列经密码子优化合成后，克隆至pET28a表达载体。

实施例2：TpsAgo蛋白异源表达与纯化

将上述TpsAgo-pET28a原核表达质粒导入E.coli BL21(DE3)中，得到TpsAgo-pET28a/E.coli BL21(DE3)原核表达菌株。含重组质粒TpsAgo-pET28a的表达菌株E.coliBL21(DE3)接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm摇床培养到OD₆₀₀至0.6-0.8之间，加入终浓度0.4-0.6mM的IPTG，18℃，200rpm摇床继续培养16-20h，诱导TpsAgo蛋白的表达。离心收集菌体，使用重悬缓冲液(含20mM Tris-HCl、pH8.0左右、1MNaCl)重悬菌体，然后高压破碎菌体，离心获得上清。利用Ni-NTA柱亲和纯化蛋白，洗脱液经超滤浓缩、脱盐等步骤得到纯化的蛋白。纯化的蛋白保存于含20mM Tris-HCl的缓冲液中，并通过BCA试剂盒测定蛋白，测定步骤按照操作说明进行。以BSA作为标准品，配置标准溶液，绘制标准曲线，依此计算纯化的目的蛋白浓度，蛋白放于-80℃冰箱保存备用。SDS-PAGE电泳分析TpsAgo蛋白。

结果如图2所示。结果表明，目的蛋白TpsAgo已得到纯化。

实施例3：TpsAgo与其他已知Ago序列比对

在本实施例中，将TpsAgo与部分已表征的Ago进行了多重序列比对。

结果显示，TpsAgo的氨基酸数是最少的，蛋白分子量也最小。据文献报道，所有具有催化活性的Ago蛋白的靶向剪切是通过一个保守的DEDX(X代表组氨酸，天冬氨酸或天冬酰胺)四联体所介导。通过序列比对，可以发现TpsAgo中存在DEDD四联体(图1)。因此进一步推测其可能具有核酸酶催化活性，需要进一步体外鉴定表征。

实施例4：TpsAgo剪切活性测定

设计带有荧光修饰的45nt单链DNA、RNA靶标核酸以及互补的四种16nt DNA、RNA引导链，并送公司合成。

DNA靶标核酸序列(SEQ ID NO:1)：

5’-FAM-CGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGG-3’

RNA靶标核酸(SEQ ID NO:2)：

5’-FAM-CGCAGCAUGUCAAGAUCACAGAUUUUGGGCUGGCCAAACUGCUGG-3’

gDNA(SEQ ID NO:3)：

5’-HO/P-TAGTTTGGCCAGCCCA-3’

gRNA(SEQ ID NO:4)：

5’-HO/P-UAGUUUGGCCAGCCCA-3’

配置反应缓冲液(含15mM Tris-HCl pH8.0、250mM NaCl)，在反应缓冲液中加入终浓度为0.5mM的MnCl₂、200nM TpsAgo、2μM合成的gDNA或gRNA和0.8μM 5’荧光修饰的序列互补单链DNA或RNA靶标核酸，在80℃反应30min，反应结束后，取6-10μL样品，按1:1比例加入上样缓冲液(含95％(去离子)甲酰胺，0.5mmol/L EDTA，0.025％溴酚蓝，0.025％二甲苯蓝)，在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测。

结果如图3所示。结果表明，TpsAgo可利用5’-P和5’-OH gDNA剪切互补单链DNA，还可利用5’-P gDNA剪切互补单链RNA。

实施例5：TpsAgo催化特性分析

分别设计11-30nt的5’磷酸化gDNA和14-24nt的5’羟基化gDNA，探究不同长度gDNA对TpsAgo酶活的影响。在反应缓冲液中加入终浓度为0.5mM的MnCl₂，终浓度为200nM的TpsAgo，2μM合成的不同长度的gDNA和0.8μM 60nt序列互补单链DNA靶标核酸，分别在80℃反应30min，反应产物在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测。

结果如图4所示。结果表明，TpsAgo可利用长度为16-20nt 5’-P gDNA，也可利用长度为16-22nt 5’-OH gDNA剪切互补靶标核酸。

分别在不同温度(50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃)下探究TpsAgo的酶活，在反应缓冲液中加入终浓度为0.5mM的MnCl₂，终浓度为200nM的TpsAgo，2μM合成的gDNA和0.8μM 60nt序列互补单链DNA靶标核酸，在不同温度下反应30min，反应产物在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测。

结果如图5所示。结果表明，TpsAgo可在65℃-90℃的范围内利用5’-PgDNA剪切互补靶标核酸。

TpsAgo、引导链和靶标核酸浓度不变，在反应体系中分别加入终浓度0.5mM的CoCl₂、CuCl₂、MgCl₂、MnCl₂、ZnCl₂、CaCl₂溶液，在反应温度80℃下，反应30min，在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测金属离子对酶活力影响。反应体系和条件不变，加入不同MnCl₂浓度：25μM、50μM、100μM、250μM、500μM、1000μM、2000μM，测定在5’磷酸化引导链介导下TpsAgo最适MnCl₂浓度。

结果如图6所示。结果表明，TpsAgo可以利用Mn²⁺和Co²⁺作为金属离子，去介导单链DNA引导的DNA剪切。其中，TpsAgo更偏好Mn²⁺，并且100μM-2000μM的Mn²⁺可使TpsAgo保持较高活性。

调整反应缓冲液成分，分别配置终浓度为15mM Tris-HCl pH8.0和不同浓度的NaCl(20mM、40mM、80mM、200mM、400mM、800mM、1600mM、2400mM、3200mM、4000mM、4800mM)的反应缓冲液，其他反应体系不变，80℃反应30min，在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测。

结果如图7所示。结果表明，TpsAgo可以在NaCl浓度为0-3200mM时发挥剪切活性。

分别设计gDNA 5’末端第一个碱基是A、T、G、C的16nt gDNA，反应体系不变，加入MnCl₂、gDNA和靶标DNA，测定在5’磷酸化引导链介导下TpsAgo对gDNA 5’末端第一个碱基的偏好性。80℃反应15min，在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测。反应体系不变，分别反应0、5min、10min、15min、20min、25min、30min，测定四种gDNA的剪切动力学。

结果如图8所示。结果表明，TpsAgo更偏好5’T或5’G。

设计合成5’末端不同修饰的gDNA：5’-P、5’-OH、5’-Biotin、5’-NH₂C₆、5’-FAM、5’-SHC₆，反应体系不变，加入MnCl₂、gDNA和靶标DNA，测定在5’不同修饰引导链介导下TpsAgo的剪切效率。80℃反应15min，在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测。

结果如图9所示。结果表明，TpsAgo可以利用5’-P、5’-OH、5’-Biotin、5’-NH₂C₆、5’-FAM、5’-SHC₆修饰的gDNA，且更偏好5’-OH和5’-NH₂C₆。

设计60-90nt范围内的野生型核酸序列以及单碱基突变的突变型核酸序列，以及一系列与target在不同位点(MP2-15)存在单点错配的gDNA，反应体系不变，加入MnCl₂、以及不同位点错配的gDNA和靶标DNA，测定TpsAgo的区分剪切效果。80℃反应15min，在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测。

结果如图10所示。结果表明，当错配发生在gDNA的2、3、4、6、8、10、11、13、14和16位时，TpsAgo的剪切效率显著降低。

设计合成GC含量为29％和65％(剪切位点上下游80bp范围内)的剪切质粒pUC19两条链的gDNAs，序列如图11所示。配置反应缓冲液(含15mM Tris-HCl pH8.0、100mM NaCl)，在反应缓冲液中加入终浓度为0.5mM的MnCl₂，750nM TpsAgo，2.5μM合成的正反向gDNA和300ng-600ng pUC19质粒，在80℃反应2-4h。反应结束后，在样品中加入一定量的蛋白酶K和CaCl₂，50-55℃反应1h。加入5×上样缓冲液，在1.2％的琼脂糖胶中进行电泳检测。

结果如图11所示。结果表明，当剪切位点附近GC含量为29％时，TpsAgo可利用一对gDNA将超螺旋质粒全部剪切为线性质粒；当剪切位点附近GC含量为65％时，TpsAgo可利用一对gDNA将超螺旋质粒转化为开环质粒和线性质粒。

实施例6：TpsAgo结合等温扩增技术，对EGFR单核苷酸变异(SNV)基因实现富集检测

以EGFR L861Q SNV突变基因为例，根据序列特征(具体见表1序列)，设计在10-11位与SNV基因具有错配的gDNAs，如图12所示。分别以EGFR两条链作为靶标DNA，筛选可以区分剪切野生型和SNV基因的gDNAs，剪切体系同上。

分别以EGFR L861Q SNV野生和突变片段为底物，通过PCR对野生和突变模板进行扩增。PCR产物经纯化回收后，采用李记生物公司销售的Pikogreen dsDNA定量试剂盒(超敏)(兼容Qubit 3.0)对配制样品进行定量。将模板配置为10nM(富集体系终浓度)10％mutEGFR L861Q样品。

筛选好gDNA后，采用New England Biolabs公司销售的tHDA试剂盒，结合TpsAgo对EGFR L861Q SNV基因进行富集。以50μL反应体系为例：

其余组分按tHDA试剂盒说明添加。

反应程序：65℃，1.5-2h

富集样品通过桑格尔测序检测。

结果如图13所示。结果表明，针对EGFR L858R基因，TpsAgo可以对等位基因突变频率(VAF)为10％的Mut基因进行少许富集。

表1

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种新型高温Argonaute蛋白TpsAgo表征及应用

<130> P2021-0609

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> ssDNA

<400> 1

cgcagcatgt caagatcaca gattttgggc tggccaaact gctgg 45

<210> 2

<211> 45

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> ssRNA

<400> 2

cgcagcaugu caagaucaca gauuuugggc uggccaaacu gcugg 45

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> gDNA

<400> 3

tagtttggcc agccca 16

<210> 4

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> gRNA

<400> 4

uaguuuggcc agccca 16

<210> 5

<211> 156

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

ggcatgaact acttggagga ccgtcgcttg gtgcaccgcg acctggcagc caggaacgta 60

ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagatc acagattttg ggctggccaa actgctgggt 120

gcggaagaga aagaatacca tgcagaagga ggcaaa 156

<210> 6

<211> 156

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> EGFR L861Q Mut

<400> 6

ggcatgaact acttggagga ccgtcgcttg gtgcaccgcg acctggcagc caggaacgta 60

ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagatc acagattttg ggctggccaa acagctgggt 120

gcggaagaga aagaatacca tgcagaagga ggcaaa 156

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> FW-11A gDNA

<400> 7

tggccaaact actggg 16

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> RV-10A gDNA

<400> 8

tgcacccaga agtttg 16

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> L861Q-FW

<400> 9

tactggtgaa aacaccgcag catgtc 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> L861Q-RV

<400> 10

accatgcaga aggaggcaaa gtaagg 26

Claims

1.一种核酸切割体系，其特征在于，所述核酸切割体系包括：

(a)向导DNA(gDNA)；

(b)可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)；和

2.如权利要求1所述的核酸切割体系，其特征在于，所述核酸切割体系的温度为65-90℃，较佳地为70-85℃，更佳地为75-85℃。

3.如权利要求1所述的核酸切割体系，其特征在于，所述的可编程核酸内切酶Argonaute来源于嗜热菌(Thermus parvatiensis)，所述的可编程核酸内切酶Argonaute是可编程核酸内切酶TpsAgo。

4.如权利要求1所述的核酸切割体系，其特征在于，所述的核酸切割体系还：(d)二价金属离子。

5.如权利要求1所述的核酸切割体系，其特征在于，所述的报告核酸是质粒DNA，并且所述的向导DNA(gDNA)包括正向gDNA和反向gDNA；

6.如权利要求5所述的核酸切割体系，其特征在于，所述的质粒DNA是超螺旋状态的。

7.一种富集低丰度目标核酸的反应体系，其特征在于，所述反应体系用于对一核酸样本同时进行依赖解旋酶等温扩增技术(Helicase-dependent isothermal DNAamplification)和核酸切割反应，从而获得扩增-切割反应产物；

所述的扩增-切割反应体系含有(i)进行等温扩增反应所需的试剂和(ii)如权利要求1所述的核酸切割体系。

8.一种富集低丰度目标核酸的方法，其特征在于，包括步骤：

并且，所述目标核酸在所述的核酸样本中的丰度为F1a；

并且，所述的扩增-切割反应体系含有(i)进行等温扩增反应所需的试剂和(ii)如权利要求1所述的核酸切割体系；

其中，F1b/F1a的比值≥5(更佳地为≥10)。

9.一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(i)如权利要求7所述的富集低丰度目标核酸反应体系或用于配制所述反应体系的试剂；

(ii)用于检测低丰度目标核酸的检测试剂；和

(ii)使用说明书，所述说明书描述了如权利要求8所述的方法。

10.一种可编程核酸内切酶Argonaute的用途，其特征在于，用于制备检测靶标分子的试剂或试剂盒，或用于制备检测低丰度目标核酸的试剂或试剂盒。