CN113046355A - 一种新型中温原核Argonaute蛋白PbAgo表征及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型中温原核Argonaute蛋白PbAgo表征及应用。具体地，本发明提供了一种用于检测靶标分子的检测体系，包括：(a)向导DNA(gDNA)；(b)核酸酶Argonaute(Ago)；和(c)报告核酸，其中若所述报告核酸被剪切，所述的剪切是可以被检测出的；其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。并且本发明还提供了相应的检测方法和检测试剂盒。本发明的检测体系可快速、廉价并且高效地检测小分子。

Description

一种新型中温原核Argonaute蛋白PbAgo表征及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型中温原核Argonaute蛋白PbAgo表征及应用。

背景技术

小分子检测在在环境监测、食品安全以及疾病诊断方面发挥着重要作用。快速、廉价和灵敏的检测技术的开发越来越受到人们的重视。

例如在食品领域中，常常会用到一些有助于防腐和抑菌的小分子；然而，若其含量超标，将会引起食物中毒或具有相应的食品安全隐患。为此，在食品安全的监管环节急需快速、廉价并且高效的小分子检测技术。

目前，小分子的常规检测主要依赖光谱和分离设备。然而，由于上述光谱或分离设备价格高昂，并且利用上述方法进行检测的操作较为繁琐；而对于环境监测、食品安全检测，以及疾病诊断的具体应用中，往往需要更加快捷的检测方法。因此，本领域已知的上述光谱分析等方法无法达到当前对于小分子检测的广大需求。

因此，本领域迫切需要开发一种快速、廉价并且高效的小分子检测技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种快速、廉价并且高效的小分子检测技术。

本发明具体地提供了一种基于中温原核Argonaute蛋白PbAgo的小分子检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测靶标分子的检测体系，所述检测体系包括：

(a)向导DNA(gDNA)；

(b)核酸酶Argonaute(Ago)；和

(c)报告核酸，其中若所述报告核酸被剪切，所述的剪切是可以被检测出的。

在另一优选例中，所述的靶标分子包括核酸分子和化学小分子。

在另一优选例中，所述的靶标分子是核酸分子，并且所述核酸分子可以和报告核酸是同一种分子。

在另一优选例中，所述核酸分子是超螺旋状态的。

在另一优选例中，所述核酸分子中的GC含量≤36％，较佳地为≤20％，更佳地为≤14％。

在另一优选例中，当所述靶标分子是化学小分子时，所述的检测体系中还包括：(d)别构转录因子，所述的别构转录因子同时具有结合所述报告核酸和所述化学小分子的活性，并且所述报告核酸和所述化学小分子与所述别构转录因子的结合具有竞争性。

在另一优选例中，所述的别构转录因子选自下组：HosA、TetR、HucR等。

在另一优选例中，所述的化学小分子选自下组：对羟基苯甲酸(p-HBA)、四环素、尿酸等。

在另一优选例中，所述的别构转录因子是HosA，并且所述化学小分子是对羟基苯甲酸(p-HBA)。

在另一优选例中，所述的核酸酶Argonaute来源于北拟杆菌(Paenibacillusborealis)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、玫瑰湖丝藻菌(Limnothrix rosea)、巴特勒肠杆菌(Intestinibacterbartlettii)、格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)、嗜热古细菌(Pyrococcusfuriosus)，或极端嗜热菌(Thermus thermophiles)。

在另一优选例中，所述的核酸酶Argonaute来源于北拟杆菌(Paenibacillusborealis)，所述的核酸酶Argonaute是核酸酶PbAgo。

在另一优选例中，所述的PbAgo包括野生型和突变型的PbAgo。

在另一优选例中，所述核酸酶PbAgo的包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述核酸酶的工作温度为10-65℃，较佳地为20-55℃，更佳地为30-45℃，更佳地为30-37℃。

在另一优选例中，所述的向导DNA是5’端磷酸化或羟基化的单链DNA分子。

在另一优选例中，所述的向导DNA是5’端磷酸化的单链DNA分子。

在另一优选例中，所述的向导DNA与所述的报告核酸之间具有互补的片段。

在另一优选例中，所述的向导DNA的长度为8-35nt，较佳地为14-21nt，最佳地为15-18nt。

在另一优选例中，所述向导DNA的5’端第一个核苷酸为磷酸化或羟基化修饰的胸腺嘧啶(T)。

在另一优选例中，所述向导DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的报告核酸是单链DNA(ssDNA)。

在另一优选例中，当所述报告核酸被剪切，所述的剪切能够通过电泳的方法被检测出。

在另一优选例中，所述的报告核酸是荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和/或淬灭基团。

在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述荧光报告核酸的5’端、3’端。

在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团分别位于所述荧光报告核酸与所述向导DNA的互补区域的两侧。

在另一优选例中，所述的报告核酸是单链DNA(ssDNA)，长度为10-100nt，较佳地20-70nt，更佳地30-60nt，更佳地40-50nt，最佳地45nt。

在另一优选例中，所述荧光基团包括：FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、TET、5-TAMRA、ROX、Texas Red-X，或其组合。

在另一优选例中，所述猝灭基团包括：BHQ、TAMRA、DABCYL、DDQ，或其组合。

在另一优选例中，所述的荧光基团是FAM。

在另一优选例中，所述的检测体系还包括：(e)二价金属离子。

在另一优选例中，所述的二价金属离子选自下组：Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺，Zn²⁺、Ca²⁺，或其组合。

在另一优选例中，所述的二价金属离子选自下组：Mg²⁺、Mn²⁺，或其组合。

在另一优选例中，所述检测体系中，二价金属离子的浓度为10mM-3M，较佳地500mM-3M，更佳地1M-3M。

在另一优选例中，所述的检测体系还包括：(f)缓冲液。

在另一优选例中，所述缓冲液中，NaCl的浓度为≤750mM，较佳地为≤500mM，更佳地为≤100mM。

在另一优选例中，所述缓冲液的pH值为7-9，较佳地为8.0。

在另一优选例中，所述的检测体系还含有待检测的靶标分子。

在另一优选例中，所述的向导DNA与所述的报告核酸的序列互补结合后，引导所述PbAgo酶对所述报告核酸进行切割，从而产生可检测的信号(如荧光)。

在另一优选例中，所述的待检测的靶标分子在所述检测体系中的浓度为0.01-10μM，较佳地为0.05-1μM，更佳地为0.1μM。

在另一优选例中，所述的检测体系中，所述的报告核酸的浓度为0.01-10μM，较佳地为0.05-1μM，更佳地为0.1μM。

在另一优选例中，所述的检测体系中，所述核酸酶Ago的浓度为0.5-8μM，较佳地2-4μM，更佳地3μM。

在另一优选例中，所述的检测体系中，所述向导DNA的浓度为0.025-4μM，较佳地0.1-1μM，更佳地0.5μM。

在另一优选例中，所述的检测体系中，所述报告核酸与所述靶标分子的摩尔比为1:1.8至1:72000，较佳地1:36000。

在另一优选例中，所述的检测体系中，待检测的靶标分子、向导DNA、核酸酶Ago的摩尔比为1:(0.25-20):(1.5-120)，较佳地为1:(1-10):(5-50)，最佳地为1:5:30。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)如本发明第一方面所述的检测体系或用于配制所述检测体系的试剂；和

(ii)使用说明书，所述说明书描述了用所述的检测体系检测靶标分子的方法。

在另一优选例中，所述的试剂盒包括：

(a)第一容器以及位于所述第一容器的向导DNA；

(b)第二容器以及位于第二容器的核酸酶Argonaute(Ago)；和

(c)第三容器以及位于第三容器的报告核酸。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：

(d)第四容器以及位于第四容器的别构转录因子。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：

(e)第五容器以及位于第五容器的二价金属离子。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：

(f)第六容器以及位于第六容器的缓冲液。

在另一优选例中，所述第一容器、第二容器、第三容器、第四容器、第五容器和第六容器可以是相同或不同的容器。

在本发明的第三方面，提供了一种检测样本中是否存在靶标分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供如本发明第一方面所述的用于检测靶标分子的检测体系；和

(b)将所述检测体系与待检测的样本在一定温度下进行反应，从而形成反应溶液；

(c)对所述反应溶液进行检测，从而获得剪切信号值；

其中，所述反应溶液中检测到剪切信号值，则表示所述样本中存在靶标分子；而所述反应溶液中没有检测到剪切信号值，则表示所述样本中不存在靶标分子。

在另一优选例中，所述的检测包括定性检测和定量检测。

在另一优选例中，所述步骤(c)中的检测可包括：利用电泳法对报告核酸进行长度的鉴定，从而判断所述的报告核酸是否被剪切。

在另一优选例中，在步骤(c)中所述的检测包括：采用酶标仪或者荧光分光光度计进行检测。

在另一优选例中，所述的方法是体外方法。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。

在本发明的第四方面，提供了一种核酸酶Argonaute的用途，用于制备检测靶标分子的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述核酸酶Argonaute来源于北拟杆菌Paenibacillusborealis；或是其具备相同或相似功能的同源类似物。

在另一优选例中，所述的PbAgo包括野生型和突变型的PbAgo。

在另一优选例中，所述的核酸酶Argonaute具有选自下组的氨基酸序列：

(i)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和

(ii)在如SEQ ID NO:1所示序列的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至10个氨基酸残基(较佳地1至5个氨基酸残基，更佳地1至3个氨基酸残基)，从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如SEQ IDNO:1所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性；并且所获得的氨基酸序列具备与(i)相同或相似的功能。

本发明首先提供了一种编码中温原核Argonaute蛋白PbAgo的基因。通过与报道的CbAgo进行序列比对，选择序列一致性较高，并且来源于中温宿主的Ago蛋白，然后挖掘宿主北拟杆菌(Paenibacillus borealis strain)DSM 13188的全基因数据而获得，该基因全长2118bp，编码705个氨基酸。通过与已报道的原核Agos进行多重序列比对，PbAgo含有Ago蛋白发挥剪切活性的DEDX催化残基。

本发明构建了重组质粒pET-28a(+)-TEV-PbAgo，该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过IPTG低温诱导表达，实现了PbAgo的异源活性表达，菌体破碎后的上清液通过Ni-NTA柱亲和纯化后，SDS-PAGE结果显示浓度较高的蛋白条带，分子量与目标蛋白分子量相符，表明PbAgo可以在大肠杆菌产生高效的可溶性表达。

本发明所得到的新型中温原核Argonaute蛋白PbAgo分子量约为80.79kDa，在5’PgDNA的指导下，最适反应温度在30℃-55℃之间；在5’OH gDNA的指导下，最适反应温度在55℃-65℃之间。二价金属离子如Mn²⁺、Mg²⁺都能够促进PbAgo发挥剪切活性，并且二价金属离子浓度在500mM至3M范围内，PbAgo酶活性保持高水平。该酶不耐受NaCl，NaCl会抑制PbAgo剪切ssDNA的活性。经过测定其剪切动力学看出，在5’P DNA guide的指导下，PbAgo反应很迅速，并且能够在30min内剪切95％的底物。其将在生物体内的基因编辑中具有广阔的前景。

本发明所得到的PbAgo能够在30℃结合gDNA，剪切不规则的双链DNA。别构转录因子HosA可结合不规则的dsDNA，小分子化合物p-HBA存在时，竞争结合HosA，释放出来的不规则dsDNA可被PbAgo剪切。可将PbAgo的这一特性结合HosA用于小分子化合物检测。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了PbAgo与已报道的原核Ago的多重序列比对结果。由图可知，PbAgo和已报道的其他原核Agos一样，也包含一个发挥剪切活性的DEDX活性中心。

图2显示了重组菌株表达PbAgo的SDS-PAGE电泳结果。其中，M是蛋白质标记(marker)；1是PbAgo纯化液。

图3显示了设计合成的45nt ssDNA/ssRNA靶标序列(target)和与之互补配对的21nt 5’P/OH修饰的DNA/RNA向导序列(guide)。

图4显示了纯化的PbAgo对向导序列(guide)和靶标序列(Target)的偏好性。由图可知，PbAgo可在37℃条件下，利用5’P/OH gDNA剪切与gDNA互补配对的ssDNA。

图5显示了在两种不同gDNA指导下PbAgo发挥剪切活性的最适温度。在5’P gDNA的指导下，最适反应温度在30℃-55℃之间；在5’OH gDNA的指导下，最适反应温度在55℃-65℃之间。

图6显示了在两种不同gDNA指导下PbAgo对二价金属离子的偏好性。由图可知，二价金属离子如Mn²⁺、Mg²⁺都能够促进PbAgo发挥剪切活性。

图7显示了在两种不同gDNA指导下，不同的二价金属离子(Mn²⁺)浓度对PbAgo剪切活性的影响。由图可知，二价金属离子浓度在500mM至3M范围内，PbAgo酶活性保持高水平。

图8显示了在两种不同gDNA指导下PbAgo对NaCl的耐受性。由图可知，该酶不耐受NaCl，NaCl会抑制PbAgo剪切ssDNA的活性。

图9显示了在最适反应条件下测定的两种不同gDNA指导的PbAgo的剪切动力学。

图10显示了在最适反应条件下测定的两种不同gDNA指导的PbAgo在前20min的剪切动力学。由图可知，PbAgo在5’P gDNA指导下，剪切速率和剪切效率都更高。

图11显示了gDNA长度对PbAgo剪切活性的影响。由图可知，gDNA长度在13-30nt时，PbAgo具有剪切活性；gDNA长度在14-21nt时，PbAgo剪切效率较高；gDNA长度在15-18nt时，PbAgo剪切效率最好。

图12显示了PbAgo检测小分子化合物p-HBA的结果。其中4号样品在不加p-HBA的前提下，PbAgo/gDNA依然与HosA竞争结合dsDNA，与5号加p-HBA的样品相比，区别较小，造成检测的背景值过高。由此可知，HosA和PbAgo因共同的底物而相互干扰，后续可以针对这一问题做出相应调整。

图13显示了PbAgo在一对5’P gDNA的指导下，在37℃反应3h剪切质粒pUC19的结果。由图可知，7号样品，PbAgo可以利用一对5’P gDNA，分别靶向质粒的一条链，剪切超螺旋状态的质粒，生成线性化质粒DNA。OC：开环质粒(质粒一条链断开)；LIN：线性化质粒(质粒双链断开)；SC：超螺旋质粒。

图14显示了PbAgo在一对5’OH gDNA的指导下，在65℃反应3h剪切质粒pUC19的结果。由图可知，7号样品，PbAgo可以利用一对5’OH gDNA，分别靶向质粒的一条链，剪切超螺旋状态的质粒，生成线性化质粒DNA。

图15显示了质粒目标片段GC含量对PbAgo剪切效率的影响。在质粒pUC19分别找到了6段50bp GC含量不同的目标片段，分别设计合成了6对与之互补配对的5’P gDNA。由图可知，50bp目标DNA片段的GC含量越低，PbAgo的剪切效果越好。PbAgo能够剪切GC含量不高于36％的双链DNA片段，生成线性化质粒；但尽管片段GC含量高达70％，PbAgo能使部分pUC19成为开环状态，可能是由于PbAgo在5’P gDNA指导下剪切了质粒的一条链。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种基于新型核酸酶Ago的靶标分子检测方法。具体地，本发明通过体外表达和纯化分离获得了核酸酶PbAgo，并且通过大量的摸索实验，获得了其最优的反应参数。实验结果表明，本发明核酸酶PbAgo的最适反应温度在30℃-65℃之间；二价金属离子如Mn²⁺、Mg²⁺，并且二价金属离子浓度在500mM至3M范围内能够显著促进PbAgo发挥剪切活性；本发明核酸酶不耐受NaCl。在5’PDNA引导序列的指导下，本发明PbAgo可在30℃下迅速反应，其能够在30min内剪切95％的底物(即不规则dsDNA)。此外，本发明的反应体系还可用于剪切超螺旋状态下的质粒DNA，有望为体内基因编辑提供新的酶资源。在此基础上完成了本发明。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以使开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”或“由…构成”。

“转导”、“转染”、“转化”或本文用到的术语指的是将外源多核苷酸传递导至宿主细胞，转录和翻译产生多肽产物的过程，包括利用质粒分子将外源多核苷酸引入宿主细胞(例如大肠杆菌)。

“基因表达”或“表达”指的是基因转录，翻译和翻译后修饰产生基因的RNA或蛋白产物的过程。

“多核苷酸”指的是任意长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核苷酸(DNA)，核糖核苷酸(RNA)，其杂合序列和类似物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，比如甲基化或加帽的核苷酸或核苷酸类似物。本文使用的术语多核苷酸指可互换的单链和双链分子。除非另有说明，本文描述的任意实施例里的多核苷酸包括双链的形式和已知的或可预测的构成双链形式的两条互补的单链。

保守氨基酸的取代是本领域已知的。在一些实施例中，潜在的取代氨基酸在以下组的一个或多个内：甘氨酸，丙氨酸；和缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和脯氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸赖氨酸，精氨酸和组氨酸；和/或苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸；蛋氨酸和半胱氨酸。此外，本发明还提供了允许来自不同基团的氨基酸取代的非保守的氨基酸取代。

本领域技术人员将容易理解本文所述的所有参数，尺寸，材料和构造的含义。实际参数，尺寸，材料和/或配置取决于使用本发明说明的特定应用。本领域技术人员能够理解，实施例或权利要求仅是通过示例的方式给出的，并且在等效物或权利要求的范围内，本发明的实施例可涵盖的范围不限于具体描述和要求的范围。

本文的定义和使用的所有定义应被理解为超过词典定义或通过引用并入的文档中的定义。

本文所发明的所有参考文献，专利和专利申请都相对于其所引用的主题通过引用并入，在某些情况下可能包含整个文档。

应当理解，对于本文所述的包括一个以上步骤的任何方法，步骤的顺序不一定限于这些实施例中描述的顺序。

Ago酶

Argonaute蛋白属于PIWI(P element-induced wimpy testis)蛋白超家族，其由PIWI结构域的存在而界定，广泛存在于生活的所有领域，能够结合siDNA或siRNA指导链来特异性沉默或剪切互补核酸靶标链。研究表明，Ago在生物体细胞免疫防御及代谢调控中发挥重要作用，并可能具有人工基因编辑的应用潜力，因此针对Ago蛋白的功能研究成为生物学研究中新关注点。

Ago蛋白最初是在真核生物中发现的，是RNA干扰(RNAi)途径的关键参与者。真核Argonaute蛋白(eAgos)作为多蛋白RNA诱导沉默复合物(RISC)的核心，能够结合siRNA分子作为指导链，剪切互补的靶标RNA，直接沉默靶标RNA的翻译；或通过与靶标RNA结合，募集其他沉默因子来促进其降解，进而间接沉默靶标RNA。因此，eAgos可以在转录后调节基因表达，保护其宿主不受入侵RNA病毒的侵害，并通过降低转座子的流动性保持基因组的完整性。

Argonaute蛋白还存在于原核生物中。对一些原核Ago(pAgos)蛋白(主要来自嗜热细菌和古菌)的结构和生化研究表明，它们在体外可以发挥核酸内切酶作用，在体内可以发挥宿主防御作用。pAgos可以结合siDNA指导链来特异性剪切和指导链互补配对的DNA靶标链。截至2018年，已报道的pAgos主要来源于高温宿主，多用于基因检测。常温条件下活性很低，无法作为基因编辑的工具。2019年至今，陆续报道了一些来源于常温宿主的pAgos，能在常温条件下发挥DNA指导的DNA剪切活性，并且能够剪切GC含量较低的质粒。

如本文所用，术语“核酸酶Paenibacillus borealis”、“核酸酶Paenibacillusborealis”、“PbAgo酶”可互换使用，指本发明第一方面的检测体系中所述的核酸酶。

野生型的PbAgo酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

MNTPLTHYVLTEWESDTNTNVLHIHLYTLPVRNVFEQHKENGNACFDLRKLNRSLIIDFYDQYIVSWQPIENWGEYTFTQHEYRSINPTILAERAILERLLLRTIESVQPKKEIAAGSRKFTWLKAEKVVENISIHRVIQCDVTVDYAGKISVGFDLNHSYRTNESVYDLMKSNAIFKGDRVIDIYNNLHYEFVEISNSTINDSIPELNQSVVNYFTKERKQAWKVDKLEQSMPVVYLKAFNGSRIAYAPAMLQKELTFESLPTNVVRQTSEIFKQNANQKIKTLLDEIQKILARTDKIKFNKQKLLVQQAGYEILELSNPNLQFGKNVTQTQLKYGLDKGGVVASKPLSINLLVYPELIDTKLDVINDFNDKLNALSHKWGVPLSILKKSGAYRNRPIDFTNPHQLAILLKELTKNLFQELTLVI IPEKISGMWYDLVKKEFGGNSSVPTQFITIETLQKANDYILGNLLLGLYSKSGIQPWILNSPLSSDCFIGLDVSHEAGRHSTGIVQVVGKDGRVLSSKANTSNEAGEKIRHETMCQIVYSAIDQYQQHYNERPKHVTFHRDGFCREDLLSLDEVMNSLDVQYDMVEIIKKTNRRMALTVGKQGWETKPGLCYLKDESAYLIATNPHPRVGTAQPIKIIKKKGSLPIEAIIQDIYHLSFMHIGSLLKCRLPITTYYADLSSTFFNRQWLPIDSGEALHFV(SEQ ID NO:1)

本发明的PbAgo酶还可包含其保留了功能活性的突变形式。所述的突变形式可含有在如SEQ ID NO:1所示序列的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至10个氨基酸残基(较佳地1至5个氨基酸残基，更佳地1至3个氨基酸残基)，从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性；并且所获得的氨基酸序列具备与野生型PbAgo酶相同或相似的功能。

检测体系

如本文所用，术语“本发明检测体系”、“基于Argonaute蛋白的核酸检测体系”可互换使用，指本发明第一方面中所述的用于检测靶标分子的检测体系。在本发明的检测体系为基于本发明所提供的适用于本发明Ago酶(特别是PbAgo酶)的功能活性的反应条件而进行检测的。

在本发明中，提供了一种用于检测靶标分子的检测体系，所述检测体系包括：(a)向导DNA(gDNA)；(b)核酸酶Argonaute(Ago)；和(c)报告核酸，其中若所述报告核酸被剪切，所述的剪切是可以被检测出的；其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。

在本发明的检测体系中，优选地，所述核酸酶的工作温度为10-65℃，较佳地为20-55℃，更佳地为30-45℃，更佳地为30-37℃。

优选地，所述的向导DNA是5’端磷酸化或羟基化的单链DNA分子；更加优选地，所述向导DNA是5’端磷酸化的单链DNA分子。优选地，所述的向导DNA的长度为8-35nt，较佳地为14-21nt，最佳地为15-18nt。

优选地，所述的报告核酸是单链DNA(ssDNA)。在一个实施方式中，当所述报告核酸被剪切，所述的剪切能够通过电泳的方法被检测出。

在另外的实施方式中，所述的报告核酸是荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团。所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述荧光报告核酸的5’端、3’端；优选地，所述的荧光基团和淬灭基团分别位于所述荧光报告核酸与所述向导DNA的互补区域的两侧。在另一优选例中，所述荧光基团包括：FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、TET、5-TAMRA、ROX、Texas Red-X，或其组合。在另一优选例中，所述猝灭基团包括：BHQ、TAMRA、DABCYL、DDQ，或其组合。

所述的报告核酸的长度为10-100nt，较佳地20-70nt，更佳地30-60nt，更佳地40-50nt，最佳地45nt。

在另一个实施方式中，本发明检测体系中的报告核酸还可以和靶标分子是同一种分子。优选地，该核酸分子是超螺旋状态的质粒DNA。更加优选地，所述核酸分子中的GC含量不超过36％，较佳地不超过20％，更佳地不超过14％。

在本发明的检测体系还可包含二价金属离子。所述的二价金属离子选自下组：Mg^{2 +}、Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺，Zn²⁺、Ca²⁺，或其组合。优选为：Mg²⁺、Mn²⁺，或其组合。在所述检测体系中，二价金属离子的浓度为10mM-3M，较佳地500mM-3M，更佳地1M-3M。

在一个实施方式中，本发明所述的检测体系中，NaCl的浓度为≤750mM，较佳地为≤500mM，更佳地为≤100mM。并且优选地，本发明所述检测体系的pH值为7-9，较佳地为8.0。

检测方法

如本文所用，术语“本发明检测方法”、“基于Argonaute蛋白的核酸检测方法”可互换使用，指本发明第三方面中所述的检测方法。

在本发明中，提供了一种检测样本中是否存在靶标分子的方法，包括以下步骤：(a)提供本发明所述的用于检测靶标分子的检测体系；和(b)将所述检测体系与待检测的样本在一定温度下进行反应，从而形成反应溶液；(c)对所述反应溶液进行检测，从而获得剪切信号值；其中，所述反应溶液中检测到剪切信号值，则表示所述样本中存在靶标分子；而所述反应溶液中没有检测到剪切信号值，则表示所述样本中不存在靶标分子。

所述的检测包括定性检测和定量检测。

在一个实施方式中，所述步骤(c)中的检测可包括：利用电泳法对报告核酸进行长度的鉴定，从而判断所述的报告核酸是否被剪切。若产生了较短长度的核酸产物，这说明该报告核酸被检测体系中的Ago剪切。

在另一个实施方式中，若所述检测体系中报告核酸中带有荧光基团和/或淬灭基团，那么在步骤(c)中所述的检测包括：采用酶标仪或者荧光分光光度计进行检测。

在本发明的一个实施方式中，所述的方法是体外方法。在另一个实施方式中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。

试剂盒

在本发明中，提供了一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，包括：(i)本发明的检测体系或用于配制所述检测体系的试剂；和(ii)使用说明书，所述说明书描述了用所述的检测体系检测靶标分子的方法。

在具体的实施方式中，所述的试剂盒包括：(a)第一容器以及位于所述第一容器的向导DNA；(b)第二容器以及位于第二容器的核酸酶Argonaute(Ago)；和(c)第三容器以及位于第三容器的报告核酸。

优选地，所述的试剂盒还含有：(d)第四容器以及位于第四容器的别构转录因子。优选地，所述的试剂盒还含有：(e)第五容器以及位于第五容器的二价金属离子。

在本发明的各个实施方式中，上述各容器可以是相同或不同的容器。

本发明的主要优点包括：

1)本发明检测体系中的PbAgo可以用两种5’端不同修饰(5’P/OH)的gDNA剪切ssDNA。

2)本发明检测体系中的PbAgo在5’P gDNA指导下剪切ssDNA的反应速率很快,反应时间较短，只需30min就能达到近乎100％剪切。

3)本发明检测体系中的PbAgo对NaCl的耐受性较高，反应体系中NaCl浓度不高于750mM时，PbAgo都具有较高的剪切活性。

4)本发明检测体系中的PbAgo对gDNA长度的要求较低，gDNA为14-21nt时，PbAgo都具有较高的剪切活性。

5)本发明检测体系中的PbAgo能够在一对5’P/OH gDNA指导下剪切GC含量不高于36％的质粒dsNDA(pUC19)。

6)本发明首次将Ago和别构转录因子一起用来检测小分子化合物。PbAgo能够利用HosA的变构效应检测p-HBA，检测速率远高于本领域已知的其他检测方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：PbAgo基因的获得

在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过BLAST对CbAgo的氨基酸序列进行相似性检索，选取部分序列一致性较高，并且来源于中温宿主的Agos。将氨基酸序列和已报道的原核Agos用MEGA X软件进行分析，构建同源进化树，选取与已报道的中温原核Agos亲缘关系近的PbAgo。然后通过与已报道的原核Agos进行多重序列比对分析，确定其是否包含DEDX催化残基。

部分序列的同源比对结果如图1所示。

实施例2：PbAgo异源表达

将PbAgo的基因序列构建到pET-28a(+)-TEV载体上，合成质粒。用合成的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后从转化的平板上挑取单克隆转接试管进行培养，保存甘油菌。

重组菌株表达PbAgo的SDS-PAGE电泳结果如图2所示。

含有pET-28a(+)-TEV-PbAgo表达载体的菌液至接种于5mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，220rpm、37℃过夜培养；以1％接种量转接至1L LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，220rpm、37℃培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃、220rpm诱导表达16h-18h。

实施例3：PbAgo分离纯化

以6000rpm、4℃离心30min收集菌体，使用重悬缓冲液(含20mM Tris-HCl pH8.0、500mM NaCl、10mM咪唑、2％甘油)重悬菌体，然后用预冷的均质机高压破碎。破碎液通过10000rpm，4℃离心30min得到上清，再利用Ni-NTA柱纯化，得到PbAgo的纯化液，通过SDS-PAGE进行检测和鉴定。

纯化后的目的蛋白用超滤管于4℃、4500rpm浓缩至2.5mL，然后进一步纯化除去咪唑。

酶浓度通过BCA试剂盒进行测定，测定步骤按照操作说明进行。以BSA作为标准品，配置标准溶液，绘制标准曲线，依此计算纯化的目的蛋白浓度，将目的蛋白保存于-80℃。

实施例4：PbAgo酶学性质研究

4.1PbAgo的剪切活性测定

设计带有荧光修饰的ssDNA和ssRNA靶标核酸以及互补的四种gDNA和gRNA，并送金斯瑞生物科技有限公司合成。

设计合成的45nt ssDNA/ssRNA靶标序列(target)和与之互补配对的21nt5’P/OH修饰的DNA/RNA引导序列(guide)如图3所示。

45nt ssDNA序列(SEQ ID NO:2)：

ATAAATAAATTTTTAAATATGCTCCATCATCCAACATATCATATA

21nt DNA向导序列(SEQ ID NO:3)：

TGAGGTAGTAGGTTGTATAGT

45nt ssRNA序列(SEQ ID NO:4)：

AUAAAUAAAUUUUUAAAUAUGCUCCAUCAUCCAACAUAUCAUAUA

21nt RNA向导序列(SEQ ID NO:5)：

UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGU

在反应缓冲液(15mM Tris-HCl、pH8.0、200mM NaCl、2mM MnCl₂)中加入PbAgo(3μM)和ssDNA或ssRNA guide(0.5μM)，混匀，在常温下孵育15min。然后加入带荧光标记的ssDNA或ssRNA靶标链(target：guide：Ago的比例为1:5:30)，在37℃条件下反应30min。

反应结束后，取10μL样品，按1:1比例加入上样缓冲液(含95％(去离子)甲酰胺、0.5mM EDTA、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯蓝)，在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测，并通过SYBR gold染色。

结果如图4所示。结果表明：PbAgo可在37℃条件下，利用5’P/OH gDNA剪切与gDNA互补配对的ssDNA。

4.2PbAgo酶活力的影响

反应体系不变，在反应缓冲液(15mM Tris-HCl pH8.0、200mM NaCl、2mM MnCl₂)中加入PbAgo和gDNA，混匀，在常温下孵育15min。然后加入荧光标记的ssDNA或ssRNA target，分别在10℃、20℃、30℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃条件下反应30min。

反应产物在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测。凝胶通过SYBR gold染色后，用凝胶定量软件ImageJ进行胶图定量分析，并通过GraphPad Prism 8作图。

结果如图5所示。结果表明，在5’P gDNA的指导下，最适反应温度在30℃-55℃之间；在5’OH gDNA的指导下，最适反应温度在55℃-65℃之间。

4.3二价金属离子对PbAgo酶活力的影响

在反应缓冲液(15mM Tris-HCl pH8.0、200mM NaCl)中，分别加入终浓度为2mM的MgCl₂、MnCl₂、FeCl₂、CoCl₂、CuCl₂、NiCl₂，ZnCl₂、CaCl₂。然后加入PbAgo和gDNA，混匀，在常温下孵育15min。然后加入荧光标记的ssDNA或ssRNA target，在37℃条件下反应30min。将不加入金属离子的样品作为对照组。

反应产物如按上述方法进行检测、染色、胶图定量和作图。

结果如图6所示。结果表明：二价金属离子如Mn²⁺、Mg²⁺都能够促进PbAgo发挥剪切活性。

反应条件不变，在反应体系中分别加入不同浓度的MnCl₂：0mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM、250mM、500mM、1000mM、2000mM、3000mM，检测在不同guides指导下PbAgo的最适MnCl₂浓度。

按上述方法进行胶图染色和定量作图。

结果如图7所示。结果表明，二价金属离子浓度在500mM至3M范围内，PbAgo酶活性保持高水平。

4.4NaCl对PbAgo酶活力的影响

反应条件不变，在反应体系中分别加入不同浓度的NaCl：50mM、100mM、250mM、500mM、750mM、1000mM、1500mM、2000mM、2500mM、3000mM。检测在不同guides指导下，NaCl对PbAgo酶活力的影响。按上述方法进行胶图染色和定量作图。

结果如图8所示。结果表明，PbAgo酶不耐受NaCl，NaCl会抑制PbAgo剪切ssDNA的活性。

4.5两种gDNA指导下PbAgo的剪切动力学

PbAgo、gDNA和ssDNA浓度不变，在50mM NaCl和2mM MnCl₂浓度下，37℃反应不同时间：0min、3min、5min、10min、20min、30min、45min、60min、80min、100min、120min、150min和180min。在16％的核酸Urea-PAGE下进行电泳检测。按上述方法进行胶图染色和定量作图。

两种不同gDNA指导的PbAgo的剪切动力学结果如图9和10所示。结果表明，PbAgo在5’P gDNA指导下，剪切速率和剪切效率都更高。

4.6gNDA长度对PbAgo酶活力的影响

根据带有荧光修饰的ssDNA靶标核酸，设计与之配对不同长度的5’P gDNA。

不同长度的5’P gDNA序列：

35nt gDNA：TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTATATTAAATTATTT(SEQ ID NO:6)

30nt gDNA：TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTATATTAAAT(SEQ ID NO:7)

25nt gDNA：TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTATAT(SEQ ID NO:8)

21nt gDNA：TGAGGTAGTAGGTTGTATAGT(SEQ ID NO:9)

18nt gDNA：TGAGGTAGTAGGTTGTAT(SEQ ID NO:10)

16nt gDNA：TGAGGTAGTAGGTTGT(SEQ ID NO:11)

15nt gDNA：TGAGGTAGTAGGTTG(SEQ ID NO:12)

14nt gDNA：TGAGGTAGTAGGTT(SEQ ID NO:13)

13nt gDNA：TGAGGTAGTAGGT(SEQ ID NO:14)

12nt gDNA：TGAGGTAGTAGG(SEQ ID NO:15)

10nt gDNA：TGAGGTAGTA(SEQ ID NO:16)

8nt gDNA：TGAGGTAG(SEQ ID NO:17)

反应体系中的其他成分和反应条件不变，在体系中加入0.5μM不同长度的5’PgDNA，在37℃条件下反应30min。将不加入gDNA的样品作为对照组。反应产物如按上述方法进行检测、染色、胶图定量和作图。

结果如图11所示，gDNA在长度14-21nt范围内时PbAgo的剪切效率保持较高水平，更佳地为15-18nt；gDNA长度为16nt时，PbAgo的剪切效率最高。而后随着gDNA的长度增加，PbAgo的剪切效率降低。

4.7PbAgo检测p-HBA

先在反应体系中加入不规则dsDNA和别构转录因子HosA，30℃孵育20min，使之结合。再将目标小分子p-HBA添加至反应体系中，诱导dsDNA与HosA解离，进而通过PbAgo对游离的dsDNA进行检测。

PbAgo检测小分子化合物p-HBA的结果如图12所示。

从结果可看出，当体系中不存在小分子p-HBA时(对应于泳道4和泳道6)，dsDNA能够部分被PbAgo剪切，而这种情况下的剪切产物信号为背景信号；而当体系中存在小分子p-HBA时(对应于泳道5)，PbAgo对dsDNA的剪切产物信号大大提高，显著高于背景信号。因此，本发明基于PbAgo酶的方法可以用来检测样品中的小分子化合物p-HBA。

4.8PbAgo剪切质粒dsDNA

设计合成与pUC19片段互补配对的一对5’P/OH gDNA，送生工生物工程科技有限公司合成。

pUC19序列：

GAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACT(SEQ ID NO:18)

pUC19目标片段序列(50bp)：

FW ssDNA：TTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAA(SEQ IDNO:19)

RV ssDNA：TTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAA(SEQ IDNO:20)

21nt FW gDNA序列：

5’P/OH-TTAGATTGATTTAAAACTTCA 3’(SEQ ID NO:21)

21nt RV gDNA序列：

5’P/OH-TGAAGTTTTAAATCAATCTAA 3’(SEQ ID NO:22)

在反应缓冲液(15mM Tris-HCl、pH 8.0、2mM MnCl₂)中加入3μM PbAgo和一对0.5μM 5’P/OH gDNA，混匀，在常温下孵育15min。然后加入600ng pUC19质粒，在37℃/65℃条件下反应3h。反应结束后，取10μL样品，按5:1比例加入上样缓冲液，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

PbAgo在5’P/OH gDNA指导下剪切pUC19的结果如图13、14所示。

结果表明，在体系中只加入PbAgo，可能通过切开一条链，将质粒底物从超螺旋状态转变为开环状态，但未观察到质粒DNA的显著线性化或降解。当质粒被结合了单个gDNA的PbAgo靶向时，可还观察到超螺旋的减少。当使用两种PbAgo-gDNA复合物时，每种都靶向质粒的一条链，可以观察到一部分线性化的目标质粒DNA。

这暗示着PbAgo-gDNA复合物介导的每条靶标质粒DNA链的切口导致了双链DNA断裂的产生，并且5'P gDNA引导PbAgo剪切pUC19的效率比5'OH gDNA高。

4.9质粒目标片段GC含量对PbAgo剪切质粒的影响

PbAgo和质粒浓度不变，加入和不同GC含量片段互补配对的一对gDNA，在50mMNaCl和2mM Mn²⁺浓度下，在37℃反应3h，测定目标片段GC含量对Ago剪切质粒DNA的活性的影响。反应结束后，取10μL样品，按5:1比例加入上样缓冲液，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

不同GC含量目标片段(50bp)：

14％GC：

FW ssDNA：TTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAA(SEQ IDNO:23)

RV ssDNA：TTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAA(SEQ IDNO:24)

FW gDNA序列：5’P-TTAGATTGATTTAAAACTTCA 3’(SEQ ID NO:25)

Rv gDNA序列：5’P-TGAAGTTTTAAATCAATCTAA 3’(SEQ ID NO:26)

20％GC：

FW ssDNA:ATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGT(S EQ IDNO:27)

RV ssDNA:ACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTAT(S EQ IDNO:28)

FW gDNA序列：5’P-TTAAAACTTCATTTTTAATTT 3’(SEQ ID NO:29)

Rv gDNA序列：5’P-AAATTAAAAATGAAGTTTTAA 3’(SEQ ID NO:30)

36％GC：

FW ssDNA:GATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGT(SEQ IDNO:31)

RV ssDNA:ACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATC(SEQ IDNO:32)

FW gDNA序列：5’P-TCTCATGACCAAAATCCCTTA 3’(SEQ ID NO:33)

Rv gDNA序列：5’P-TAAGGGATTTTGGTCATGAGA 3’(SEQ ID NO:34)

50％GC：

FW ssDNA:ACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGT(SEQ IDNO:35)

RV ssDNA:ACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGT(SEQ IDNO:36)

FW gDNA序列：5’P-CGTGAGTTTTCGTTCCACTGA 3’(SEQ ID NO:37)

Rv gDNA序列：5’P-TCAGTGGAACGAAAACTCACG 3’(SEQ ID NO:38)

60％GC：

FW ssDNA:ACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCT(SEQ IDNO:39)

RV ssDNA:AGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGT(SEQ IDNO:40)

FW gDNA序列：5’P-CCCGGCATCCGCTTACAGACA 3’(SEQ ID NO:41)

Rv gDNA序列：5’P-TGTCTGTAAGCGGATGCCGGG 3’(SEQ ID NO:42)

70％GC：

FW ssDNA:CAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCT(SEQ IDNO:43)

RV ssDNA:AGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTG(SEQ IDNO:44)

FW gDNA序列：5’P-CGCCCTGACGGGCTTGTCTGC 3’(SEQ ID NO:45)

Rv gDNA序列：5’P-GCAGACAAGCCCGTCAGGGCG 3’(SEQ ID NO:46)

结果如图15所示，50bp目标DNA片段的GC含量越低，PbAgo的剪切效果越好。PbAgo能够剪切GC含量不高于36％的双链DNA片段，但尽管片段GC含量高达70％，PbAgo能使部分pUC19形成开环。

讨论

2019年，有文献报道利用别构转录因子(allosteric transcription factor，aTF)的别构效应可实现对目标小分子简单、灵敏、快速和低成本的检验。aTF可将难以检测的小分子信号转换成极易检测的DNA信号，是一种极具开发价值的小分子检测生物识别元件。来源于大肠杆菌UMN026的别构转录因子HosA能够特异性识别对羟基苯甲酸(p-HBA)，p-HBA是酚酸类物质，具有抑制细菌、真菌和酶的作用，常用作食品、药品、化妆品中的防腐剂。

而在本发明中，通过对PbAgo酶的功能活性的摸索和反应条件的优化，利用HosA的别构效应和PbAgo结合siDNA指导链剪切DNA靶标链的特点，开发和提供了了一种更为简单、更为快捷、低成本的p-HBA检测平台。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种新型中温原核Argonaute蛋白PbAgo表征及应用

<130> P2021-0607

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 705

<212> PRT

<213> 北拟杆菌(Paenibacillus borealis)

<400> 1

Met Asn Thr Pro Leu Thr His Tyr Val Leu Thr Glu Trp Glu Ser Asp

1 5 10 15

Thr Asn Thr Asn Val Leu His Ile His Leu Tyr Thr Leu Pro Val Arg

20 25 30

Asn Val Phe Glu Gln His Lys Glu Asn Gly Asn Ala Cys Phe Asp Leu

35 40 45

Arg Lys Leu Asn Arg Ser Leu Ile Ile Asp Phe Tyr Asp Gln Tyr Ile

50 55 60

Val Ser Trp Gln Pro Ile Glu Asn Trp Gly Glu Tyr Thr Phe Thr Gln

65 70 75 80

His Glu Tyr Arg Ser Ile Asn Pro Thr Ile Leu Ala Glu Arg Ala Ile

85 90 95

Leu Glu Arg Leu Leu Leu Arg Thr Ile Glu Ser Val Gln Pro Lys Lys

100 105 110

Glu Ile Ala Ala Gly Ser Arg Lys Phe Thr Trp Leu Lys Ala Glu Lys

115 120 125

Val Val Glu Asn Ile Ser Ile His Arg Val Ile Gln Cys Asp Val Thr

130 135 140

Val Asp Tyr Ala Gly Lys Ile Ser Val Gly Phe Asp Leu Asn His Ser

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Asn Glu Ser Val Tyr Asp Leu Met Lys Ser Asn Ala Ile

165 170 175

Phe Lys Gly Asp Arg Val Ile Asp Ile Tyr Asn Asn Leu His Tyr Glu

180 185 190

Phe Val Glu Ile Ser Asn Ser Thr Ile Asn Asp Ser Ile Pro Glu Leu

195 200 205

Asn Gln Ser Val Val Asn Tyr Phe Thr Lys Glu Arg Lys Gln Ala Trp

210 215 220

Lys Val Asp Lys Leu Glu Gln Ser Met Pro Val Val Tyr Leu Lys Ala

225 230 235 240

Phe Asn Gly Ser Arg Ile Ala Tyr Ala Pro Ala Met Leu Gln Lys Glu

245 250 255

Leu Thr Phe Glu Ser Leu Pro Thr Asn Val Val Arg Gln Thr Ser Glu

260 265 270

Ile Phe Lys Gln Asn Ala Asn Gln Lys Ile Lys Thr Leu Leu Asp Glu

275 280 285

Ile Gln Lys Ile Leu Ala Arg Thr Asp Lys Ile Lys Phe Asn Lys Gln

290 295 300

Lys Leu Leu Val Gln Gln Ala Gly Tyr Glu Ile Leu Glu Leu Ser Asn

305 310 315 320

Pro Asn Leu Gln Phe Gly Lys Asn Val Thr Gln Thr Gln Leu Lys Tyr

325 330 335

Gly Leu Asp Lys Gly Gly Val Val Ala Ser Lys Pro Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Leu Leu Val Tyr Pro Glu Leu Ile Asp Thr Lys Leu Asp Val Ile Asn

355 360 365

Asp Phe Asn Asp Lys Leu Asn Ala Leu Ser His Lys Trp Gly Val Pro

370 375 380

Leu Ser Ile Leu Lys Lys Ser Gly Ala Tyr Arg Asn Arg Pro Ile Asp

385 390 395 400

Phe Thr Asn Pro His Gln Leu Ala Ile Leu Leu Lys Glu Leu Thr Lys

405 410 415

Asn Leu Phe Gln Glu Leu Thr Leu Val Ile Ile Pro Glu Lys Ile Ser

420 425 430

Gly Met Trp Tyr Asp Leu Val Lys Lys Glu Phe Gly Gly Asn Ser Ser

435 440 445

Val Pro Thr Gln Phe Ile Thr Ile Glu Thr Leu Gln Lys Ala Asn Asp

450 455 460

Tyr Ile Leu Gly Asn Leu Leu Leu Gly Leu Tyr Ser Lys Ser Gly Ile

465 470 475 480

Gln Pro Trp Ile Leu Asn Ser Pro Leu Ser Ser Asp Cys Phe Ile Gly

485 490 495

Leu Asp Val Ser His Glu Ala Gly Arg His Ser Thr Gly Ile Val Gln

500 505 510

Val Val Gly Lys Asp Gly Arg Val Leu Ser Ser Lys Ala Asn Thr Ser

515 520 525

Asn Glu Ala Gly Glu Lys Ile Arg His Glu Thr Met Cys Gln Ile Val

530 535 540

Tyr Ser Ala Ile Asp Gln Tyr Gln Gln His Tyr Asn Glu Arg Pro Lys

545 550 555 560

His Val Thr Phe His Arg Asp Gly Phe Cys Arg Glu Asp Leu Leu Ser

565 570 575

Leu Asp Glu Val Met Asn Ser Leu Asp Val Gln Tyr Asp Met Val Glu

580 585 590

Ile Ile Lys Lys Thr Asn Arg Arg Met Ala Leu Thr Val Gly Lys Gln

595 600 605

Gly Trp Glu Thr Lys Pro Gly Leu Cys Tyr Leu Lys Asp Glu Ser Ala

610 615 620

Tyr Leu Ile Ala Thr Asn Pro His Pro Arg Val Gly Thr Ala Gln Pro

625 630 635 640

Ile Lys Ile Ile Lys Lys Lys Gly Ser Leu Pro Ile Glu Ala Ile Ile

645 650 655

Gln Asp Ile Tyr His Leu Ser Phe Met His Ile Gly Ser Leu Leu Lys

660 665 670

Cys Arg Leu Pro Ile Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Leu Ser Ser Thr Phe

675 680 685

Phe Asn Arg Gln Trp Leu Pro Ile Asp Ser Gly Glu Ala Leu His Phe

690 695 700

Val

705

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> ssDNA

<400> 2

ataaataaat ttttaaatat gctccatcat ccaacatatc atata 45

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> gDNA

<400> 3

tgaggtagta ggttgtatag t 21

<210> 4

<211> 45

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> ssRNA

<400> 4

auaaauaaau uuuuaaauau gcuccaucau ccaacauauc auaua 45

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> gRNA

<400> 5

ugagguagua gguuguauag u 21

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 35nt gDNA

<400> 6

tgaggtagta ggttgtatag tatattaaat tattt 35

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 30nt gDNA

<400> 7

tgaggtagta ggttgtatag tatattaaat 30

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 25nt gDNA

<400> 8

tgaggtagta ggttgtatag tatat 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 21nt gDNA

<400> 9

tgaggtagta ggttgtatag t 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 18nt gDNA

<400> 10

tgaggtagta ggttgtat 18

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 16nt gDNA

<400> 11

tgaggtagta ggttgt 16

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 15nt gDNA

<400> 12

tgaggtagta ggttg 15

<210> 13

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 14nt gDNA

<400> 13

tgaggtagta ggtt 14

<210> 14

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 13nt gDNA

<400> 14

tgaggtagta ggt 13

<210> 15

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 12nt gDNA

<400> 15

tgaggtagta gg 12

<210> 16

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 10nt gDNA

<400> 16

tgaggtagta 10

<210> 17

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 8nt gDNA

<400> 17

tgaggtag 8

<210> 18

<211> 2686

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> pUC19

<400> 18

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 60

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 120

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 180

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 240

acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 300

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 360

gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc 420

tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 480

agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 540

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 600

cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag 660

aggatccccg ggtaccgagc tcgaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 720

aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc 780

gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg 840

aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat 900

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 960

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 1020

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 1080

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 1140

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1200

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 1260

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 1320

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 1380

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 1440

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 1500

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 1560

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 1620

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 1680

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 1740

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 1800

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 1860

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 1920

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 1980

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 2040

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 2100

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 2160

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 2220

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 2280

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 2340

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 2400

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 2460

ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 2520

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 2580

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 2640

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaact 2686

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> FW ssDNA

<400> 19

ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 50

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> RV ssDNA

<400> 20

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 50

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 21nt FW gDNA

<400> 21

ttagattgat ttaaaacttc a 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 21nt RV gDNA

<400> 22

tgaagtttta aatcaatcta a 21

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 14%GC FW ssDNA

<400> 23

ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 50

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 14%GC RV ssDNA

<400> 24

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 50

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> FW gDNA

<400> 25

ttagattgat ttaaaacttc a 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> RV gDNA

<400> 26

tgaagtttta aatcaatcta a 21

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 20%GC FW ssDNA

<400> 27

atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 50

<210> 28

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 20%GC RV ssDNA

<400> 28

acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 50

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> FW gDNA

<400> 29

ttaaaacttc atttttaatt t 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> RV gDNA

<400> 30

aaattaaaaa tgaagtttta a 21

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 36%GC FW ssDNA

<400> 31

gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 50

<210> 32

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 36%GC RV ssDNA

<400> 32

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 50

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> FW gDNA

<400> 33

tctcatgacc aaaatccctt a 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> RV gDNA

<400> 34

taagggattt tggtcatgag a 21

<210> 35

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 50%GC FW ssDNA

<400> 35

accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 50

<210> 36

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 50%GC RV ssDNA

<400> 36

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 50

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> FW gDNA

<400> 37

cgtgagtttt cgttccactg a 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> RV gDNA

<400> 38

tcagtggaac gaaaactcac g 21

<210> 39

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 60%GC FW ssDNA

<400> 39

acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 50

<210> 40

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 60%GC RV ssDNA

<400> 40

agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt 50

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> FW gDNA

<400> 41

cccggcatcc gcttacagac a 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> RV gDNA

<400> 42

tgtctgtaag cggatgccgg g 21

<210> 43

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 70%GC FW ssDNA

<400> 43

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct 50

<210> 44

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 70%GC RV ssDNA

<400> 44

agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 50

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> FW gDNA

<400> 45

cgccctgacg ggcttgtctg c 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> RV gDNA

<400> 46

gcagacaagc ccgtcagggc g 21

Claims (10)

1.一种用于检测靶标分子的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：

(a)向导DNA(gDNA)；

(b)核酸酶Argonaute(Ago)；和

(c)报告核酸，其中若所述报告核酸被剪切，所述的剪切是可以被检测出的。

2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的靶标分子是核酸分子，并且所述核酸分子可以和报告核酸是同一种分子；

或者，所述靶标分子是化学小分子，并且所述的检测体系中还包括：(d)别构转录因子，所述的别构转录因子同时具有结合所述报告核酸和所述化学小分子的活性，并且所述报告核酸和所述化学小分子与所述别构转录因子的结合具有竞争性。

3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的核酸酶Argonaute来源于北拟杆菌(Paenibacillus borealis)，所述的核酸酶Argonaute是核酸酶PbAgo。

4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述核酸酶的工作温度为10-65℃，较佳地为20-55℃，更佳地为30-45℃，更佳地为30-37℃。

5.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的向导DNA是5’端磷酸化或羟基化的单链DNA分子。

6.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的向导DNA的长度为8-35nt，较佳地为14-21nt，最佳地为15-18nt。

7.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的检测体系还包括：(e)二价金属离子。

8.一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(i)如权利要求1所述的检测体系或用于配制所述检测体系的试剂；和

(ii)使用说明书，所述说明书描述了用所述的检测体系检测靶标分子的方法。

9.一种检测样本中是否存在靶标分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)提供如权利要求1所述的用于检测靶标分子的检测体系；和

(b)将所述检测体系与待检测的样本在一定温度下进行反应，从而形成反应溶液；

(c)对所述反应溶液进行检测，从而获得剪切信号值；

其中，所述反应溶液中检测到剪切信号值，则表示所述样本中存在靶标分子；而所述反应溶液中没有检测到剪切信号值，则表示所述样本中不存在靶标分子。

10.一种核酸酶Argonaute的用途，其特征在于，用于制备检测靶标分子的试剂或试剂盒。

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