CN110117551B - 生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。该工程菌是通过将酵母基因组中全局抑制因子基因敲除和角鲨烯合成酶基因下调，表达瓦伦西亚烯合成酶和过表达HMG‑CoA还原酶，且优化瓦伦西亚烯合成酶启动子获得。本发明通过游离载体过表达代谢途径中的关键基因，提高瓦伦西亚烯合成途径中的代谢通量，优化酵母细胞工厂，再结合瓦伦西亚烯合成酶启动子的适配性研究，经培养优化得到的酿酒酵母工程菌实现了对瓦伦西亚烯的高效生产，瓦伦西亚烯细胞干重产量可达到124.40mg/g，具有广阔的工业应用前景，具有积极的经济和社会发展的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
瓦伦西亚烯，淡黄色澄清液体，具有甜橙油特征香气，可以与无水乙醇混溶，难溶于水，相对密度(20℃)0.9194g/L，折光率1.5001，闪点100℃，分子式为C15H24。瓦伦西亚烯作为重要的倍半萜类化合物，一直是消费者对众多产品偏好的关键因素，产品包括食品、饮料、香水、个人护理和家人护理产品等。
瓦伦西亚烯目前主要通过蒸馏、萃取等工艺从柑橘精油中获得，过程繁琐且高耗。柑橘精油是由柑橘类水果皮冷榨而得，250万公斤的橙子才能获得1公斤的瓦伦西亚烯。而我国的柑橘绝大多数是以鲜果销售为主，因此瓦伦西亚烯提取所需的原材料严重不足，造成瓦伦西亚烯的市场价格昂贵。目前瓦伦西亚烯的生产方法主要包括三种：化学合成法、植物提取法和生物转化法。众所周知，化学合成的过程中，通常伴随一些非环境友好型的氧化剂，会对环境造成严重的伤害。萜类化合物在植物中含量很低，植物提取法易对野生植物资源造成严重破坏，并且其作物的种植受到环境、气候、季节、运输等诸多因素的影响(Lian,J.et al Recent advances in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae:New tools and their applications.Metabolic Engineering 2018,50,85-108.)。相比较而言，生物转化法没有诸多条件的限制，而且绿色环保，是瓦伦西亚烯理想的生产方式。近年来，随着合成生物学技术的发展，利用生物合成的方法获得瓦伦西亚烯成为可能。许多用作香料、香精，保健品和药物的高价值天然产物都是由生物体天然合成的，但是在工业化生产的过程中并没有实现最佳的状态。例如，许多重要的抗肿瘤药物比如紫杉醇、长春花碱、长春新碱和喜树碱都是由植物得来的。植物次生代谢产物通常通过提取得到，但是最终的产物产量通常很低，因为天然的次生代谢产物水平很低而且要经过复杂的提取过程。此外，许多真菌的代谢产物也具有许多价值，能够抗细菌，但这些真菌由于菌丝生长趋于形成密集的菌丝体，因此不能大规模培养。虽然有些天然产物可以经化学合成得到。这些化合物复杂的化学结构使得化学合成的过程很困难。所以提供可供选择的合成路线是非常有必要的。随着合成生物学的发展，对于来源于植物的产物，设计天然生产者的代谢途径以提高目标产物的量成为了一种普遍的手段。但是植物代谢工程错综复杂，需要作出许多努力。一种更有希望的途径是通过植物细胞培养获得产物，当前该途径被用来生产紫杉醇、人参、花青素，但是这个途径也充满挑战，存在培养不均匀，低生长率，产量不稳定，对压力敏感以及聚集等方面的问题。
鉴于以上原因，在微生物中重新构建生物合成途径以生产高价值化合物的方法日益受到关注。微生物系统可通过更快更经济的途径合成高价值的分子，且在微生物宿主中重构路线减少了中间体的损失，在天然宿主中有其他的支路竞争中间体。再者，这种重建提供了改变生物合成途径的机会，可以合成效能更好且治疗范围更广阔的新类似物，另外，微生物宿主生长速度快且适用于多种基因工程工具(可以促进代谢途径的优化)。几种微生物，如大肠杆菌、酿酒酵母已经分别作为原核生物和真核生物的代表宿主被广泛应用(Krivoruchko,A.et al Production of natural products through metabolicengineering of Saccharomyces cerevisiae.Current Opinion in Biotechnology2015,35,7-15.)。
发明内容
本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一种生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌的构建方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述构建方法构建得到的生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌。
本发明的再一目的在于提供上述生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌的应用。
本发明的目的通过下列技术方案实现：生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建靶向敲除全局抑制因子(ROX1)和下调角鲨烯合成酶(ERG9)的引导RNA(gRNA)表达载体；
(2)构建瓦伦西亚烯合成酶(CnVS)重组表达载体；
(3)在步骤(2)得到的瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体中引入HMG-CoA还原酶(tHMG1)表达盒，获得过表达HMG-CoA还原酶和表达瓦伦西亚烯合成酶的重组表达载体；
(4)将步骤(1)得到的引导RNA表达载体转化酿酒酵母感受态细胞，获得突变菌株PK2-M；
(5)将步骤(3)得到的过表达HMG-CoA还原酶和表达瓦伦西亚烯合成酶的重组表达载体转化步骤(4)得到的突变菌株PK2-M的感受态细胞，获得生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌。
步骤(1)中所述的全局抑制因子的靶向核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
步骤(1)中所述的角鲨烯合成酶的靶向核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
步骤(1)中所述的引导RNA表达载体通过如下方法获得：以p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t为模板分别扩增ROX1-1、ROX1-2、ERG9-1和ERG9-2片段，并分别将ROX1-1和ROX1-2、ERG9-1和ERG9-2片段重组，获得带有ROX1和ERG9引导RNA序列的重组载体，然后以这两个重组载体为模板分别扩增靶向ROX1和ERG9的片段，并将片段连接，获得靶向敲除全局抑制因子(ROX1)和下调角鲨烯合成酶的引导RNA表达载体。
步骤(2)中所述的瓦伦西亚烯合成酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
步骤(2)中所述的瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体通过如下方法获得：以YEplac181为出发载体，引入瓦伦西亚烯合成酶表达盒，得到瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体。
所述的瓦伦西亚烯合成酶表达盒中，启动子为组成型启动子；优选为TDH3和TEF1中的一种；终止子为ADH1。
所述的TDH3的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
所述的TEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
所述的ADH1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
步骤(3)中所述的HMG-CoA还原酶是表达缺乏N端调控区域的截短HMG-CoA还原酶，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
步骤(3)中所述的过表达HMG-CoA还原酶和表达瓦伦西亚烯合成酶的重组表达载体通过如下方法获得：以酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1Ca的基因组为模板扩增tHMG1片段，将其与步骤(2)得到的瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体连接转化，获得HMG-CoA还原酶的重组表达载体，再以其为模板扩增出HMG-CoA还原酶表达盒，然后与步骤(2)得到的瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体连接转化，获得过表达HMG-CoA还原酶和表达瓦伦西亚烯合成酶的重组表达载体。
所述的HMG-CoA还原酶表达盒中，启动子为TDH3和TEF1中的一种；终止子为ADH1。
步骤(4)优选如下：在同源重组片段存在的情况下，采用Cas9系统协助步骤(1)得到的引导RNA表达载体转化酿酒酵母感受态细胞，实现酵母基因组的定点编辑，获得突变菌株PK2-M。
所述的同源重组片段为donor1和donor2，核苷酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9所示。
所述的Cas9系统为酵母基因编辑Cas9表达质粒p414-TEF1p-Cas9-CYC1t。
步骤(4)中所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741、酿酒酵母BJ5464和酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1Ca中的一种；优选为酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1Ca。
所述的生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌的构建方法，还包括将步骤(5)得到的工程菌进行活化、扩繁培养的步骤：将获得的工程菌活化，接种，培养，接种，发酵。
所述的活化使用的平板为SD/ΔTrp/ΔLeu固体平板。
所述的培养和所述的发酵使用的培养基为SD/ΔTrp/ΔLeu液体培养基。
所述的培养的条件为：温度30℃、转速200rpm培养48h。
所述的发酵的条件为：溶氧30％以上、温度25℃发酵158h。
所述的发酵的过程中，每48h补加一次葡萄糖。
一种生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌，通过上述构建方法构建得到。
上述生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌在工业生产瓦伦西亚烯中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明中生产瓦伦西亚烯的工程菌提高了细胞产能，实现了酿酒酵母细胞工厂对瓦伦西亚烯的高效生产，瓦伦西亚烯细胞干重含量可达到124.40mg/g。
2、本发明中生产瓦伦西亚烯的工程菌是在CRISPR/Cas9系统引导下实现基因组定点编辑，通过游离载体过表达代谢途径中的关键基因，提高瓦伦西亚烯合成途径中的代谢通量，优化酵母细胞工厂，再结合瓦伦西亚烯合成酶启动子的适配性研究，经培养优化得到的。具体是在酿酒酵母中表达瓦伦西亚烯合成酶基因CnVS，同时过表达酵母内源的HMG-CoA还原酶基因tHMG1，敲除全局抑制因子基因ROX1，下调角鲨烯合成酶基因ERG9以及优化瓦伦西亚烯的启动子和终止子获得。生物合成瓦伦西亚烯的代谢见图1
3、相对于传统的化学合成或天然提取的方法，微生物中重新构建生物合成途径生产化合物的方法具有周期短，污染小，节约资源的特点。本发明生物合成瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌具有广阔的工业应用前景，具有积极的经济和社会发展的意义。
附图说明
图1为生物合成瓦伦西亚烯的代谢图。
图2是tHMG1表达盒。
图3为瓦伦西亚烯GC-FID检测峰图。
图4为实施例5中不同菌株摇瓶培养的产量图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体的构建
以质粒YEplac181(购自Invitrogen公司)为出发载体，在该载体中的EcoRI和PstI位点引入瓦伦西亚烯合成酶基因CnVS的表达盒，得到完整的不同启动子的CnVS重组表达载体，标记为YEp181-PTDH3-VS-TADH1和YEp181-PTEF1-VS-TADH1。具体实施如下：
1.基因表达元件的克隆
使用Yeast DNA Kit试剂盒(购自Omega公司)提取酿酒酵母S.cerevisiaeCEN.PK2-1Ca的基因组。以基因组为模板，以TDH3-F/TDH3-R引物对扩增TDH3启动子；以基因组为模板，以ADH1-F/ADH1-R引物对扩增ADH1终止子；以基因组为模板，以TEF1-F/TEF1-R引物对扩增TEF1启动子。
所用引物序列如下：
TDH3-F：5′-GAGCGAGTCGACACAGTTTATTCCTGGCATCC-3′；
TDH3-R：5′-GTTACCGAGCTCTTTGTTTGTTTATGT-3′；
ADH1-F：5′-GAGCGATCTAGAAGCTTTGGACTTCTTCGCCA-3′；
ADH1-R：5′-TTTACACTCGAGCATAGGGTAGGGGAATTTCGA-3′；
TEF1-F：5′-GAGCGAGTCGAC3CATAGCTTCAAAATGTTTCTACT-3′；
TEF1-R：5′-G GTTACCGAGCTC3CTTAGATTAGATTGCTATGCTT-3′。
2.CnVS基因重组表达载体的构建
以CnVS基因为模板(上海生工生物有限公司合成)，以VS-U/VS-D引物对扩增带有酶切位点SmaI和BamHI的CnVS基因片段，将其插入到SmaI和BamHI双酶切的质粒pYES2载体(购自Invitrogen公司)上，标记为pYES2-VS。通过SalI和SacI双酶切载体pYES2-VS和TDH3启动子片段，经常规连接转化，获得启动子为TDH3的pYES2-VS1。
通过XbaI和XhoI酶切pYES2-VS1和ADH1片段，经常规的连接转化，获得终止子为ADH1的pYES2-VS2。
以pYES2-VS2为模板，TDH3-F2/ADH1-R2引物对扩增CnVS完整的表达盒，引入酶切位点EcoRI和PstI。分别用EcoRI和PstI酶切YEplac181和CnVS完整的表达盒，经常规的连接转化，获得含有CnVS表达盒的YEp181-PTDH3-VS-TADH1的重组载体。
YEp181-PTEF1-VS-TADH1表达载体的构建方法同上述YEp181-PTDH3-VS-TADH1的构建方法。
所用引物序列如下：
VS-U：5′-GTTACCGAGCTCGTTACCGGATCCATGGCTGAAATGTTCAACGGA-3′；
VS-D：5′-GAGCGATCTAGAGAGCGACCCGGGTTAGGGAATAATCGGTTCGAC-3′；
TDH3-F2：5′-GTTACCCTGCAGGAAT TCTTTACCGT CGACACAGTT-3′；
ADH1-R2：5′-GTTACCCTGC AGTTTACCCT CGAGCATAGG GTAGGGGAATTTCGA-3′。
实施例2引导RNA(gRNA)重组表达载体的构建
以靶向刀豆氨酸转运酶的gRNA质粒p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t(Addgene公司购得)为构建骨架，构建靶向敲除ROX1和下调ERG9的gRNA重组表达载体p426-SNR52p-gRNA.ROX1-ERG9.Y-SUP4t。具体实施如下：
1.PCR扩增rox1-gRNA、erg9-gRNA表达载体片段
以p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t为模板，以Tong-F/ROX1-R、ROX1-F/Tong-R引物对分别扩增ROX1-1和ROX1-2(ROX1-1和ROX1-2分别具有如SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示核苷酸序列)两个片段。
以p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t为模板，Tong-F/ERG9-R、ERG9-F/Tong-R引物对分别扩增得到ERG9-1和ERG9-2(ERG9-1和ERG9-2分别具有如SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示核苷酸序列)两个片段。
2.p426-SNR52p-gRNA.ROX1.Y-SUP4t重组表达载体的构建
利用
II重组克隆试剂盒，将ROX1-1和ROX1-2两个片段重组，获得携带有ROX1引导RNA序列的重组载体p426-SNR52p-gRNA.ROX1.Y-SUP4t。
3.p426-SNR52p-gRNA.ERG9.Y-SUP4t重组表达载体的构建
利用
II重组克隆试剂盒，将ERG9-1和ERG9-2两个片段重组，获得携带有ERG9引导RNA序列的重组载体p426-SNR52p-gRNA.ERG9.Y-SUP4t。
4.p426-SNR52p-gRNA.ROX1-ERG9.Y-SUP4t重组表达载体的构建
以p426-SNR52p-gRNA.ROX1.Y-SUP4t为模板，以Vector2-F/Tong2-R为扩增引物对获得靶向ROX1基因的线性化片段。然后以p426-SNR52p-gRNA.ERG9.Y-SUP4t为模板，Tong2-F/Vector2-R为扩增引物对扩增出靶向ERG9基因的线性化片段。最终利用ClonExpress II重组克隆试剂盒，将两线性化片段通过同源臂重组方法连接成一个完整的p426-SNR52p-gRNA.ROX1-ERG9Y-SUP4t gRNA重组表达载体。
具体体系：2μL 5×CEII buffer、1μL Exnase II、0.8μL靶向ROX1基因的线性化片段、1.2μL靶向ERG9基因的线性化片段、5 μL蒸馏水。37℃反应30min，然后按照常规方法，采用大肠杆菌E.coli DH5α的感受态细胞(购于Takara公司)作为转化宿主进行转化。
所用引物序列如下：
Tong-F：5′-TAATAATGGTTTCTTAGTATGA-3′；
Tong-R：5′-ACTAAGAAACCATTATTATCAT-3′；
ROX1-F：5′-ACAGGATCTTAATAGACGAAGTTTTAGAGCTAGAAATA-3′；
ROX1-R：5′-TTCGTCTATTAAGATCCTGTGATCATTTATCTTTCACTG-3′；
ERG9-F：5′-CAACAACAATACCGACTTACCAT GTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3′；
ERG9-R：5′-ATGGTAAGTCGGTATTGTTGTTGGATCATTTATCTTTCACTG-3′；
Tong2-F：5′-GAACAAAAGCTGGAGCT-3′；
Tong2-R：5′-CCTTTAGTGAGGGTTAA-3′；
Vector2-F：5′-TTAACCCTCACTAAAGGTCTTTGAAAAGATAATGTATGA-3′；
Vector2-R：5′-AGCTCCAGCTTTTGTTCAAGACATAAAAAACAAAAAAAG-3′。
实施例3过表达tHMG1表达载体的构建
以实施例1中构建好的YEp181-PTDH3-VS-TADH1为出发载体，引入完整的tHMG1表达盒，获得过表达tHMG1的重组表达载体，标记为YEp181-tHMG1-VS1。具体实施如下：
1.以酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1Ca的基因组(同实施例1)为模板，以tHMG1-U/tHMG1-D为扩增引物对扩增带有酶切位点BamHI和SmaI的tHMG1基因片段。
2.过表达tHMG1重组表达载体的构建
用BamHI和SmaI双酶切YEp181-PTDH3-VS-TADH1载体和tHMG1的片段，载体通过常规的切胶回收纯化，载体和tHMG1片段经连接转化，获得过表达tHMG1的重组表达载体，标记为YEp181-PTDH3-tHMG1-TADH1。再以YEp181-PTDH3-tHMG1-TADH1为模板，以TDH3-F/ADH1T-R为引物，扩增出PTDH3-tHMG1-TADH1表达盒(图2)，分别用SalI和PstI酶切片段，XhoI和PstI酶切YEp181-PTDH3-VS-TADH1载体，经连接转化，获得同时过表达tHMG1和表达CnVS的重组表达载体，标记为YEp181-tHMG1-VS1。
同上述YEp181-tHMG1-VS1的构建方法，用SalI和PstI双酶切P TEF1-tHMG1-TADH1，XhoI和PstI酶切YEp181-PTEF1-VS-TADH1载体(实施例1制备得到)，载体和tHMG1表达盒最后经连接转化，获得过表达tHMG1和表达CnVS的重组表达载体，标记为YEp181-tHMG1-VS2。
所用引物序列如下：
tHMG1-U：5′-GTTACCGAGCTCGTTACCGGATCCATGGACCAATTGGTGAAAACTGAA-3′；
tHMG1-D：5′-GAGCGATCTAGAGAGCGACCCGGGTTAGGATTTAATGCAGGTGAC-3′。
TDH3-F：5′-GAGCGAGTCGACACAGTTTATTCCTGGCATCC-3′；
ADH1T-R：5′-TTTACACTCGAGCATAGGGTAGGGGAATTTCGA-3′。
实施例4产瓦伦西亚烯工程菌的构建
将实施例2中构建好的gRNA表达载体p426-SNR52p-gRNA.ROX1-ERG9.Y-SUP4t转入酵母感受态细胞，在p414-TEF1p-Cas9-CYC1t载体(购自Addgene公司)的协助下实现酵母基因组的定点编辑。然后将实施例1和3所构建的重组表达载体分别转入经过定点编辑的酵母感受态细胞，获得重组酵母表达菌株，分别标记为PK2-1，PK2-2，PK2-3和PK2-4。具体实施如下：
1.扩增同源重组片段
分别以引物对ROX1-M-F/ROX1-M-R、UAS-M-F/UAS-M-R通过上下游之间的退火延伸互为模板，分别获得同源重组片段donor1和donor2。
2.酵母基因组的ROX1和ERG9位点编辑的验证
将实施例2制备的p426-SNR52p-gRNA.ROX1-ERG9.Y-SUP4t、p414-TEF1p-Cas9-CYC1t载体及同源重组片段donor1和donor2转入酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK-1Ca的感受态细胞(
MYA-1108TM)，ROX1基因gRNA和ERG9基因gRNA序列分别定位，实现酵母基因组ROX1基因的敲除、ERG9基因的下调，获得突变菌株PK2-M。
3.产瓦伦西亚烯工程菌的构建
将实施例1制备得到的YEp181-PTDH3-VS-TADH1、YEp181-PTEF1-VS-TADH1，实施例3制备得到的YEp181-tHMG1-VS1、YEp181-tHMG1-VS2分别转入突变菌株PK2-M的感受态细胞，获得重组表达菌株PK2-1、PK2-2、PK2-3和PK2-4。并将YEp181-PTDH3-VS-TADH1转入S.cerevisiaeCEN.PK2-1Ca酵母感受态细胞，获得对照菌株PK2-C。
所用引物序列如下：
ROX1-M-F：5′-GCATTTATTCTGTTCAGACAGCACTACCACAGGATCTTAATAGACGAATAACCGCTCAA-3′；
ROX1-M-R：5′-AAATGTTTGAATTATGGGGTATTTCCACACCTTGAGCGGTTATTCGTCTATTAAGATCC-3′；
UAS-M-F：5′-CTCTGACTCAGTACATTTCATAGCCCATCTTCAACAACAATACCGACTTATCGGAAGGC-3′；
UAS-M-R：5′-GCTCGTTTAGGCACTAAACCCAAAACCGATAACGCCTTCCGATAAGTCGGTATTGTT-3′。
实施例5工程菌株培养产瓦伦西亚烯
将实施例4构建的工程菌株，经营养缺陷型平板SD/ΔTrp/ΔLeu固体平板活化后，接种到液体培养基，按30℃摇瓶培养。然后接种PK2-4菌株的种子液，在3L发酵罐中进行上罐培养。具体实施如下：
1.菌种摇瓶培养
从平板挑取PK2-C、PK2-1、PK2-2、PK2-3和PK2-4单菌落，分别接种于5mL SD/ΔTrp/ΔLeu液体培养基(葡萄糖20.0g/L、DO Supplement 0.62g/L、无氨基酵母氮源YNB6.7g/L、Ura 0.02g/L)中，30℃、200rpm培养22～24h，待OD600长到1～3。将种子液分别接种于含10mL SD/ΔTrp/ΔLeu的50mL小摇瓶中，每株菌三个平行，并加入2mL的正十二烷覆盖，起始OD600为0.05，分别在30℃培养48h。
2.菌种发酵罐培养
在3L发酵罐中加入1L SD/ΔTrp/ΔLeu液体培养基，并加入摇瓶培养得到的PK2-4种子液至起始OD600为0.3～0.5，以20％(v/v)的正十二烷覆盖，共3个平行发酵培养过程。发酵罐控制溶氧在30％以上，发酵罐的温度控制在25℃。发酵过程中每48h补加50mL浓度为质量分数40％的葡萄糖(补加两次)，培养158h。
3.瓦伦西亚烯的检测
分别取步骤1摇瓶培养后得到的培养液和步骤2发酵罐培养后得到的发酵液的上层有机相500μL，加入500μL的乙酸乙酯，再加入2μL 25mM的异长叶烯作为内标，用0.22μm无菌有机相滤头过滤到干净的气相色谱瓶中。检测产物用到的是Hewlett-Packard 5890II气相色谱仪(GC)，色谱柱为5％Ph-Me硅氧烷柱，规格为10m×0.10mm×0.10μm，检测器为氢火焰检测器(FID)。设置的程序如下：1μL样品分流进样，分流比30:1，进样口温度250℃，检测器温度320℃，流速为0.4mL/min，柱温100℃保持10min，再以10℃/min升温至200℃，200℃保持8min，总时间为28min。打开仪器及软件，编好序列，将样品瓶按顺序放到样品盘中，进样。瓦伦西亚烯的出峰时间为14.639min(图3)。
检测结果显示，在摇瓶培养条件下，菌株PK2-C、PK2-1、PK2-2、PK2-3和PK2-4瓦伦西亚烯的产量分别可达1.54mg/g、5.40mg/g、7.56mg/g、8.27mg/g和16.90mg/g(图4)，敲除酵母基因组ROX1基因并下调ERG9基因后，菌株的瓦伦西亚烯产量提高了3倍以上，而过表达tHMG1的菌株产量能够进一步显著提升。并且，在发酵罐培养后，表达CnVS和过表达tHMG1、敲除ROX1和下调ERG9，且CnVS的启动子优化后的菌株PK2-4的瓦伦西亚烯最大产量可达到124.40mg/g细胞干重，最大生物量为2.60g/L。其余两次菌株PK2-4发酵培养的瓦伦西亚烯产量分别为121.01mg/g和2.44g/L，生物量分别为122.95mg/g和2.53g/L，证明了本发明的酿酒酵母工程菌可稳定遗传，用于生产瓦伦西亚烯的产量稳定。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120>生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ROX1
<400> 1
accacaggat cttaatagac gaatggaccg ctcaaggtgt ggaaataccc ca 52
<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ERG9
<400> 2
caacaacaat accgacttac catcctattt gctttgccct ttttcttttc cactgcactt 60
tgcatcggaa ggcgttatcg gttttgggtt 90
<210> 3
<211> 1770
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CnVS
<400> 3
atggctgaaa tgtttaatgg aaattccagc aatgatggaa gttcttgcat gcccgtgaag 60
gacgcccttc gtcggactgg aaatcatcat cctaacttgt ggactgatga tttcatacag 120
tccctcaatt ctccatattc ggattcttca taccataaac atagggaaat actaattgat 180
gagattcgtg atatgttttc taatggagaa ggcgatgagt tcggtgtact tgaaaatatt 240
tggtttgttg atgttgtaca acgtttggga atagatcgac attttcaaga ggaaatcaaa 300
actgcacttg attatatcta caagttctgg aatcatgata gtatttttgg cgatctcaac 360
atggtggctc taggatttcg gatactacga ctgaatagat atgtcgcttc ttcagatgtt 420
tttaaaaagt tcaaaggtga agaaggacaa ttctctggtt ttgaatctag cgatcaagat 480
gcaaaattag aaatgatgtt aaatttatat aaagcttcag aattagattt tcctgatgaa 540
gatatcttaa aagaagcaag agcgtttgct tctatgtacc tgaaacatgt tatcaaagaa 600
tatggtgaca tacaagaatc aaaaaatcca cttctaatgg agatagagta cacttttaaa 660
tatccttgga gatgtaggct tccaaggttg gaggcttgga actttattca tataatgaga 720
caacaagatt gcaatatatc acttgccaat aacctttata aaattccaaa aatatatatg 780
aaaaagatat tggaactagc aatactggac ttcaatattt tgcagtcaca acatcaacat 840
gaaatgaaat taatatccac atggtggaaa aattcaagtg caattcaatt ggatttcttt 900
cggcatcgtc acatagaaag ttatttttgg tgggctagtc cattatttga acctgagttc 960
agtacatgta gaattaattg taccaaatta tctacaaaaa tgttcctcct tgacgatatt 1020
tatgacacat atgggactgt tgaggaattg aaaccattca caacaacatt aacaagatgg 1080
gatgtttcca cagttgataa tcatccagac tacatgaaaa ttgctttcaa tttttcatat 1140
gagatatata aggaaattgc aagtgaagcc gaaagaaagc atggtccctt tgtttacaaa 1200
taccttcaat cttgctggaa gagttatatc gaggcttata tgcaagaagc agaatggata 1260
gcttctaatc atataccagg ttttgatgaa tacttgatga atggagtaaa aagtagcggc 1320
atgcgaattc taatgataca tgcactaata ctaatggata ctcctttatc tgatgaaatt 1380
ttggagcaac ttgatatccc atcatccaag tcgcaagctc ttctatcatt aattactcga 1440
ctagtggatg atgtcaaaga ctttgaggat gaacaagctc atggggagat ggcatcaagt 1500
atagagtgct acatgaaaga caaccatggt tctacaaggg aagatgcttt gaattatctc 1560
aaaattcgta tagagagttg tgtgcaagag ttaaataagg agcttctcga gccttcaaat 1620
atgcatggat cttttagaaa cctatatctc aatgttggca tgcgagtaat attttttatg 1680
ctcaatgatg gtgatctctt tacacactcc aatagaaaag agatacaaga tgcaataaca 1740
aaattttttg tggaaccaat cattccatag 1770
<210> 4
<211> 500
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TDH3
<400> 4
acagtttatt cctggcatcc actaaatata atggagcccg ctttttaagc tggcatccag 60
aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca ccaaccatca gttcataggt 120
ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac aggcaaaaaa cgggcacaac 180
ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac acaaggcaat tgacccacgc 240
atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct gctctctctg atttggaaaa 300
agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt cccctacttg actaataagt 360
atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct atttcttaaa cttcttaaat 420
tctactttta tagttagtct tttttttagt tttaaaacac caagaactta gtttcgaata 480
aacacacata aacaaacaaa 500
<210> 5
<211> 399
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TEF1
<400> 5
catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca gattttctcg gactccgcgc 60
atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aatttcccct ctttcttcct 120
ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag accgcctcgt 180
ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt ttcttgaaaa 240
tttttttttt gatttttttc tctttcgatg acctcccatt gatatttaag ttaataaacg 300
gtcttcaatt tctcaagttt cagtttcatt tttcttgttc tattacaact ttttttactt 360
cttgctcatt agaaagaaag catagcaatc taatctaag 399
<210> 6
<211> 349
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ADH1
<400> 6
agctttggac ttcttcgcca gaggtttggt caagtctcca atcaaggttg tcggcttgtc 60
taccttgcca gaaatttacg aaaagatgga aaagggtcaa atcgttggta gatacgttgt 120
tgacacttct aaataagcga atttcttatg atttatgatt tttattatta aataagttat 180
aaaaaaaata agtgtataca aattttaaag tgactcttag gttttaaaac gaaaattctt 240
attcttgagt aactctttcc tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc atgaggtcgc 300
tcttattgac cacacctcta ccggccggtc gaaattcccc taccctatg 349
<210> 7
<211> 1580
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> tHMG1
<400> 7
ctgcagacca attggtgaaa actgaagtca ccaagaagtc ttttactgct cctgtacaaa 60
aggcttctac accagtttta accaataaaa cagtcatttc tggatcgaaa gtcaaaagtt 120
tatcatctgc gcaatcgagc tcatcaggac cttcatcatc tagtgaggaa gatgattccc 180
gcgatattga aagcttggat aagaaaatac gtcctttaga agaattagaa gcattattaa 240
gtagtggaaa tacaaaacaa ttgaagaaca aagaggtcgc tgccttggtt attcacggta 300
agttaccttt gtacgctttg gagaaaaaat taggtgatac tacgagagcg gttgcggtac 360
gtaggaaggc tctttcaatt ttggcagaag ctcctgtatt agcatctgat cgtttaccat 420
ataaaaatta tgactacgac cgcgtatttg gcgcttgttg tgaaaatgtt ataggttaca 480
tgcctttgcc cgttggtgtt ataggcccct tggttatcga tggtacatct tatcatatac 540
caatggcaac tacagagggt tgtttggtag cttctgccat gcgtggctgt aaggcaatca 600
atgctggcgg tggtgcaaca actgttttaa ctaaggatgg tatgacaaga ggcccagtag 660
tccgtttccc aactttgaaa agatctggtg cctgtaagat atggttagac tcagaagagg 720
gacaaaacgc aattaaaaaa gcttttaact ctacatcaag atttgcacgt ctgcaacata 780
ttcaaacttg tctagcagga gatttactct tcatgagatt tagaacaact actggtgacg 840
caatgggtat gaatatgatt tctaaaggtg tcgaatactc attaaagcaa atggtagaag 900
agtatggctg ggaagatatg gaggttgtct ccgtttctgg taactactgt accgacaaaa 960
aaccagctgc catcaactgg atcgaaggtc gtggtaagag tgtcgtcgca gaagctacta 1020
ttcctggtga tgttgtcaga aaagtgttaa aaagtgatgt ttccgcattg gttgagttga 1080
acattgctaa gaatttggtt ggatctgcaa tggctgggtc tgttggtgga tttaacgcac 1140
atgcagctaa tttagtgaca gctgttttct tggcattagg acaagatcct gcacaaaatg 1200
ttgaaagttc caactgtata acattgatga aagaagtgga cggtgatttg agaatttccg 1260
tatccatgcc atccatcgaa gtaggtacca tcggtggtgg tactgttcta gaaccacaag 1320
gtgccatgtt ggacttatta ggtgtaagag gcccgcatgc taccgctcct ggtaccaacg 1380
cacgtcaatt agcaagaata gttgcctgtg ccgtcttggc aggtgaatta tccttatgtg 1440
ctgccctagc agccggccat ttggttcaaa gtcatatgac ccacaacagg aaacctgctg 1500
aaccaacaaa acctaacaat ttggacgcca ctgatataaa tcgtttgaaa gatgggtccg 1560
tcacctgcat taaatcctaa 1580
<210> 8
<211> 92
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> donor1
<400> 8
ctctgactca gtacatttca tagcccatct tcaacaacaa taccgactta tcggaaggcg 60
ttatcggttt tgggtttagt gcctaaacga gc 92
<210> 9
<211> 90
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> donor2
<400> 9
gcatttattc tgttcagaca gcactaccac aggatcttaa tagacgaata accgctcaag 60
gtgtggaaat accccataat tcaaacattt 90
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物TDH3-F
<400> 10
gagcgagtcg acacagttta ttcctggcat cc 32
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物TDH3-R
<400> 11
gttaccgagc tctttgtttg tttatgt 27
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ADH1-F
<400> 12
gagcgatcta gaagctttgg acttcttcgc ca 32
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ADH1-R
<400> 13
tttacactcg agcatagggt aggggaattt cga 33
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物TEF1-F
<400> 14
gagcgagtcg accatagctt caaaatgttt ctact 35
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物TEF1-R
<400> 15
ggttaccgag ctccttagat tagattgcta tgctt 35
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物VS-U
<400> 16
gttaccgagc tcgttaccgg atccatggct gaaatgttca acgga 45
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物VS-D
<400> 17
gagcgatcta gagagcgacc cgggttaggg aataatcggt tcgac 45
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物TDH3-F2
<400> 18
gttaccctgc aggaattctt taccgtcgac acagtt 36
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ADH1-R2
<400> 19
gttaccctgc agtttaccct cgagcatagg gtaggggaat ttcga 45
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Tong-F
<400> 20
taataatggt ttcttagtat ga 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Tong-R
<400> 21
actaagaaac cattattatc at 22
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ROX1-F
<400> 22
acaggatctt aatagacgaa gttttagagc tagaaata 38
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ROX1-R
<400> 23
ttcgtctatt aagatcctgt gatcatttat ctttcactg 39
<210> 24
<211> 44
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ERG9-F
<400> 24
caacaacaat accgacttac catgttttag agctagaaat agca 44
<210> 25
<211> 42
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ERG9-R
<400> 25
atggtaagtc ggtattgttg ttggatcatt tatctttcac tg 42
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Tong2-F
<400> 26
gaacaaaagc tggagct 17
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Tong2-R
<400> 27
cctttagtga gggttaa 17
<210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Vector2-F
<400> 28
ttaaccctca ctaaaggtct ttgaaaagat aatgtatga 39
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Vector2-R
<400> 29
agctccagct tttgttcaag acataaaaaa caaaaaaag 39
<210> 30
<211> 48
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物tHMG1-U
<400> 30
gttaccgagc tcgttaccgg atccatggac caattggtga aaactgaa 48
<210> 31
<211> 45
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物tHMG1-D
<400> 31
gagcgatcta gagagcgacc cgggttagga tttaatgcag gtgac 45
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ADH1T-R
<400> 32
tttacactcg agcatagggt aggggaattt cga 33
<210> 33
<211> 59
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ROX1-M-F
<400> 33
gcatttattc tgttcagaca gcactaccac aggatcttaa tagacgaata accgctcaa 59
<210> 34
<211> 59
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ROX1-M-R
<400> 34
aaatgtttga attatggggt atttccacac cttgagcggt tattcgtcta ttaagatcc 59
<210> 35
<211> 59
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物UAS-M-F
<400> 35
ctctgactca gtacatttca tagcccatct tcaacaacaa taccgactta tcggaaggc 59
<210> 36
<211> 57
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物UAS-M-R
<400> 36
gctcgtttag gcactaaacc caaaaccgat aacgccttcc gataagtcgg tattgtt 57
<210> 37
<211> 3860
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ROX1-1
<400> 37
taataatggt ttcttagtat gatccaatat caaaggaaat gatagcattg aaggatgaga 60
ctaatccaat tgaggagtgg cagcatatag aacagctaaa gggtagtgct gaaggaagca 120
tacgataccc cgcatggaat gggataatat cacaggaggt actagactac ctttcatcct 180
acataaatag acgcatataa gtacgcattt aagcataaac acgcactatg ccgttcttct 240
catgtatata tatatacagg caacacgcag atataggtgc gacgtgaaca gtgagctgta 300
tgtgcgcagc tcgcgttgca ttttcggaag cgctcgtttt cggaaacgct ttgaagttcc 360
tattccgaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc agagcgcttt tgaaaaccaa 420
aagcgctctg aagacgcact ttcaaaaaac caaaaacgca ccggactgta acgagctact 480
aaaatattgc gaataccgct tccacaaaca ttgctcaaaa gtatctcttt gctatatatc 540
tctgtgctat atccctatat aacctaccca tccacctttc gctccttgaa cttgcatcta 600
aactcgacct ctacattttt tatgtttatc tctagtatta ctctttagac aaaaaaattg 660
tagtaagaac tattcataga gtgaatcgaa aacaatacga aaatgtaaac atttcctata 720
cgtagtatat agagacaaaa tagaagaaac cgttcataat tttctgacca atgaagaatc 780
atcaacgcta tcactttctg ttcacaaagt atgcgcaatc cacatcggta tagaatataa 840
tcggggatgc ctttatcttg aaaaaatgca cccgcagctt cgctagtaat cagtaaacgc 900
gggaagtgga gtcaggcttt ttttatggaa gagaaaatag acaccaaagt agccttcttc 960
taaccttaac ggacctacag tgcaaaaagt tatcaagaga ctgcattata gagcgcacaa 1020
aggagaaaaa aagtaatcta agatgctttg ttagaaaaat agcgctctcg ggatgcattt 1080
ttgtagaaca aaaaagaagt atagattctt tgttggtaaa atagcgctct cgcgttgcat 1140
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tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 1500
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ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 2460
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gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 2700
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 2760
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ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 2880
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 2940
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 3000
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 3060
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 3120
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 3180
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ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 3300
caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca 3360
ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tacctcactc 3420
attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcc tatgttgtgt ggaattgtga 3480
gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta 3540
accctcacta aagggaacaa aagctggagc ttctttgaaa agataatgta tgattatgct 3600
ttcactcata tttatacaga aacttgatgt tttctttcga gtatatacaa ggtgattaca 3660
tgtacgtttg aagtacaact ctagattttg tagtgccctc ttgggctagc ggtaaaggtg 3720
cgcatttttt cacaccctac aatgttctgt tcaaaagatt ttggtcaaac gctgtagaag 3780
tgaaagttgg tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc 3840
acaggatctt aatagacgaa 3860
<210> 38
<211> 2451
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ROX1-2
<400> 38
acaggatctt aatagacgaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtggtgct ttttttgttt tttatgtctt 120
cgagtcatgt aattagttat gtcacgctta cgttcacgcc ctccccccac atccgctcta 180
accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt ttttatagtt 240
atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct gtacagacgc 300
gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg acgctcgaag 360
gctttaattt gcggccggta cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac gcgcgctcac 420
tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 480
ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc 540
cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcga cgcgccctgt agcggcgcat 600
taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 660
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ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 840
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cccagcctgc ttttctgtaa cgttcaccct ctaccttagc atcccttccc tttgcaaata 1260
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ccttgcatga caattctgct aacatcaaaa ggcctctagg ttcctttgtt acttcttctg 1560
ccgcctgctt caaaccgcta acaatacctg ggcccaccac accgtgtgca ttcgtaatgt 1620
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tgtcagcaaa ttttctgtct tcgaagagta aaaaattgta cttggcggat aatgccttta 1740
gcggcttaac tgtgccctcc atggaaaaat cagtcaagat atccacatgt gtttttagta 1800
aacaaatttt gggacctaat gcttcaacta actccagtaa ttccttggtg gtacgaacat 1860
ccaatgaagc acacaagttt gtttgctttt cgtgcatgat attaaatagc ttggcagcaa 1920
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cttcaacact acatatgcgt atatatacca atctaagtct gtgctccttc cttcgttctt 2100
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<210> 39
<211> 3863
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ERG9-1
<400> 39
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acataaatag acgcatataa gtacgcattt aagcataaac acgcactatg ccgttcttct 240
catgtatata tatatacagg caacacgcag atataggtgc gacgtgaaca gtgagctgta 300
tgtgcgcagc tcgcgttgca ttttcggaag cgctcgtttt cggaaacgct ttgaagttcc 360
tattccgaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc agagcgcttt tgaaaaccaa 420
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tctgtgctat atccctatat aacctaccca tccacctttc gctccttgaa cttgcatcta 600
aactcgacct ctacattttt tatgtttatc tctagtatta ctctttagac aaaaaaattg 660
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ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tacctcactc 3420
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caacaacaat accgacttac cat 3863
<210> 40
<211> 2454
<212> DNA
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<220>
<223> ERG9-2
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caacaacaat accgacttac catgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 60
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cttccttctg ttcggagatt accgaatcaa aaaaatttca aggaaaccga aatcaaaaaa 2160
aagaataaaa aaaaaatgat gaattgaatt gaaaagctgt ggtatggtgc actctcagta 2220
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 2280
cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 2340
ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc 2400
tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagt 2454
Claims (7)
1.一种生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建靶向敲除全局抑制因子和下调角鲨烯合成酶的引导RNA表达载体；
（2）构建瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体；
（3）在步骤（2）得到的瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体中引入HMG-CoA还原酶表达盒，获得过表达HMG-CoA还原酶和表达瓦伦西亚烯合成酶的重组表达载体；
（4）将步骤（1）得到的引导RNA表达载体转化酿酒酵母感受态细胞，获得突变菌株PK2-M；
（5）将步骤（3）得到的过表达HMG-CoA还原酶和表达瓦伦西亚烯合成酶的重组表达载体转化步骤（4）得到的突变菌株PK2-M的感受态细胞，获得生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌；
步骤（4）中所述的酿酒酵母为酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1Ca；
步骤（1）中所述的全局抑制因子的靶向核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
步骤（1）中所述的角鲨烯合成酶的靶向核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
步骤（2）中所述的瓦伦西亚烯合成酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
步骤（2）中所述的瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体通过如下方法获得：以YEplac181为出发载体，引入瓦伦西亚烯合成酶表达盒，得到瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体；
所述的瓦伦西亚烯合成酶表达盒中，启动子为TDH3和TEF1中的一种；终止子为ADH1；
所述的TDH3的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述的TEF1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述的ADH1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
步骤（3）中所述的HMG-CoA还原酶是表达缺乏N端调控区域的截短HMG-CoA还原酶，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
步骤（3）中所述的过表达HMG-CoA还原酶和表达瓦伦西亚烯合成酶的重组表达载体通过如下方法获得：以酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1 Ca的基因组为模板扩增HMG-CoA还原酶基因片段，将其与步骤（2）得到的瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体连接转化，获得HMG-CoA还原酶的重组表达载体，再以其为模板扩增出HMG-CoA还原酶表达盒，然后与步骤（2）得到的瓦伦西亚烯合成酶重组表达载体连接转化，获得过表达HMG-CoA还原酶和表达瓦伦西亚烯合成酶的重组表达载体；
所述的HMG-CoA还原酶表达盒中，启动子为TDH3和TEF1中的一种；终止子为ADH1。
2.根据权利要求1所述的生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述的引导RNA表达载体通过如下方法获得：以p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t为模板分别扩增ROX1-1、ROX1-2 、ERG9-1和ERG9-2片段，并分别将ROX1-1和ROX1-2、ERG9-1和ERG9-2片段重组，获得带有全局抑制因子和角鲨烯合成酶引导RNA序列的重组载体，然后以这两个重组载体为模板分别扩增靶向全局抑制因子和角鲨烯合成酶的片段，并将片段连接，获得靶向敲除全局抑制因子和下调角鲨烯合成酶的引导RNA表达载体。
3.根据权利要求1所述的生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，
步骤（4）如下：在同源重组片段存在的情况下，采用Cas9系统协助步骤（1）得到的引导RNA表达载体转化酿酒酵母感受态细胞，实现酵母基因组的定点编辑，获得突变菌株PK2-M。
4.根据权利要求3所述的生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，
所述的同源重组片段为donor1和donor2，核苷酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；
所述的Cas9系统为酵母基因编辑Cas9表达质粒p414-TEF1p-Cas9-CYC1t。
5.根据权利要求1所述的生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，
所述的生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌的构建方法，还包括将步骤（5）得到的工程菌进行活化、扩繁培养的步骤：将获得的工程菌活化，接种，培养，接种，发酵；
所述的活化使用的平板为
固体平板；
所述的培养和所述的发酵使用的培养基为
液体培养基；
所述的培养的条件为：温度30℃、转速200 rpm培养48h；
所述的发酵的条件为：溶氧30%以上、温度25℃发酵158h；
所述的发酵的过程中，每48 h补加一次葡萄糖。
6.一种生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌，其特征在于，通过权利要求1～5任一项所述的构建方法构建得到。
7.权利要求6所述的生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌在工业生产瓦伦西亚烯中的应用。
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