CN116463325A - 瓦伦烯合酶突变体及瓦伦烯高产菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了瓦伦烯合酶突变体及瓦伦烯高产菌株，属于合成生物学领域。合成瓦伦烯的酶来源于刺芹Eryngium glaciale，经过酶的定向进化获得了酶性能提升的瓦伦烯合酶突变体，含有该突变体的菌株产量是含有野生型合成酶的菌株产量的3.15倍。本发明的瓦伦烯合酶突变体加强了菌株合成瓦伦烯的能力，为其工业化生产奠定了强有力的基础。本发明利用瓦伦烯合成酶突变体构建了合成瓦伦烯的高产菌株，发酵罐产量达到了12.4g/L，是目前所报道的最高水平。

Description

瓦伦烯合酶突变体及瓦伦烯高产菌株
技术领域
本发明属于合成生物学领域，涉及瓦伦烯合酶突变体及瓦伦烯高产菌株。
背景技术
瓦伦烯是一种具有柑橘香味的倍半萜化合物，是商业规模使用的最有价值的萜类化合物之一，作为调味剂被广泛用于食品、饮料领域，具有很高的经济价值。目前瓦伦烯主要是通过植物提取获得，但由于植物中含量低、提取成本高，使得这种方法并不是经济可行的。
近来，微生物细胞工厂被广泛的应用于化合物的生产。目前，在微生物中表达瓦伦烯合酶可以实现在微生物中瓦伦烯的异源合成，但是所能达到的产量水平还很低，其中所存在的主要因素即目前所存在的瓦伦烯合酶活性不高，往往需要配合复杂的代谢工程改造才能获得较高的瓦伦烯产量。因此获得高酶活的瓦伦烯合酶是实现瓦伦烯高产的一个主要因素。
发明内容
本发明的目的在于提供高性能的瓦伦烯合酶突变体及其在生产瓦伦烯中的应用。本发明的目的还在于提供一种瓦伦烯高产菌株以及实现瓦伦烯产量提升的方法。
为了实现上述目的，本发明提供下述技术方案：
本发明提供了瓦伦烯合酶突变体，其野生型为序列如SEQ ID NO.1所示的来源于刺芹Eryngium glaciale的瓦伦烯合酶，与该野生型瓦伦烯合酶相比，所述的瓦伦烯合酶突变体含有下述突变位点的任一种：(1)I533V、R336K；(2)I533V、R336K、H196R、D176E；(3)I533V、R336K、R306K；(4)I533V、R336K、K325E；(5)I533V、R336K、H196R、D176E、R306K、K325E。
本发明还提供了编码上述瓦伦烯合酶突变体的基因，所述的基因的核苷酸序列可以根据宿主密码子偏爱性进行优化。
本发明还提供了含有上述基因的重组质粒，所述的重组质粒转入到宿主细胞后可表达上述瓦伦烯合酶突变体。
本发明还提供了含有上述基因的重组细胞，所述的重组细胞的宿主包括细菌、真菌。
上述瓦伦烯合酶突变体、基因、重组质粒或重组细胞在生产瓦伦烯、诺卡酮中的应用。
本发明还提供了一种瓦伦烯高产菌株，所述的瓦伦烯高产菌株含有上述编码瓦伦烯合酶突变体的基因。
在一些实施方案中，所述的瓦伦烯高产菌株含有编码法尼基焦磷酸合酶的基因ERG20。
在一些实施方案中，所述的瓦伦烯高产菌株含有甲羟戊酸途径(MVA途径)基因，所述的MVA途径基因包括：编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因ERG10，编码HMG-CoA合酶的基因ERG13，编码HMG-CoA还原酶的基因tHMG1，编码甲羟戊酸激酶的基因ERG12，编码甲羟戊酸-5-磷酸激酶的基因ERG8，编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因MVD1，编码异戊二烯焦磷酸异构酶的基因IDI1。
在一些实施方案中，所述的瓦伦烯高产菌株中，MVA途径基因法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数为ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20＝2、2、3、2、2、2、2、2，编码瓦伦烯合酶突变体的基因的拷贝数为2。
在一些实施方案中，所述的瓦伦烯高产菌株的宿主为酿酒酵母。
在一些实施方案中，所述的瓦伦烯高产菌株的宿主为酿酒酵母时，其敲除了GAL80基因。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明获得了性能提升显著的瓦伦烯合成酶突变体，含有该突变体的菌株的瓦伦烯产量是含有野生型合成酶的菌株产量的3.15倍。本发明的瓦伦烯合成酶突变体为瓦伦烯工业化生产奠定了强有力的基础。
(2)本发明利用瓦伦烯合成酶突变体构建了瓦伦烯的高产菌株，所构建的菌株的发酵罐产量达到了12.4g/L，是目前所报道的最高水平。
附图说明
图1是合成瓦伦烯的路径图。
图2是EGVS和5-epi-aristolochene合酶TEAS的氨基酸比对结果图。
图3是模拟的EGVS和FPP对接的结果图。
图4是瓦伦烯合成酶EgVS和其同源序列比对的氨基酸残基偏好性结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1酵母表达载体构建
质粒pZY900相关特征：
△LEU2：LEU2(URA3)_TCYC1_LacZ_pGAL10pGAL1_ERG20_tERG20，用启动子GAL1、GAL10分别控制表达基因ERG20、LacZ，筛选标记为Leu2，插入的染色体位点为Leu2。
质粒pZY900具体构建过程：以酿酒酵母S288c基因组为模板，用引物900-1F/1R、900-2F/2R、900-6F/6R、900-7F/7R分别扩增获得片段9001(Leu2的左同源臂)、9002(终止子tTDH2)、9006(基因ERG20与终止子tERG20)、9007(Leu2右同源臂)；以酿酒酵母CEN.PK2-1D的基因组为模板，用引物900-3F/3R、900-5F/5R分别扩增获得片段9003(终止子tCYC1)和9005(启动子pGAL1和Pgal10)；用引物900-4F/4R以pCAS为模板扩增获得片段9004(无义基因，用于目标基因的替换)；以pRS426为模板，用引物900-8F/8R扩增获得质粒骨架(引入MssI酶切位点，筛选标记)。通过DNA assemble(酵母组装)的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pZY900，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，得到pZY900。(pCAS的构建见文献Zhang,Yueping et al.“A gRNA-tRNA array for CRISPR-Cas9 basedrapid multiplexed genome editing in Saccharomyces cerevisiae.”Naturecommunications vol.10,1 1053.5Mar.2019,doi:10.1038/s41467-019-09005-3)。
构建质粒pZY900所用引物的序列见下表1：
表1
质粒pYH300相关特征：
△LEU2：LEU2(URA3)_TCYC1_LacZ_pGAL10pGAL1_ERG20_tERG20，用启动子GAL1、GAL10分别控制表达基因ERG20、LacZ，筛选标记为Leu2，插入的染色体位点为Leu2。与pZY900的差异为在同源臂和质粒骨架间的酶切位点为NotI。
质粒pYH300具体构建过程：以pZY900为模板，以引物P48-F/R扩增获得同源臂间的片段，以引物P49-F/R扩增获得含有NotI酶切位点的载体骨架，通过同源重组的方法获得质粒。
P48-F GAACAAAAGCTGGAGCTCTAGTAGCGGCCGCATAACGAGAACACACAGGGG
P48-R GCAACTGTTGCGGCCGCGACAACGACCAAGCTCACATCAA
P49-F GTTGTCGCGGCCGCAACAGTTGCGCAGCCTGA
P49-R TACTAGAGCTCCAGCTTTTGTTC
实施例2瓦伦烯合成载体的构建
关于瓦伦烯合酶，现有研究中，研究较多的是文献(Beekwilder,Jules et al.“Valencene synthase from the heartwood of Nootka cypress(Callitropsisnootkatensis)for biotechnological production of valencene.”Plantbiotechnology journal vol.12,2(2014):174-82.doi:10.1111/pbi.12124)中提及Callitropsis nootkatensis来源的瓦伦烯合酶CnVS，专利US 2015/0007368 A1中提及了Eryngium glaciale来源的瓦伦烯合酶EgVS未见文献报道。首先对这两个来源的野生型瓦伦烯合酶进行比较。将CnVS和EgVS的编码序列按照酿酒酵母密码子优化后合成，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
设计特异基因引物对CnVS-F/R，以合成的基因(SEQ ID NO.2)为模板，利用Takara公司的Prime STAR高保真酶通过PCR扩增获得CnVS基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pYH300中，经过测序确认无误后，获得含有该基因的酵母表达载体，命名为pYH329。
设计特异基因引物对EgVS-F/R，以合成的基因(SEQ ID NO.3)为模板，利用Takara公司的Prime STAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pYH300中，经过测序确认无误后，获得含有该基因的酵母表达载体，命名为pYH327。
实施例3瓦伦烯合成菌株的构建
使用NotI将质粒pYH327和pYH329线性化，获得pYH327-NotI切后片段以及pYH329-NotI切后片段，分别通过PEG/LiAC方法将切后片段转化到酵母菌株JCR27感受态中(酵母菌株JCR27的构建见文献Siemon,Thomas et al.“Semisynthesis of Plant-DerivedEnglerin A Enabled by Microbe Engineering of Guaia-6,10(14)-diene as BuildingBlock.”Journal of the American Chemical Society vol.142,6(2020):2760-2765.doi:10.1021/jacs.9b12940)，获得的阳性菌命名为JGH29以及JGH31。菌株JGH29是在酿酒酵母CEN.PK2-1D基础上，首先加强了MVA途径，并转入了含有法尼基焦磷酸合酶基因以及EgVS的片段。菌株JGH31是在酿酒酵母CEN.PK2-1D基础上，首先加强了MVA途径，并转入了含有法尼基焦磷酸合酶基因以及CnVS的片段。
实施例4菌株JGH29与JGH31的摇瓶发酵
将菌株JGH29以及JGH31分别接种于种子培养基(蛋白胨(20g/L)，酵母粉(10g/L)，葡萄糖(20g/L))中在30℃、200rpm条件下培养20-24h，随后转接至发酵培养基(蛋白胨(20g/L)，酵母粉(10g/L)，葡萄糖(10g/L)，半乳糖(10g/L))，转接后覆盖发酵液体积20％的有机相(正十二烷或肉豆蔻酸异丙酯)置于30℃、200rpm条件下发酵72h。GCMS检测，菌株JGH29的瓦伦烯产量为78mg/L，菌株JGH31的瓦伦烯产量为22mg/L。经过此实验我们发现Eryngium glaciale来源的瓦伦烯合酶具有较好的性能。
实施例5瓦伦烯合酶突变体的获得
上述实验虽然证明了Eryngium glaciale来源的瓦伦烯合酶具有较好的性能，但其产量仅100mg/L不到，想要瓦伦烯的产量达到工业化生产的水平，需要进一步提升瓦伦烯合酶的性能。
首先我们利用Swiss-model对该酶进行三维结构模拟，使用的最优模板为4RNQ，两者序列比对结果发现酶的I533位点对应模板4RNQ上的氨基酸残基为V(图2)，结构模拟结果发现I533位于底物结合腔的底部(图3)，因此推测I533V的突变可能会增加结合腔的体积，从而更适合底物的结合，最终选择该突变进行实验验证，需要构建瓦伦烯突变体I533V。
以合成的基因(SEQ ID NO.3)为模板，设计特异基因引物对P4-F/P50-R，利用Takara公司的Prime STAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS部分基因片段，P51-F/P4-R通过PCR扩增获得EgVS剩余部分基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pYH300中，经过测序确认无误后，获得含有该基因的酵母表达载体，命名为pYH332。
在构建pYH332的过程中，我们意外获得了同时含I533V和R336K突变序列的质粒，将这个质粒命名为pYH340，将这两个质粒经过NotI线性化后整合到酵母菌株JCR27中获得菌株JGH37与JGH44，在摇瓶发酵水平(条件同实施例4)，瓦伦烯的产量分别达到了69mg/L和100mg/L，相对于EgVS野生型而言，含有I533V和R336K突变的酶的性能得到了提升。
为了进一步提升EgVS的性能，通过和EgVS的同源序列比对，氨基酸残基的偏好性(图4)被展示出来，我们挑出了8个位点N81D、D176E、E216G、R306K、K325E、G347E、H491E、R350K，继续对EgVS(I533V、R336K)进行定点突变。
以pYH340质粒(含EgVS(I533V、R336K)突变的序列)为模板，设计特异基因引物对P4-F/P52-R，利用Takara公司的Prime STAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS部分基因片段，P53-F/P4-R通过PCR扩增获得EgVS剩余部分基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有EgVS(I533V、R336K、N81D)编码序列的酵母表达载体，命名为pYH355。
以pYH340质粒为模板，设计特异基因引物对P4-F/P54-R，利用Takara公司的PrimeSTAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS部分基因片段，P55-F/P4-R通过PCR扩增获得EgVS剩余部分基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有EgVS(I533V、R336K、H196R、D176E)编码序列的酵母表达载体，命名为pYH356。其中，H196R突变在构建过程意外引入。
以pYH340质粒为模板，设计特异基因引物对P4-F/P56-R，利用Takara公司的PrimeSTAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS部分基因片段，P57-F/P4-R通过PCR扩增获得EgVS剩余部分基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有EgVS(I533V、R336K、E216G)编码序列的酵母表达载体，命名为pYH358。
以pYH340质粒为模板，设计特异基因引物对P4-F/P58-R，利用Takara公司的PrimeSTAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS部分基因片段，P59-F/P4-R通过PCR扩增获得EgVS剩余部分基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有EgVS(I533V、R336K、R306K)编码序列的酵母表达载体，命名为pYH361。
以pYH340质粒为模板，设计特异基因引物对P4-F/P60-R，利用Takara公司的PrimeSTAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS部分基因片段，P61-F/P4-R通过PCR扩增获得EgVS剩余部分基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有EgVS(I533V、R336K、K325E)编码序列的酵母表达载体，命名为pYH362。
以pYH340质粒为模板，设计特异基因引物对P4-F/P62-R，利用Takara公司的PrimeSTAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS部分基因片段，P63-F/P4-R通过PCR扩增获得EgVS剩余部分基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有EgVS(I533V、R336K、G347E)编码序列的酵母表达载体，命名为pYH363。
以pYH340质粒为模板，设计特异基因引物对P4-F/P64-R，利用Takara公司的PrimeSTAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS部分基因片段，P65-F/P4-R通过PCR扩增获得EgVS剩余部分基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有EgVS(I533V、R336K、H491E)编码序列的酵母表达载体，命名为pYH372。
以pYH340质粒为模板，设计特异基因引物对P4-F/P66-R，利用Takara公司的PrimeSTAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS部分基因片段，P67-F/P4-R通过PCR扩增获得EgVS剩余部分基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有EgVS(I533V、R336K、R350K)编码序列的酵母表达载体，命名为pYH375。
P52-R AACAACAATTGAATTTGATTgATGAAATCCAAAGATTGGGTTTGT
P53-F ACCCAATCTTTGGATTTCATcAATCAAATTCAATTGTTGTTGTGG
P54-R CATTTTAGAGTTCATAACGAaGATAAGTTGGAAGAATTGTTGTCAG
P55-F AACAATTCTTCCAACTTATCtTCGTTATGAACTCTAAAATGTGTTGC
P56-R GAAGCATCCATTGCATAAGGGTTTGAACAGATTGGGTGCAAGA
P57-F CTTGCACCCAATCTGTTCAAACCCTTATGCAATGGATGCTTCA
P58-R TGTTAGAGAATTCTTGAACAAAGTTTTCGCTTTGATCACTGTT
P59-F CAGTGATCAAAGCGAAAACTTTGTTCAAGAATTCTCTAACATCCTTTC
P60-R ACGATGTTTACGGTACTTTTgAAGAATTGTTGTTGTTTACTGATGC
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P62-R TGATTTGGATCAATTGCCAGAATACATGAGAATCATCTATCAAGCTTTG
P63-F TGATAGATGATTCTCATGTATTCTGGCAATTGATCCAAATCAG
P64-R AGGAAAACCATGTTACTAAGGAAGAAGCATACGATGAATTCCAAAAG
P65-F TGGAATTCATCGTATGCTTCTTCCTTAGTAACATGGTTTTCCTTGATGTAA
P66-R TCAATTGCCAGGTTACATGAAAATCATCTATCAAGCTTTGATGGAT
P67-F TCAAAGCTTGATAGATGATTTTCATGTAACCTGGCAATTGATC
实施例6含瓦伦烯合酶突变体的菌株获得与摇瓶发酵
将上述获得的质粒pYH355、356、358、361、362、363、372、375经过MssI线性化后整合到酵母菌株JCR27中获得菌株JGH55、56、57、58、59、60、63、64。
摇瓶发酵方法和上述实施例4一致。和菌株JGH44相比，含有E216G、和G347E突变的菌株JGH57、JGH60产量明显下降，产量分别为13mg/L和38mg/L，含有N81D、H491E、R350K突变的菌株JGH55、JGH63、JGH64产量略微下降，产量分别为94mg/L、86mg/L和64mg/L，而含有D176E(构建过程引入的意外突变H196R)、R306K、和K325E的菌株JGH56、JGH58、JGH59产量上升，产量分别为117mg/L、143mg/L和114mg/L。将有利突变组合，构建质粒pYH383，将pYH383经过MssI线性化后整合到菌株JCR27获得菌株JGH71，产量得到了进一步的提升，含有(I533V、R336K、H196R、D176E、R306K、K325E)的突变体在72h摇瓶发酵后，瓦伦烯的产量达到了248mg/L，是野生型的3.15倍，酶性能得到了明显提升。除此之外，副产物的比例也下降了，从原有的瓦伦烯和马兜铃烯比例2.97：1转变为4.18：1。最终突变体的产量相较于野生型产量提升了这些有提升的位点中，除了I533处于活性口袋中，其他位点皆位于活性口袋之外区域，且远离口袋，表明了远端残基对于蛋白质的性能也有很重要的影响。
pYH383的构建过程：以pYH362为模板，设计特异基因引物对P4-F/P68-R，利用Takara公司的Prime STAR高保真酶通过PCR扩增获得EgVS部分基因片段，以pYH356为模板，P69-F/P4-R通过PCR扩增获得EgVS剩余部分基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有EgVS(I533V、R336K、K325E、R306K、D176E、H196R)编码序列的酵母表达载体，命名为pYH383。
P68-R TGTTAGAGAATTCTTGAACAAAGTTTTCGCTTTGATCACTGTT
P69-F CAGTGATCAAAGCGAAAACTTTGTTCAAGAATTCTCTAACATCCTTTC
实施例7代谢途径优化提升瓦伦烯的产量
为了进一步提高瓦伦烯的产量，为了增大瓦伦烯合酶的拷贝数，构建质粒pYH384、pYH385。
以酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组为模板，设计特异基因引物对P11-F/P11-R，通过PCR扩增获得URA3同源臂左臂；以商用质粒pRS423为模板，引物P12-F/R扩增获得组氨酸筛选标记；以CEN.PK2-1D基因组为模板，引物P13-F/R扩增获得Tcyc1；以酿酒酵母S288C基因组为模板，引物P14-F/R扩增获得基因Thmg1；以CEN.PK2-1D基因组为模板，引物P15-F/R扩增获得pGAL1-pGAL10；以pYH383为模板，引物P16-F/R扩增获得EgVS(I533V、R336K、K325E、R306K、D176E、H196R)编码序列；以CEN.PK2-1D基因组为模板，引物P17-F/R扩增获得tPGK1；以CEN.PK2-1D基因组为模板，引物P18-F/R扩增获得URA3同源臂右臂；以商用质粒pRS426为模板，引物P19-F/R扩增获得载体骨架；通过DNA assemble(酵母组装)的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pYH384，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，得到pYH384。该质粒包含基因tHMG1和EgVS(I533V、R336K、K325E、R306K、D176E、H196R)。
以CEN.PK2-1D基因组为模板，设计特异基因引物对P20-F/P20-R，通过PCR扩增获得HIS3同源臂左臂；以商用质粒pRS424为模板，引物P21-F/R扩增获得色氨酸筛选标记；以CEN.PK2-1D基因组为模板，引物P22-F/R扩增获得TADH1；以pYH383为模板，引物P23-F/R扩增获得EgVS(I533V、R336K、K325E、R306K、D176E、H196R)编码序列；以CEN.PK2-1D基因组为模板，引物P24-F/R扩增获得pGAL1-pGAL10；以CEN.PK2-1D基因组为模板，引物P25-F/R扩增获得tCPS1同源臂右臂；以CEN.PK2-1D基因组为模板，引物P26-F/R扩增获得HIS3同源臂右臂；以商用质粒pRS426为模板，引物P27-F/R扩增获得载体骨架；通过DNA assemble(酵母组装)的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pYH385，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，得到pYH385。该质粒包含基因EgVS(I533V、R336K、K325E、R306K、D176E、H196R)。
用MssI将质粒pYH384线性化后整合到菌株JGH71中，获得菌株JGH72，该菌株是以CEN.PK2-1D为基础，含有甲羟戊酸途径基因、法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数为ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20＝2、2、3、2、2、2、2、2，所述瓦伦烯合酶突变体的编码基因的拷贝数为2。
用MssI将质粒pYH385线性化后整合到菌株JGH72中，获得菌株JGH73，该菌株是以CEN.PK2-1D为基础，含有甲羟戊酸途径基因、法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数为ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20＝2、2、3、2、2、2、2、2，所述瓦伦烯合酶突变体的编码基因的拷贝数为3。
对菌株进行摇瓶发酵，当增加一个拷贝tHMG1和瓦伦烯合酶时，菌株JGH72产量达到了393mg/L，而进一步增大瓦伦烯合酶的数量时，菌株产量下降了，JGH73的摇瓶产量为377mg/L。表明了含有两个拷贝瓦伦烯合酶突变体的菌株产量更高。在菌株JGH72的基础上进一步整合pZY528以敲除GAL80补齐营养缺陷可以不用添加半乳糖诱导，获得菌株JGH78，产量达到了515mg/L。
敲除盒pZY528的构建过程：以CEN.PK2-1D基因组为模板，用引物5281-1F和5281-1R通过PCR扩增得到片段5281(含Gal80位点左同源臂)，用引物5284_4F和5284_4R通过PCR扩增得到片段5284(含Gal80位点右同源臂)；以质粒pRS426-ura(ATCC87333)为模板，用引物5282-2F和5282-2R通过PCR扩增得到片段5282(含尿嘧啶筛选标记)；以质粒pRS424为模板，用引物5283-3F和5283-3R通过PCR扩增得到片段5283(含色氨酸筛选标记)；再用引物5281-1F和5284-4R将片段5281、片段5282、片段5283和片段5284通过OE-PCR连接起来得到pZY528。
实施例8瓦伦烯高产菌株的发酵罐发酵
参照文献(van Hoek,P.；de Hulster,E.；van Di jken,J.P.；Pronk,J.T.Fermentative capacity in high-cell-density fed-batch cultures of baker’syeast.Biotechnol.Bioeng.2000,68,517-523.)中所记载的发酵培养基，对所构建的菌株JGH78进行分批补料发酵，在发酵过程中添加覆盖剂以实现原位萃取，覆盖剂为肉豆蔻酸异丙酯。发酵过程控制溶氧在20％以上，pH为5，葡萄糖浓度为1-2g/L，乙醇浓度为5g/L以下。最终在15L钢罐发酵罐上，菌株JGH78瓦伦烯产物产量达到了12.4g/L，是目前所报道的最高水平。
序列表
<110> 武汉臻智生物科技有限公司
<120> 瓦伦烯合酶突变体及瓦伦烯高产菌株
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 565
<212> PRT
<213> Eryngium glaciale
<400> 1
Met Ser Leu Asn Val Leu Ser Thr Ser Gly Ser Ala Pro Thr Thr Lys
1 5 10 15
Ser Ser Glu Ile Thr Arg Arg Ser Ala Asn Tyr His Pro Ser Leu Trp
20 25 30
Gly Asp Lys Phe Leu Glu Tyr Ser Ser Pro Asp His Leu Lys Asn Asp
35 40 45
Ser Phe Thr Glu Lys Lys His Glu Gln Leu Lys Glu Glu Val Lys Lys
50 55 60
Met Leu Val Glu Thr Val Gln Lys Pro Gln Gln Gln Leu Asn Leu Ile
65 70 75 80
Asn Glu Ile Gln Arg Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Phe Glu Pro Glu Ile
85 90 95
Glu Ala Ala Leu Gln Glu Ile Ser Val Thr Tyr Asp Glu Phe Cys Cys
100 105 110
Ser Thr Asp Ala Asp Asp Leu His Asn Val Ala Leu Ser Phe Arg Ile
115 120 125
Leu Arg Glu His Gly His Asn Val Ser Ser Asp Val Phe Gln Lys Phe
130 135 140
Met Asp Ser Asn Gly Lys Leu Lys Asp Tyr Leu Val Asn Asp Ala Arg
145 150 155 160
Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Thr His Phe Arg Val His Asn Asp
165 170 175
Asp Lys Leu Glu Glu Leu Leu Ser Val Thr Thr Ser Arg Leu Glu His
180 185 190
Leu Lys Ser His Val Lys Tyr Pro Leu Glu Asp Glu Ile Ser Arg Ala
195 200 205
Leu Lys His Pro Leu His Lys Glu Leu Asn Arg Leu Gly Ala Arg Tyr
210 215 220
Tyr Ile Ser Ile Tyr Glu Lys Phe Asp Ser His Asn Lys Leu Leu Leu
225 230 235 240
Glu Phe Ala Lys Leu Asp Phe Asn Arg Leu Gln Lys Met Tyr Gln His
245 250 255
Glu Leu Ala His Leu Thr Arg Trp Trp Lys Asp Leu Asp Phe Thr Asn
260 265 270
Lys Leu Pro Phe Ala Arg Asp Arg Ile Val Glu Gly Tyr Phe Trp Ile
275 280 285
Leu Gly Met Tyr Phe Glu Pro Glu Arg Lys Asp Val Arg Glu Phe Leu
290 295 300
Asn Arg Val Phe Ala Leu Ile Thr Val Val Asp Asp Thr Tyr Asp Val
305 310 315 320
Tyr Gly Thr Phe Lys Glu Leu Leu Leu Phe Thr Asp Ala Ile Glu Arg
325 330 335
Trp Gly Thr Ser Asp Leu Asp Gln Leu Pro Gly Tyr Met Arg Ile Ile
340 345 350
Tyr Gln Ala Leu Met Asp Val Tyr Asn Gln Met Glu Glu Lys Leu Ser
355 360 365
Met Lys Ala Asp Cys Pro Thr Tyr Arg Leu Glu Phe Ala Ile Glu Thr
370 375 380
Val Lys Ala Met Phe Arg Ser Tyr Leu Glu Glu Ala Arg Trp Ser Lys
385 390 395 400
Glu His Tyr Ile Pro Ser Met Glu Glu Tyr Met Thr Val Ala Leu Val
405 410 415
Ser Val Gly Tyr Lys Thr Ile Leu Thr Asn Ser Phe Val Gly Met Gly
420 425 430
Asp Ile Ala Thr Arg Glu Val Phe Glu Trp Val Phe Asn Ser Pro Leu
435 440 445
Ile Ile Arg Ala Ser Asp Leu Ile Ala Arg Leu Gly Asp Asp Ile Gly
450 455 460
Gly His Glu Glu Glu Gln Lys Lys Gly Asp Ala Ala Thr Ala Ile Glu
465 470 475 480
Cys Tyr Ile Lys Glu Asn His Val Thr Lys His Glu Ala Tyr Asp Glu
485 490 495
Phe Gln Lys Gln Ile Asp Asn Ala Trp Lys Asp Leu Asn Lys Glu Ala
500 505 510
Leu Arg Pro Phe Pro Val Pro Met Thr Phe Ile Thr Arg Val Val His
515 520 525
Phe Thr Arg Ala Ile His Val Ile Tyr Ala Asp Phe Ser Asp Gly Tyr
530 535 540
Thr Arg Ser Asp Lys Ala Ile Arg Gly Tyr Ile Thr Ser Leu Leu Val
545 550 555 560
Asp Pro Ile Pro Leu
565
<210> 2
<211> 1770
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctgaaa tgttcaacgg taattcttct aatgatggtt catcatgtat gccagttaag 60
gatgctttga ggagaactgg caatcatcac cctaacttgt ggactgatga ctttatacaa 120
tctttaaatt ctccatactc agattcttca taccataaac acagagaaat tttaattgat 180
gaaataagag atatgttttc aaacggtgag ggtgatgagt tcggtgtttt ggaaaatata 240
tggtttgttg atgttgtcca gaggttgggt attgatagac actttcaaga agagattaaa 300
actgctttgg attacatata caaattctgg aaccatgatt caattttcgg tgatttgaat 360
atggttgctt tgggatttag aattttgaga ttaaatagat atgttgcttc ttcagatgtc 420
tttaaaaaat tcaaaggtga ggaaggtcaa ttctctggtt ttgaatcttc tgaccaagat 480
gcaaaattgg aaatgatgtt gaatttatat aaggcttctg aattggattt tccagatgaa 540
gatatattga aagaagctag agcttttgct tctatgtact tgaaacatgt cattaaggaa 600
tacggtgata ttcaagaatc aaagaaccca ttgttgatgg agattgaata tacatttaag 660
tacccttgga ggtgtagatt gccaagattg gaggcttgga atttcattca tattatgaga 720
caacaagatt gtaacatatc tttggcaaac aatttgtaca aaattcctaa aatatatatg 780
aagaagattt tggaattggc tattttagat ttcaatattt tgcaatcaca acatcaacat 840
gaaatgaagt tgatttctac ttggtggaaa aactcttctg ctatacagtt agatttcttt 900
cgtcatagac atattgaatc ttacttctgg tgggcttctc ctttattcga accagagttt 960
tctacttgta gaattaattg tactaagttg tctactaaga tgtttttgtt ggatgatatt 1020
tacgatactt atggaactgt tgaagaattg aagccattta caacaacttt aactagatgg 1080
gatgtttcta ctgttgacaa ccacccagat tatatgaaga ttgctttcaa tttttcttat 1140
gaaatttata aagaaattgc atcagaagca gagaggaagc acggtccatt tgtctataaa 1200
tatttgcaat cttgttggaa atcatacatt gaggcttata tgcaagaagc agagtggata 1260
gcttcaaacc acattcccgg ttttgatgaa tacttgatga acggtgtcaa atcttctggt 1320
atgagaatat tgatgattca tgctttgatt ttgatggata caccattgtc tgatgaaata 1380
ttggaacaat tagacatacc atcttcaaag tcacaagcct tattgtcttt gattactagg 1440
ttggttgatg atgttaaaga tttcgaagat gaacaagctc atggtgaaat ggcttcttct 1500
attgaatgtt atatgaagga taaccacggt tcaactaggg aggacgcatt gaattactta 1560
aaaattagga ttgaatcttg cgttcaagaa ttgaataaag aattattaga gccttcaaac 1620
atgcacggtt cttttcgtaa tttatattta aatgttggta tgagggttat cttttttatg 1680
ttgaatgatg gtgatttgtt tacacattct aatagaaaag aaattcaaga cgctattaca 1740
aagttctttg ttgaacctat tattccttaa 1770
<210> 3
<211> 1698
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtcattga atgttttatc tacatcaggt tctgctccaa ctacaaagtc ttcagaaatc 60
actagaagat cagcaaacta ccatccatct ttatggggtg acaaattttt ggaatactct 120
tcaccagatc atttgaaaaa tgattctttt acagaaaaga aacatgaaca attaaaagaa 180
gaagttaaga aaatgttggt tgaaactgtt caaaagccac aacaacaatt gaatttgatt 240
aatgaaatcc aaagattggg tttgtcatac ttattcgaac cagaaatcga agctgcattg 300
caagaaatct cagttactta cgatgaattc tgttgttcta cagatgctga tgatttgcat 360
aacgttgcat tgtcttttag aatcttgaga gaacatggtc ataatgtttc ttcagatgtt 420
tttcaaaagt ttatggattc aaacggtaaa ttgaaggatt atttggttaa tgatgctaga 480
ggtttgttat ctttgtacga agcaacacat tttagagttc ataacgatga taagttggaa 540
gaattgttgt cagttactac atctagattg gaacatttga agtcacatgt taagtaccca 600
ttggaagatg aaatctctag agctttgaag catccattgc ataaggaatt gaacagattg 660
ggtgcaagat actacatctc aatctatgaa aagtttgatt ctcataataa gttgttattg 720
gaatttgcta aattagattt taatagattg caaaagatgt atcaacatga attggcacat 780
ttgacaagat ggtggaagga tttggatttc actaataagt tgccatttgc tagagataga 840
atcgttgaag gttacttctg gatcttgggc atgtacttcg aaccagaaag aaaggatgtt 900
agagaattct tgaacagagt tttcgctttg atcactgttg ttgatgatac atacgatgtt 960
tacggtactt ttaaagaatt gttgttgttt actgatgcaa ttgaaagatg gggtacttct 1020
gatttggatc aattgccagg ttacatgaga atcatctatc aagctttgat ggatgtttac 1080
aaccaaatgg aagaaaagtt gtcaatgaaa gcagattgtc caacatacag attggaattc 1140
gctatcgaaa ctgttaaggc aatgttcaga tcttatttgg aagaagctag atggtcaaag 1200
gaacattaca tcccatctat ggaagaatac atgacagttg cattagtttc agttggttac 1260
aagactatct tgacaaactc tttcgttggt atgggtgaca ttgctactag agaagttttc 1320
gaatgggttt ttaattcacc attaatcatc agagcttctg atttgattgc aagattaggt 1380
gacgatattg gtggtcatga agaagaacaa aagaaaggtg acgctgcaac agctatcgaa 1440
tgttacatca aggaaaacca tgttactaag catgaagcat acgatgaatt ccaaaagcaa 1500
atcgataatg cttggaaaga tttgaataag gaagcattga gaccatttcc agttccaatg 1560
acttttatta caagagttgt tcatttcact agagctatcc atgttatcta tgcagatttc 1620
tcagatggtt acacaagatc tgataaggct atcagaggtt acatcacttc tttgttggtt 1680
gatccaattc cattataa 1698

Claims (10)

1.瓦伦烯合酶突变体，其特征在于：所述的瓦伦烯合酶突变体与野生型瓦伦烯合酶相比，含有下述突变位点的任一种：
(1)I533V、R336K；
(2)I533V、R336K、H196R、D176E；
(3)I533V、R336K、R306K；
(4)I533V、R336K、K325E；
(5)I533V、R336K、H196R、D176E、R306K、K325E；
所述的野生型瓦伦烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的瓦伦烯合酶突变体的基因。
3.一种重组质粒，其特征在于：含有权利要求2所述的基因。
4.一种重组细胞，其特征在于：含有权利要求2所述的基因。
5.权利要求1所述的瓦伦烯合酶突变体、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组质粒或权利要求4所述的重组细胞在生产瓦伦烯和诺卡酮中的应用。
6.一种瓦伦烯高产菌株，其特征在于：含有权利要求2所述的基因。
7.根据权利要求6所述的瓦伦烯高产菌株，其特征在于：含有编码法尼基焦磷酸合酶的基因ERG20；还含有甲羟戊酸途径基因，所述的甲羟戊酸途径基因包括：编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因ERG10，编码HMG-CoA合酶的基因ERG13，编码HMG-CoA还原酶的基因tHMG1，编码甲羟戊酸激酶的基因ERG12，编码甲羟戊酸-5-磷酸激酶的基因ERG8，编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因MVD1，编码异戊二烯焦磷酸异构酶的基因IDI1。
8.根据权利要求7所述的瓦伦烯高产菌株，其特征在于：MVA途径基因法尼烯焦磷酸合酶基因的拷贝数为ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1、ERG20＝2、2、3、2、2、2、2、2，权利要求2所述的基因的拷贝数为2。
9.根据权利要求6-8任一项所述的瓦伦烯高产菌株，其特征在于：所述的瓦伦烯高产菌株的宿主为酿酒酵母。
10.根据权利要求9所述的瓦伦烯高产菌株，其特征在于：所述的瓦伦烯高产菌株敲除了GAL80基因。
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