CN112175849A

CN112175849A - 一种l-薄荷醇产量提高的重组酵母菌

Info

Publication number: CN112175849A
Application number: CN202011060996.7A
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 陈坚; 吕雪芹; 堵国成; 李江华; 于文文; 马骏; 房峻
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN112175849B

Abstract

本发明公开了一种L‑薄荷醇产量提高的重组酵母菌，属于代谢工程技术领域。本发明以酵母菌为出发菌株，采用诱导型启动子表达基因ERG20WW或/和NPPS，重构MVA代谢合成途径，使得化合物IPP与DMAPP更趋向于合成化合物GPP与NPP，进而更利于L‑薄荷醇的代谢合成。采用诱导型启动子过表达基因L3H，提高L3H酶的表达量，促进柠檬烯转化为反式异胡椒醇，或通过蛋白酶融合表达tLIS与L3H基因，克服因L3H酶活过低而导致L‑薄荷醇发酵产量低的因素。采用YPD液体培养基发酵4d，发酵至对数生长期后期添加10％的半乳糖水溶液诱导EEG20WW、NPPS基因与L‑薄荷醇代谢途径基因的表达，保证了细胞的正常生长繁殖，L‑薄荷醇的发酵产量最高达到30.14mg/L。

Description

一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌

技术领域

本发明涉及一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌，属于代谢工程技术领域。

背景技术

L-薄荷醇(L-menthol)是具有高挥发性单环单萜物质，白色针状结晶，易溶于石油醚、氯仿等有机溶剂，微溶于水。L-薄荷醇是世界范围内销量最大的香料之一，全球年需求量超过2万吨。L-薄荷醇因为具有清凉、杀菌、止痒、镇痛等作用，被广泛的应用于食品、日化、医药、烟草等领域；且还可以作为前体物质合成其他香味物质。目前L-薄荷醇的工业化生产方式较为单一，主要为天然提取与化学合成，天然提取方法需要大量的薄荷属植物原料，化学合成L-薄荷醇同样需要植物来源的百里酚等化合物为底物进行反应拆分。但植物原料生长周期长，市场反馈慢，且容易受到气候、地域等自然环境因素的影响出现产量不稳定。另有以长叶薄荷酮等为底物进行全细胞或酶催化制备L-薄荷醇的方法，仍无法解决植物原料的限制因素。

申请人在前期构建了一株重组酿酒酵母工程菌WMT4，首次实现了发酵法生产L-薄荷醇，利用廉价的发酵培养基培养4d左右，L-薄荷醇的发酵产量达到5.03mg/L，但是仍然存在L-薄荷醇发酵产量低的缺点。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌，采用诱导型启动子表达基因ERG20WW与NPPS，重构MVA代谢合成途径，使得化合物IPP与DMAPP更趋向于合成化合物GPP与NPP，进而更利于L-薄荷醇的代谢合成。采用诱导型启动子过表达基因L3H，提高L3H酶的表达量，促进柠檬烯转化为反式异胡椒醇，通过蛋白酶融合表达tLIS与L3H基因，克服因L3H酶活过低而导致L-薄荷醇发酵产量低的因素。

本发明的第一个目的是提供一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌，所述的重组酵母菌是以产L-薄荷醇的基因工程菌为出发菌株，表达了法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20WW和/或橙花二磷酸合酶基因NPPS，所述的产L-薄荷醇的基因工程菌是以酵母菌为宿主，过表达内源MVA合成途径中的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1，并异源表达截短的柠檬烯合成酶基因LIS、柠檬烯羟基化酶基因L3H、细胞色素P450还原酶基因CPR、反式异胡椒醇脱氢酶基因IPDH、异薄荷二烯酮还原酶基因IPR、类固醇异构酶基因KSI、长叶薄荷酮还原酶基因PGR和薄荷醇还原酶基因MMR。

进一步地，所述的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的NCBI编号是NP_015208.1，所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的NCBI编号是NP_013636.1，柠檬烯合成酶的NCBI编号是AAC37366.1，柠檬烯羟基化酶的NCBI编号是AAD44151.1，细胞色素P450还原酶的NCBI编号是ABB88839.2，反式异胡椒醇脱氢酶的NCBI编号是AAU20370.1，异薄荷二烯酮还原酶的NCBI编号是AAQ75422.1，类固醇异构酶的NCBI编号是AFY18860.1，长叶薄荷酮还原酶的NCBI编号是AAQ75423.1，薄荷醇还原酶的NCBI编号是AAQ55960.1。

进一步地，所述的法尼基焦磷酸合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的橙花二磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20WW和/或橙花二磷酸合酶基因NPPS通过诱导型启动子进行表达。

进一步地，所述的重组酵母菌还过表达了柠檬烯羟基化酶基因L3H。

进一步地，所述的柠檬烯羟基化酶基因L3H通过诱导型启动子进行表达。

进一步地，所述的重组酵母菌还过表达了柠檬烯合成酶和柠檬烯羟基化酶的融合蛋白基因。

进一步地，所述的融合蛋白基因通过诱导型启动子进行表达。

进一步地，所述的酵母菌为酿酒酵母、异常汉逊氏酵母、粟酒裂殖酵母、黏红酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、解脂假丝酵母或巴斯德毕赤酵母。

本发明的第二个目的是提供所述的重组酵母菌在发酵生产L-薄荷醇中的应用。

本发明的有益效果：

本发明以酵母菌为出发菌株，采用诱导型启动子表达基因ERG20WW或/和NPPS，重构MVA代谢合成途径，使得化合物IPP与DMAPP更趋向于合成化合物GPP与NPP，进而更利于L-薄荷醇的代谢合成。采用诱导型启动子过表达基因L3H，提高L3H酶的表达量，促进柠檬烯转化为反式异胡椒醇，或通过蛋白酶融合表达tLIS与L3H基因，克服因L3H酶活过低而导致L-薄荷醇发酵产量低的因素。采用YPD液体培养基发酵4d，发酵至对数生长期后期添加10％的半乳糖水溶液诱导EEG20WW、NPPS基因与L-薄荷醇代谢途径基因的表达，保证了细胞的正常生长繁殖，L-薄荷醇的发酵产量最高达到30.14mg/L。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

气相-质谱联用检测L-薄荷醇：使用带有FID检测器和Chirasil-DEX-CB色谱柱(Agilent；25m，0.32mm，0.25μm)的Agilent Technologies 7890A仪器进行检测。进样器温度为180℃，载气为氦气，流速为1mL/min，压力为5.8psi。程序从70℃开始，以20℃/min的速率将温度升至150℃，保持3分钟，然后以2℃/min的速度将温度升至190℃，保持3分钟。

实施例1：优化内源性MVA途径

(a)以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物tHMG1-F、tHMG1-R扩增得到基因tHMG1，tHMG1是基因HMG1去除前530个氨基酸序列所形成，采用引物GPD-F，GPD-R扩增得到启动子基因GPD(SEQ ID NO.3)，采用引物ADH1-F1，ADH1-R1扩增得到终止子基因ADH1-1(SEQ ID NO.4)；采用引物IDI-F、IDI-R扩增得到基因IDI，采用引物TEF1-F，TEF1-R扩增得到启动子基因TEF1(SEQ ID NO.5)，采用引物CYC1-F1，CYC1-R1扩增得到终止子基因CYC1-1(SEQ ID NO.6)，采用引物208a-D-F，208a-D-R扩增得到基因片段208a-D，采用引物208a-U-F，208a-U-R扩增得到基因片段208a-F。

(b)将步骤(a)中获得的六个片段tHMG1、GPD、ADH1-1和IDI、TEF1、CYC1-1基因片段分为两组进行重叠延伸PCR，PCR条件：98℃，5min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段P_GPD-tHMG1-T_ADH1与P_TEF1-IDI-T_CYC1基因片段。

(c)以pML104质粒为模板，采用引物208a-F，208a-R扩增后得到片段208a，热击转入大肠杆菌JM109感受态后，采用引物208a-YZ-F与L4440菌落PCR验证，并进行测序，测序正确的单菌落接入2mL LB培养基内培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒pML104-208a。

(d)制备酿酒酵母CEN.PK2–1C感受态，并将构建好的融合片段P_GPD-tHMG1-T_ADH1、P_TEF1-IDI-T_CYC1与基因片段208a-D、208a-F与质粒pML104-208a共同转入CEN.PK2–1C感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物208a-U-F，208a-D-R进行菌落PCR验证。

(e)将步骤(d)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为WMT1。

引物序列：

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L4440 AGCGAGTCAGTGAGCGAG。

实施例2：重建L-薄荷醇代谢合成途径

(a)人工合成基因片段P_GAL1-tLIS-T_ADH1-P_GAL10-L3H-T_CYC1-P_GAL7-CPR-T_TDH3、P_GAL1-IPDH-T_ADH1-P_GAL10-IPR-T_CYC1-P_GAL7-KSI-T_TDH3、P_GAL1-PGR-T_ADH1-P_GAL10-MMR-T_CYC1，其中tLIS基因是基因LIS去除前56个氨基酸序列所形成。以酿酒酵母S288C基因组为模版，分别扩增得到基因片段911b-U、基因片段911b-D、基因片段308a-U、基因片段308a-D、基因片段1622b-U以及基因片段1622b-D。

(b)以质粒pML104为模版，分别扩增得到片段308a，911b和1622b，分别采用与实施例1(c)步骤类似的方法，构建获得质粒pML104-308a、pML104-911b和pML104-1622b。

(c)制备菌株WMT1的感受态，并将合成的基因片段P_GAL1-tLIS-T_ADH1、P_GAL10-L3H-T_CYC1、P_GAL7-CPR-T_TDH3和基因片段911b-U，911b-D和质粒pML104-911b转入WMT1感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后进行菌落PCR验证，采用实施例1(e)类似的方法筛选得到正确的工程菌，并命名为WMT2。

(d)制备菌株WMT2的感受态，并将合成的基因片段P_GAL1-IPDH-T_ADH1、P_GAL10-IPR-T_CYC1、P_GAL7-KSI-T_TDH3和基因片段308a-U，308a-D和质粒pML104-308a转入WMT2感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后进行菌落PCR验证，采用实施例1(e)类似的方法筛选得到正确的工程菌，并命名为WMT3(其中，启动子基因GAL1如SEQ ID NO.7所示，启动子基因GAL10如SEQ ID NO.8所示，启动子基因GAL7如SEQ ID NO.9所示，终止子基因TDH3如SEQ IDNO.10所示)。

(e)制备菌株WMT3的感受态，并将合成的基因片段P_GAL1-PGR-T_ADH1、P_GAL10-MMR-T_CYC1和基因片段1622b-U，1622b-D和质粒pML104-1622b转入WMT3感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后进行菌落PCR验证，采用实施例1(e)类似的方法筛选得到正确的工程菌，并命名为WMT4。

引物序列：

911b-D-F acaaaatctgagtgatatggaaattccgctgtatagctcatatctttcccttgatgagggtgaagggaaacagg

911b-D-R ccaacaatatgggtacgagaga

911b-U-F tctctgctggtcggtacttaa

911b-U-R cttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcggcctctgtcaccaagaaatgtcc

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实施例3：重构酿酒酵母工程菌WMT5

(a)人工合成基因片段P_GAL1-ERG20WW-T_ADH1，以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物416d-U-F、416d-U-R扩增得到基因416d-U，采用引物416d-D-F、416d-D-R扩增得到基因416d-D。

(b)将步骤(a)中获得的三个片段P_GAL1-ERG20WW-T_ADH1、416d-U、和416d-D基因片段进行重叠延伸PCR，PCR条件：98℃，5min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段416d-U-P_GAL1-ERG20WW-T_ADH1-416d-D基因片段。

(c)以pML104质粒为模板，采用引物416d-F，416d-R扩增后得到片段416d，热击转入大肠杆菌JM109感受态后，采用引物416d-YZ-F与L4440菌落PCR验证，并进行测序，测序正确的单菌落接入2mL LB培养基内培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒pML104-416d。

(d)制备酿酒酵母工程菌WMT4感受态，并将构建好的融合基因片段416d-U-P_GAL1-ERG20WW-T_ADH1-416d-D与质粒pML104-416d共同转入WMT4感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物416d-U-F，416d-D-R进行菌落PCR验证。

(e)将步骤(d)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为WMT5。

引物序列：

416b-U-F tccgatgctgacttgctgggtatta

416d-D-F tacacttattttttttataacttatttaataataaaaatcataaatcataagaaattcgcctattttaacatgtggaattcttgaaagaa

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L4440 agcgagtcagtgagcgag。

实施例4：重构酿酒酵母工程菌WMT6

(a)人工合成基因片段P_GAL1-NPPS-T_ADH1，以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物416d-U-F、416d-U-R扩增得到基因416d-U，采用引物416d-D-F、416d-D-R扩增得到基因416d-D。

(b)将步骤(a)中获得的三个片段P_GAL1-NPPS-T_ADH1、416d-U、和416d-D基因片段进行重叠延伸PCR，PCR条件：98℃，5min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段416d-U-P_GAL1-NPPS-T_ADH1-416d-D基因片段。

(d)制备酿酒酵母工程菌WMT4感受态，并将构建好的融合基因片段416d-U-P_GAL1-NPPS-T_ADH1-416d-D与质粒pML104-416d共同转入WMT4感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物416d-U-F，416d-D-R进行菌落PCR验证。

(e)将步骤(d)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为WMT6。

引物序列：

416b-U-F tccgatgctgacttgctgggtatta

416d-D-R tgtatctggtcgccaaggcgt

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实施例5：重构酿酒酵母工程菌WMT7

(a)人工合成基因片段P_GAL1-NPPS-T_ADH1-P_GAL10-ERG20WW-T_CYC1，以酿酒酵母S288C基因组为模版，采用引物416d-U-F、416d-U-R扩增得到基因416d-U，采用引物416d-D-F、416d-D-R扩增得到基因416d-D。

(b)将步骤(a)中获得的三个片段P_GAL1-NPPS-T_CYC1-P_GAL10-ERG20WW-T_ADH1、416d-U、和416d-D基因片段进行重叠延伸PCR，PCR条件：98℃，5min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段416d-U-P_GAL1-NPPS-T_CYC1-P_GAL10-ERG20WW-T_ADH1-416d-D基因片段。

(d)制备酿酒酵母工程菌WMT4感受态，并将构建好的融合基因片段416d-U-P_GAL1-NPPS-T_CYC1-P_GAL10-ERG20WW-T_ADH1-416d-D与质粒pML104-416d共同转入WMT4感受态中，待SDUra筛选固体平板上长出单菌落后采用引物416d-U-F，416d-D-R进行菌落PCR验证。

(e)将步骤(d)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为WMT7。

引物序列：

416b-U-F tccgatgctgacttgctgggtatta

416d-D-R tgtatctggtcgccaaggcgt

416d-YZ-F aacgtggggtaagtgcacta

416d-F aacgtggggtaagtgcactagatcatttatctttcactgcggagaagttt

416d-R gatctagtgcacttaccccacgttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggc

L4440 agcgagtcagtgagcgag。

实施例6：重构酿酒酵母工程菌WMT8

(a)以酿酒酵母工程菌WMT2基因组为模版，采用引物106a-U-F，106a-U-R扩增得到基因片段106a-U，采用引物106a-D-F，106a-D-R扩增得到基因片段106a-D，采用引物L3H-FC，L3H-RC扩增得到基因片段L3HC。

(b)以质粒pML104为模版，采用引物106a-F，106a-R扩增得到片段106a，热击转入大肠杆菌JM109感受态后，采用引物416d-YZ-F与L4440菌落PCR验证，并进行测序，测序正确的单菌落接入2mL LB培养基内培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒pML104-106a。

(c)制备酿酒酵母工程菌WMT7的感受态，并将基因片段106a-D、106a-U、L3HC和质粒pML104-106a转入WMT7感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物106a-U-F，106a-D-R进行菌落PCR验证。

(d)将步骤(c)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为WMT8。

引物序列：

106a-D-F gaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcggcccggctctattgttttccatctctc

106a-D-R cggttctgatgaaagaagcgaagacc

106a-U-F ctacatagtatatgcggcgctacc

106a-U-R cacaacatataagtaagattagatatggatatgtatatggtggtaatgccatgtataaggggggaaaaataattcacctcttt

106a-YZ-F gggcgctaccctgaccgtat

106a-F gggcgctaccctgaccgtatgatcatttatctttcactgcggagaagttt

106a-R gatcatacggtcagggtagcgcccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggc

L4440 agcgagtcagtgagcgag

L3H-FC acatggcattaccaccatatacat

L3H-RC ggccgcaaattaaagccttcgagcg。

实施例7：重构酿酒酵母工程菌WMT9

(a)以酿酒酵母工程菌WMT2基因组为模版，采用引物106a-U-F，106a-U-R扩增得到基因片段106a-U，采用引物106a-D-F，106a-D-R扩增得到基因片段106a-D，采用引物L3H-FD，L3H-RD扩增得到基因片段L3HD，采用引物LIS-FC，LIS-RC扩增得到基因片段LISC。

(c)制备酿酒酵母工程菌WMT7的感受态，并将基因片段106a-D、106a-U、L3HD、LISC和质粒pML104-106a转入WMT7感受态中，待SD Ura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物106a-U-F，106a-D-R进行菌落PCR验证。

(d)将步骤(c)中菌落PCR验证正确的单菌落接入YPD液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-FOA的YPD固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于YPD固体平板与SD Ura筛选固体平板上对比验证，YPD平板上正常生长但SD Ura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为WMT9。

引物序列：

106a-D-R cggttctgatgaaagaagcgaagacc

106a-U-F ctacatagtatatgcggcgctacc

106a-YZ-F gggcgctaccctgaccgtat

106a-F gggcgctaccctgaccgtatgatcatttatctttcactgcggagaagttt

106a-R gatcatacggtcagggtagcgcccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggc

L4440 agcgagtcagtgagcgag

LIS-FC ttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttgg

LIS-RC ggtggcggtggaagcggcggtggcggaagcggcggtggcggcagcagcaaatggttcgaacaatgttctagt

L3H-FD gctgccgccaccgccgcttccgccaccgccgcttccaccgccaccatggaattacaaatttcttcagctattattattt

L3H-RD cttcgagcgtcccaaaaccttctcaagca。

实施例8：重构酿酒酵母工程菌的发酵培养

在2ml YPD培养基中接种固体YPD平板上的酿酒酵母工程菌单菌落，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量1％接入含有25mL YPD液体培养基的250mL圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至16h时，加入10％半乳糖水溶液。发酵结束后，取600μL菌液加入0.5mm玻璃珠与等体积乙酸乙酯破碎，之后高速离心取上层乙酸乙酯层进行气相质谱联用检测。

以酿酒酵母工程菌WMT4为出发菌株，利用诱导型启动子表达法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20WW，构建的酿酒酵母工程菌WMT5，发酵产量达到8.56mg/L。以酿酒酵母工程菌WMT4为出发菌株，利用诱导型启动子表达橙花二磷酸合酶NPPS，构建的酿酒酵母工程菌WMT6，发酵产量达到11.56mg/L；以酿酒酵母工程菌WMT4为出发菌株，利用诱导型启动子共表达ERG20WW与NPPS基因，构建的酿酒酵母工程菌WMT7，发酵产量达到14.36mg/L。以酿酒酵母工程菌WMT7为出发菌株，利用诱导型启动子过表达L-薄荷醇代谢途径中的关键酶基因柠檬烯羟基化酶基因L3H，提高L3H酶的表达量，解除L-薄荷醇后续合成步骤的代谢通量限制瓶颈，构建得到的酵母酿酒酵母工程菌WMT8，发酵产量达到18.74mg/L；以酿酒酵母工程菌WMT7为出发菌株，利用诱导启动子过表达融合蛋白tLIS-L3H基因，提高L-薄荷醇代谢途径的催化效率，构建得到的酵母酿酒酵母工程菌WMT9，L-薄荷醇的发酵产量达到30.14mg/L。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 352

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe

1 5 10 15

Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met

20 25 30

Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr

35 40 45

Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala

50 55 60

Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Trp

85 90 95

Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln

100 105 110

Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Trp Asp

115 120 125

Ala Phe Met Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Lys Leu Leu Lys Ser His Phe

130 135 140

Arg Asn Glu Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr Glu Leu Phe His Glu Val

145 150 155 160

Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Met Asp Leu Ile Thr Ala Pro

165 170 175

Glu Asp Lys Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Leu Lys Lys His Ser Phe

180 185 190

Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala

195 200 205

Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln

210 215 220

Ala Arg Asp Val Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp

225 230 235 240

Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly

245 250 255

Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu

260 265 270

Glu Leu Ala Ser Ala Glu Gln Arg Lys Thr Leu Asp Glu Asn Tyr Gly

275 280 285

Lys Lys Asp Ser Val Ala Glu Ala Lys Cys Lys Lys Ile Phe Asn Asp

290 295 300

Leu Lys Ile Glu Gln Leu Tyr His Glu Tyr Glu Glu Ser Ile Ala Lys

305 310 315 320

Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser Arg Gly Phe Lys

325 330 335

Ala Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys

340 345 350

<210> 2

<211> 260

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Ser Ala Arg Gly Leu Asn Lys Ile Ser Cys Ser Leu Asn Leu Gln

1 5 10 15

Thr Glu Lys Leu Cys Tyr Glu Asp Asn Asp Asn Asp Leu Asp Glu Glu

20 25 30

Leu Met Pro Lys His Ile Ala Leu Ile Met Asp Gly Asn Arg Arg Trp

35 40 45

Ala Lys Asp Lys Gly Leu Glu Val Tyr Glu Gly His Lys His Ile Ile

50 55 60

Pro Lys Leu Lys Glu Ile Cys Asp Ile Ser Ser Lys Leu Gly Ile Gln

65 70 75 80

Ile Ile Thr Ala Phe Ala Phe Ser Thr Glu Asn Trp Lys Arg Ser Lys

85 90 95

Glu Glu Val Asp Phe Leu Leu Gln Met Phe Glu Glu Ile Tyr Asp Glu

100 105 110

Phe Ser Arg Ser Gly Val Arg Val Ser Ile Ile Gly Cys Lys Ser Asp

115 120 125

Leu Pro Met Thr Leu Gln Lys Cys Ile Ala Leu Thr Glu Glu Thr Thr

130 135 140

Lys Gly Asn Lys Gly Leu His Leu Val Ile Ala Leu Asn Tyr Gly Gly

145 150 155 160

Tyr Tyr Asp Ile Leu Gln Ala Thr Lys Ser Ile Val Asn Lys Ala Met

165 170 175

Asn Gly Leu Leu Asp Val Glu Asp Ile Asn Lys Asn Leu Phe Asp Gln

180 185 190

Glu Leu Glu Ser Lys Cys Pro Asn Pro Asp Leu Leu Ile Arg Thr Gly

195 200 205

Gly Glu Gln Arg Val Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln Leu Ala Tyr Thr

210 215 220

Glu Phe Tyr Phe Thr Asn Thr Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Glu Ala Ile Met Asn Phe Gln Gln Arg His Arg Arg Phe Gly

245 250 255

Gly His Thr Tyr

260

<210> 3

<211> 644

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

tcattatcaa tactcgccat ttcaaagaat acgtaaataa ttaatagtag tgattttcct 60

aactttattt agtcaaaaaa ttagcctttt aattctgctg taacccgtac atgcccaaaa 120

tagggggcgg gttacacaga atatataaca tcgtaggtgt ctgggtgaac agtttattcc 180

tggcatccac taaatataat ggagcccgct ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa 240

tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc aaccatcagt tcataggtcc attctcttag 300

cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag gcaaaaaacg ggcacaacct caatggagtg 360

atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac aaggcaattg acccacgcat gtatctatct 420

cattttctta caccttctat taccttctgc tctctctgat ttggaaaaag ctgaaaaaaa 480

aggttgaaac cagttccctg aaattattcc cctacttgac taataagtat ataaagacgg 540

taggtattga ttgtaattct gtaaatctat ttcttaaact tcttaaattc tacttttata 600

gttagtcttt tttttagttt taaaacacca gaacttagtt tcga 644

<210> 4

<211> 166

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta 60

tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct 120

ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctc 166

<210> 5

<211> 401

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60

tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120

tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180

tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat 240

tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg 300

tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc 360

ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt t 401

<210> 6

<211> 252

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60

aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120

tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180

acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240

taatttgcgg cc 252

<210> 7

<211> 600

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120

tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180

attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccta tggttgttaa 240

tttgattcgt taatttgaag gtttgtgggg ccaggttact gccaattttt cctcttcata 300

accataaaag ctagtattgt agaatcttta ttgttcggag cagtgcggcg cgaggcacat 360

ctgcgtttca ggaacgcgac cggtgaagac gaggacgcac ggaggagagt cttccgtcgg 420

agggctgtcg cccgctcggc ggcttctaat ccgtacttca atatagcaat gagcagttaa 480

gcgtattact gaaagttcca aagagaaggt ttttttaggc taagataatg gggctcttta 540

catttccaca acatataagt aagattagat atggatatgt atatggtggt aatgccatgt 600

<210> 8

<211> 500

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccca ttatcttagc ctaaaaaaac cttctctttg gaactttcag 180

taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat tagaagccgc cgagcgggcg 240

acagccctcc gacggaagac tctcctccgt gcgtcctcgt cttcaccggt cgcgttcctg 300

aaacgcagat gtgcctcgcg ccgcactgct ccgaacaata aagattctac aatactagct 360

tttatggtta tgaagaggaa aaattggcag taacctggcc ccacaaacct tcaaattaac 420

gaatcaaatt aacaaccata ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt atttctgggg 480

taattaatca gcgaagcgat 500

<210> 9

<211> 300

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

ttttgaggga atattcaact gttttttttt atcatgttga tgctctgcat aataatgccc 60

ataaatattt ccgacctgct tttatatctt tgctagccaa actaactgaa catagctaca 120

cattattttc agcttggcta ttttgtgaac actgtatagc cagtccttcg gatcacggtc 180

aacagttgtc cgagcgcttt ttggaccctt tcccttattt ttgggttaag gaaaatgaca 240

gaaaatatat ctaatgagcc ttcgctcaac agtgctccga agtatagctt tccaaaagga 300

<210> 10

<211> 582

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

aagggaaaga tatgagctat acagcggaat ttccatatca ctcagatttt gttatctaat 60

tttttccttc ccacgtccgc gggaatctgt gtatattact gcatctagat atatgttatc 120

ttatcttggc gcgtacattt aattttcaac gtattctata agaaattgcg ggagtttttt 180

tcatgtagat gatactgact gcacgcaaat ataggcatga tttataggca tgatttgatg 240

gctgtaccga taggaacgct aagagtaact tcagaatcgt tatcctggcg gaaaaaattc 300

atttgtaaac tttaaaaaaa aaagccaata tccccaaaat tattaagagc gcctccatta 360

ttaactaaaa tttcactcag catccacaat gtatcaggta tctactacag atattacatg 420

tggcgaaaaa gacaagaaca atgcaatagc gcatcaagaa aaaacacaaa gctttcaatc 480

aatgaatcga aaatgtcatt aaaatagtat ataaattgaa actaagtcat aaagctataa 540

aaagaaaatt tatttaaatg caagatttaa agtaaattca ct 582

Claims

1.一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌是以产L-薄荷醇的基因工程菌为出发菌株，表达了法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20WW和/或橙花二磷酸合酶基因NPPS，所述的产L-薄荷醇的基因工程菌是以酵母菌为宿主，过表达内源MVA合成途径中的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1，并异源表达截短的柠檬烯合成酶基因LIS、柠檬烯羟基化酶基因L3H、细胞色素P450还原酶基因CPR、反式异胡椒醇脱氢酶基因IPDH、异薄荷二烯酮还原酶基因IPR、类固醇异构酶基因KSI、长叶薄荷酮还原酶基因PGR和薄荷醇还原酶基因MMR。

2.根据权利要求1所述的的重组酵母菌，其特征在于，所述的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的NCBI编号是NP_015208.1，所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的NCBI编号是NP_013636.1，柠檬烯合成酶的NCBI编号是AAC37366.1，柠檬烯羟基化酶的NCBI编号是AAD44151.1，细胞色素P450还原酶的NCBI编号是ABB88839.2，反式异胡椒醇脱氢酶的NCBI编号是AAU20370.1，异薄荷二烯酮还原酶的NCBI编号是AAQ75422.1，类固醇异构酶的NCBI编号是AFY18860.1，长叶薄荷酮还原酶的NCBI编号是AAQ75423.1，薄荷醇还原酶的NCBI编号是AAQ55960.1。

3.根据权利要求1所述的的重组酵母菌，其特征在于，所述的法尼基焦磷酸合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的橙花二磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的的重组酵母菌，其特征在于，所述的法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20WW和/或橙花二磷酸合酶基因NPPS通过诱导型启动子进行表达。

5.根据权利要求1所述的的重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌还过表达了柠檬烯羟基化酶基因L3H。

6.根据权利要求5所述的的重组酵母菌，其特征在于，所述的柠檬烯羟基化酶基因L3H通过诱导型启动子进行表达。

7.根据权利要求1所述的的重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌还过表达了柠檬烯合成酶和柠檬烯羟基化酶的融合蛋白基因。

8.根据权利要求7所述的的重组酵母菌，其特征在于，所述的融合蛋白基因通过诱导型启动子进行表达。

9.根据权利要求1所述的的重组酵母菌，其特征在于，所述的酵母菌为酿酒酵母、异常汉逊氏酵母、粟酒裂殖酵母、黏红酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、解脂假丝酵母或巴斯德毕赤酵母。

10.权利要求1-9任一项所述的重组酵母菌在发酵生产L-薄荷醇中的应用。