KR101640853B1 - 연속 대사경로 효소 집합체 구축을 통한 이소프레노이드 고효율 생산 방법 - Google Patents

연속 대사경로 효소 집합체 구축을 통한 이소프레노이드 고효율 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 유래 레트로트랜스포존 유전자를 이용한 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터, 특히, 이소프레노이드 생산용 연속 대사경로 효소 집합체를 포함하는 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터와 상기 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터로 형질전환된 재조합 균주 또는 파네실 피로포스페이트를 합성하는 효소; 및 이소프레노이드를 합성하는 합성효소;를 발현하는 이소프레노이드 생산용 재조합 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 이소프레노이드 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이소프레노이드 과생산을 위하여 백신에서 각광받고 있는 바이러스유사입자 (virus-like particle)를 형성하는 효모 유래의 레트로트랜스포존인 Ty1을 이용하여 metabolosome을 구축하였는바, 상기 전략을 이용하여 다양한 이소프레노이드에 대해 우수한 생산성을 가지는 발현 벡터 및 재조합 균주를 제조할 수 있으며, 이를 이용하여 이소프레노이드를 높은 효율로 생산할 수 있어 해당 기술분야에서 널리 사용될 것으로 기대된다.

Description

연속 대사경로 효소 집합체 구축을 통한 이소프레노이드 고효율 생산 방법 {Improved production of isoprenoids by metabolosome construction}
본 발명은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 유래 레트로트랜스포존 유전자를 이용한 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터, 특히, 이소프레노이드 생산용 연속 대사경로 효소 집합체를 포함하는 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터와 상기 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터로 형질전환된 재조합 균주 또는 파네실 피로포스페이트를 합성하는 효소; 및 이소프레노이드를 합성하는 합성효소;를 발현하는 이소프레노이드 생산용 재조합 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 이소프레노이드 생산 방법에 관한 것이다.
일련의 대사경로를 구성하는 연속 효소 반응에 있어서 한 반응의 생성물이 주위 환경으로 퍼져 나가 희석되지 않고 다음 반응의 기질로 바로 이용될 수 있도록 하는 소위 "기질 채널(substrate channeling)"을 통하여 대사산물의 생산성 효율이 대폭 증진되는 것으로 알려져 있으며 2개의 연속되는 반응의 경우 2개의 효소를 융합하여 발현하는 것을 통해 이러한 효과를 얻을 수 있다고 알려져 있다. 그러나, 다수의 연속되는 반응으로 구성된 대사경로의 경우 단순히 2개의 효소를 융합하는 방법을 사용하는 것은 한계가 있었다.
최근 합성 생물학의 발전에 따라 이러한 단백질의 구조적 집합체를 이룰 수 있는 단백질 도메인(scaffolds)의 활용 사례가 증가하고 있다 (Lee H. 등, Metabolic Engineering 14:242-251 (2012); Agapakis C. 등, Nature Chem Biol. 8:527-535, (2012)).
바이러스 유사 입자(virus-like particle)는 백신과 관련하여 이미 많은 연구가 활발히 진행되고 있다. 바이러스 유사 입자는 바이러스와 유사하지만 바이러스 유전물질을 가지고 있지 않기 때문에 감염을 시키지 않는다. Envolope이나 Capsid와 같은 바이러스 구조 단백질을 가지고 있어 바이러스 유사 입자를 자가 조립하는 것이 가능하다고 알려져 있다.
최근에 바이러스 유사 입자는 Parvoviridae, Retroviridae, Flaviviridae 등의 다양한 바이러스 종으로부터 생산이 확대되고 있다. 또한, 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 효모에 이르기까지 다양한 세포 배양 시스템으로 생산되고 있다. 대표적으로 Hepatitis B, human papillomavirus로부터 유래된 바이러스 유사 입자는 백신으로서 이용되어 지는 것에 대한 미국 식품의약국(FDA)의 승인이 되어 있다. 또한, 바이러스 유사 입자를 이용하여 아프리카, 동남아에 분포되어 있는 치군군야바이러스에 대한 백신을 개발한 전례도 있다 (Akahata W. 등, Nat. Med. 16(3):334-338 (2010)).
그러나 미생물 대사공학 분야에서는 바이러스 유사 입자의 활용에 대한 연구가 아직 많이 진행되어 있지 않아 본 발명자는 효모에서 바이러스 유사 입자를 형성하는 것으로 알려진 Ty1 유전자의 Tya 단백질을 선별하여 본 발명에 이용하였다.
한편, 이소프레노이드는 C5 출발물질 IPP(isopentenyl pyrophosphate)와 DMAPP(dimethylallyl pyrophosphate)의 연쇄적인 축합에 의하여 생성되는 화합물들을 총칭하는데 약 5만 가지 이상의 방대한 화합물 군이 알려져 있다. 이소프레노이드 화합물은 보통 자연계에서 미량 존재하며 이를 다량으로 생산하기 위한 미생물 대사공학 기술이 최근 활발히 진행되고 있다 (Tokuhiro K. 등, Appl. Environ. Microbiol. 75(17):5536-43 (2009), Ohto C. 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 82(5):837-845 (2009)).
특히, 가솔린이나 디젤유를 대체하기 위한 바이오 연료로서 C10, C15, C20 이소프레노이드 화합물이 탄화수소 연료로 개발이 시작되고 있다. 화석연료를 대체하기 위한 바이오 연료의 대표적인 예인 에탄올이 현재 주로 미국을 중심으로 옥수수 전분, 브라질 등에서는 사탕수수를 원료로 생산되고 있으며 이는 식량 소비량 감소의 부작용을 초래하여 농산물 가격 폭등의 세계적인 문제를 발생시키고 있고 또한 당초 기대와 달리 이산화탄소 저감 효과가 미미한 것으로 알려지고 있다. 또한, 에탄올은 에너지 함량이 가솔린에 비하여 낮고 부식성이 있고 흡습성이 높아 엔진과 파이프라인을 손상시키고 저장과 수송이 어려우며 정제에 많은 에너지가 요구되는 등의 단점을 가지고 있다.
따라서 최근에는 차세대 연료로서 가솔린 (C4-C12)이나 디젤(C9-C23)과 같은 연료에 보다 가까운 특성을 지니는 탄화수소(hydrocarbon)를 지속가능한 생물학적 방법으로 생산할 수 있는 기술개발의 필요성이 대두되고 있다.
생물학적인 방법으로 생산이 가능한 탄화수소류 화합물, 이소프레놀 (파르네솔, 파르네신, 스쿠알렌 등)은 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)균주 내 대사경로에서 이소프레노이드계 화합물로서 acetyl CoA로부터 생합성이 가능하다. 이소프레노이드를 고효율로 생산하기 위해서는 모든 이소프레노이드 화합물 생합성의 필수 중간체로서 기본 출발 물질인 IPP (isopentenyl pyrophosphate), DMAPP (dimethylallyl pyrophosphate) 생합성에 가장 중요한 HMG-CoA reductase를 포함하는 약 7종의 유전자와 아울러 중간체로부터 파르네솔 (farnesol), 파르네신 (farnesene) 등의 이소프레노이드 바이오 화합물을 생합성하는데 관련되는 유전자 FPP (farnesyl pyrophosphate) synthase (ispA, Erg20)등 다양한 유전자로 구성된 대사회로 구축과 이들 유전자들의 정교하고 조합적인 발현을 위한 metabolosome 구축을 위한 기술 개발이 필요하다.
상기와 같은 배경 하에 본 발명자는 사카로미세스 세레비시아 균주에서 효율적인 이소프레노이드 생산을 위한 metabolosome을 구축하고자 노력한 결과, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 유래 레트로트랜스포존 유전자를 이용한 연속 대사경로 효소 집합체를 제조할 수 있음을 확인하고, 모든 이소프레노이드 생합성의 전구물질인 IPP, DMAPP와 수많은 sesquiterpenoid 류 화합물의 생합성 전구체인 FPP의 생합성을 증대시켜 sesquiterpenoid를 포함하는 다른 이소프레노이드를 생산하는 데에도 범용적으로 활용이 가능한 연속 대사경로 효소 집합체를 구축하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 유래 레트로트랜스포존 유전자를 이용한 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터를 제공하는 것이다. 특히, 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터로 형질전환한 이소프레노이드 생산용 사카로미세스 세레비시아 재조합 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 파네실 피로포스페이트를 합성하는 효소; 및 이소프레노이드를 합성하는 합성효소;를 발현하는 이소프레노이드 생산용 사카로미세스 세레비시아 재조합 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 이소프레노이드 생산 방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 유래 레트로트랜스포존 유전자를 이용한 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 유래 레트로트랜스포존 유전자; 및 목적 대사산물을 생산하는 연속 대사경로의 유전자;를 포함하는 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터를 제공한다.
본 발명자들은 사카로미세스 세레비시아 유래 레트로트랜스포존 유전자를 이용하여 연속 대사경로에 관여하는 두 개 이상의 유전자를 포함하는 연속 대사경로 효소 집합체를 구축하였으며, 이를 통하여 대사경로의 효율성을 증진시켜 목적 대사산물의 생산성을 증가시키는 결과를 확인하였다. 특히, 본 발명에서 목적 대사산물은 이소프레노이드일 수 있으며, 연속 대사경로 또한 이소프레노이드 생산 대사경로일 수 있으나, 본 발명의 사카로미세스 세레비시아 유래 레트로트랜스포존 유전자를 이용하여 구축한 연속 대사경로 효소 집합체를 구성할 수 있는 연속 대사경로인 한 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 이소프레노이드 생산 대사경로, 특히 파르네실과 파르네솔을 생산하는 대사경로에 대한 효소 집합체를 구성하기 위하여, 각각 파네실 피로포스페이트 합성효소 (farnesyl pyrophosphate synthase, ispA) 유전자, 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 (Hydroxymethyl glutaryl CoA reductase 1, HMG1) 유전자, 파르네솔 합성효소(diacylglycerol pyrophosphate phosphatase 1, DPP1) 또는 파르네신 합성효소(farnesene synthase, FS)와 사카로미세스 세레비시아 유래 레트로트랜스포존 유전자인 Tya 및 Ty1을 이용하여 이소프레노이드 생산 효소 집합체를 구성하는 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터를 제조하였다.
특히, 본 발명은 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로 파네실 피로포스페이트를 합성하는 효소 유전자; 이소프레노이드를 합성하는 합성효소 유전자; 및 레트로트랜스포존 유전자;를 포함하는 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터를 제공하며, 특히, i) 파네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP)를 합성하는 효소인 파네실 피로포스페이트 합성효소 (farnesyl pyrophosphate synthase, ispA) 유전자 및 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 (Hydroxymethyl glutaryl CoA reductase 1, HMG1) 유전자; ii) 파네실 피로포스페이트를 전구체로 하여 이소프레노이드를 합성하는 합성효소 유전자; 및 iii) 레트로트랜스포존 유전자;를 포함하는 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 용어, "이소프레노이드(isoprenoid)"는 5개의 탄소 원자가 특이한 형태로 배열된 2개 이상의 단위체로 이루어진 유기 화합물을 지칭하며, 특히 C5 출발물질 IPP(isopentenyl pyrophosphate)와 DMAPP(dimethylallyl pyrophosphate)의 연쇄적인 축합에 의하여 생성되는 화합물들을 총칭하는데 약 5만 가지 이상의 방대한 화합물 군을 이른다. 본 발명에서 이소프레노이드는 FPP(farnesyl pyrophosphate)로부터 생합성 되는 sesquiterpenoid류 화합물들인 파네솔, 파르네신과 triterpenoid류 화합물인 스쿠알렌 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 이들을 전구체로 하는 많은 이소프레노이드의 생합성에 효과적일 수 있다.
본 발명에서 이소프레노이드를 합성하는 합성효소는 상기 설명한 다양한 이소프레노이드를 합성하는 효소를 모두 포함하며, 특히 파네실 피로포스페이트를 전구체로 하여 이소프레노이드를 합성하는 합성효소일 수 있다. 본 발명의 이소프레노이드를 합성하는 합성효소는 예를 들어, 스쿠알렌 합성효소(squalene synthase, Erg9), 파르네솔 합성효소(diacylglycerol pyrophosphate phosphatase 1, DPP1), 파르네신 합성효소(farnesene synthase, FS)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 이소프레노이드 생산용 발현벡터는 상기 이소프레노이드를 합성하는 합성효소의 유전자를 포함할 수 있으며 이는 스쿠알렌 합성효소(Erg9) 유전자, 파르네솔 합성효소(DPP1) 유전자, 파르네신 합성효소(FS) 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "파네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP)"는 파네실 디포스페이트(farnesyl diphosphate, FDP)로도 불리우며, 테르펜(terpenes), 테르페노이드(terpenoids), 스테롤(sterols) 등의 생합성에 사용되는, HMG-CoA 환원효소 경로의 중간물질이다. 본 발명에서 파네실 피로포스페이트는 이소프레노이드를 합성하는 전구체로 사용될 수 있으며, 이에 따라 이소프레노이드를 합성하는 합성효소의 기질로 사용될 수 있다. 본 발명의 파네실 피로포스페이트는 파네실 피로포스페이트 합성효소 (farnesyl pyrophosphate synthase, ispA 또는 Erg20)로부터 합성될 수 있다.
본 발명의 파네실 피로포스페이트 합성효소는 Isopentenyl-5-PP로부터 Geranyl-PP를, 그리고 Geranyl-PP로부터 Farnesyl-PP 반응을 매개하는 효소로서, 본 발명에서 파네실 피로포스페이트 합성효소가 이소프레노이드 생성 중에 매개하는 작용은 도 2에 도식화하였다. 본 발명의 이소프레노이드 생산용 발현벡터는 상기 파네실 피로포스페이트 합성효소의 유전자를 포함할 수 있으며 이는 ispA/Erg20일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "히드록시메틸 글루타릴 CoA (Hydroxymethyl glutaryl CoA, HMG-CoA)"는 콜레스테롤을 비롯한 각종 스테로이드나 테르펜 생합성의 전구체이다. 케톤 대사와 스테로이드나 테르펜 생합성 대사에 관여한다. 즉, HMG-CoA는 스테로이드 생합성계와 케톤체 대사계 분기점의 화합물이다. 본 발명의 HMG-CoA 환원효소는 콜레스테롤 생합성계에서 중요한 속도 조절 효소이다.
본 발명의 이소프레노이드 생산용 발현벡터는 상기 HMG-CoA 환원효소의 유전자를 포함할 수 있으며, 이는 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 1 (Hydroxymethyl glutaryl CoA reductase 1, HMG1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "레트로트랜스포존(retrotransposon)"은 레트로트랜스포존 DNA의 전사체인 RNA를 매개체로 하여 유전체 내에서 이동하는 성질을 갖는 전위인자이다. 일반적으로 양쪽에 긴 말단반복서열(LTRs, Long terminal repeats)이 존재하고, 역전사를 통해 증식할 수 있다. 통상 레트로트랜스포존 DNA가 mRNA로 전사된 후에, 역전사 효소를 통해 새로운 dsDNA를 만든 후, 유전체의 다른 위치에 삽입되는 기작을 통해 이동한다. 본 발명의 레트로트랜스포존은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 유래 전위인자인 Tya(Transposons of yeast element a, Tya) 또는 Ty1 (Transposons of yeast element, Ty1)일 수 있으며, 서열번호 24의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서 레트로트랜스포존은 효소에 연결되어 발현하여, 효소의 구조적 집합체를 구성하는데 작용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 이소프레노이드 생산용 발현벡터에 파네실 피로포스페이트 합성효소 (farnesyl pyrophosphate synthase, ispA) 유전자 및 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 (Hydroxymethyl glutaryl CoA reductase 1, HMG1) 유전자를 도입하였으며, 이소프레노이드를 합성하는 합성효소의 유전자 파르네솔 합성효소(DPP1) 유전자 또는 파르네신 합성효소(FS) 유전자를 도입하였다. 또한, 레트로트랜스포존 유전자(Ty1 또는 Tya)를 도입하였다.
본 발명은 효모 유래의 레트로트랜스포존인 Ty1 또는 Tya를 이용하여 방대한 생리활성 물질군인 이소프레노이드 화합물을 과생산할 수 있는 균주를 구축하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 1) metabolosome 구축을 위한 효모 유래 레트로트랜스포존인 Ty1또는 Tya와 이소프레노이드 합성의 핵심 유전자를 융합하여 효모 발현 벡터에 클로닝 하는 단계; 2) 상기 단계 1에서 구축한 융합 발현 벡터를 효모 균주인 사카로미세스 세레비시아 균주에 각각 도입하여 배양하는 단계; 3) 상기 단계 2를 통해 생산된 이소프레노이드 화합물을 가스 크로마토그래피 (Gas chromatography)를 이용하여 분석하는 단계; 4) 상기 단계 2를 토대로 이소프레노이드 과생산 균주의 정확한 생산성을 알아보기 위한 5L 실험실 규모의 발효조를 이용한 배양단계를 포함하는 사카로미세스 세레비시아 균주에서 이소프레노이드 과생산을 위한 metabolosome을 구축하였다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하며, 효모 숙주세포 내에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 당업계에 공지된 벡터를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되면 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편의 영향을 받지만, 이들 핵산 단편의 여러 가능한 결합 조합 중에서 각 단편이 그 기능을 수행하는데 있어 검출할 만한 영향이 없는 상태의 결합을 의미한다. 즉, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 아울러, 본 발명의 발현 카세트는 전사를 조절하기 위한 임의의 전사 시작 조절 서열 및 전사 종결 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 작동가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"이란 형질전환 또는 형질도입에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질전환은 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염 (infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.
본 발명의 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터는 상기 파네실 피로포스페이트 합성효소 유전자, 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 유전자 및 이소프레노이드를 합성하는 합성효소 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 레트로트랜스포존 유전자가 연결된 것일 수 있으며, 특히 상기 파네실 피로포스페이트 합성효소 유전자, 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 유전자 및 이소프레노이드를 합성하는 합성효소 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 레트로트랜스포존 유전자가 연결은 링커 유전자를 통해 연결된 것일 수 있다. 본 발명에서 링커 유전자는 서열번호 26의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 Ty1을 HMG1, DPP1 또는 FS 및 ispA 중 어느 하나 이상의 유전자 3' 또는 5' 쪽에 연결한 발현 벡터를 구축하였다. 구체적으로, pGal-HMG1/Ty1LDPP1/Ty1LispA, pGal-HMG1/DPP1LTy1/ispALTy1, pGal-Ty1LHMG1/Ty1LDPP1/ispALTy1, pGal-HMG1LTy1/Ty1LDPP1/ispALTy1, pGal-HMG1/Ty1LFS/Ty1LispA, pGal-HMG1/FSLTy1/ispALTy1, pGal-Ty1LHMG1/FSLTy1/ispALTy1 및 pGal-HMG1LTy1/FSLTy1/ispALTy1을 구축하였다(도 3 및 도 4).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이소프레노이드 생산 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터로 형질전환한 이소프레노이드 생산용 재조합 균주를 제공한다.
구체적으로 본 발명의 이소프레노이드 생산용 재조합 균주는 i) 파네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP)를 합성하는 효소인 파네실 피로포스페이트 합성효소 (farnesyl pyrophosphate synthase, ispA) 및 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 (Hydroxymethyl glutaryl CoA reductase 1, HMG1); 및 ii) 파네실 피로포스페이트를 전구체로 하여 이소프레노이드를 합성하는 합성효소;를 발현하는 이소프레노이드 생산용 재조합 균주일 수 있다.
특히, i) 파네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP)를 합성하는 효소인 파네실 피로포스페이트 합성효소 (farnesyl pyrophosphate synthase, ispA) 및 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 (Hydroxymethyl glutaryl CoA reductase 1, HMG1); 및 ii) 파네실 피로포스페이트를 전구체로 하여 이소프레노이드를 합성하는 합성효소;을 발현하고, iii) 상기 파네실 피로포스페이트 합성효소, 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 및 이소프레노이드를 합성하는 합성효소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소에 레트로트랜스포존이 연결되어 발현하는 것을 특징으로 하는 이소프레노이드 생산용 사카로미세스 세레비시아 재조합 균주일 수 있다. 특히, 본 발명은 상기 파네실 피로포스페이트 합성효소, 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 및 이소프레노이드를 합성하는 합성효소 각각에 레트로트랜스포존이 연결되어 발현하는 이소프레노이드 생산용 사카로미세스 세레비시아 재조합 균주일 수 있다.
본 발명에서 상기 이소프레노이드, 이소프레노이드 합성효소, 파네실 피로포스페이트, 이의 합성효소, 히드록시메틸 글루타릴 CoA 및 이의 환원효소 등은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 상기 균주는 이소프레노이드를 생산할 수 있는 균주일 수 있으며, 특히 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
사카로미세스 세레비시아 균주는 효모의 대표적인 종으로서 진핵생물 가운데 가장 많이 밝혀져 있으며, 유전체 서열도 규명되어 있어 유전자를 조작하기가 매우 용이하다. 또한 각종 발효에 많이 사용되고 있으며, 특히 알코올 발효가 뛰어나다고 많이 알려져 있다. 이미 사카로미세스 세레비시아 균주는 에르고스테롤, 스쿠알렌 등의 이소프레노이드 화합물을 원래 많이 생산하는 것으로 알려져 있어 이소프레노이드 생산을 위한 합성 생물학의 숙주세포로서 적합한 장점을 가지고 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 효율적인 이소프레노이드 생산을 위한 숙주 세포로 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)균주를 사용하였다. 구체적으로, 파르네솔을 생산하는 재조합 효모균주인 Y2805 pGal-Ty1LDPP1/HMG1/Ty1LispA, Y2805 pGal-DPP1LTy1/HMG1/ispALTy1, Y2805 Ty1LDPP1/Ty1LHMG1/ispALTy1, Y2805 Ty1LDPP1/HMG1LTy1/ispALTy1 및 Y200589 pGal-Ty1LDPP1/HMG1/Ty1LispA, Y200589 pGal-DPP1LTy1/HMG1/ispALTy1, Y200589 Ty1LDPP1/Ty1LHMG1/ispALTy1, Y200589 Ty1LDPP1/HMG1LTy1/ispALTy1을 구축하였고 대조구로서는 각각의 유전자 DPP1 및 ispA, HMG1을 개별적으로 동시에 발현시키는 Y2805 DPP1/HMG1/ispA와 Y200589 DPP1/HMG1/ispA을 사용하였고 추가적으로 DPP1과 ispA를 링커 (Linker, 서열번호 25)로 연결시켜 융합발현시킨 Y2805 ispALDPP1/HMG1와 Y200589 ispALDPP1/HMG1을 사용하였다. 또한, 파르네신을 생산하는 재조합 효모균주인 Y2805 pGal-Ty1LFS/HMG1/Ty1LispA, Y2805 pGal-FSLTy1/HMG1/ispALTy1, Y2805 FSLTy1/Ty1LHMG1/ispALTy1, Y2805 FSLTy1/HMG1LTy1/ispALTy1 및 Y200589 pGal-Ty1LFS/HMG1/Ty1LispA, Y200589 pGal-FSLTy1/HMG1/ispALTy1, Y200589 FSLTy1/Ty1LHMG1/ispALTy1, Y200589 FSLTy1/HMG1LTy1/ispALTy1 을 구축하였고 대조구로서는 각각의 유전자 FS 및 ispA, HMG1을 개별적으로 동시에 발현시키는 Y2805 FS/HMG1/ispA와 Y200589 FS/HMG1/ispA을 사용하였고 추가적으로 FS와 ispA를 링커 (Linker, 서열번호 25)로 연결시켜 융합발현 시킨 Y2805 ispALFS/HMG1와 Y200589 ispALFS/HMG1을 사용하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 이소프레노이드 생산용 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 이소프레노이드 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 이소프레노이드 생산용 재조합 균주를 당업계에 공지된 다양한 균주의 배양 방법에 의해 배양을 수행할 수 있으며, 배양의 예로서, UD 배지를 사용하여 초기 배양한 후, YPDG(1% 글루코즈, 1% 갈락토즈) 배지를 사용하여 본 배양을 수행할 수 있으나, 상기 방법으로 배양 방법이 제한되는 것은 아니다. 또한 축적된 이소프레노이드는 통상적인 분리 및 추출 방법을 사용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 배양은 초기배양과 본 배양으로 구분하며, 초기배양에는 UD 배지를 사용하였다. UD 배지는 0.67% 무아미노산 효모질소원 (Yeast Nitrogen Base W/O Amino Acids), 0.077% Ura Drop Out supplement base, 2% 글루코스 (Glucose)가 첨가된 배지를 사용하였다. UD 배지 3mL에 단일집락을 접종하고 30℃, 180rpm에서 24시간 초기배양 후 본 배양을 하였다. 본 배양은 YPDG 배지를 250mL 배플 플라스크 (baffled flask)에 25mL씩 분주한 뒤 초기 배양한 균주를 OD가 0.1이 되도록 접종하였다. YPDG 배지는 2% 펩톤 (peptone), 1% 효모추출물 (Yeast extract), 1% 글루코스 (Glucose), 1% 갈락토스 (Galactose)가 첨가된 배지를 사용하였다. 배양 시 생성되는 파르네솔, 파르네신을 효율적으로 포집하기 위하여 도데칸 (dodecane) (시그마알드리치 사, 미국)을 5mL 첨가한 후 30℃, 180rpm으로 교반 하면서 72시간 배양하였다. 상기 도데칸 (dodecane)층에 포집되어 있는 파르네솔, 파르네신을 분석하기 위해 원심분리 방법으로 분리하여 생산성을 측정하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 파르네솔을 생산할 수 있도록 DPP1 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 다양한 재조합 균주 중에서 발현 벡터에 도입된 각 유전자를 전부 Ty1 융합발현 한 경우 개별발현시킨 대조구 pGal-DPP1/HMG1/ispA에 비해 약 4.5배의 생산성을 가지는 것을 확인하였다 (도 5). 또한, 본 발명의 파르네신을 생산할 수 있도록 FS 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 다양한 재조합 균주 중에서 발현 벡터에 도입된 각 유전자를 전부 Ty1 융합발현 한 경우 개별발현시킨 대조구 pGal-FS/HMG1/ispA에 비해 약 12배의 생산성을 가지는 것을 확인하였다 (도 6).
또한, 상기 균주를 5L의 발효조를 이용하여 배양한 경우에도 파르네솔 및/또는 파르네신 생산량이 우수함을 확인하였다(도 7 및 도 8).
본 발명은 이소프레노이드 과생산을 위하여 백신에서 각광받고 있는 바이러스유사입자 (virus-like particle)를 형성하는 효모 유래의 레트로트랜스포존인 Ty1을 이용하여 metabolosome을 구축하였는바, 상기 전략을 이용하여 다양한 이소프레노이드에 대해 우수한 생산성을 가지는 발현 벡터 및 재조합 균주를 제조할 수 있으며, 이를 이용하여 이소프레노이드를 높은 효율로 생산할 수 있어 해당 기술분야에서 널리 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 연속대사체(Metabolosome) 구축을 위한 사카로미세스 세레비시아 유래의 레트로트랜스포존(Tya 혹은 Ty1)을 이용한 기질 채널을 위한 모듈 기작을 개시하고 있는 도면이다. 도 1의 A는 pOGS40 벡터 및 이로부터 형성되는 Tya와 융합된 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1) 에 대한 이미지이고, 도 1의 B는 pOGS40-X 벡터 및 이로부터 형성된 Tya와 융합된 PGK1와 X에 대한 이미지이다.
도 2는 사카로미세스 세레비시아 균주에서의 이소프레노이드 생산을 위한 대사경로를 도식화한 도면이다.
도 3은 파르네솔 생산을 위해 구축한 융합발현 벡터의 모식도이다. 구체적으로 pGal-DPP1/HMG1/ispA, pGal-ispLDPP1/HMG1, pGal-Ty1LDPP1/HMG1/Ty1LispA, pGal-DPP1LTy1/HMG1/ispALTy1, pGal-Ty1LDPP1/Ty1LHMG1/ispALTy1 및 pGal-Ty1LDPP1/HMG1LTy1/ispALTy1의 파르네솔 생산용 융합 발현 벡터에 대한 모식도이다.
도 4는 파르네신 생산을 위해 구축한 융합발현 벡터의 모식도이다. 구체적으로 pGal-FS/HMG1/ispA, pGal-ispLFS/HMG1, pGal-Ty1LFS/HMG1/Ty1LispA, pGal-FSLTy1/HMG1/ispALTy1, pGal-FSLTy1/Ty1LHMG1/ispALTy1 및 pGal-FSLTy1/HMG1LTy1/ispALTy1의 파르네신 생산용 융합 발현 벡터에 대한 모식도이다.
도 5는 파르네솔 생산을 위한 재조합 효모 균주의 생산성 및 세포 성장율(OD600)을 측정한 도면이다.
도 6은 파르네신 생산을 위한 재조합 효모 균주의 생산성 및 세포 성장율(OD600)을 측정한 도면이다.
도 7은 파르네솔 생산을 위한 재조합 효모 균주(200589 pGal-Ty1LDPP/HMG1LTy1/ispALTy1)의 5L 발효조를 이용한 발효를 시간대 별로 측정한 도면이다. 구체적으로 세포 성장율(OD600), Glucose 양, feeding rate 및 파르네솔 생산량(g/L)를 측정한 도면이다.
도 8은 파르네신 생산을 위한 재조합 효모 균주(200589 pGal-FSLTy1/HMG1LTy1/ispALTy1)의 5L 발효조를 이용한 발효를 시간대 별로 측정한 도면이다. 구체적으로 세포 성장율(OD600), Glucose 양, feeding rate 및 파르네신 생산량(g/L)를 측정한 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 사카로미세스 세레비시아 유래 레트로트랜스포존 유전자를 이용하여 연속 대사경로에 관여하는 두 개 이상의 유전자를 포함하는 연속 대사경로 효소 집합체를 구축하고자 하였으며, 이를 통하여 대사경로의 효율성을 증진시켜 목적 대사산물의 생산성을 증가시키고자 하였다. 이에 대표적으로 이소프레노이드를 생산하는 두 연속 대사경로, 즉, 목적 대사산물로 이소프레노이드의 일종인 파르네솔과 파르네신을 생산하는 두 연속 대사경로를 선택하여 적용하여 확인해보았다. 이는 하기 실시예를 통하여 설명된다.
실시예 1 : 파르네솔을 생산하는 융합발현 벡터 및 형질전환체 제조
1-1. 파르네솔을 생산하는 융합발현 벡터
본 발명자들은 이소프레노이드의 한 종류인 파르네솔을 고효율로 생산하는 융합 발현 벡터를 제조하고자 하였다. 이에 Metabolosome 구축을 위한 효모 유래의 레트로트랜스포존 유전자와 파르네솔 합성의 핵심 유전자를 융합하여 발현 벡터에 클로닝 하였다.
구체적으로, 파르네솔 생합성의 핵심적인 단계인 파르네솔 생합성의 직전 전구체 FPP를 만드는 효소 ispA와 FPP로부터 파르네솔을 만드는 효소 DPP1, hydroxymethyl glutaryl CoA로부터 mevalonate를 생합성하는 효소인 hydroxymethyl glutaryl CoA reductase (HMG1)와 metabolosome 구축을 위한 효모 유래의 레트로트랜스포존인 Ty1(서열번호 23)을 암호화하는 핵산 서열인 유전자를 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통하여 수득하였다.
ispA 유전자는 대장균(Escherichia coli) 유전체(chromosome)을 주형으로 수득하였으며, DPP1, HMG1 및 Ty1은 사카로미세스 세레비시아(효모, Saccharomyces cerevisiae) 유전체를 주형으로 수득하였다.
상기 유전자 합성을 위한 중합효소 연쇄반응은 Phusion Hot Start Ⅱ High-Fidelity DNA 중합효소 (써모피셔사이언티픽 사, 미국)를 이용하여 98 ℃에서 30초 동안 반응시키고, 98 ℃에서 10초간, 50 ℃에서 30초간, 72 ℃에서 유전자 크기 1kb당 30초간 반응을 설정하여, 상기 사이클(98 ℃에서 10초간, 50 ℃에서 30초간, 72 ℃에서 유전자 크기 1kb당 30초간 반응)을 25회 수행하고, 마지막으로 72 ℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다.
상기 중합효소 연쇄반응으로 증폭된 유전자들은 염기서열 분석을 통하여 유전자를 확인하였다. Ty1 유전자를 이용한 metabolosome 구축을 위하여 DPP1 및 ispA, HMG1 유전자 각각의 N-말단과 C-말단에 링커 유전자(서열번호 26)를 이용하여 Ty1 유전자를 융합하였다.
이에 사용된 프라이머들은 하기 표 1에 정리하였다.
파르네솔 생산용 융합벡터 제조를 위한 프라이머
유전자 프라이머 염기서열 제한효소
Ty1L
DPP1		 Ty1L-F
(서열번호 1)		 5'-GCGCGAATTCAAAAATGGAATCCCAACAATTATCTCAACATTC-3' EcoRⅠ
Ty1L(DPP1)-R
(서열번호 2)		 5'-GGATCCGCCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTTTGGTTGTATTCGTATAGCTGCGAG-3'
DPP1(Ty1L)-F
(서열번호 3)		 5'-GGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCCATGAACAGAGTTTCGTTTATTAAAACGCC-3'
DPP1-R
(서열번호 4)		 5'-GCGCGTCGACTTACATACCTTCATCGGACAAAGGATG-3' SalⅠ
DPP1
LTy1		 DPP1-F
(서열번호 5)		 5'-GCGCGAATTCAAAAATGAACAGAGTTTCGTTTATTAAAACGCC-3' EcoRⅠ
DPP1(LTy1)-R
(서열번호 6)		 5'-GGATCCGCCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCATACCTTCATCGGACAAAGGATGT-3'
LTy1(DPP1)-F
(서열번호 7)		 5'-GGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCCATGGAATCCCAACAATTATCTCAACATTC-3'
LTy1-R
(서열번호 8)		 5'-GCGCGTCGACTTATTTGGTTGTATTCGTATAGCTGCGA-3' SalⅠ
Ty1L
ispA		 Ty1L-F
(서열번호 1)		 5'-GCGCGAATTCAAAAATGGAATCCCAACAATTATCTCAACATTC-3' EcoRⅠ
Ty1L(ispA)-R
(서열번호 2)		 5'-GGATCCGCCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTTTGGTTGTATTCGTATAGCTGCGAG-3'
ispA(Ty1L)-F
(서열번호 9)		 5'-GGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCCATGGAATCCCAACAATTATCTCAACATT-3'
LispA-R
(서열번호 10)		 5'-GCGCGTCGACTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCC-3' SalⅠ
ispAL
Ty1		 ispA-F
(서열번호 11)		 5'-GCGCGAATTCAAAAATGGACTTTCCGCAGCAACTCGA-3' EcoRⅠ
ispA(LTy1)-R
(서열번호 12)		 5'-GGATCCGCCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTTTATTACGCTGGATGATGTAGTCCG-3'
LTy1(ispA)-F
(서열번호 7)		 5'-GGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCCATGGAATCCCAACAATTATCTCAACATTC-3'
LTy1-R
(서열번호 8)		 5'-GCGCGTCGACTTATTTGGTTGTATTCGTATAGCTGCGA-3'
Ty1L
HMG1		 Ty1L-F
(서열번호 1)		 5'-GCGCGAATTCAAAAATGGAATCCCAACAATTATCTCAACATTC-3' EcoRⅠ
Ty1L(HMG1)-R
(서열번호 2)		 5'-GGATCCGCCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTTTGGTTGTATTCGTATAGCTGCGAG-3'
HMG1(Ty1L)-F
(서열번호 13)		 5'-GGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCCATGGACCAATTGGTGAAAACTGAAGTC-3'
HMG1-R
(서열번호 14)		 5'-GCGCGTCGACTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGAC-3' SalⅠ
HMG1
Ty1		 HMG1-F
(서열번호 15)		 5'-GCGCGAATTCAAAAATGGACCAATTGGTGAAAACTGAAGTC-3' EcoRⅠ
HMG1(LTy1)-R
(서열번호 16)		 5'-GGATCCGCCGCCACCCGAGCCACCGCCACCGGATTTAATGCAGGTGACGGACC-3'
LTy1(HMG1)-F
(서열번호 7)		 5'-GGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCCATGGAATCCCAACAATTATCTCAACATTC-3'
LTy1-R
(서열번호 8)		 5'-GCGCGTCGACTTATTTGGTTGTATTCGTATAGCTGCGA-3' SalⅠ
* 볼드체 : 제한 효소/ * 밑줄 : Linker 유전자
상기의 방법으로 서열번호 1, 2, 3, 4로 기재되는 프라이머를 이용하여 Ty1LDPP1 유전자(Ty1 - 링커(L) - DPP1)를 획득하였으며, 서열번호 5, 6, 7, 8로 기재되는 프라이머를 이용하여 DPP1LTy1 유전자를 획득하였다. 또한, 서열번호 1, 2, 9, 10로 기재되는 프라이머를 이용하여 Ty1LispA 유전자를 획득하였으며, 서열번호 11, 12, 7, 8로 기재되는 프라이머를 이용하여 ispALTy1 유전자를 획득하였다. 아울러, 서열번호 1, 2, 13, 14로 기재되는 프라이머를 이용하여 Ty1LHMG1 유전자를 획득하였으며, 서열번호 15, 16, 7, 8로 기재되는 프라이머를 이용하여 HMG1LTy1 유전자를 획득하였다.
상기의 방법으로 제조한 유전자들을 사카로미세스 세레비시아 발현벡터인 pGal-vector (갈락토오즈 유도성 프로모터인 Gal10을 포함하는 벡터)에 제한효소(다카라 사, 일본) EcoRⅠ 및 SalⅠ으로 절단한 후 도입하여 재조합 벡터들을 제조하였다. 이와 같은 방법으로 제조한 융합발현 벡터들을 In-Fusion 방법을 이용하여 이소프레노이드를 효율적으로 생산하기 위한 구조적 집합체를 형성하였다 (Nick S. 등, Nucleic. Acids. Res. 35(6):e45 (2007)). In-Fusion 클로닝 방법은 In-Fusion HD cloning kit(클론테크사, 미국)을 이용하였다.
구체적으로 상기 방법으로 먼저 구축한 각각의 융합 발현 벡터들을 주형 DNA로 하여, 서열번호 17 및 18로 기재되는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 Gal10 프로모터를 포함하는 각각의 유전자들을 획득하였다. 이를 기존에 구축한 융합 발현 벡터 중 하나인 "pGal-HMG1"을 제한효소(다카라 사, 일본) SmaⅠ으로 절단한 후 In-Fusion 방법을 이용하여 다양한 조합으로 추가적으로 도입하였다(도 3). 상기와 같은 In-Fusion 방법을 통해 제조된 벡터는 각각 pGal-Ty1LDPP1/HMG1/Ty1LispA, pGal-DPP1LTy1/HMG1/ispALTy1, pGal-Ty1LDPP/HMG1LTy1/ispALTy1, pGal-Ty1LDPP1/Ty1LHMG1/ispALTy1로 명명하였다(도 3).
상기 In-Fusion 클로닝에 이용한 프라이머는 하기 표 2에 정리하였다.
In-Fusion 클로닝에 이용한 프라이머
프라이머 염기서열 제한효소
Fusion-SmaI-F
(서열번호 17)		 5'-TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCATCGCTTCGCTGATTAA-3' SmaI
Fusion-SmaI-R
(서열번호 18)		 5'-AAGCGATGGATCCCCACAATGAGCCTTGCTGCAACATCC-3'
* 볼드체 : 제한 효소
1-2. 형질전환체 제조 및 선별
상기 실시예 1-1 방법으로 제조한 융합발현 벡터들을 사카로미세스 세레비시아 Y2805, Y200589 균주에 형질전환하여 UD 배지(0.67% 무아미노산 효모 질소원(Yeast Nitrogen Base W/O Amino Acids), 0.077% Ura Drop Out suppolement base, 2% 글루코스)에서 30℃, 72 시간 배양하여 형질전환주를 선별하였다.
실시예 2 : 파르네신을 생산하는 융합발현 벡터 및 형질전환체의 제조
2-1. 파르네신을 생산하는 융합발현 벡터
본 발명자들은 이소프레노이드의 한 종류인 파르네신을 고효율로 생산하는 융합 발현 벡터를 제조하고자 하였다. 이에 Metabolosome 구축을 위한 효모 유래의 레트로트랜스포존 유전자와 파르네신 합성의 핵심 유전자를 융합하여 발현 벡터에 클로닝 하였다.
구체적으로, 파르네신 생합성 과정에 있는 효소들 중에서 파르네솔 생합성과 동일한 전구체 FPP로부터 pyrophosphate가 탈락되면서 알켄(alkene)으로 전환되는 반응을 촉매하는 효소(farnesene synthase, FS)와 가장 핵심적인 단계인 전구체 FPP를 만드는 효소 ispA와 FPP로부터 파르네솔을 만드는 효소 DPP1, hydroxymethyl glutaryl CoA로부터 mevalonate를 생합성하는 효소인 hydroxymethyl glutaryl CoA reductase (HMG1)와 metabolosome 구축을 위한 효모 유래의 레트로트랜스포존인 Ty1(서열번호 23)의 유전자를 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통하여 수득하였다.
상기 유전자 합성을 위한 중합효소 연쇄반응은 Phusion Hot Start Ⅱ High-Fidelity DNA 중합효소 (써모피셔사이언티픽 사, 미국)를 이용하여 98 ℃에서 30초 동안 반응시키고, 98 ℃에서 10초간, 50 ℃에서 30초간, 72 ℃에서 유전자 크기 1kb당 30초간 반응을 설정하여, 상기 사이클(98 ℃에서 10초간, 50 ℃에서 30초간, 72 ℃에서 유전자 크기 1kb당 30초간 반응)을 25회 수행하고, 마지막으로 72 ℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다.
상기 중합효소 연쇄반응로 증폭된 유전자들은 염기서열 분석을 통하여 유전자를 확인하였다. Ty1 유전자를 이용한 metabolosome 구축을 위하여 FS 및 ispA, HMG1 유전자 각각의 N-말단과 C-말단에 Linker 유전자(서열번호 25)를 이용하여 Ty1 유전자를 융합하였다.
이에 사용된 프라이머들은 하기 표 3에 정리하였다.
파르네신 생산용 융합벡터 제조를 위한 프라이머
유전자 프라이머 염기서열 제한효소
Ty1L
FS		 Ty1L-F
(서열번호 1)		 5'-GCGCGAATTCAAAAATGGAATCCCAACAATTATCTCAACATTC-3' EcoRⅠ
Ty1L(FS)-R
(서열번호 2)		 5'-GGATCCGCCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTTTGGTTGTATTCGTATAGCTGCGAG-3'
FS(Ty1L)-F
(서열번호 19)		 5'-GGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCCATGGAATTTCGTGTCCACCTGCAA-3'
FS-R
(서열번호 20)		 5'-GCGCGTCGACTTAGTTGACCAGCGGCTGAAACAG-3' SalⅠ
FSL
Ty1		 FS-F
(서열번호 21)		 5'-GCGCGAATTCAAAAATGGAATTTCGTGTCCACCTGCAA-3' EcoRⅠ
FS(LTy1)-R
(서열번호 22)		 5'-GGATCCGCCGCCACCCGAGCCACCGCCACCGTTGACCAGCGGCTGAAACAG-3'
LTy1(FS)-F
(서열번호 7)		 5'-GGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCCATGGAATCCCAACAATTATCTCAACATTC-3'
LTy1-R
(서열번호 8)		 5'-GCGCGTCGACTTATTTGGTTGTATTCGTATAGCTGCGA-3' SalⅠ
* 볼드체 : 제한 효소/ 밑줄 : Linker 유전자
상기의 방법으로 서열번호 1, 2, 19, 20으로 기재되는 프라이머를 이용하여 Ty1LFS 유전자(Ty1 - 링커(L) - FS)를 획득하였으며, 서열번호 21, 22, 7, 8로 기재되는 프라이머를 이용하여 FSLTy1 유전자를 획득하였다. 또한, 서열번호 1, 2, 9, 10로 기재되는 프라이머를 이용하여 Ty1LispA 유전자를 획득하였으며, 서열번호 11, 12, 7, 8로 기재되는 프라이머를 이용하여 ispALTy1 유전자를 획득하였다. 아울러, 서열번호 1, 2, 13, 14로 기재되는 프라이머를 이용하여 Ty1LHMG1 유전자를 획득하였으며, 서열번호 15, 16, 7, 8로 기재되는 프라이머를 이용하여 HMG1LTy1 유전자를 획득하였다.
상기의 방법으로 제조한 유전자들을 사카로미세스 세레비시아 발현벡터인 pGal-vector (갈락토오즈 유도성 프로모터인 Gal10을 포함하는 벡터)에 제한효소(다카라 사, 일본) EcoRⅠ 및 SalⅠ으로 절단한 후 도입하여 재조합 벡터들을 제조하였다. 이와 같은 방법으로 제조한 융합발현 벡터들을 In-Fusion 방법을 이용하여 이소프레노이드를 효율적으로 생산하기 위한 구조적 집합체를 형성하였다 (Nick S. 등, Nucleic. Acids. Res. 35(6):e45 (2007)). In-Fusion 클로닝 방법은 In-Fusion HD cloning kit(클론테크사, 미국)을 이용하였다.
구체적으로 상기 방법으로 먼저 구축한 각각의 융합 발현 벡터들을 주형 DNA로 하여, 서열번호 17 및 18로 기재되는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 Gal10 프로모터를 포함하는 각각의 유전자들을 획득하였다. 이를 기존에 구축한 융합 발현 벡터 중 하나인 "pGal-HMG1"을 제한효소(다카라 사, 일본) SmaⅠ으로 절단한 후 In-Fusion 방법을 이용하여 다양한 조합으로 추가적으로 도입하였다(도 3). 상기와 같은 In-Fusion 방법을 통해 제조된 벡터는 각각 pGal-HMG1/Ty1FS/Ty1LispA, pGal-HMG1/FSLTy1/ispALTy1, pGal-FSLTy1/HMG1LTy1/ispALTy1, pGal-FSLTy1/Ty1LHMG1/ispALTy1로 명명하였다(도 4).
2-2. 형질전환체 제조 및 선별
상기 실시예 2-1 방법으로 제조한 융합발현 벡터들을 사카로미세스 세레비시아 Y2805, Y200589 균주에 형질전환하여 UD 배지(0.67% 무아미노산 효모 질소원(Yeast Nitrogen Base W/O Amino Acids), 0.077% Ura Drop Out suppolement base, 2% 글루코스)에서 30℃, 72 시간 배양하여 형질전환주를 선별하였다.
실시예 3 : 파르네솔 , 파르네신을 생산하는 재조합 효모 균주의 배양
상기의 방법으로 파르네솔을 생산하는 재조합 효모 균주인 Y2805 pGal-Ty1LDPP1/HMG1/Ty1LispA, Y2805 pGal-DPP1LTy1/HMG1/ispALTy1, Y2805 Ty1LDPP1/Ty1LHMG1/ispALTy1, Y2805 Ty1LDPP1/HMG1LTy1/ispALTy1 및 Y200589 pGal-Ty1LDPP1/HMG1/Ty1LispA, Y200589 pGal-DPP1LTy1/HMG1/ispALTy1, Y200589 Ty1LDPP1/Ty1LHMG1/ispALTy1, Y200589 Ty1LDPP1/HMG1LTy1/ispALTy1을 구축하였고 대조구로서는 각각의 유전자 DPP1 및 ispA, HMG1을 개별적으로 동시에 발현시키는 Y2805 DPP1/HMG1/ispA와 Y200589 DPP1/HMG1/ispA을 사용하였고 추가적으로 DPP1과 ispA를 링커(서열번호 25)로 연결시켜 융합발현시킨 Y2805 ispALDPP1/HMG1와 Y200589 ispALDPP1/HMG1을 사용하였다.
파르네신을 생산하는 재조합 효모균주인 Y2805 pGal-Ty1LFS/HMG1/Ty1LispA, Y2805 pGal-FSLTy1/HMG1/ispALTy1, Y2805 FSLTy1/Ty1LHMG1/ispALTy1, Y2805 FSLTy1/HMG1LTy1/ispALTy1 및 Y200589 pGal-Ty1LFS/HMG1/Ty1LispA, Y200589 pGal-FSLTy1/HMG1/ispALTy1, Y200589 FSLTy1/Ty1LHMG1/ispALTy1, Y200589 FSLTy1/HMG1LTy1/ispALTy1 을 구축하였고 대조구로서는 각각의 유전자 FS 및 ispA, HMG1을 개별적으로 동시에 발현시키는 Y2805 FS/HMG1/ispA와 Y200589 FS/HMG1/ispA을 사용하였고 추가적으로 FS와 ispA를 링커(서열번호 25)로 연결시켜 융합발현시킨 Y2805 ispALFS/HMG1와 Y200589 ispALFS/HMG1을 사용하였다.
구축한 재조합 효모 균주들의 파르네솔, 파르네신 생산성을 비교하기 위해 YPDG (1% 글루코스, 1% 갈락토스) 배지에서 배양하였다.
배양은 초기배양과 본 배양으로 구분하여 진행하였다. 초기배양에는 UD 배지를 사용하고 본 배양에는 YPDG 배지를 이용하였다.
UD 배지는 0.67% 무아미노산 효모 질소원 (Yeast Nitrogen Base W/O Amino Acids), 0.077% Ura Drop Out supplement base, 2% 글루코스 (Glucose)가 첨가된 배지이고, YPDG 배지는 2% 펩톤 (peptone), 1% 효모추출물 (Yeast extract), 1% 글루코스 (Glucose), 1% 갈락토스 (Galactose)가 첨가된 배지이다.
초기 배양으로 UD 배지 3mL에 단일집락을 접종하고 30℃, 180 rpm에서 24시간 배양한 후 본 배양을 하였다. 본 배양은 YPDG 배지를 250mL 배플 플라스크 (baffled flask)에 25mL씩 분주한 뒤 초기 배양한 균주를 OD가 0.1이 되도록 접종하여 진행하였다. 배양 시 생성되는 파르네솔, 파르네신을 효율적으로 포집하기 위하여 도데칸 (dodecane) (시그마알드리치 사, 미국)을 5mL 첨가한 후 30℃, 180 rpm으로 교반 하면서 72시간 배양하였다.
실시예 4 : 기체 크로마토그래피( Gas Chromatography )를 이용한 파르네솔 , 파르네신 생산성 측정
상기 실시예 3에서 진행된 본 배양을 통해 도데칸(dodecane) 층에 포집되어 있는 파르네솔, 파르네신을 분석하고자 하였다. 이를 위해 상기 본 배양액으로부터 도데칸 층 200 ㎕를 취하여 이 중 2 ㎕를 기체 크로마토그래피(GC) 분석에 이용하였다.
구체적으로 파르네솔, 파르네신은 다음의 방법으로 분석하였다. 250 ㎖ 배플 플라스크에서 배양한 배양액을 50 ㎖ 팔콘튜브(falcon tube)에 옮긴 후, 잠시동안 방치하면 도데칸 층과 배양액 층이 분리되었다. 분리된 도데칸 층 1 mL을 취하여 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 후, 상층액 200 ㎕를 취하여 이 중 2 ㎕를 기체 크로마토그래피 정량 분석을 실시하였다.
기체 크로마토그래피는 Agilent 사의 Gas chromatography 7890A를 사용하였다. GC 컬럼(column)은 19091J-413HP-5 (5%-Phenyl Methyl Siloxane, 30mX0.32mmX0.25μm film thickness)를 사용하였으며 검출기 (detector)는 수소와 산소를 이용한 불꽃 이온화 검출기 (Flame ionization detector, FID)를 사용하였고 운반기체 (carrier gas)로는 고순도 헬륨을 사용하였다. 분석조건은 클로로폼 (Chloroform) (준세이 사, 일본)으로 샘플을 3회 워싱(washing) 실시한 후, split ratio 10:1, split flow 10 mL/ min, 압력은 5.1068 psi, Heater temp는 300 ℃ oven temp는 40 ℃에서 3 min hold, 10 ℃/ min으로 240℃ 5 min hold, 10 ℃/ min으로 300℃ 1 min hold 하였고, FID temp는 320 ℃ H2 flow 40 mL/ min, Air flow 400 mL/ min, makeup flow 30 mL/ min temp 250℃, 10 ℃/ min 300℃ 1 min 으로 맞추어 실험을 수행하였다. 총 분석시간은 35분이었다. 분석한 도데칸 층의 파르네솔, 파르네신 농도는 배양액 리터 당 생산된 파르네솔, 파르네신 농도로 환산하여 서로 비교하였다.
상기 실험 결과, 도데칸 층에 포집된 파르네솔은 20.1분대에 피크가 나타났다. 파르네솔 생산성을 비교해보면 유전자들을 각기 개별 발현시킨 pGal-DPP1/HMG1/ispA는 Y200589균주에서 0.04g/L의 파르네솔 생산성을 보였다. 한편 연속반응에서 기질 채널링 (substrate channeling)효과를 얻을 수 있도록 ispA와 DPP1 유전자를 Liker를 이용하여 융합발현시킨 pGal-ispALDPP1/HMG1의 경우에는 Y200589 균주에서 4배정도 생산성이 증가하여 0.17g/L를 보였다. metabolosome 구축을 위한 효모 유래의 레트로트랜스포존인 Ty1을 N-말단에 융합시킨 pGal-Ty1LDPP1/HMG1/Ty1LispA의 경우에 Y200589균주에서 대조구 pGal-DPP1/HMG1/ispA에 비해 약 3배정도 생산성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 C-말단에 Ty1을 융합발현시킨 pGal-DPP1LTy1/HMG1/ispALTy1의 경우에는 Y200589 균주에서 전혀 파르네솔을 생산하지 못하는 것을 확인하였다. 따라서 DPP1 유전자에서는 Ty1이 C-말단에 연결되었을 때 활성을 잃는 것으로 추정된다. 또한 HMG1 유전자의 Ty1 융합발현의 경우 N-말단에 Ty1을 융합 발현시킨 pGal-Ty1LDPP1/Ty1LHMG1/ispALTy1의 경우에는 Ty1을 추가로 융합하지 않은 경우 pGal-Ty1LDPP1/HMG1/Ty1LispA에 비해 좀더 생산성이 증가하여 추가로 약 1.5배의 생산성 증가를 보였다 (0.18g/L). 또한 HMG1 유전자의 C-말단에 Ty1을 융합발현시킨 pGal-Ty1LDPP1/HMG1LTy1/ispALTy1의 경우에는 좀더 증가한 0.182g/L의 파르네솔 생산량을 확인하였고 최종적으로 각 유전자를 전부 Ty1 융합발현 한 경우 개별발현 시킨 대조구 pGal-DPP1/HMG1/ispA에 비해 Y200589 균주에서 약 4.5배의 생산성 증가를 확인하였다(도 5).
아울러, 상기 실험 결과, 도데칸 층에 포집된 파르네신은 17.8분대에 피크가 나타났다. 파르네신 생산성을 비교해보면 유전자들을 각기 개별 발현시킨 pGal-FS/HMG1/ispA는 Y200589균주에서 0.021g/L의 파르네신 생산성을 보였다. 한편 연속반응에서 기질 채널링 (substrate channeling)효과를 얻을 수 있도록 ispA와 FS 유전자를 Linker를 이용하여 융합발현시킨 pGal-ispALFS/HMG1의 경우에는 4배정도 생산성이 증가하여 0.08g/L로 나타났다. metabolosome 구축을 위한 효모 유래의 레트로트랜스포존인 Ty1을 N-말단에 융합시킨 pGal-Ty1LFS/HMG1/Ty1LispA의 경우에는 Y2805, Y200589균주에서 전혀 파르네신을 생산하지 못하는 것을 확인하였다. 그러나 C-말단에 Ty1을 융합발현시킨 pGal-FSLTy1/HMG1/ispALTy1의 경우에는 Y200589 균주에서 pGal-FS/HMG1/ispA에 비해 약 9배 정도 생산성이 증가하여 0.18g/L 생산성을 보임을 확인할 수 있었다. 따라서 FS 유전자에서는 Ty1이 N-말단에 연결되었을 때 활성을 잃는 것으로 추정된다. 또한 HMG1 유전자의 Ty1 융합발현의 경우 N-말단에 Ty1을 융합 발현시킨 pGal-FSLTy1/Ty1LHMG1/ispALTy1의 경우에는 Ty1을 융합하지 않은 경우 pGal-FSLTy1/HMG1/ispALTy1에 비해 약간 생산성이 증가하였지만 HMG1 유전자의 C-말단에 Ty1을 융합발현시킨 pGal-FSLTy1/HMG1LTy1/ispALTy1의 경우에는 더욱 증가한 0.24g/L의 파르네신 생산량을 확인하였고 최종적으로 각 유전자를 Ty1 융합발현 한 경우 개별발현 시킨 대조구 pGal-FS/HMG1/ispA에 비해 Y200589 균주에서 약 12배의 생산성 증가를 확인하였다(도 6).
실시예 5 : 생산 균주의 발효조 배양을 통한 발효
상기 실시예 4에서 가장 생산성이 좋았던 파르네솔 과생산 균주 Y200589 pGal-Ty1LDPP1/HMG1LTy1/ispALTy1와 파르네신 과생산 균주 Y200589 pGal-FSLTy1/HMG1Ty1/ispALTy1의 정확한 생산성을 알아보기 위하여 5L 규모의 발효조를 운용하여 생산성을 조사하였다.
구체적으로, 먼저 UD배지 25mL에 단일집락을 접종하고 20시간 배양 후 YPD 배지(2% 펩톤 (peptone), 1% 효모추출물 (Yeast extract), 1% 글루코스 (Glucose)) 175mL에 첨가하여 16시간 30℃, 180rpm으로 배양하였다. 초기 배양이 끝난 후 1.8L의 YPD 배지에 접종하고 최종 2L 가 되도록 배지 부피를 맞추어 발효를 시작하였다. 그리고 생산된 파르네솔과 파르네신을 효율적으로 포집하기 위하여 도데칸 400mL을 배양액에 첨가하였다. 글루코스가 모두 소모가 되면 피딩 (feeding)을 시작하는데 피딩 배지는 글루코스 (Glucose) 600g/L, 효모추출물 (Yeast extract) 40g/L, 류신 (leucine) 0.7919g/L, 페닐알라닌 (phenylalanine) 0.726g/L, 티로신 (tyrosine) 0.594g/L, 트립토판 (tryptophane) 0.276g/L을 첨가한 배지를 사용하였다. pH는 6.0으로 맞추었고 이는 10N Na0H를 이용하여 조절하였다. 30℃, 3vvm, 800rpm 으로 맞추어 교반하면서 배양하였다. 갈락토스 유도 (induction)를 위하여 갈락토스는 급작스런 유도에 의한 부하가 걸리지 않도록 각각 5g/L를 72시간까지 4번 첨가한 후 96, 120, 144시간에 각각 10g/L씩 추가로 첨가하였다.
상기 실시예 4에서 가장 높은 생산성을 보였던 파르네솔 생산균주 Y200589 pGal-Ty1LDPP1/HMG1LTy1/ispALTy1의 5L 발효조 배양 결과 OD는 96시간 이후부터 95정도로 더 이상 생육하지 못하고 정체 되는 것을 확인할 수 있었으며, 글루코스는 30시간 이후에 모두 소모하였고 피딩은 18시간부터 시작하여 차즘 증가시켰다. 파르네솔 생산량 분석은 48시간부터 6시간마다 샘플을 10mL씩 취하여 분석하였다.
파르네솔 생산량 분석 결과 48시간에 0.056 g/L, 72시간에 0.334 g/L, 96시간에 0.512 g/L로 지속적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 발효 후반부까지 지속적으로 증가하여 164시간에 최종적으로 가장 높은 약 0.9 g/L의 파르네솔이 생산된 것을 확인하였다 (도 7).
또한, 상기 실시예 4에서 가장 높은 생산성을 보였던 파르네신 생산균주 Y200589 pGal-FSLTy1/HMG1LTy1/ispALTy1의 5L 발효조 배양 결과 OD는 파르네솔 생산균주와는 다르게 지속적으로 증가하여 164시간에 120정도 인 것을 확인할 수 있었으며, 글루코스는 24시간 이후에 모두 소모하였고 피딩은 18시간부터 시작하여 차즘 증가시켰다. 파르네신 생산량 분석은 48시간부터 6시간마다 샘플을 10mL씩 취하여 분석하였다.
파르네신 생산량 분석 결과 파르네솔 발효의 경우와 유사하게 발효 후반부까지 지속적으로 파르네신이 생산됨을 알 수 있었다 (도 8). 그런데 플라스크 배양과는 달리 파르네신만 생산할 뿐만 아니라 파르네솔도 거의 대등한 수준으로 생산함을 알 수 있었다. 48시간에 파르네신 0.102 g/L, 파르네솔 0.094 g/L, 72시간에 파르네신 0.434 g/L, 파르네솔 0.276 g/L, 96시간에 파르네신 0.584 g/L, 파르네솔 0.394 g/L로 지속적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
최종적으로 발효 164 시간에 파르네신 0.93g/L와 파르네솔 0.89g/L 도합 1.82 g/L의 이소프레노이드 생산성을 얻을 수 있었다.
실시예 6 : 결과 분석
상기 실시예에서 확인할 수 있듯이, 본 발명자들은 이소프레노이드 과생산을 위하여 백신에서 각광받고 있는 바이러스유사입자 (virus-like particle)를 형성하는 효모 유래의 레트로트랜스포존인 Ty1을 이용하여 metabolosome을 구축하였다. Ty1은 N-말단이나 C-말단에 외래단백질을 융합하여도 바이러스유사입자 형성에 문제가 없는 것으로 알려져 있지만 상기 실시예 4에서 확인 하였듯이 FPP로부터 파르네솔을 만드는 효소 DPP1의 경우 Ty1을 N-말단에 융합하였을 경우에는 파르네솔 생산성이 증가하였지만 C-말단에 융합할 경우는 파르네솔이 생산되지 않는 것을 확인하였다. 또한 파르네솔 생합성과 동일한 전구체 FPP로부터 pyrophosphate가 탈락되면서 alkene으로 전환되는 반응을 촉매 하는 효소 FS의 경우는 C-말단에 융합하였을 경우에는 파르네신 생산성이 증가하였지만 N-말단에 융합하였을 경우에는 파르네신이 생산되지 않는 것을 확인하였다. 그러나 파르네솔 생합성의 직전 전구체 FPP를 만드는 효소 ispA, hydroxymethyl glutaryl CoA로부터 mevalonate를 생합성하는 효소인 HMG1은 N-말단이나 C-말단 양쪽 방향 모두에 Ty1을 융합하여도 이소프레노이드를 생산하는 것으로 보아 이 효소들은 방향성에 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다.
상기에서 언급한 것처럼 metabolosome을 구축할 시 방향성에 영향을 받지 않는 효소들도 있지만 방향성에 의해 이소프레노이드를 전혀 생산하지 못하는 효소들도 존재하기 때문에 metabolosome 구축을 위해서는 방향성도 중요히 생각해야 하는 요인 중 하나이다.
생산성이 가장 우수한 파르네솔, 파르네신 생산 재조합 균주 2종을 좀 더 정확한 생산성을 확인하기 위해 실시한 5L 발효조 배양 결과에서 발효 양상을 살펴보면 세포 성장이 멈춘 후에도 파르네솔과 파르네신이 지속적으로 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 연속배양 공정 등을 통하여 발효 생산성을 높일 수 있는 가능성이 있을 것으로 기대된다. 또한 추후 이소프레노이드 대사경로의 다른 효소들에 추가적으로 Ty1를 융합시켜 도입할 경우에도 생산성이 계속 증가할 수 있을 것으로 기대되어 진다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Improved production of isoprenoids by metabolosome construction <130> KPA140786-KR <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ty1L-F primer <400> 1 gcgcgaattc aaaaatggaa tcccaacaat tatctcaaca ttc 43 <210> 2 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ty1L(DPP1)-R primer <400> 2 ggatccgccg ccacccgagc caccgccacc tttggttgta ttcgtatagc tgcgag 56 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DPP1(Ty1L)-F primer <400> 3 ggtggcggtg gctcgggtgg cggcggatcc atgaacagag tttcgtttat taaaacgcc 59 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DPP1-R primer <400> 4 gcgcgtcgac ttacatacct tcatcggaca aaggatg 37 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DPP1-F primer <400> 5 gcgcgaattc aaaaatgaac agagtttcgt ttattaaaac gcc 43 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DPP1(LTy1)-R primer <400> 6 ggatccgccg ccacccgagc caccgccacc cataccttca tcggacaaag gatgt 55 <210> 7 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LTy1(DPP1)-F primer <400> 7 ggtggcggtg gctcgggtgg cggcggatcc atggaatccc aacaattatc tcaacattc 59 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LTy1-R primer <400> 8 gcgcgtcgac ttatttggtt gtattcgtat agctgcga 38 <210> 9 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA(Ty1L)-F primer <400> 9 ggtggcggtg gctcgggtgg cggcggatcc atggaatccc aacaattatc tcaacatt 58 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LispA-R primer <400> 10 gcgcgtcgac ttatttatta cgctggatga tgtagtcc 38 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA-F primer <400> 11 gcgcgaattc aaaaatggac tttccgcagc aactcga 37 <210> 12 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ispA(LTy1)-R primer <400> 12 ggatccgccg ccacccgagc caccgccacc tttattacgc tggatgatgt agtccg 56 <210> 13 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMG1(Ty1L)-F primer <400> 13 ggtggcggtg gctcgggtgg cggcggatcc atggaccaat tggtgaaaac tgaagtc 57 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMG1-R primer <400> 14 gcgcgtcgac ttaggattta atgcaggtga cggac 35 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMG1-F primer <400> 15 gcgcgaattc aaaaatggac caattggtga aaactgaagt c 41 <210> 16 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMG1(LTy1)-R primer <400> 16 ggatccgccg ccacccgagc caccgccacc ggatttaatg caggtgacgg acc 53 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion-SmaI-F primer <400> 17 tcgagctcgg tacccgggga tccatcgctt cgctgattaa 40 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion-SmaI-R primer <400> 18 aagcgatgga tccccacaat gagccttgct gcaacatcc 39 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FS(Ty1L)-F primer <400> 19 ggtggcggtg gctcgggtgg cggcggatcc atggaatttc gtgtccacct gcaa 54 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FS-R primer <400> 20 gcgcgtcgac ttagttgacc agcggctgaa acag 34 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FS-F primer <400> 21 gcgcgaattc aaaaatggaa tttcgtgtcc acctgcaa 38 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FS(LTy1)-R primer <400> 22 ggatccgccg ccacccgagc caccgccacc gttgaccagc ggctgaaaca g 51 <210> 23 <211> 379 <212> PRT <213> Ty1 aa seq <400> 23 Met Glu Ser Gln Gln Leu Ser Gln His Ser Pro Ile Ser His Gly Ser 1 5 10 15 Ala Cys Ala Ser Val Thr Ser Lys Glu Val His Thr Asn Gln Asp Pro 20 25 30 Leu Asp Val Ser Ala Ser Lys Thr Glu Glu Cys Glu Lys Ala Ser Thr 35 40 45 Lys Ala Asn Ser Gln Gln Thr Thr Thr Pro Ala Ser Ser Ala Val Pro 50 55 60 Glu Asn Pro His His Ala Ser Pro Gln Thr Ala Gln Ser His Ser Pro 65 70 75 80 Gln Asn Gly Pro Tyr Pro Gln Gln Cys Met Met Thr Gln Asn Gln Ala 85 90 95 Asn Pro Ser Gly Trp Ser Phe Tyr Gly His Pro Ser Met Ile Pro Tyr 100 105 110 Thr Pro Tyr Gln Met Ser Pro Met Tyr Phe Pro Pro Gly Pro Gln Ser 115 120 125 Gln Phe Pro Gln Tyr Pro Ser Ser Val Gly Thr Pro Leu Arg Thr Pro 130 135 140 Ser Pro Glu Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Ser Ser Ser Ala Asp Ser 145 150 155 160 Asp Met Thr Ser Thr Lys Lys Tyr Val Arg Pro Pro Pro Met Leu Thr 165 170 175 Ser Pro Asn Asp Phe Pro Asn Trp Val Lys Thr Tyr Ile Lys Phe Leu 180 185 190 Gln Asn Ser Asn Leu Gly Gly Ile Ile Pro Thr Val Asn Gly Lys Pro 195 200 205 Val Arg Gln Ile Thr Asp Asp Glu Leu Thr Phe Leu Tyr Asn Thr Phe 210 215 220 Gln Ile Phe Ala Pro Ser Gln Phe Leu Pro Thr Trp Val Lys Asp Ile 225 230 235 240 Leu Ser Val Asp Tyr Thr Asp Ile Met Lys Ile Leu Ser Lys Ser Ile 245 250 255 Glu Lys Met Gln Ser Asp Thr Gln Glu Ala Asn Asp Ile Val Thr Leu 260 265 270 Ala Asn Leu Gln Tyr Asn Gly Ser Thr Pro Ala Asp Ala Phe Glu Thr 275 280 285 Lys Val Thr Asn Ile Ile Asp Arg Leu Asn Asn Asn Gly Ile His Ile 290 295 300 Asn Asn Lys Val Ala Cys Gln Leu Ile Met Arg Gly Leu Ser Gly Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Phe Leu Arg Tyr Thr Arg His Arg His Leu Asn Met Thr Val 325 330 335 Ala Glu Leu Phe Leu Asp Ile His Ala Ile Tyr Glu Glu Gln Gln Gly 340 345 350 Ser Arg Asn Ser Lys Pro Asn Tyr Arg Arg Asn Pro Ser Asp Glu Lys 355 360 365 Asn Asp Ser Arg Ser Tyr Thr Asn Thr Thr Lys 370 375 <210> 24 <211> 1140 <212> DNA <213> Ty1 seq <400> 24 atggaatccc aacaattatc tcaacattca cccatttctc atggtagcgc ctgtgcttcg 60 gttacttcta aggaagtcca cacaaatcaa gatccgttag acgtttcagc ttccaaaaca 120 gaagaatgtg agaaggcttc cactaaggct aactctcaac agacaacaac acctgcttca 180 tcagctgttc cagagaaccc ccatcatgcc tctcctcaaa ctgctcagtc acattcacca 240 cagaatgggc cgtacccaca gcagtgcatg atgacccaaa accaagccaa tccatctggt 300 tggtcatttt acggacaccc atctatgatt ccgtatacac cttatcaaat gtcgcctatg 360 tactttccac ctgggccaca atcacagttt ccgcagtatc catcatcagt tggaacgcct 420 ctgaggactc catcacctga gtcaggtaat acatttactg attcatcctc agcggactct 480 gatatgacat ccactaaaaa atatgtcaga ccaccaccaa tgttaacctc acctaatgac 540 tttccaaatt gggttaaaac atacatcaaa tttttacaaa actcgaatct cggtggtatt 600 attccgacag taaacggaaa acccgtacgt cagatcactg atgatgaact caccttcttg 660 tataacactt ttcaaatatt tgctccctct caattcctac ctacctgggt caaagacatc 720 ctatccgttg attatacgga tatcatgaaa attctttcca aaagtattga aaaaatgcaa 780 tctgataccc aagaggcaaa cgacattgtg accctggcaa atttgcaata taatggcagt 840 acacctgcag atgcatttga aacaaaagtc acaaacatta tcgacagact gaacaataat 900 ggcattcata tcaataacaa ggtcgcatgc caattaatta tgagaggtct atctggcgaa 960 tataaatttt tacgctacac acgtcatcga catctaaata tgacagtcgc tgaactgttc 1020 ttagatatcc atgctattta tgaagaacaa cagggatcga gaaacagtaa acctaattac 1080 aggagaaatc cgagtgatga gaagaatgat tctcgcagct atacgaatac aaccaaataa 1140 1140 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker aa seq <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker seq <400> 26 ggtggcggtg gctcgggtgg cggcggatcc 30

Claims (16)

  1. 사카로미세스 세레비시아 유래 레트로트랜스포존 유전자; 및 목적 대사산물을 생산하는 연속 대사경로의 유전자;를 포함하는 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터로서,
    상기 목적 대사산물은 이소프레노이드이고;
    파네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP)를 합성하는 효소인 파네실 피로포스페이트 합성효소 (farnesyl pyrophosphate synthase) 유전자 및 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 (Hydroxymethyl glutaryl CoA reductase) 유전자,
    파네실 피로포스페이트를 전구체로 하여 이소프레노이드를 합성하는 합성효소 유전자, 및
    레트로트랜스포존 유전자를 포함하고;
    상기 레트로트랜스포존 유전자는 사카로미세스 세레비시아 유래의 Ty1 유전자인 것인, 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 이소프레노이드는 스쿠알렌, 파르네솔, 파르네신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 이소프레노이드를 합성하는 합성효소 유전자는 스쿠알렌 합성효소(Erg9) 유전자, 파르네솔 합성효소(DPP1) 유전자, 파르네신 합성효소(FS) 유전자으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 Ty1 유전자는 서열번호 24의 핵산 서열로 이루어진 것인, 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 파네실 피로포스페이트 합성효소 유전자, 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 유전자 및 이소프레노이드를 합성하는 합성효소 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 레트로트랜스포존 유전자가 연결된 것인, 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 파네실 피로포스페이트 합성효소 유전자, 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 유전자 및 이소프레노이드를 합성하는 합성효소 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 레트로트랜스포존 유전자가 연결은 링커 유전자를 통해 연결된 것인, 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 링커 유전자는 서열번호 26의 핵산 서열로 이루어진 것인, 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터.
  11. 제1항에 따른 이소프레노이드 생산하는 것을 특징으로 하는 연속 대사경로 효소 집합체 구축용 발현 벡터로 형질전환한 이소프레노이드 생산용 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 재조합 균주.
  12. i) 파네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate, FPP)를 합성하는 효소인 파네실 피로포스페이트 합성효소 (farnesyl pyrophosphate synthase) 및 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 (Hydroxymethyl glutaryl CoA reductase); 및
    ii) 파네실 피로포스페이트를 전구체로 하여 이소프레노이드를 합성하는 합성효소;을 발현하고,
    iii) 상기 파네실 피로포스페이트 합성효소, 히드록시메틸 글루타릴 CoA 환원효소 및 이소프레노이드를 합성하는 합성효소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소에 레트로트랜스포존이 연결되어 발현하는 것을 특징으로 하는 이소프레노이드 생산용 사카로미세스 세레비시아 재조합 균주로서,
    상기 레트로트랜스포존은 사카로미세스 세레비시아 유래의 Ty1 유전자인 것인, 이소프레노이드 생산용 사카로미세스 세레비시아 재조합 균주.
  13. 제12항에 있어서, 상기 이소프레노이드는 스쿠알렌, 파르네솔, 파르네신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 이소프레노이드 생산용 사카로미세스 세레비시아 재조합 균주.
  14. 제12항에 있어서, 상기 이소프레노이드를 합성하는 합성효소는 스쿠알렌 합성효소(Erg9), 파르네솔 합성효소(DPP1), 파르네신 합성효소(FS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 이소프레노이드 생산용 사카로미세스 세레비시아 재조합 균주.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 이소프레노이드 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 이소프레노이드는 스쿠알렌, 파르네솔, 파르네신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 이소프레노이드 생산 방법.
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