CN116064264A - 一种产生对萜类或含萜精油的耐受性提高的重组宿主细胞的方法及其用途 - Google Patents
一种产生对萜类或含萜精油的耐受性提高的重组宿主细胞的方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及对萜类或含萜精油耐受性提高或萜类产量提高的重组宿主细胞、其产生方法及其用途。更具体地，所述重组宿主细胞通过增加野生型宿主细胞中PDR5蛋白的表达量或活性而产生，其可用于萜类生产。
Description
本申请是2016年11月23日提交的题为“对萜类或含萜精油耐受性提高或萜类产量提高的重组宿主细胞、其产生方法及其用途”的中国专利申请201611037629.9的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及对萜类或含萜精油耐受性提高或萜类产量提高的重组宿主细胞、其产生方法及其用途。
背景技术
天然活性产物一般为生物体生物合成的微量次生代谢物，在生物体内主要发挥信号传导、化感、阻止病菌和昆虫入侵等作用。同时由于其重要的生物学活性，已被广泛地应用于医疗保健和营养等领域。从原植物中直接提取是目前生产这类天然产物的主要方式，但这种方法有较多的缺点，包括含量低和差异大，产品纯化难，植物生长周期长，对生物资源尤其野生资源造成严重破坏等。
目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在酵母工程菌中生产青蒿素的前体青蒿酸最高达到25g/L(Paddon CJ et al.,2013,Nature,2013,496:528-532)。然而许多天然产物对微生物宿主有毒性，将严重影响其在细胞工厂中的生产效率。因此，挖掘能提高微生物宿主对该天然产物具有耐受性的功能蛋白是高效细胞工厂创建成功的关键。
水解ATP供能的ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)和依赖于H+/Na+浓度梯度的逆向转运的MATE解毒蛋白(Multidrug and toxic compound extrusiontransporter)等转运蛋白是执行该功能的主要蛋白。例如，在植物药黄连素的转运研究中，科学家发现了MATE类外排蛋白AtDTX1能向细胞外转运黄连素，并在酿酒酵母中过表达AtDTX1蛋白能显著提高细胞对抗黄连素的毒性(Li L et al.,J Biol Chem 2002,277(7):5360-5368.)。
青蒿素、紫杉醇、β-榄香烯、莪术油、吉马烯A等萜类化合物在肿瘤和感染等方面有广泛临床应用。然而，许多重要的萜类化合物对微生物宿主均有毒性。针对数量众多的萜类化合物，尤其是一些重要的萜类化合物，有必要挖掘能提高宿主细胞对其具有耐受性的特定功能蛋白，从而为这类化合物的高效生物合成奠定基础。
发明概述
本发明提供了对萜类或含萜精油耐受性提高或萜类产量提高的宿主细胞及其用途，具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种重组宿主细胞，其包含与对应野生型宿主细胞相比表达量或活性增加的PDR5蛋白。
第二方面，本发明提供了一种产生对萜类或含萜精油的耐受性提高或萜类产量提高的重组宿主细胞的方法，其包括增加野生型宿主细胞中PDR5蛋白的表达量或活性的步骤。
在本发明的具体实施方案中，PDR5蛋白的表达量增加通过增加PDR5基因的拷贝数和/或使用强启动子实现。
在与增加PDR5基因的拷贝数有关的一个具体实施方案中，PDR5基因是酿酒酵母PDR5基因。
在与增加PDR5基因的拷贝数有关的进一步的具体实施方案中，酿酒酵母PDR5基因由SEQ ID NO：1的核酸序列组成。
第三方面，本发明提供了分离的编码PDR5蛋白的多核苷酸用于提高宿主细胞对萜类或含萜精油的耐受性或提高宿主细胞萜类产量的用途。
在一个具体实施方案中，编码PDR5蛋白的多核苷酸是酿酒酵母PDR5基因。
在进一步的实施方案中，酿酒酵母PDR5基因由SEQ ID NO：1的核酸序列组成。
第四方面，本发明提供了PDR5蛋白用于提高宿主细胞对萜类或含萜精油的耐受性或提高宿主细胞萜类产量的用途。
在一个具体实施方案中，PDR5蛋白是酿酒酵母PDR5蛋白。
在一个具体实施方案中，酿酒酵母PDR5蛋白由SEQ ID NO：139的氨基酸序列组成。
在本发明的上述各方面中，宿主细胞进一步包含用于萜类生产的外源多核苷酸。
在本发明的上述各方面中，宿主细胞是真核生物，优选酵母纲(Saccharomycetes)。
在本发明的上述各方面中，宿主细胞选自伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、念珠菌属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希菌属(Escherichia)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyce)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、红发夫酵母属(Phaffia)、平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、红发夫酵母属(Xanthophyllomyces)和耶氏酵母属(Yarrowiagenera)。
在本发明的上述各方面中，宿主细胞选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、博伊丁念珠菌(Candida boidinii)、Arxula adeninivorans、红发夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)或白色念珠菌(Candida albicans)物种，优选酿酒酵母。
在本发明的上述各方面中，萜类选自半萜、单萜、倍半萜和二萜，优选选自单萜和倍半萜，尤其优选倍半萜。
在本发明的上述各方面中，萜类选自香叶酯、香叶醇、金合欢醇、橙花叔醇、诺卡酮、吉玛烯A、榄香烯、檀香醇、香紫苏醇，优选选自金合欢醇、橙花叔醇、吉玛烯A、榄香烯和檀香醇，含萜精油选自莪术油、姜黄油、甜橙油、薄荷油、紫苏油和檀香油，优选选自莪术油、姜黄油和檀香油。
第五方面，本发明提供了一种生产萜类的方法，包括在培养基中于导致产生萜类的条件下培养本发明的重组宿主细胞或由本发明的方法产生的重组宿主细胞，并从培养基中回收所述萜类。
附图说明
图1.酵母细胞ABC和MATE类转运蛋白突变株系构建流程图
图2.吉马烯A(Gemacrene A，以下简称GMA)对突变菌株生长的影响。当在培养基中添加GMA时，ABC转运蛋白ScPDR5(酿酒酵母PDR5)缺失的菌株NK2-ScPDR5的生长与对照菌株相比，生长明显受到抑制。
图3.调控ScPDR5基因表达对GMA耐受性的变化。在菌株NK2中过表达ScPDR5基因能显著提高菌株对GMA的耐受性，而菌株NK2、NK2-GFP，NK2-ScPDR5的生长明显受抑制，其中ScPDR5功能的缺失导致菌株对萜类的耐受性显著降低。
发明详述
本发明并不限于本文所述的具体方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而不是为了限制本发明的范围。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。
如本文所用，术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型适于进行本发明的重组操作，例如对于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的。术语宿主细胞涵盖亲本细胞的任何后代，其由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。
适于本发明的宿主细胞包括原核生物和真核生物。示例性的宿主细胞是真核生物，优选酵母纲，例如选自伞菌属、曲霉属、芽孢杆菌属、念珠菌属、棒状杆菌属、埃希菌属、镰孢属、赤霉属、克鲁维酵母属、硫磺菌属、香菇属、红发夫酵母属、平革菌属、毕赤酵母属、藓属、红酵母属、酵母属、裂殖酵母属、痂圆孢属、红发夫酵母属和耶氏酵母属。优选选自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑念珠菌、棉阿舒囊霉、产朊假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁念珠菌、Arxula adeninivorans、红发夫酵母或白色念珠菌物种。特别优选酿酒酵母。
在本发明的一个具体实施方案中，所使用的宿主细胞为酿酒酵母CEN.PK2-1D(以下简称NK2，购自欧洲酿酒酵母保藏中心(EUROSCARF))。
如本文所用，术语“重组”是指通过人介入来改变遗传物质。通常，重组是指通过分子生物学方法来操作细胞或病毒或表达载体中的DNA或RNA。
如本文所用，术语“表达”是指内源或外源目标蛋白在细胞中产生的过程，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
本发明通过同源重组进行基因表达的方法属于本领域的常规方法(Shao Z etal.,Nucleic Acids Research 2009,37(2):e16；Dai Z et al.,Metabolic Engineering2013,20:146–156)。
如本文所用，术语“表达量增加”是指与野生型相比，目标蛋白在细胞中以较高水平产生，即过表达。
目标蛋白的表达量增加可通过增加编码目标蛋白的多核苷酸的拷贝数的方式实现，例如将一或多个额外拷贝的外源多核苷酸导入宿主细胞。如本文所用，术语“外源多核苷酸”是指对于宿主细胞并非天然的多核苷酸，其包括来自与宿主细胞相同种属的同源多核苷酸和来自与宿主细胞不同种属的异源多核苷酸。
可以通过许多已知的技术将位于表达载体中的外源多核苷酸导入宿主细胞，包括但不限于：热激转化，电穿孔，DEAE-葡聚糖转染，显微注射，脂质体介导的转染，磷酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击，病毒转化及类似技术。
目标蛋白的表达量增加还可以通过使用强启动子的方式实现，例如增加用于驱动编码序列的表达的启动子的强度或改变所述启动子的类型。
在一些实施方案中，可利用同源重组将编码目标蛋白的内源基因的启动子替换成导致目标蛋白表达量增加的启动子，例如强启动子。所述强启动子例如组成型或诱导型启动子。在另一些实施方案中，可利用同源重组将诱导型或组成型启动子和编码目标蛋白的基因或转录因子基因整合到基因组的另一基因座中。
目标蛋白的表达量增加还可以通过本领域已知的其他常规方式实现，例如增加核糖体结合位点或Kozak序列的强度，对编码区进行结构修饰，改变密码子使用，增加mRNA转录物的稳定性，增加蛋白的稳定性，利用宿主细胞的天然机制(例如，热休克、应激、重金属或抗生素暴露)诱导目标蛋白过表达等。例如本发明的萜类经证实能诱导PDR5过表达。
目标蛋白的表达量增加还可通过上述方式的任意组合实现，例如使用含有导致宿主细胞中目标蛋白过表达的启动子的质粒将编码目标蛋白的外源多核苷酸导入该宿主细胞中。
如本文所用，术语“活性增加”是指与在野生型宿主细胞中相比，目标蛋白的特定生物学功能增加。本发明中PDR5蛋白的活性增加是指与在野生型宿主细胞中相比，重组宿主细胞中PDR5蛋白通过生物膜转运分子和离子的功能增加。
如本文所用，术语“载体”是指线性的或环状的DNA分子，其包含编码目标蛋白的多核苷酸，并与供用于其表达的调控序列可操作地连接。用于本发明的载体包括在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还包括能够整合到宿主细胞基因组中并和宿主细胞基因一起复制的载体。可商购获得适于本发明的载体。
如本文所用，术语“分离的”多核苷酸是指从至少一种与其天然结合的成分分离的多核苷酸。
如本文所用，术语“转运蛋白”是指参与将分子和离子移动通过生物膜的一种膜蛋白。目前已知的转运蛋白家族包括SMR家族、RND家族、MATE家族和ABC转运蛋白家族等。
ABC转运蛋白利用腺苷三磷酸(ATP)水解的能量参与多种底物，例如代谢产物、脂质和固醇以及药物的跨膜运输。截至目前，拟南芥和水稻基因组中分别有129种和128种ABC转运蛋白；酿酒酵母和白念珠菌中分别有31种和28种ABC转运蛋白。以酿酒酵母为例，其ABC转运蛋白超家族成员分为6个亚族，非限制性实例包括PDR5、PDR10、PDR15、SNQ2、YOR1、YOL075C和PDR18等。
ABC转运蛋白通常具有不同的底物特异性，本领域技术人员并不完全知晓不同的ABC转运蛋白与其底物的对应关系。以PDR5为例，之前有报道内源PDR5基因的删除导致酵母对丁醇的耐受性增加。本发明发现，PDR5基因的删除导致酵母对萜类耐受性的降低，而其过表达导致酵母对萜类或含萜精油耐受性的增加。
PDR5(pleiotropic drug resistance 5)基因编码一种涉及细胞内外物质交换的细胞质膜ABC转运蛋白PDR5，酿酒酵母PDR5基因的GenBank号为Z75061.1。
作为示例，本发明使用的PDR5基因是酿酒酵母PDR5基因，特别是由SEQ ID NO：1的核酸序列组成的酿酒酵母PDR5基因。
作为示例，本发明使用的PDR5蛋白是酿酒酵母PDR5蛋白，特别是由SEQ ID NO：139的氨基酸序列组成的酿酒酵母PDR5蛋白。
本领域技术人员应当理解，上述基因/蛋白或其序列仅为例证，任何该基因/蛋白的功能类似物或经基因/蛋白序列的任意常规调整获得的同样能提高宿主细胞对萜类或含萜精油的耐受性的基因/蛋白序列的等同技术方案均在本发明的保护范围之内。
用于特定萜类生产的外源多核苷酸，如橙花叔醇合成酶基因，吉玛烯A合成酶基因，香紫苏醇生产的，焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因和香紫苏醇合酶基因等，可根据实际生产需要用于本发明。
如本文所用，术语“萜类”是指数量大且多样的一类有机分子，该分子衍生自以多种方式组装和修饰并且根据组成员中所用的类异戊二烯单元的数目分组的五碳类异戊二烯单元。例如，半萜具有一个类异戊二烯单元，单萜具有两个类异戊二烯单元，倍半萜具有三个类异戊二烯单元，二萜具有四个异戊二烯单元，三萜具有六个类异戊二烯单元，四萜具有八个类异戊二烯单元。萜类有链形的，环状的，还有饱和程度不同的烯键。萜类经过化学修饰，如氧化、碳链重排，可以形成大量的类萜，其也属于本发明的萜类。
如本文所用，术语“含萜精油”是指从植物的花、叶、茎、根或果实中通过水蒸气蒸馏法、挤压法、冷浸法或溶媒等提取法提炼萃取的含有萜类的挥发性芳香物质。本发明重组宿主细胞对包含萜类的含萜精油的耐受性也提高，所述含萜精油例如选自莪术油、姜黄油、甜橙油、薄荷油、紫苏油和檀香油，优选莪术油、姜黄油和檀香油。
本发明成功筛选和鉴定到能提高宿主细胞例如酿酒酵母对萜类或含萜精油耐受性的ABC转运蛋白PDR5，并构建了对萜类或含萜精油耐受性提高的宿主细胞，为萜类的高效生物合成奠定了基础。
实施例
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将通过实施例对本发明实施方式作进一步地详细描述。应当理解实施例不应理解为限制性的，本领域技术人员能够基于本发明的原理对实施方式做进一步的调整。
实施例1：系列萜类对酿酒酵母CEN.PK2-1D生长的影响
取适量DMSO溶剂配制表1所列萜类或含萜精油(均购自上海源叶生物科技有限公司)的储备母液(终浓度均为10g/L)备用。在固体选择培养基1中活化酿酒酵母CEN.PK2-1D(以下简称NK2，购自欧洲酿酒酵母保藏中心(EUROSCARF))，固体选择培养基1组成如下：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His(购自北京泛基诺科技有限公司)，2％葡萄糖，0.01％Leu.(亮氨酸)，0.005％His.(组氨酸)，0.01％Ura.(尿嘧啶)，0.01％Trp.(色氨酸)和2％琼脂粉。然后接种于相应液体选择培养基1中，液体选择培养基1组成如下：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His，2％葡萄糖，0.01％Leu.，0.005％His.，0.01％Ura.0.01％Trp.。于30℃，250rpm培养16小时制备种子液。将种子液分别接种于含4ml液体选择培养基1的试管中，再分别加入适量的萜类或含萜精油储备母液，使其终浓度分别如表1所示。于30℃，250rpm培养8小时，用酶标分析仪于600nm测样品OD值。以萜类或含萜精油浓度0mg/L为对照参比计算抑制率(抑制率＝(1-添加GMA生长OD/对照参比OD)×100％。并以抑制率50％以上的最低浓度孔中的药物浓度计为MIC50，单位mg/L。
表1：系列萜类或含萜精油对酿酒酵母的抑制
如表1，不同浓度的萜类或含萜精油对常见的酿酒酵母工程底盘菌株NK2的生长存在明显抑制作用。
实施例2：酵母细胞ABC和MATE类转运蛋白突变株系构建
1.pEASY-Trp-URA质粒的构建
分别以A:pRS313-TRP-PGK1-MAA45-CYC1t(记载在中国专利201610236283.9中，公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所中获得)和B:pHUra-δDNA(Zhubo Dai，YiLiu，Luqi Huang，Xueli Zhang,Biotechnology and Bioengineering，2012，109(11)：2845-2853。公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所中获得)为模板，使用表2中引物扩增TRP-URA-BamH1(1253bp)、BamH1-TRP-URA(1184bp)，扩增体系为：5×Phusion HFBuffer 10μL、dNTP(10mM每种dNTP)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各1μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退火温度58℃)、72℃延伸1分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。
表2：PCR体系信息表
BamH1分别酶切TRP-URA-BamH1、BamH1-TRP-URA，割胶纯化两个片段，两个基因片段各50ng加入连接体系：2μL 10×T4 DNA Ligase Reaction Buffer(NEB公司)、1μL T4ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μL，室温反应2小时得到连接产物，取1μL连接产物加入扩增体系：5×Phusion HF Buffer(NEB公司)10μL、dNTP(10mM每种dNTP)1μL、DNA模板20ng、加引物TRP-F(10μM)和URA-R(10μM)各1μL、PhusionHigh-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL)(NEB公司)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。
将目标大小片段扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)。克隆体系为：1μL PCR扩增产物、1μL pEASY-Blunt克隆载体，轻轻混合、25℃反应10分钟后，加入50μL Trans10感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μL LB培养基，250rpm，37℃孵育1小时，取200μL菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后，PCR筛选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入目的片段，得到质粒：pEASY-TRP-URA。
2.突变株系的构建
2.1同源重组法基因敲除
同源重组法基因敲除是应用DNA同源重组原理，将含有营养缺陷型筛选标记的同源DNA片段导入受体细胞，使同源片段在原有位置替代了靶基因片段，并通过营养缺陷型培养基筛选出丧失该基因活性的菌株。敲除主要分为两步，第一，同源重组片段的制备，同源重组片段分为两部分，第一部分是带有筛选标记的同源重组片段，通过PCR扩增得到含有50bp同源区域和TRP-URA筛选标记的同源重组片段Gene-TU，第二部分是含有500-600bp同源区域的同源重组片段Gene-Up、Gene-Down；第二，体内同源重组，将扩增到的同源重组片段通过电击法整合到受体细胞中，使其发生同源重组。敲除原理参见图1。
2.2同源重组片段制备
分别以C:pEASY-TRP-URA(可从本实施例：步骤1中获得)和D:CEN.PK2-1D基因组(使用康为世纪酵母基因组提取试剂盒(货号：CW0569)，根据厂商说明提取基因组)为模板和表3中的引物，扩增敲除模块：M1(ScPDR5-TU、ScPDR5-UP、ScPDR5-Down)，M2(ScPDR10-TU、ScPDR10-UP、ScPDR10-Down)，M3(ScPDR11-TU、ScPDR11-UP、ScPDR11-Down)，M4(ScPDR12-TU、ScPDR12-UP、ScPDR12-Down)，M5(ScPDR15-TU、ScPDR15-UP、ScPDR15-Down)，M6(ScAUS1-TU、ScAUS1-UP、ScAUS1-Down)，M7(ScYOR1-TU、ScYOR1-UP、ScYOR1-Down)，M8(ScSNQ2-TU、ScSNQ2-UP、ScSNQ2-Down)，M9(ScSTE6-TU、ScSTE6-UP、ScSTE6-Down)，M10(ScSCE1-TU、ScSCE1-UP、ScSCE1-Down)，M11(ScSCE2-TU、ScSCE2-UP、ScSCE2-Down)，M12(ScSCE3-TU、ScSCE3-UP、ScSCE3-Down)，敲除模块均为三个基因片段摩尔比1:1:1混合。扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μl、dNTP(10mM每种dNTP)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各1μl、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、补加蒸馏水至总体积50μl。扩增条件为98℃预变性1.5分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退火温度58℃)、72℃延伸均用2分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存。
表3：PCR体系信息表
2.3菌株的构建
出发菌酿酒酵母NK2于液体培养基1(液体培养基配方参考实施例1)中过夜培养，取1ml(OD约0.6-1.0)分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mM LiAc；10mM DTT；0.6Msorbitol；10mM Tris-HCl(pH7.5)，处理液使用时才加DTT)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml 1M sorbitol(0.22μM水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1Msorbitol重悬二次)，到最终体积约为90μl，同样方法制备12管。分别加入敲除模块M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12(敲除模块可从本实施例：步骤2.2中获得)片段4.5μL，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂布于筛选固体培养基2中，固体培养基2组成如下：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His(购自北京泛基诺科技有限公司)，0.01％Leu.，0.005％His.，2％葡萄糖和2％琼脂粉。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。PCR验证和测序鉴定出正确的阳性克隆，分别命名为菌株NK2-ScPDR5、NK2-ScPDR10、NK2-ScPDR11、NK2-ScPDR12、NK2-ScPDR15、NK2-ScAUS1、NK2-ScYOR1、NK2-ScSNQ2、NK2-ScSTE6、NK2-ScSCE1、NK2-ScSCE2、NK2-ScSCE3。菌株信息如表4。
表4：工程菌株信息表
实施例3：筛选和鉴定与萜类耐受性相关的转运蛋白
1.提高GMA耐受性的转运蛋白筛选
分别在固体选择培养基1(培养基配方参考实施例1)中活化NK2，在固体选择培养基2(培养基配方参考实施例2)中活化NK2-ScPDR5、NK2-ScPDR10、NK2-ScPDR11、NK2-ScPDR12、NK2-ScPDR15、NK2-ScAUS1、NK2-ScYOR1、NK2-ScSNQ2、NK2-ScSTE6、NK2-ScSCE1、NK2-ScSCE2、NK2-ScSCE3，分别接种于相应液体选择培养基1(培养基配方参考实施例1)和液体选择培养基2中，液体培养2组成如下：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His(购自北京泛基诺科技有限公司)，0.01％Leu.，0.005％His.，2％葡萄糖。于30℃，250rpm培养16h制备种子液。将种子液分别接种于含GMA(终浓度为5mg/L)或不含GMA的4ml相应液体选择培养基的试管中于30℃，250rpm培养8小时，用酶标分析仪于600nm测样品OD值。以药物浓度0mg/L为对照参比计算抑制率。(抑制率＝(1-添加GMA生长OD/对照参比OD)×100％)。
如图2，当在培养基中添加GMA时，ABC转运蛋白ScPDR5缺失的菌株NK2-ScPDR5的生长与对照菌株相比，生长明显受到抑制。
2.提高GMA耐受性的转运蛋白功能鉴定
2.1过表达ScPDR5及对照菌株的构建
2.1.1 pRS313-TRP-TEF1-MAA45-CYC1t质粒的构建
以pM3-ERG9(记载在中国专利申请201210453416.X中,可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得)为模板及引物列表5中引物，扩增TEF1(450bp)。扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM每种dNTP)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各1μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退火温度58℃)、72℃延伸1分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。
表5：PCR体系信息表
用Pac1和SexA1对扩增片段TEF1和质粒pRS313-TRP-PGK1-MAA45-CYC1t进行双酶切，胶回收片段TEF1和pRS313-TRP-MAA45-CYC1t将所得片段各50ng加入连接体系：2μL 10×T4 DNA Ligase Reaction Buffer(NEB公司)、1μL T4 ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μL，室温反应2小时得到连接产物，转入Trans10感受态细胞中和测序验证(方法同实施例2：步骤1)。得到质粒：pRS313-TRP-TEF1-MAA45-CYC1t。
2.1.2对照pRS313-TRP-TEF1-GFP-CYC1t质粒的构建
以pYM–N9(Carsten Janke,Maria M.Magiera and Nicole Rathfelder,et al.,Yeast 2004；21:947–962.可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得)为模板及引物列表5中引物，扩增GFP(828bp)。扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM每种dNTP)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各1μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退火温度58℃)、72℃延伸1分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。
用SexA1和Asc1对扩增片段GFP和质粒pRS313-TRP-TEF1-MAA45-CYC1t(可以从本实施例：步骤2.1.1中获得)进行双酶切，胶回收片段GFP和pRS313-TRP-TEF1-…-CYC1t,将所得片段各50ng加入连接体系：2μL 10×T4 DNA Ligase Reaction Buffer(NEB公司)、1μLT4 ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μL，室温反应2小时得到连接产物，转入Trans10感受态细胞中和测序验证(方法同实施例2：步骤1)。得到pRS313-TRP-TEF1-GFP-CYC1t质粒。
2.1.3菌株NK2+ScPDR5和NK2+GFP构建
以E:pRS313-TRP-TEF1-MAA45-CYC1t(可以从本实施例：步骤2.1.1中获得)和D:CEN.PK2-1D基因组(可从实施例2：步骤2.2中获得)为模板及列表6中引物，扩增Asse-313-TRP-TEF1-CYC1t(6680bp)、Asse-ScPDR5(4550bp)、Helper-TEF1(550bp)、Helper-CYC1(550bp)，扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM每种dNTP)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各1μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退火温度58℃)、72℃延伸3分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。胶回收备用。
表6：PCR体系信息表
采用和实施例2：步骤2.3中相同的方法进行NK2感受态细胞的制备及转化，分别加入片段Asse-313-TRP-TEF1-CYC1t、Asse-ScPDR5、Helper-TEF1、Helper-CYC1共6μL(摩尔比为1:1:1:1)和质粒pRS313-TRP-TEF1-GFP-CYC1t(可从本实施例：步骤2.2.2中获得)混匀后分别转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂布于固体选择培养基3中，固体选择培养基3组成如下：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His(购自北京泛基诺科技有限公司)，0.01％Leu.，0.005％His.0.01％Ura.，2％葡萄糖和2％琼脂粉。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。PCR鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株NK2+ScPDR5和NK2+GFP。
2.2调控ScPDR5基因表达对GMA耐受性的变化
在固体选择培养基1(培养基配方参考实施例1)中活化NK2，并将其接种于相应液体选择培养基1(培养基配方参考实施例1)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，在固体选择培养基3(培养基配方参考本实施例：步骤2.1.3)中活化NK2+GFP、NK2-ScPDR5(可从实施例2中获得)和NK2+ScPDR5，并将其接种于相应液体选择培养基3中，液体选择培养基3组成如下：0.8％酵母选择培养基SD-Trp(购自北京泛基诺科技有限公司)，2％葡萄糖。于30℃，250rpm培养16h制备种子液。将种子液NK2、NK2+GFP、NK2+ScPDR5和NK2-ScPDR5接种于含GMA(终浓度为5mg/L)/不含GMA的4ml相应液体选择培养基的试管中，于30℃，250rpm培养8小时，用酶标分析仪于600nm测样品OD值，并以药物浓度0mg/L为对照参比。
如图3，在菌株NK2中过表达ScPDR5基因能显著提高菌株对GMA的耐受性，而菌株NK2、NK2-GFP，NK2-ScPDR5的生长明显受抑制，其中ScPDR5功能的缺失导致菌株对GMA的耐受性显著降低。
实施例4：酿酒酵母中过表达ScPDR5基因能提高菌株对萜类及含萜精油的耐受性
在固体选择培养基1(培养基配方参考实施例1)中活化NK2，并将其接种于相应液体选择培养基1(培养基配方参考实施例1)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液，在固体选择培养基3(培养基配方参考本实施例：步骤2)中活化NK2+GFP、NK2-ScPDR5和NK2+ScPDR5，并将其接种于相应液体选择培养基3(培养基配方参考实施例3)中于30℃，250rpm培养16h制备种子液。将种子液NK2、NK2+GFP、NK2+ScPDR5和NK2-ScPDR5同样分别接种于含各种萜类(终浓度如表7)/不含各种萜类的4ml相应液体选择培养基的试管中,于30℃，250rpm培养8小时，用酶标分析仪于600nm测样品OD值。以药物浓度0mg/L为对照参比计算抑制率。(抑制率＝(1-添加GMA生长OD/对照参比OD)×100％)。酿酒酵母中过表达ScPDR5基因能提高菌株对萜类及含萜精油的耐受性，结果如表7。
表7：酿酒酵母中调控ScPDR5基因表达与菌株对萜类及含萜精油的耐受性关系
表注：“↑”代表耐受性提高
如表7，通过在菌株NK2中敲除和过表达ScPDR5能显著影响菌株对相关萜类或含萜精油的耐受性。在NK2-ScPDR5中，由于ScPDR5功能的缺失导致菌株对相关萜类或含萜精油的耐受性显著降低，抑制率显著提高；相反，在NK2+ScPDR5中，由于ScPDR5的过表达导致菌株对相关萜类或含萜精油的耐受性显著提高，抑制率显著降低。
实施例5：过表达ScPDR5基因对萜类工程菌株的目标产物产量影响
5.1基因元件的获得和所用质粒的构建
5.1.1基因元件的制备
在金斯瑞生物科技有限公司全合成GES基因(SEQ ID NO：2)、SAAT基因(SEQ IDNO：3)、NES基因(SEQ ID NO：4)、LPS基因(SEQ ID NO：5)、TPS基因(SEQ ID NO：6)和SaGGPS基因(SEQ ID NO：7)。
提取酵母菌株NK2-SQ(创建酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇，中国中药杂志，林庭庭，王冬，戴住波，张学礼，黄璐琦，2016，41(6)：1008-1015)的基因组DNA作为模板，用表8中的引物进行扩增，得到ERG20片段(SEQ ID NO：8)；以合成的LPS基因和TPS基因为模板，用表8中的引物进行扩增，得到cLPS片段和cTPS片段。
上述扩增体系为：TAKARA
HS DNA聚合酶5×PS Buffer 10μL，dNTPMix4μL，引物各1μL，DNA模板1μL，
HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火15秒、72℃延伸2.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。所得PCR产物经纯化后，置于-20℃冰箱，备用。
表8：引物序列
5.1.2基因元件质粒的构建
5.1.2.1 pM2-cLPS和pM2-SAAT质粒的构建
用SexA1和Asc1分别对上述5.1.1中扩增得到的cLPS，全合成的SAAT以及质粒pM2-tHMG1(记载在中国专利ZL201310399947.X中)进行双酶切，得到SAAT酶切产物、cLPS酶切产物和质粒pM2-tHMG1酶切后骨架；再将pM2-tHMG1酶切后骨架分别与酶切产物cLPS和SAAT进行连接，得到重组质粒pM2-cLPS和pM2-SAAT。
5.1.2.2 pM4-ERG20和pM4-SaGGPS质粒的构建
用SexA1和Asc1分别对上述5.1.1中得到的ERG20、SaGGPS以及质粒pM11-AtCPR1(pM11-AtCPR1记载在中国专利ZL201310399947.X中，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得))进行双酶切；得到ERG20和SaGGPS酶切产物和质粒pM11-AtCPR1酶切后骨架；再将ERG20和SaGGPS酶切产物分别与质粒pM11-AtCPR1酶切后骨架连接，得到重组质粒pM4-ERG20和pM4-SaGGPS。
5.1.2.3 pM3-cTPS和pM3-GES质粒的构建
用SexA1和Asc1分别对上述5.1.1中扩增得到的cTPS，全合成的GES以及质粒pM3-ERG9(记载在中国专利申请201210453416.X中)进行双酶切；得到GES酶切产物、cLPS酶切产物和质粒pM3-ERG9酶切后骨架；再将pM3-ERG9酶切后骨架分别与酶切产物cTPS和GES进行连接，得到重组质粒pM3-cTPS和pM3-GES。
5.1.2.4 pEASY-GAL80-LEU2质粒的构建
分别以NK2-SQ基因组DNA和pRS425(Sikorski,R.S.and Hieter,P.1989,Genetics122(1):19-27，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得)为模板，用引物表9中引物，扩增GAL80和LEU2。扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-FidelityDNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。
扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。将扩增产物GAL80克隆到pEASY-BluntSimple克隆载体转化，测序验证，得到质粒pEASY-GAL80。
表9：引物序列
PmeI酶切pEASY-GAL80，割胶纯化5145bp目的片段(30ng)，加入4μL NEB buffer、1μL CIP去磷酸化酶(NEB公司)，补充蒸馏水至40μL，37℃处理1h，加入终浓度为10μmol的EDTA，65℃30min终止反应，割胶回收目的片段pEASY-GAL80，备用。
割胶纯化LEU2(30ng)，加入4μL10×T4 DNA Ligase Reaction Buffer(NEB公司)、1μL T4 Polynucleotide kinase(NEB公司)，补充蒸馏水至40μL，37℃磷酸化1h；割胶回收后，与pEASY-GAL80用T4 DNA连接酶连接(NEB公司)，转化，测序验证，得到质粒pEASY-GAL80-LEU2。
5.1.2.5 pRS313-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-NES-TCYC1质粒的构建
以SynSmFPS(记载在中国专利201610961269.5上，公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所中获得)和NES为模板，用表10中引物分别扩增得到SynSmFPS-GGGS和GGGS-SynNES。扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火15秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。所得PCR产物经纯化后，置于-20℃冰箱，备用。
表10：引物序列
以SynSmFPS-GGGS和GGGS-NES共同作为模板，用表10中引物(SexA1-SynSmFPS和NES-Asc1-R)扩增得到SynSmFPS-GGGS-NES片段。
扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模板SynSmFPS-GGGS和GGGS-NES各20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
将扩增产物纯化，然后用SexA1和Asc1酶切，割胶回收目的片段SexA1-SynSmFPS-GGGS-NES-Asc1，备用。
将质粒pRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1(记载在中国专利201610961269.5上，公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所中获得)用SexA1和Asc1酶切，割胶回收大片段，得到载体pRS313-LEU2-PTEF1-...-TCYC1；将载体pRS313-LEU2-PTEF1-...-TCYC1与SexA1-SynSmFPS-GGGS-NES-Asc1各50ng加入连接体系：2μL 10×T4 DNA Ligase ReactionBuffer(NEB公司)、1μL T4 DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μL，室温反应2小时得到连接产物，转入Trans10感受态细胞中，提取质粒测序验证，得到pRS313-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-NES-TCYC1质粒。
表11：质粒信息
5.2单萜香叶酯
5.2.1功能模块的制备
分别用表12中描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模块：M21(GAL80-LEU2-up)，M22(PPGK1-SAAT-TADH1)，M23(PTDH3-ERG20-TTPI1)，M24(PTEF1-GES-TCYC1)，M25(GAL80-LEU2-down)。扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存。
表12：PCR体系信息表
5.2.2香叶酯工程菌的构建
采用和实施例2：步骤3中相同的方法进行FPP-001(记载在中国专利201610961269.5上，公众可以从中国科学院天津工业生物技术研究所中获得)感受态细胞的制备。然后，在感受态中分别加入片段M21、M22、M23、M24、M25共5μL(摩尔比为1:1:1:1:1)混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂布于固体培养基4(固体培养基4配方如下：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His(购自北京泛基诺科技有限公司)，0.01％Trp.，2％葡萄糖和2％琼脂粉)中，30℃，培养36h以上，PCR鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株GE-001；在此基础上，采用和实施例2：步骤3中相同的方法进行GE-001感受态细胞的制备。然后，将对照质粒pRS313-TRP-TEF1-GFP-CYC1t和4μL片段混合物(Asse-313-TRP-TEF1-CYC1t、Asse-ScPDR5、Helper-TEF1、Helper-CYC1，摩尔比为1:1:1:1)分别加入到两管GE-001感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂布于固体培养基5(固体培养基5配方如下：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His(购自北京泛基诺科技有限公司)，2％葡萄糖和2％琼脂粉)中，30℃，培养36h以上，PCR鉴定出正确的阳性克隆，获得对照菌株GE-CK和ScPDR5过表达菌株GE+ScPDR5。
5.2.3工程菌培养及产物提取
在固体培养基5中活化5.1.2.2制备的GE-CK和GE+ScPDR5，于相应液体选择培养基中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含15mL液体选择培养基的100mL三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养3天，然后加入2.25mL正己烷，继续震荡培养1h。最后，将三角瓶中液体转移至50mL离心管，5000rpm离心5min，收集有机相过有机尼龙膜(0.22μm)，用GC-MS检测。检测仪器：安捷伦气质联用仪Agilent 7890A/5975C。GC-MS测定条件：进样口温度250℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时5min；色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mm)；色谱条件：45℃，1min，10℃/min到220℃保温5min；MS条件：Full Scan:45-700amu。备用。用香叶酯的标准品进行定性定量，香叶酯标准品在西格玛公司购买(货号：45896)。
结果：工程菌GE-CK和GE+ScPDR5发酵3天时香叶酯产量分别为0.09mg/(L·OD)和0.13mg/(L·OD)，后者香叶酯的产量较前者提高了41％。
5.3倍半萜橙花叔醇
5.3.1功能模块的制备
分别用表13中描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模块：M26(GAL80-LEU2-up)，M27(PTEF1-SynSmFPS-GGGS-NES-TCYC1)，M28(GAL80-LEU2-down)。扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存。
表13：PCR体系信息表
5.3.2橙花叔醇工程菌的构建
采用和实施例2：步骤3中相同的方法进行FPP-001感受态细胞的制备。然后，在感受态中分别加入片段M26、M27、M28共3μL(摩尔比为1:1:1)混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂布于固体培养基4中，30℃，培养36h以上，PCR鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株NE-001；在此基础上，采用和实施例2：步骤3中相同的方法进行NE-001感受态细胞的制备。然后，将对照质粒pRS313-TRP-TEF1-GFP-CYC1t和4μL片段混合物(Asse-313-TRP-TEF1-CYC1t、Asse-ScPDR5、Helper-TEF1、Helper-CYC1，摩尔比为1:1:1:1)分别加入到两管NE-001感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂布于固体培养基5中，30℃，培养36h以上，PCR鉴定出正确的阳性克隆，分别获得对照菌株NE-CK和ScPDR5过表达菌株NE+ScPDR5。
5.3.3工程菌培养及产物提取
在固体选择培养基5中活化5.3.2制备的工程菌株NE-CK和NE+ScPDR5，于相应液体选择培养基中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含15mL相应液体选择培养基的100mL三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养1天，然后加入1.5mL正十二烷，继续震荡培养5天。最后，将三角瓶中液体转移至50mL离心管，5000rpm离心5min，收集有机相，用正己烷稀释10倍，过有机尼龙膜(0.22μm)，用GC-MS检测。检测仪器：安捷伦气质联用仪Agilent7890A/5975C。GC-MS测定条件：进样口温度250℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时3min；色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mm)；色谱条件：45℃，1min，10℃/min到300℃保温5min；MS条件：Full Scan:50-750amu。备用。用橙花叔醇的标准品对样品进行定性定量橙花叔醇标准品在西格玛公司购买(货号：81431)。
结果：工程菌NE-CK和NE+ScPDR5发酵6天时橙花叔醇产量分别达到13.9mg/(L·OD)和15.0mg/(L·OD)，后者橙花叔醇的产量较前者提高了8％。
5.4二萜香紫苏醇
5.4.1功能模块的制备
分别用表14中描述的PCR模板)和引物进行PCR获得功能模块：M29(GAL80-LEU2-up)，M30(PPGK1-cLPS-TADH1)，M31(PTDH3-SaGGPPS-TTPI1)，M32(PTEF1-cTPS-TCYC1)，M33(GAL80-LEU2-down)。扩增体系为：5×Phusion HF Buffer10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存。
表14：PCR体系信息表
5.4.2香紫苏醇底盘细胞的构建
采用和实施例2：步骤3中相同的方法进行FPP-001感受态细胞的制备。然后，在感受态中分别加入片段M29、M30、M31、M32、M33共5μL(摩尔比为1:1:1:1:1)混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂布于固体培养基4中，30℃，培养36h以上，PCR鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株SC-001；在此基础上，采用和实施例2：步骤3中相同的方法进行SC-001感受态细胞的制备。然后，将pRS313-TRP-TEF1-GFP-CYC1t和4μL片段混合物(Asse-313-TRP-TEF1-CYC1t、Asse-ScPDR5、Helper-TEF1、Helper-CYC1，摩尔比为1:1:1:1)分别加入到两管SC-001感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂布于固体培养基5中，30℃，培养36h以上，PCR鉴定出正确的阳性克隆，获得对照菌株SC-CK和ScPDR5过表达菌株SC+ScPDR5。
5.4.3工程菌培养及产物提取
在固体选择培养基5中活化5.4.2制备的工程菌株SC-CK和SC+ScPDR5，于相应液体选择培养基中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含15mL相应液体选择培养基的100mL三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养1天，然后加入1.5mL正十二烷，继续震荡培养5天。最后，将三角瓶中液体转移至50mL离心管，5000rpm离心5min，收集有机相，用正己烷稀释10倍，过有机尼龙膜(0.22μm)，用GC-MS检测。检测仪器：安捷伦气质联用仪Agilent7890A/5975C。GC-MS测定条件：进样口温度300℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时5min；色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mm)；色谱条件：50℃，2min，20℃/min到280℃保温4min,20℃/min到300℃保温7.5min；MS条件：Full Scan:20-600amu。备用。用香紫苏醇的标准品进行定性定量，香紫苏醇标准品在西格玛公司购买(货号：49944)。
结果：工程菌株SC-CK和SC+ScPDR5发酵6天时香紫苏醇产量分别达到1.34mg/(L·OD)和1.67mg/(L·OD)，后者香紫苏醇的产量较前者提高了25％。
Claims (10)
1.一种产生对萜类或含萜精油的耐受性提高的重组宿主细胞的方法，其包括增加野生型宿主细胞中PDR5蛋白的表达量或活性的步骤，其中所述萜类或含萜精油选自香叶醇、金合欢醇、橙花叔醇、诺卡酮、吉玛烯A、榄香烯、檀香醇、香紫苏醇、莪术油、姜黄油、甜橙油、薄荷油、紫苏油和檀香油，优选选自金合欢醇、橙花叔醇、吉玛烯A、榄香烯、檀香醇、莪术油、姜黄油和檀香油。
2.权利要求1的方法，其中PDR5蛋白的表达量增加通过增加PDR5基因的拷贝数和/或使用强启动子实现，优选所述PDR5基因是酿酒酵母PDR5基因，更优选所述酿酒酵母PDR5基因由SEQ ID NO：1的核酸序列组成。
3.权利要求1的方法，其中：(a)所述宿主细胞进一步包含用于萜类生产的外源多核苷酸；和/或(b)所述宿主细胞是真核生物，优选酵母纲(Saccharomycetes)。
4.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞选自伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、念珠菌属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希菌属(Escherichia)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyce)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、红发夫酵母属(Phaffia)、平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、红发夫酵母属(Xanthophyllomyces)和耶氏酵母属(Yarrowiagenera)，更优选所述宿主细胞选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnerajadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、博伊丁念珠菌(Candida boidinii)、Arxula adeninivorans、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)或白色念珠菌(Candida albicans)物种，优选酿酒酵母。
5.分离的编码PDR5蛋白的多核苷酸或PDR5蛋白用于提高宿主细胞对萜类或含萜精油的耐受性的用途，其中所述萜类或含萜精油选自香叶醇、金合欢醇、橙花叔醇、诺卡酮、吉玛烯A、榄香烯、檀香醇、香紫苏醇、莪术油、姜黄油、甜橙油、薄荷油、紫苏油和檀香油，优选选自金合欢醇、橙花叔醇、吉玛烯A、榄香烯、檀香醇、莪术油、姜黄油和檀香油。
6.权利要求5的用途，其中所述编码PDR5蛋白的多核苷酸是酿酒酵母PDR5基因，优选所述酿酒酵母PDR5基因由SEQ ID NO：1的核酸序列组成。
7.权利要求5的用途，其中所述PDR5蛋白是酿酒酵母PDR5蛋白，优选所述酿酒酵母PDR5蛋白由SEQ ID NO：139的氨基酸序列组成。
8.权利要求5的用途，其中所述宿主细胞进一步包含用于萜类生产的外源多核苷酸，优选所述宿主细胞是真核生物，优选酵母纲。
9.权利要求5的用途，其中所述宿主细胞选自伞菌属、曲霉属、芽孢杆菌属、念珠菌属、棒状杆菌属、埃希菌属、镰孢属、赤霉属、克鲁维酵母属、硫磺菌属、香菇属、红发夫酵母属(Phaffia)、平革菌属、毕赤酵母属、藓属、红酵母属、酵母属、裂殖酵母属、痂圆孢属、红发夫酵母属(Xanthophyllomyces)和耶氏酵母属，优选所述宿主细胞选自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑念珠菌、棉阿舒囊霉、产朊假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁念珠菌、Arxula adeninivorans、红发夫酵母或白色念珠菌物种，优选酿酒酵母。
10.一种生产萜类或含萜精油的方法，包括在培养基中于导致产生萜类的条件下培养由权利要求1-4任一项的方法产生的重组宿主细胞，并从培养基中回收所述萜类或含萜精油，其中所述萜类或含萜精油选自香叶醇、金合欢醇、橙花叔醇、诺卡酮、吉玛烯A、榄香烯、檀香醇、香紫苏醇、莪术油、姜黄油、甜橙油、薄荷油、紫苏油和檀香油，优选选自金合欢醇、橙花叔醇、吉玛烯A、榄香烯、檀香醇、莪术油、姜黄油和檀香油。
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