CN114989997B - 一株高产香紫苏醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的的目的是提供一株高产香紫苏醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用，属于生物工程领域。该重组解脂耶氏酵母菌是XJ‑12株，保藏编号为CCTCC NO：M 2022556。本发明还提供该重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括将3‑羟基‑3‑甲基戊二酰CoA还原酶表达盒、法尼基焦磷酸合酶表达盒、异源焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶表达盒、异源香紫苏醇合酶表达盒和至少一种香叶基香叶基焦磷酸合酶表达盒通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，通过同源重组整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。重组解脂耶氏酵母XJ‑12株能够高效发酵生产香紫苏醇，实现了天然产物香紫苏醇在解脂耶氏酵母菌中的合成，构建方法高效，操作简单。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一株高产香紫苏醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用。
背景技术
香紫苏醇(Sclareol,C20H36O2)又名硬尾醇，是一种半日花烷型二萜二叔醇，主要存在于香紫苏(Salvia sclarea)等鼠尾草属植物中。目前，香紫苏醇在工业上是半合成降龙涎香醚的原料化合物，通过氧化-还原-环化三步反应可高效合成降龙涎香醚，是香料工业重要的原材料。此外，香紫苏醇具有抗肿瘤、抗炎和免疫调节活性，是治疗帕金森、强直性惊厥、破骨细胞导致的骨质酥松等疾病的潜在药物。
香紫苏醇传统上从香紫苏花序的植物浸膏中提取。但是，根据种植地区的环境、气候因素影响，香紫苏的生长周期存在较大变化，因此植物提取法受到较大限制。相比植物提取法而言，微生物发酵生长周期短且可全天候生产、产量稳定，能满足日益增长的市场需求。但是，现有技术中，缺乏能够高效生产香紫苏醇的微生物。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产香紫苏醇的重组解脂耶氏酵母菌，能够高效合成香紫苏醇。
本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，该方法高效，操作简单。
本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌在生产香紫苏醇中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一株高产香紫苏醇的重组解脂耶氏酵母菌，是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)XJ-12株，保藏编号为CCTCC NO：M 2022556。
在本发明中，所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-12株是在解脂耶氏酵母基因组中插入3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶表达盒、法尼基焦磷酸合酶表达盒、异源焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶表达盒、异源香紫苏醇合酶表达盒和至少一种香叶基香叶基焦磷酸合酶表达盒后得到的。
在本发明中，所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶和法尼基焦磷酸合酶编码基因来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；异源焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶和异源香紫苏醇合酶是将来源于香紫苏(Salvia sclarea)的焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶和香紫苏醇合酶编码基因经密码子优化后去除信号肽所得；香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因1是将来自蓝藻(Synechococcus sp.)的香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因经密码子优化所得，香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因2是将核果果腐拟茎点菌(Phomopsis amygdali)来源的壳梭孢菌素二烯合酶(Fusicoccadiene Synthase)390到719的氨基酸序列的编码基因经密码子优化后所得。
在本发明中，所述异源焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶通过连接肽(GGGGS)3连接RIDD，异源香紫苏醇合酶通过连接肽(GGGGS)3连接RIAD。RIDD会自发形成稳定的二聚体，RIAD则会与RIDD二聚体结合，形成稳定的三聚结构，通过在焦磷酸赖百当烯二醇酯合成酶和香紫苏醇合成酶上分别融合表达这一对多肽标签，就能连接代谢通路，使异源合成体系更为高效运转。
在本发明中，所述各表达盒的启动子为解脂耶氏酵母的启动子PTEF、Php4d、PTEFin、PYAT1、PFBA、PFBAin、PPOX2、PPOT1或PGPD中的任意一种；所述终止子为解脂耶氏酵母的终止子Txpr2t、Tmig1t、Tlip2t、Tcyc1t、Tpex3t、Tpex10t或Tpex20t中的任意一种。
在本发明中，所述表达盒的整合位点为解脂耶氏酵母的A08位点、26s rDNA位点、IntA位点、IntB位点、IntC位点、IntD位点、IntE2位点、IntF位点、lip1位点、SCP2位点、或YlSCD位点中的任意一种。
在本发明中，所述香紫苏异源焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶SsLPPS编码基因序列如SEQ ID No.1所示；所述香紫苏异源香紫苏醇合酶SsSCS编码基因序列如SEQ ID No.2所示；所述香叶基香叶基焦磷酸合酶1(GGPPS1)编码基因序列如SEQ ID No.3所示；所述香叶基香叶基焦磷酸合酶2(GGPPS2)编码基因序列如SEQ ID No.4所示；由所述连接肽(GGGGS)3与RIDD相连得到(GGGGS)3-RIDD，(GGGGS)3-RIDD的编码基因序列如SEQ ID No.5所示；由所述连接肽(GGGGS)3与RIAD相连得到(GGGGS)3-RIAD，(GGGGS)3-RIAD编码基因序列如SEQ IDNo.6所示。
本发明还提供所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括将3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶表达盒、法尼基焦磷酸合酶表达盒、异源焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶表达盒、异源香紫苏醇合酶表达盒和至少一种香叶基香叶基焦磷酸合酶表达盒通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，然后通过同源重组整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。
本发明还提供所述重组菌在生产香紫苏醇中的应用，包括采用发酵培养基培养权利要求所述重组菌，得到发酵产物的步骤。
在本发明中，所述发酵培养基含有葡萄糖50-70g/L，蛋白胨15-25g/L，酵母膏8-12g/L，接种后添加10％十二烷对香紫苏醇进行萃取。
有益效果：解脂耶氏酵母中香紫苏醇合成途径代谢图如图1。本发明的重组解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-12株，是基于敲除负责编码非同源重组基因ku70的解脂耶氏酵母，使其同源重组能力增强，通过解脂耶氏酵母自身的同源重组功能实现基因的整合，能大幅度提高导入基因的遗传稳定性。本发明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-12株过表达内源法尼基焦磷酸合酶(ERG20)和3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(tHMG)，表达异源焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶(SsLPPS)与香紫苏醇合酶(SsSCS)并形成胞内耦联体，表达异源香叶基香叶基焦磷酸合酶1(GGPPS1)表达盒与香叶基香叶基焦磷酸合酶2(GGPPS2)表达盒。本发明重组解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)XJ-12株能够高效发酵生产香紫苏醇，实现了天然产物香紫苏醇在解脂耶氏酵母菌中的合成。本发明重组解脂耶氏酵母构建方法高效，操作简单。
附图说明
图1是解脂耶氏酵母中香紫苏醇合成途径代谢图。其中，tHMG为3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶；ERG20为法尼基焦磷酸合酶；GGPPS1为香叶基香叶基焦磷酸合酶1，以法尼基焦磷酸与异戊烯焦磷酸为底物；GGPPS2为香叶基香叶基焦磷酸合酶2，以异戊烯焦磷酸和二甲基丙烯焦磷酸为底物；SsLPPS为焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶；SsSCS为香紫苏醇合酶。
图2是重组质粒pUC-HUH-IntC-tHMG的结构图,其中IntC-up表示IntC位点上游同源臂，IntC-dm表示IntC位点下游同源臂，TEFin表示启动子PTEFin，xpr2t表示终止子Txpr2t，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒，tHMG为3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因。
图3是重组质粒pUC-HUH-SCP2-ERG20的结构图，其中SCP2-up表示SCP2位点上游同源臂，SCP2-dm表示SCP2位点下游同源臂，TEFin表示启动子PTEFin，xpr2t表示终止子Txpr2t，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒，ERG20为法尼基焦磷酸合酶基因。
图4是重组质粒pUC-HUH-IntA-GGPPS1的结构图，其中IntA-up表示IntA位点上游同源臂，IntA-dm表示IntA位点下游同源臂，TEFin表示启动子PTEFin，xpr2t表示终止子Txpr2t，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒，GGPPS1为蓝藻来源的香叶基香叶基焦磷酸合酶1基因。
图5是重组质粒pUC-HUH-lip1-GGPPS2的结构图，其中lip1-up表示lip1位点上游同源臂，lip1-dm表示lip1位点下游同源臂，TEFin表示启动子PTEFin，xpr2t表示终止子Txpr2t，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒，GGPPS2为核果果腐拟茎点菌来源的香叶基香叶基焦磷酸合酶2基因。
图6是重组质粒pUC-leu-A08-SsLPPSRIDD的结构图，其中A08-up表示A08位点上游同源臂，A08-dm表示A08位点下游同源臂，TEFin表示启动子PTEFin，xpr2t表示终止子Txpr2t，leu表示3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒，SsLPPS-(GGGGS)3-RIDD表示焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶的编码基因与(GGGGS)3-RIAD的编码基因顺序连接后形成的融合基因。
图7是重组质粒pUC-HUH-IntE2-SsSCSRIAD的结构图，其中IntE2-up表示IntE2位点上游同源臂，IntE2-dm表示IntE2位点下游同源臂，TEFin表示启动子PTEFin，xpr2t表示终止子Txpr2t，URA表示乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因表达盒，SsSCS-(GGGGS)3-RIAD表示香紫苏醇合酶的编码基因与(GGGGS)3-RIAD的编码基因顺序连接后形成的融合基因。
图8显示Yarrowia lipolytica XJ-12株(重组菌4)生产香紫苏醇的GC检测图和香紫苏醇标品图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f，购于美国菌种保藏中心，编号为ATCCMYA-2613。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1fΔku70(MatA,Δku70::hisG,leu2-270,ura3-302,xpr2-322,axp1-2)，缩写为Yarrowia lipolytica Po1fΔku70。Yarrowialipolytica Po1fΔku70由解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f敲除了负责非同源重组的编码基因ku70后构建得到(公开于Kretzschmar A,et al.,Current Genetics,2013,59(1-2):63-72)。
A08位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体A上A08位点起始密码子上游大小为2521bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为2031bp的序列(下游同源臂)插入pUC57-Leu载体(构建方法见实施例1)中所得，leu表达盒在A08位点上、下游同源臂之间。
IntE2位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体E上IntE2位点起始密码子上游大小为1533bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为1521bp的序列(下游同源臂)插入pUC57-hisG-ura-hisG载体(构建方法见实施例1)中所得，两个hisG标签编码基因在IntE2位点上、下游同源臂之间。
IntC位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体C上IntC位点起始密码子上游大小为1402bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为1396bp的序列(下游同源臂)插入pUC57-hisG-ura-hisG载体中所得，两个hisG标签编码基因在IntC位点上、下游同源臂之间。
SCP2位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体E上的SCP2位点起始密码子上游大小为1523bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为1524bp的序列(下游同源臂)插入pUC57-hisG-ura-hisG载体中所得，两个hisG标签编码基因在SCP2位点上、下游同源臂之间。
IntA位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体A上的IntA位点起始密码子上游大小为1633bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为1621bp的序列(下游同源臂)插入pUC57-hisG-ura-hisG载体中所得，两个hisG标签编码基因在IntA位点上、下游同源臂之间。
lip1位点整合质粒是将Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组中染色体E上的lip1位点起始密码子上游大小为1458bp的序列(上游同源臂)和终止密码子下游大小为1438bp的序列(下游同源臂)插入pUC57-hisG-ura-hisG载体中所得，两个hisG标签编码基因在lip1位点上、下游同源臂之间。
实施例1、基因元件的扩增与目标质粒的制备
(一)目标基因的制备
根据NCBI上提供的来自香紫苏(Salvia sclarea)的焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶编码基因(GenBank登录号：JQ478434.1)的核苷酸序列，去除起始端189个核苷酸的信号肽序列后，经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的焦磷酸赖百当烯二醇酯合成酶编码基因SsLPPS(SEQ ID No：1)，并插入质粒pUC57(购自金唯智公司)中，得到质粒pUC57-SsLPPS。
根据NCBI上提供的来自香紫苏(Salvia sclarea)的香紫苏醇合酶编码基因(GenBank登录号：JQ478435.1)的核苷酸序列，去除起始端150个核苷酸的信号肽序列后，经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的香紫苏醇合成酶编码基因SsSCS(SEQ ID No：2)，并插入质粒pUC57中，得到质粒pUC57-SsSCS。
根据NCBI上提供的来自蓝藻(Synechococcus sp.)的香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因(GenBank登录号：WP_011429285.1)的核苷酸序列，经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的香叶基香叶基焦磷酸合酶1编码基因GGPPS1(SEQ IDNo：3)，并插入质粒pUC57中，得到质粒pUC57-GGPPS1。
根据NCBI上提供的来自核果果腐拟茎点菌(Phomopsis amygdali)来源的壳梭孢菌素二烯合酶(Fusicoccadiene Synthase,GenBank登录号：A2PZA5.1)390到719的氨基酸序列，经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的核苷酸序列，命名为香叶基香叶基焦磷酸合酶2编码基因GGPPS2(SEQ ID No：4)，并插入质粒pUC57中，得到质粒pUC57-GGPPS2。
根据文献(公开于Ni N P,et al.Biomolecules,2021,11(6).)RIDD会自发形成稳定的二聚体，RIAD则会与RIDD二聚体结合，形成稳定的三聚结构，通过在两个蛋白上分别融合表达这一对多肽标签，就能连接代谢通路，使异源合成体系更为高效运转。在RIDD的N端添加(GGGGS)3连接子序列后，经密码子优化，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的(GGGGS)3-RIDD编码基因(SEQ ID No：5)，并插入质粒pUC57中，得到质粒pUC57-(GGGGS)3-RIDD。
根据文献(公开于Ni N P,et al.Biomolecules,2021,11(6).)提供的RIAD序列，在RIAD的N端添加(GGGGS)3连接子序列后，经密码子优化，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的(GGGGS)3-RIAD编码基因(SEQ ID No：6)，并插入质粒pUC57中，得到质粒pUC57-(GGGGS)3-RIAD。
根据NCBI上提供的Yarrowia lipolytica中的3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leu的核苷酸序列(GenBank登录号：M37309.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成leu，将3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒(由启动子PTEFin、3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leu和终止子Txpr2t组成)插入质粒pUC57中，得到质粒pUC57-Leu。
根据NCBI上提供的Yarrowia lipolytica中的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因Ura的核苷酸序列(GenBank登录号：AJ306421.1)和hisG标签(GenBank登录号：AF324729.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，将两个hisG标签编码基因序列插入质粒pUC57(购自金唯智公司)中，在两个hisG标签编码基因序列之间插入乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(由启动子PTEFin、乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因Ura和Txpr2t组成)，以便实现ura标记回收，得到质粒pUC57-hisG-ura-hisG。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以IntC-tHMG-F和IntC-tHMG-R为引物，扩增3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶编码基因tHMG(GenBank登录号：XP_503558.1)。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以SCP2-ERG20-F和SCP2-ERG20-R为引物，扩增法尼基焦磷酸合酶编码基因ERG20(GenBank登录号：YALI0E05753g)。
启动子PTEFin的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，终止子Txpr2t核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示。
(二)重组质粒的构建
重组质粒的结构见表1和图2-7；构建重组质粒所用引物见表2。
1、重组质粒pUC-HUH-IntC-tHMG的构建
重组质粒pUC-HUH-IntC-tHMG是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowialipolytica Po1fΔku70中IntC位点处上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了tHMG表达盒(PTEFin-tHMG-Txpr2t)，乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因表达盒(URA)也在上下游同源臂之间，具体结构见图2。在本发明中，表达盒的表示方法如下：启动子-目的基因-终止子，例如tHMG表达盒(PTEFin-tHMG-Txpr2t)，启动子为PTEFin，目的基因为tHMG，终止子为Txpr2t。
以IntC-TEFin-F和IntC-TEFin-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增tHMG表达盒启动子PTEFin。以IntC-xpr2t-F和IntC-xpr2t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增tHMG表达盒终止子Txpr2t。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以IntC-tHMG-F和IntC-tHMG-R为引物，扩增两端分别带有启动子PTEFin和终止子Txpr2t同源臂的tHMG基因。
用TaKaRaMiniBEST DNAFragment Purification Kit(购自上海百赛生物技术股份有限公司)纯化回收各片段。
用NEB公司的限制性内切酶PacI对IntC位点整合质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化IntC位点整合质粒。
将线性化IntC位点整合质粒和本实施例标题1构建的tHMG基因表达盒中的各元件(PTEFin、Txpr2t、两端分别带有启动子PTEFin和终止子Txpr2t同源臂的tHMG基因)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-IntC-tHMG。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRI对重组质粒pUC-HUH-IntC-tHMG进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化重组质粒pUC-HUH-IntC-tHMG。
2、重组质粒pUC-HUH-SCP2-ERG20的构建
重组质粒pUC-HUH-SCP2-ERG20是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中SCP2位点处上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了ERG20表达盒(PTEFin-ERG20-Txpr2t)，乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因表达盒也在上下游同源臂之间，具体结构见图3。
以SCP2-TEFin-F和SCP2-TEFin-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增ERG20表达盒启动子PTEFin。以SCP2-xpr2t-F和SCP2-xpr2t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增ERG20表达盒终止子Txpr2t。
以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，以SCP2-ERG20-F和SCP2-ERG20-R为引物，扩增两端分别带有启动子PTEFin和终止子Txpr2t同源臂的ERG20基因。
用NEB公司的限制性内切酶HindIII对SCP2位点整合质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化SCP2位点整合质粒。
将线性化SCP2位点整合质粒和本实施例标题2构建的ERG20基因表达盒中的各元件(PTEFin、Txpr2t、两端分别带有启动子PTEFin和终止子Txpr2t同源臂的ERG20基因)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-SCP2-ERG20。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRI对重组质粒pUC-HUH-SCP2-ERG20进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化重组质粒pUC-HUH-SCP2-ERG20。
3、重组质粒pUC-HUH-IntA-GGPPS1的构建
重组质粒pUC-HUH-IntA-GGPPS1是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中IntA位点处上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了GGPPS1表达盒(PTEFin-GGPPS1-Txpr2t)，乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因表达盒也在上下游同源臂之间，具体结构见图4。
以IntA-TEFin-F和IntA-TEFin-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增GGPPS1表达盒启动子PTEFin。以IntA-xpr2t-F和IntA-xpr2t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增GGPPS1表达盒终止子Txpr2t。
以质粒pUC57-GGPPS1为模板，以IntA-GGPPS1-F和IntA-GGPPS1-R为引物，扩增两端分别带有启动子PTEFin和终止子Txpr2t同源臂的GGPPS1基因。
用NEB公司的限制性内切酶PacI对IntA位点整合质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化IntA位点整合质粒。
将线性化IntA位点整合质粒和本实施例标题3构建的GGPPS1基因表达盒中的各元件(PTEFin、Txpr2t和两端分别带有启动子PTEFin和终止子Txpr2t同源臂的GGPPS1基因)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-IntA-GGPPS1。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRI对重组质粒pUC-HUH-IntA-GGPPS1进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化重组质粒pUC-HUH-IntA-GGPPS1。
4、重组质粒pUC-HUH-lip1-GGPPS2的构建
重组质粒pUC-HUH-lip1-GGPPS2是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中lip1位点处上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了GGPPS2表达盒(PTEFin-GGPPS2-Txpr2t)，乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因表达盒也在上下游同源臂之间，具体结构见图5。
以lip1-TEFin-F和lip1-TEFin-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增GGPPS2表达盒启动子PTEFin。以lip1-xpr2t-F和lip1-xpr2t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增GGPPS2表达盒终止子Txpr2t。
以质粒pUC57-GGPPS2为模板，以lip1-GGPPS2-F和lip1-GGPPS2-R为引物，扩增两端分别带有启动子PTEFin和终止子Txpr2t同源臂的GGPPS2基因。
用NEB公司的限制性内切酶PacI对lip1位点整合质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化lip1位点整合质粒。
将线性化lip1位点整合质粒和本实施例标题4构建的GGPPS2基因表达盒中的各元件(PTEFin、Txpr2t和两端分别带有启动子PTEFin和终止子Txpr2t同源臂的GGPPS2基因)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-lip1-GGPPS2。
用NEB公司的限制性内切酶BamHI对重组质粒pUC-HUH-lip1-GGPPS2进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化重组质粒pUC-HUH-lip1-GGPPS2。
5、重组质粒pUC-Leu-A08-SsLPPSRIDD的构建
重组质粒pUC-leu-A08-SsLPPSRIDD是以pUC57-leu为骨架，插入了Yarrowialipolytica Po1fΔku70中A08位点处上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了SsLPPSRIDD表达盒(PTEFin-SsLPPS-(GGGGS)3-RIDD-Txpr2t)，3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒在该上下游同源臂之间，具体结构见图6。其中，SsLPPSRIDD表达盒(PTEFin-SsLPPS-(GGGGS)3-RIDD-Txpr2t)中启动子为PTEFin，终止子为Txpr2t，目的基因为SsLPPS-(GGGGS)3-RIDD，SsLPPS-(GGGGS)3-RIDD是由基因SsLPPS与基因(GGGGS)3-RIDD相连形成。
以A08-TEFin-F和A08-TEFin-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增SsLPPSRIDD表达盒启动子PTEFin。以A08-xpr2t-DD-F和A08-xpr2t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增SsLPPSRIDD表达盒终止子Txpr2t。
以质粒pUC57-SsLPPS为模板，以A08-SsLPPS-F和A08-SsLPPS-DD-R为引物，扩增两端分别带有启动子PTEFin和RIDD同源臂的SsLPPS基因。以质粒pUC57-(GGGGS)3-RIDD为模板，以A08-RIDD-F和A08-RIDD-R为引物，扩增两端分别带有SsLPPS和终止子Txpr2t同源臂的(GGGGS)3-RIDD。
用NEB公司的限制性内切酶SnaBI对A08位点整合质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化lip1位点整合质粒。
将线性化A08位点整合质粒和本实施例标题5构建的SsLPPSRIDD表达盒中的各元件(启动子PTEFin、终止子Txpr2t、两端分别带有启动子PTEFin和RIDD同源臂的SsLPPS基因、两端分别带有SsLPPS和终止子Txpr2t同源臂的(GGGGS)3-RIDD)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-leu-A08-SsLPPSRIDD。
用NEB公司的限制性内切酶NotI对重组质粒pUC-leu-A08-SsLPPSRIDD进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化重组质粒pUC-leu-A08-SsLPPSRIDD。
6、重组质粒pUC-HUH-IntE2-SsSCSRIAD的构建
重组质粒pUC-HUH-IntE2-SsSCSRIAD是以pUC57-hisG-ura-hisG为骨架，插入了Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中IntE2位点处上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了SsSCSRIAD表达盒(PTEFin-SsSCS-(GGGGS)3-RIAD-Txpr2t)，乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因表达盒也在上下游同源臂之间，具体结构见图7。其中，SsSCSRIAD表达盒(PTEFin-SsSCS-(GGGGS)3-RIAD-Txpr2t)中启动子为PTEFin，终止子为Txpr2t，目的基因为SsSCS-(GGGGS)3-RIAD，SsSCS-(GGGGS)3-RIAD是由基因SsSCS与基因(GGGGS)3-RIAD相连形成。
以IntE2-TEFin-F和IntE2-TEFin-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增SsSCSRIAD表达盒启动子PTEFin。以IntE2-xpr2t-AD-F和IntE2-xpr2t-R为引物，以Yarrowia lipolytica Po1fΔku70基因组DNA为模板，扩增SsSCSRIAD表达盒终止子Txpr2t。
以质粒pUC57-SsSCS为模板，以IntE2-SsSCS-F和IntE2-SsSCS-AD-R为引物，扩增两端分别带有启动子PTEFin和RIAD同源臂的SsSCS基因。以质粒pUC57-(GGGGS)3-RIAD为模板，以IntE2-RIAD-F和IntE2-RIAD-R为引物，扩增两端分别带有SsSCS和终止子Txpr2t同源臂的(GGGGS)3-RIAD基因。
用NEB公司的限制性内切酶PacI对IntE2位点整合质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化IntE2位点整合质粒。
将线性化IntE2位点整合质粒和本实施例标题6构建的SsSCSRIAD基因表达盒中的各元件(启动子PTEFin、终止子Txpr2t、两端分别带有启动子PTEFin和RIAD同源臂的SsSCS基因、两端分别带有SsSCS和终止子Txpr2t同源臂的(GGGGS)3-RIAD)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pUC-HUH-IntE2-SsSCSRIAD。
用NEB公司的限制性内切酶EcoRI对重组质粒pUC-HUH-IntE2-SsSCSRIAD进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化重组质粒pUC-HUH-IntE2-SsSCSRIAD。
表1各重组质粒中插入序列
表2引物序列
实施例2、重组解脂耶氏酵母菌的构建本实施例中，质粒都是以线性化的形式导入宿主菌。
(一)重组菌1的构建
将重组质粒pUC-leu-A08-SsLPPSRIDD、pUC-HUH-IntE2-SsSCSRIAD、pUC-HUH-IntC-tHMG和pUC-HUH-SCP2-ERG20依次转化至Yarrowia lipolytica Po1fΔku70中，进行同源重组，在A08位点插入SsLPPSRIDD表达盒，IntE2位点插入SsSCSRIAD表达盒，IntC位点插入tHMG表达盒，SCP2位点插入ERG20表达盒，得到重组菌1。
具体方法如下：
①Yarrowia lipolytica Po1fΔku70于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ Yeast Transformation Kit II将pUC-leu-A08-SsLPPSRIDD转化至Yarrowia lipolytica Po1fΔku70感受态细胞中，进行同源重组。
②采用筛选培养基SD-Leu筛选阳性克隆，PCR鉴定。其中，筛选培养基SD-Leu含有：葡萄糖20g/L，YNB(无氨基酵母氮源，购自BBI Life Sciences)6.7g/L，CSM-Leu(完全补充混合物除去亮氨酸，购自MP Biomedicals)0.67g/L，琼脂粉23g/L。
③将步骤②中PCR鉴定正确的阳性克隆于YPD液体培养基中过夜培养后制备感受态细胞。利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ Yeast TransformationKit II将pUC-HUH-IntE2-SsSCSRIAD转化至步骤②中PCR鉴定正确的阳性克隆的感受态细胞中，进行同源重组。
④采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，PCR鉴定。其中筛选培养基SD-Ura含有：葡萄糖20g/L，YNB(无氨基酵母氮源，购自BBI Life Sciences)6.7g/L，CSM-Ura(完全补充混合物除去尿嘧啶，购自MPBiomedicals)0.67g/L，琼脂粉23g/L。
⑤将PCR正确的阳性克隆子涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板(含有：5-氟乳清酸1g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L和琼脂粉23g/L)，放置于30℃培养箱中培养3天。取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板和SD-Ura平板上同时划线，观察菌体的生长情况。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上能生长而SD-Ura平板上能未生长的单菌落PCR鉴定。
⑥将步骤⑤PCR鉴定正确的阳性克隆于YPD液体培养基中过夜培养后制备感受态细胞。利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ Yeast TransformationKit II将pUC-HUH-IntC-tHMG转化至步骤⑤PCR鉴定正确的阳性克隆的感受态细胞中，进行同源重组。
⑦采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，PCR鉴定。将PCR正确的阳性克隆子涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板，放置于30℃培养箱中培养3天。取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板和SD-Ura平板上同时划线，观察菌体的生长情况。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上能生长而SD-Ura平板上能未生长的单菌落PCR鉴定。
⑧将步骤⑦PCR鉴定正确的阳性克隆于YPD液体培养基中过夜培养后制备感受态细胞。利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ Yeast TransformationKit II将pUC-HUH-SCP2-ERG20转化至步骤⑦PCR鉴定正确的阳性克隆的感受态细胞中，进行同源重组，将PCR正确的阳性克隆子命名为重组菌1。
(二)重组菌2的构建
将重组菌1涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，在5-氟乳清酸筛选压力下丢失一个hisG标签和Ura筛选标记，然后导入含有GGPPS1表达盒的重组质粒pUC-HUH-IntA-GGPPS1，进行同源重组，GGPPS1表达盒整合至基因组IntA位点处，得到重组菌2。
具体方法如下：
①将重组菌1涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板，放置于30℃培养箱中培养3天。取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板和SD-Ura平板上同时划线，观察菌体的生长情况。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上能生长而SD-Ura平板上能未生长的单菌落，进行下一步转化。其中筛选培养基SD-Ura。
②将Ura筛选标记丢失的重组菌1于YPD液体培养基中过夜培养后制备感受态细胞，利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ Yeast Transformation KitII将重组质粒pUC-HUH-IntA-GGPPS1转化Ura筛选标记丢失的重组菌1中，进行同源重组，采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，PCR鉴定正确的阳性克隆子命名为重组菌2。
(三)重组菌3的构建
将重组菌1涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，在5-氟乳清酸筛选压力下丢失一个hisG标签和Ura筛选标记。将含有GGPPS2表达盒的重组质粒pUC-HUH-lip1-GGPPS2转化至Ura丢失的重组菌1中进行同源重组，GGPPS2表达盒整合至基因组lip1位点处，得到重组菌3。
具体方法如下：
①将重组菌1涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板，放置于30℃培养箱中培养3天。取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板和SD-Ura平板上同时划线，观察菌体的生长情况。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上能生长而SD-Ura平板上能未生长的单菌落，进行下一步转化。
②将Ura筛选标记丢失的重组菌1于YPD液体培养基中过夜培养后制备感受态细胞，利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ Yeast Transformation KitII将重组质粒pUC-HUH-lip1-GGPPS2转化Ura筛选标记丢失的重组菌1中，进行同源重组，采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，PCR鉴定正确的阳性克隆子命名为重组菌3。
(三)重组菌4的构建
将重组菌2涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板上，在5-氟乳清酸筛选压力下丢失一个hisG标签和Ura筛选标记。将含有GGPPS2表达盒的重组质粒pUC-HUH-lip1-GGPPS2转化至Ura丢失的重组菌2中进行同源重组，GGPPS2表达盒整合至基因组lip1位点处，得到重组菌4。
具体方法如下：
①将重组菌2涂布于含有5-氟乳清酸的YPD平板，放置于30℃培养箱中培养3天。取单菌落在含有5-氟乳清酸的YPD平板和SD-Ura平板上同时划线，观察菌体的生长情况。选择在含有5-氟乳清酸的YPD平板上能生长而SD-Ura平板上能未生长的单菌落，进行下一步转化。
②将Ura筛选标记丢失的重组菌2于YPD液体培养基中过夜培养后制备感受态细胞，利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ Yeast Transformation KitII将重组质粒pUC-HUH-lip1-GGPPS2转化Ura筛选标记丢失的重组菌2中，进行同源重组，采用筛选培养基SD-Ura筛选阳性克隆，PCR鉴定正确的阳性克隆子命名为重组菌4。
以上共构建了4株重组菌，其中，重组菌4被命名为解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)XJ-12株已于2022年5月5日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，分类命名为：解脂耶氏酵母XJ-12或Yarrowia lipolytica XJ-12，保藏编号：CCTCC NO：M 2022556。
实施例3、重组解脂耶氏酵母菌在生产香紫苏醇中的应用(一)工程菌的培养及产物提取
分别采用初始菌解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica Po1fΔku70、实施例2中重组菌1-4生产香紫苏醇。具体方法如下：将各香紫苏醇生产菌株于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖，溶剂为水)中30℃、220rpm条件下培养16h，得到种子液。将种子液以5％的接种量接种于50ml发酵培养基中，同时加入发酵液体积10％的正十二烷，在30℃、220rpm震荡培养5天。发酵结束后，将发酵液转移至50ml离心管，5000rpm离心15min，收集有机相备用。
其中发酵培养基配方为：葡萄糖60g/L，10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨。
(二)香紫苏醇的定性定量分析
配制香紫苏醇标准品(购于上海麦克林生化科技有限公司)的正十二烷溶液。将各香紫苏醇生产菌株发酵后收集的有机相，过有机尼龙滤膜(0.22um)，用GC检测。检测条件为：FID检测器，进样口温度250℃，进样体积1ul，不分流；色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mM)；色谱条件：初始温度为50℃，按照20℃/min的速度上升到200℃，然后5℃/min上升到260℃，最后20℃/min上升到300℃。用香紫苏醇标准品的正十二烷溶液进行定性定量。
图8为重组菌4生产的香紫苏醇的GC检测图。发酵5天后，重组菌8的香紫苏醇产量达到最高，达到919mg/L，即每升发酵液可获得919mg香紫苏醇。
重组菌1、重组菌2、重组菌3的香紫苏醇产量分别为16mg/L、187mg/L、211mg/L。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京工业大学
<120> 一株高产香紫苏醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用
<130> 20220624
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2175
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> SsLPPS
<400> 1
atggacgctt ctcaggcttc tgagaaggac atctccctcg tccagacccc ccacaaggtc 60
gaggttaacg agaagatcga ggagtccatc gagtacgttc agaacctgct gatgacctcc 120
ggagacggcc gaatttccgt ctccccttac gacaccgccg tcatcgctct catcaaggac 180
ctgaagggcc gagacgcccc tcagtttcct tcctgtctcg agtggatcgc ccaccaccag 240
ctggctgacg gttcttgggg tgacgagttt ttctgtattt acgaccgaat cctgaacacc 300
ctggcttgcg tggtcgccct gaagtcttgg aacctccagt ccgacatcat cgagaagggc 360
gtcacctaca tcaaggagaa cgtgcacaag ctgaagggcg ccaacgtgga gcaccgaacc 420
gctggttttg agctggtcgt ccccaccttc atgcagatgg ccaccgacct gggcattcag 480
ggactccctt acgaccaccc cctcatcaag gagatcgccg acaccaagaa gcagcgactg 540
aaggagatcc ccaaggacct cgtctaccag atgcccacca acctgctgta ctccctcgag 600
ggtctcggcg acctggagtg ggagcgactg ctgaagctgc agtccggaaa cggctccttc 660
ctgacctccc cttcctccac cgctgctgtt ctcatgcaca ccaaggacga gaagtgtctg 720
aagtacattg agaacgctct gaagaactgc gacggcggcg ctcctcacac ctaccctgtt 780
gacatcttct cccgactgtg ggccatcgac cgactgcagc gactgggtat ctcccgattc 840
ttccagcacg agattaagta cttcctggac cacatcgagt ccgtctggga ggagaccgga 900
gtcttttctg gccgatacac caagttttcc gacatcgacg acacctccat gggcgtccga 960
ctcctgaaga tgcacggcta cgacgtcgac cccaacgtcc tgaagcactt caagcagcag 1020
gacggcaagt tttcctgcta catcggccag tccgtggagt ccgcttcccc tatgtacaac 1080
ctgtaccgag ccgcccagct ccgattccct ggtgaggagg ttttcgagga ggccaccaag 1140
tttgccttta actttctgca ggagatgctg gtcaaggacc gactgcagga gcgatgggtg 1200
atctccgacc acctctttga cgagatcaag ctgggcctga agatgccctg gtacgccacc 1260
ctgcctcgag ttgaggctgc ttactacctg gaccactacg ccggctccgg tgacgtttgg 1320
atcggtaagt ccttctaccg aatgcccgag atctccaacg acacctacaa ggagctggcc 1380
attctggact tcaaccgatg ccagacccag caccagctgg agtggattca catgcaggag 1440
tggtacgacc gatgctccct gtccgagttc ggcatctcca agcgagagct gctgcgatcc 1500
tacttcctgg ccgctgctac catctttgag cccgagcgaa cccaggagcg actcctgctg 1560
gctaagaccc gaattttgtc caagatgatc acctccttcg tcaacatctc cggcaccacc 1620
ctgtccctgg actacaactt caacggcctg gacgagatca tctcctccgc caacgaggac 1680
cagggcctgg ctggtactct gctggctacc ttccaccagc tgctggacgg tttcgacatc 1740
tacaccctgc accagctcaa gcacgtctgg tcccagtggt tcatgaaggt ccagcagggc 1800
gagggctctg gtggtgagga cgctgttctg ctcgccaaca ccctgaacat ctgcgccggt 1860
ctgaacgagg acgtcctgtc taacaacgag tacaccgccc tgtccaccct caccaacaag 1920
atttgcaacc gactggccca gatccaggac aacaagatcc tccaggtcgt cgacggctcc 1980
atcaaggaca aggagctgga gcaggacatg caggccctcg ttaagctggt cctgcaggag 2040
aacggcggcg ctgttgaccg aaacattcga cacaccttcc tctccgtctt caagaccttc 2100
tactacgacg cctaccacga cgacgagacc accgacctgc acatcttcaa ggtcctgttc 2160
cgacctgtcg tttaa 2175
<210> 2
<211> 1578
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> SsSCS
<400> 2
atggctaaga tgaaggagaa ctttaagcga gaggacgaca agttccccac caccaccacc 60
ctgcgatccg aggacatccc ttccaacctg tgcatcatcg acaccctgca gcgactgggc 120
gtcgaccagt tttttcagta cgagatcaac accatcctcg acaacacctt tcgactgtgg 180
caggagaagc acaaggtcat ctacggcaac gtcaccaccc acgccatggc tttccgactg 240
ctgcgagtca agggctacga ggtctcctcc gaggagctgg ctccttacgg taaccaggag 300
gccgtctccc agcagaccaa cgacctgcct atgatcatcg agctgtaccg agccgccaac 360
gagcgaatct acgaggagga gcgatccctg gagaagattc tggcctggac caccattttc 420
ctcaacaagc aggtccagga caactccatc cccgacaaga agctgcacaa gctggtcgag 480
ttttacctgc gaaactacaa gggcatcacc atccgactcg gtgctcgacg aaacctggag 540
ctgtacgaca tgacctacta ccaggccctg aagtccacca accgattctc caacctgtgt 600
aacgaggact tcctggtctt cgccaagcag gacttcgaca tccacgaggc ccagaaccag 660
aagggactgc agcagctgca gcgatggtac gctgactgcc gactggacac cctgaacttc 720
ggccgagacg tcgtgatcgt tgccaactac ctggcttccc tgattatcgg cgaccacgcc 780
ttcgactacg tccgactggc tttcgccaag acctccgttc tggtcaccat catggacgac 840
ttttttgact gccacggctc ctcccaggag tgtgacaaga tcatcgagct cgtcaaggag 900
tggaaggaga accccgacgc tgagtacggc tccgaggagc tcgagatcct gtttatggcc 960
ctgtacaaca ccgtcaacga gctggccgag cgagctcgag ttgagcaggg tcgatccgtc 1020
aaggagttcc tggtgaagct gtgggtggag atcctgtccg ccttcaagat cgagctggac 1080
acctggtcca acggcaccca gcagtctttt gacgagtaca tctcctcttc ctggctgtcc 1140
aacggctccc gactcaccgg tctgctgacc atgcagttcg tcggcgtcaa gctctccgac 1200
gagatgctca tgtccgagga gtgcaccgac ctggctcgac acgtttgcat ggtcggccga 1260
ctgctgaacg acgtctgctc ttccgagcga gagcgagagg agaacatcgc cggtaagtcc 1320
tactccatcc tcctggccac cgagaaggac ggtcgaaagg tctccgagga cgaggctatc 1380
gccgagatta acgagatggt cgagtaccac tggcgaaagg tcctgcagat cgtctacaag 1440
aaggagtcca tcctgccccg acgatgtaag gacgtctttc tggagatggc caagggcacc 1500
ttctacgcct acggcattaa cgacgagctg acctcccccc agcagtctaa ggaggacatg 1560
aagtccttcg ttttttaa 1578
<210> 3
<211> 894
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> GGPPS1
<400> 3
atggtcgctc agaccttcaa cctggacacc tacctgtccc agcgacagca gcaggttgag 60
gaggctctgt ctgctgctct ggtccctgct taccctgagc gaatctacga ggccatgcga 120
tactccctcc tggctggtgg taagcgactg cgacctatcc tctgcctcgc tgcttgtgag 180
ctggctggtg gctctgttga gcaggctatg cctaccgctt gcgctctgga gatgattcac 240
accatgtctc tgatccacga cgacctcccc gctatggaca acgacgactt tcgacgaggc 300
aagcctacca accacaaggt cttcggcgag gacatcgcca ttctggctgg tgacgctctg 360
ctggcttacg ctttcgagca catcgcctcc cagacccgag gtgttcctcc tcagctggtt 420
ctccaggtca tcgctcgaat cggtcacgct gtcgctgcta ccggtctggt tggtggtcag 480
gttgtcgacc tggagtccga gggtaaggct atctccctgg agaccctcga gtacattcac 540
tcccacaaga ccggcgccct gctggaggct tctgttgttt ctggcggtat cctggccggc 600
gctgacgagg agctgctggc tcgactgtct cactacgctc gagacattgg cctggccttt 660
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caggctgagc ctctcctggc tctggctgac tttattaccc gacgacagca ctaa 894
<210> 4
<211> 996
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> GGPPS2
<400> 4
atgctctcga caggtctgag tctctctcca gtgcattcca acgagggcaa ggatcttcag 60
cgagtggaca ccgaccacat tttctttgag aaggctgttt tggaggctcc ttacgactac 120
attgcctcca tgccttccaa gggtgttcgt gatcagttca tcgacgctct caacgactgg 180
ctgcgggtgc ccgacgtcaa ggtcggtaag atcaaggacg ccgtgcgcgt actgcataat 240
agctctctac ttctggatga cttccaggac aactcgcctc tccgtagagg aaagccctcc 300
acccacaaca tcttcggatc agcccagacg gtcaacaccg ccacttatag tatcataaag 360
gccatcggcc agatcatgga gttttcagct ggagagtctg tccaggaggt catgaactcc 420
atcatgattc tctttcaagg acaggccatg gacctgttct ggacctacaa cggccacgtt 480
ccctctgagg aggagtacta ccgaatgatt gaccagaaaa ctggccaact gttttccatt 540
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aacctggttt ctgctgatta caccaagcag aagggcttct gcgaggatct cgatgagggg 720
aagtggtcgc tggcgctcat tcacatgatc cacaagcaac ggagccatat ggcgttgctt 780
aatgtgcttt caacaggacg aaagcacggt ggtatgaccc tcgagcaaaa acagtttgtg 840
ctggacatta tcgaggaaga aaagtccctc gattatacta ggtctgtgat gatggatctg 900
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<400> 5
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggctct ggtggtggcg gttgtggttc tctgcgagag 60
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<210> 6
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<213> artificial
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<223> (GGGGS)3-RIAD
<400> 6
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<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 7
agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60
cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttcacc ccacatatca 120
aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180
cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240
gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300
aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360
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aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480
acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt ac 522
<210> 8
<211> 519
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 8
gatccaacta cggaacttgt gttgatgtct ttgcccccgg ctccgatatc atctctgcct 60
cttaccagtc cgactctggt actttggtct actccggtac ctccatggcc tgtccccacg 120
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tcgaggctct tattactgag tccaacaccg gtgttcttcc caccaccaac ctcaagggct 240
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ctttgttcat caattccctc tgtgactact cgtcatccct ttatgttcga ctgtcgtatt 480
tcttattttc catacatatg caagtgagat gcccgtgtc 519
Claims (3)
1.一株高产香紫苏醇的重组解脂耶氏酵母菌，是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）XJ-12株，保藏编号为CCTCC NO：M 2022556。
2.权利要求1所述重组菌在生产香紫苏醇中的应用，其特征在于包括采用发酵培养基培养权利要求1所述重组菌，得到发酵产物的步骤。
3.根据权利要求2所述重组菌在生产香紫苏醇中的应用，其特征在于所述发酵培养基含有葡萄糖50-70g/L，蛋白胨15-25g/L，酵母膏8-12g/L，接种后添加10%十二烷对香紫苏醇进行萃取。
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