CN103387944A - 高产香紫苏醇菌株的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过合成生物学手段构建高产香紫苏醇工程菌株的方法及其应用。本发明的菌株构建方法涉及表达植物来源香紫苏醇合成关键酶—焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶和香紫苏醇合酶，以及过表达酵母内源的一个或者多个酶基因的组合，包括甲羟戊酸途径关键酶—羟甲基辅酶A还原酶、异戊烯焦磷酸途径的两酶—法尼基焦磷酸合酶和双牻牛基焦磷酸合酶。该方法能高效生产香紫苏醇，摇瓶发酵水平达到9mg/l，具有工业应用前景。

Description

高产香紫苏醇菌株的构建方法

技术领域

本发明涉及高产香紫苏醇菌株的构建方法。更具体的说，本发明涉及真核微生物生产香紫苏醇的方法。

背景技术

异戊二烯类(isoprenoids)化合物，也称萜烯或萜类化合物，是一类自然界中广泛存在的种类最多的化合物，已有40,000多种不同的萜类化合物从植物、动物及微生物中分离出来(Rohdich et al.，2005，Biochem SocTrans.33：785-791)。这类化合物丰富多样的结构为解决人类健康和社会问题提供了良好的化合物筛选库，并且一些化合物已广泛用于医药、保健食品、香料、农用化学品等(Misawa，2011，Curr Opin Biotechnol.22：627-633)。然而，这类化合物在天然宿主中的产量极少，很大程度上限制了该类化合物的工业生产及应用。目前，解决该困难的有效方法之一，是通过合成生物学及途径工程手段对异源微生物或植物的代谢途径进行重组改造，引入目标产物合成的关键基因，通过途径优化等策略异源合成目标产物。该生物方法具有生产工艺简单、周期短、对环境友好、不依赖于土地及气候因素的优点。目前，已有很多成功的实例，其中最具代表性的当属青蒿素前体青蒿酸(Martin et al.，2003，Nat Biotechnol.21：796-802)、紫杉醇前体紫杉二烯(Ajikumar et al.，2010，Science.330：70-74)和番茄红素(Alper et al.，2005，Nat Biotechnol.23：612-616)。

香紫苏醇(sclareol)又称硬尾醇，是一种半日花烷(labdane)型二萜二叔醇，是植物的次级代谢产物，最初在鼠尾草属唇形香料植物香紫苏(Salvia sclarea)中提取，并由此得名，其最丰富的来源是香紫苏的头状花序及烟草(Nicotiana glutinosa)的叶子。香紫苏醇常用于化妆品和香水的香味材料以及食品的调味材料，并且在医药和农药上具有重要的生物活性。如香紫苏醇具有很强的抗菌活性以及在真菌生长调节和植物生长抑制方面起作用，并且对人类的白血病细胞(Dimas et al.，1999，Leuk Res.23：217-234)、肿瘤细胞株(Mahaira et al.，2011，Eur J Pharmacol.666：173-182)、结肠癌细胞及异种移植物(Dimas et al.，2007，Apoptosis.12：685-694；Mahaira et al.，2011，Eur J Pharmacol.666：173-182)具有细胞毒性。

目前，香紫苏醇的生产大多以植物香紫苏花序及茎叶提油后的香紫苏浸膏为原料，缺点是植物香紫苏的生长周期长，且受限于土地、环境及气候因素的影响，不能完全满足工业化生产的需求。2009年，瑞士日内瓦弗门尼舍有限公司的Schalk克隆出植物香紫苏中香紫苏醇合成的两个关键基因，一是，焦磷酸赖百当烯二醇酯(labdenediol diphosphate，LPP)合酶(SsLPPs，II型萜类合酶)，催化二萜类化合物前体物质GGPP生成LPP；二是，香紫苏醇合酶(SsTps，I型萜类合酶)，催化LPP生成香紫苏醇，在E.coli中过表达两酶，可胞内生成香紫苏醇(WO.Pat.NO.2009101126-A1)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产香紫苏醇基因工程菌株的构建方法，并且利用该菌株大量生产香紫苏醇。相对于从植物中提取，微生物培养法能够有效降低成本，节省消耗在植物培养上的时间及土地。

高产香紫苏醇菌株的构建方法增加宿主香紫苏醇合成的前体物质——双牻牛基焦磷酸(GGPP)，进而使更多的GGPP流向香紫苏醇的合成过程；

所述宿主为酿酒酵母。

所述酿酒酵母工程菌株构建过程如下：

1)将香紫苏醇合成关键酶基因在酿酒酵母中表达；进而使更多的GGPP流向香紫苏醇的合成过程；

关键酶基因为：焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因(LPPs)和香紫苏醇合酶基因(Tps)；

2)将GGPP合成的相关酶基因在酿酒酵母中过表达；进而增加宿主香紫苏醇合成的前体物质；

相关酶基因为：羟甲基辅酶A还原酶基因(HMG1)、法尼基焦磷酸合酶基因(ERG20)和双牻牛基焦磷酸合酶基因(BTS1)中的一个或二个以上酶基因的组合。

所述的基因LPPs和Tps，按照酿酒酵母密码子偏好性进行优化，优化后序列如序列1和2所示，优化后序列于酿酒酵母中单独表达或共表达或融合表达，表达全长或N端截短的蛋白，LPPs蛋白N端截短长度为50-70aa，Tps蛋白N端截短长度为40-60aa。

所述的基因HMG1于酿酒酵母中过表达全长或N端截短的蛋白，N端截短长度为520-540aa；所述的基因ERG20和BTS1于酿酒酵母中单独过表达或共过表达或融合过表达。

关键酶基因在酿酒酵母中表达，关键酶基因为：焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因(LPPs)和香紫苏醇合酶基因(Tps)，基因的拷贝数分别由0增加到10-20个；

相关酶基因在酿酒酵母中过表达，基因的拷贝数由1个增加到10-20个。

将获得的基因工程菌株在YPD培养液中，30℃，200rpm培养48-72h，加入与培养液等体积的正己烷，震荡混匀0.5-1h，离心分层，取上层有机相，旋蒸浓缩后即为含有香紫苏醇的粗品。

所述生产的香紫苏醇，可作为香料的有效成分或龙涎香等香料的前体化合物，用于香水、化妆品、调味原料等领域；可作为抗菌、抗炎症、抗肿瘤等医药品或医药品前体化合物，用于医药卫生等领域。

本发明的菌株构建方法涉及过表达焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因(LPPs)和香紫苏醇合酶基因(Tps)以及过表达羟甲基辅酶A还原酶基因(HMG1)、法尼基焦磷酸合酶基因(ERG20)和双牻牛基焦磷酸合酶基因(BTS1)中的一个或者多个酶基因的组合，如图1。

本发明的菌株构建方法涉及的LPP合酶和香紫苏醇合酶的蛋白序列源自瑞士日内瓦弗门尼舍有限公司的专利(WO.Pa t.NO.2009101126-A1)，针对酿酒酵母密码子偏好性分别重新设计了LPP合酶和香紫苏醇合酶的基因序列，含有与Schalk专利中的基因序列23.92和23.50％的差异，具体序列见序列1和序列2。由TaKaRa公司(中国大连)进行LPP合酶和香紫苏醇合酶的全基因合成。

本发明的菌株构建方法涉及的启动子TPIp、TEF1p和TDH3p，终止子FBA1t和TDH2t以及基因HMG1(accession number：NM_001182434)、BTS1(accession number：NM_001183883)和ERG20(accession number：NM_001181600)，均克隆自酿酒酵母；终止子pYX212t克隆自质粒pYX212(Ingenius，R&D systems，Madison，WI，USA)的多克隆位点下游，序列如序列3。

本发明的菌株构建方法涉及表达植物来源香紫苏醇合成两关键酶—焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶和香紫苏醇合酶以及过表达酵母内源的一个或者多个酶基因的组合，包括甲羟戊酸途径关键酶—羟甲基辅酶A还原酶、异戊烯焦磷酸途径的两酶—法尼基焦磷酸合酶和双牻牛基焦磷酸合酶。该方法能高效生产香紫苏醇，摇瓶发酵水平达到15mg/l，具有工业应用前景。

附图说明

图1为不同基因组合的融合模块构建示意图。

具体实施方式

通过如下实施例对本发明进行进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明。

序列1：LPP合酶基因(LPPs)序列。粗体方框标注的三个核苷酸为N端截短蛋白的第二个密码子。

序列2：香紫苏醇合酶基因(Tps)序列。粗体方框标注的三个核苷酸为N端截短蛋白的第二个密码子。

序列3：启动子TPI p、TEF1p、TDH3p和终止子FBA1t、TDH2t、pYX212t序列。

实施例1

LPP合酶与香紫苏醇合酶的全基因合成

植物香紫苏的LPP合酶与香紫苏醇合酶的蛋白质序列源自瑞士日内瓦弗门尼舍有限公司Schalk撰写的专利(WO.Pat.NO.2009101126-A1)。利用密码子优化网站(http://www.jcat.de/Start.jsp)，对LPP合酶与香紫苏醇合酶的基因按照酿酒酵母密码子偏好性进行核酸序列设计，优设计后的基因序列与Schalk专利中的基因序列不同，分别具有23.92和23.50％的差异，具体序列见序列1和序列2。由TaKaRa公司进行LPP合酶与香紫苏醇合酶的全基因合成，编号分别为CBG747和CBG748。

全基因合成具体过程如下：首先，根据基因序列合成50-100nt单链小片段DNA，通过PCR的方法，把单链小DNA拼接成一条完整的双链DNA片段；其次，将双链DNA与载体pMD19-T(TaKaRa，中国大连)连接，其中，连接反应体系为：双链DNA(插入片段)2μl(约200ng)、质粒DNA(pMD19-T)1μl(约50ng)、连接混合液(ligation solution I)5μl以及超纯水2μl；连接液在16℃保温30min后全量转化感受态细胞JM109；最后，对平板上菌落用M13-47(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)和RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)引物进行菌落PCR，检测所含质粒中插入片段的长度。通过菌落PCR检测，分别对检测正确的CBG747-42和CBG748-67号菌落进行质粒DNA提取，pMD18-F(GCCTCTTCGCTATTACGCCA)和pMD18-R(CACTCATTAGGCACCCCAGG)引物测序验证是否正确插入且没有碱基突变。经测序验证，CBG747-42和CBG748-67号菌落中的重组质粒均正确连入基因序列，分别命名重组质粒为pMD19-T-LPPs和pMD19-T-Tps。

将正确重组质粒的穿刺菌(CBG747-42和CBG748-67号)置于37℃静止过夜，挑取一环于5ml LB(含氨苄青霉素抗性，50μg/ml)摇菌12h，加入400μl80％甘油(V_甘油∶V_水＝4∶1)到1.6ml菌液中，保存于-80℃备用。

实施例2

重组菌株S2生产香紫苏醇

重组菌株S2是共过表达LPP合酶和香紫苏醇合酶及过表达融合FPP合酶和GGPP合酶的菌株，见图1(2)，其构建过程如下。首先，以酿酒酵母基因组或质粒为模板，克隆启动子(TEF1p-1、TDH 3p-6和TPIp-1)、终止子(TDH2t、pYX212t和FBA1t-1)及基因序列(LPPs、Tps、BTS1和ERG20)，详细信息见表1；其次，将克隆的DNA片段进行连接，采用融合PCR的方法(Yuetal.，2004，Fungal genetics and biology.41：973-981)。其中，融合PCR法共分两轮PCR反应，第一轮是按照表2的片段组合，a：1(35ng)、2(450ng)、3(100ng)和6(35ng)；b：3(40ng)、6(140ng)、7(500ng)和8(40ng)；c：15(40ng)、16(140ng)、17(140ng)、18(100ng)和1(40ng)，分别加入到PCR反应体系中，不需加额外的引物和模板，体系中各片段即做引物又做模板，反应条件为：1.95℃ 5min；2.98℃ 10s；3.68℃ 4min；4.重复步骤2和步骤3，14个循环；5.72℃ 10min；第二轮是以第一轮PCR产物为模板，按照表2加入上下游引物，反应条件为：1.95℃ 5min；2.98℃ 10s；3.68℃ 4min；4.重复步骤2和步骤3，34个循环；5.72℃ 10min，分别连接成三个融合模块(表2①、②、⑦)；最后，将各融合模块和EcoR I和Xho I双酶切的线性化质粒pYX212电转化至酿酒酵母感受态细胞，利用酿酒酵母高效重组效率(Shao，Z.，andH.Zhao.2009.Nucleic acids research.37：e16)，各融合模块及线性质粒可在胞内自行重组成质粒。利用营养缺陷平板筛选并测序验证正确连接的质粒，命名为pSclaerol-2，相应的菌株命名为S2。所用引物见表3。

其中，电击感受态制备及转化步骤如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜16h；

2.转接2ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，于30℃剧烈摇动约6h，直到细胞密度达到1×10⁸细胞/ml(OD₆₀₀＝0.8-1.0)；以下3-7步操作均在0-4℃下进行：

3.2000g离心10min收集菌体细胞；

4.20ml冰预冷的无菌水洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

5.20ml冰预冷的1mol/L山梨醇洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

6.0.4ml冰预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞，50μl每管分装；

7.往感受态细胞中加入等摩尔比的各融合模块(表2①、②、⑦)和EcoRI和Xho I双酶切质粒pYX212片段(每片段约200-600ng，总体积≤5ul)，冰浴10min；

8.将细胞与待转化DNA混合物转移到冰预冷的0.2cm间隙的电转杯中，以1.5KV、25uF、200Ω做脉冲转化；

9.迅速加入1ml冰预冷的1mol/L山梨醇于电转杯中，枪头轻轻吹吸混匀，于30℃培养1-3h；

10.将酵母菌涂布在山梨醇选择培养基平板上(山梨醇180g/l，YNB 1.7g/l，NH₄SO₄ 5g/l，葡萄糖20g/l，组氨酸20mg/l，琼脂粉13g/l)，于30℃培养3-6天，直到转化子出现。

表1质粒pSclaerol-2各启动子、终止子和基因的克隆信息

^a启动子：TEF1p-1、TDH3p-6和TPIp-1；终止子：TDH2t、pYX212t和FBA1t-1；基因：LPPs(编码LPP合酶)，Tps(编码香紫苏醇合酶)，BTS1(编码GGPP合酶)和ERG20(编码FPP合酶)。

^b基因组：酿酒酵母基因组。

表2质粒pSclaerol-2融合模块的克隆信息

表3质粒pSclaerol-2构建所用引物序列

重组菌株S2的摇瓶发酵及香紫苏醇的抽提过程如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜48h；

2.转接约1ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，使初始OD600nm＝0.05，于30℃剧烈摇动约48h；

3.等体积正己烷剧烈震荡混匀30-60min，抽提香紫苏醇；

4.1800rpm离心8min，使两相分层；

5.将上层有机相50ml转移至梨形烧瓶中，旋转蒸干，重悬于400μl正己烷中，4℃暂存待测。

对重组菌株S2的香紫苏醇产量的检测方法如下：

1.设置气谱(Agilent 5975)面板上参数：柱温250℃，进样270℃，检测290℃；

2.取4℃暂存样品进样，并采集图谱；

3.根据香紫苏醇标准曲线，计算重组菌株S2的香紫苏醇合成量为2.05±0.46mg/l。

实施例3

重组菌株S3生产香紫苏醇

重组菌株S3是共过表达截短的LPP合酶和截短的香紫苏醇合酶及过表达融合FPP合酶和GGPP合酶的菌株，见图1(3)，其构建过程与菌株S2的构建过程基本相同，不同之处是LPP合酶与香紫苏醇合酶为去掉N端部分序列的截短基因，其中，N端截短的序列长度参考Schalk的专利(WO.Pat.NO.2009101126-A1)，LPP合酶和香紫苏醇合酶分别截短63aa和50aa。

首先，以酿酒酵母基因组或质粒为模板，克隆启动子(TEF1p-1、TDH3p-6和TPIp-4)、终止子(TDH2t、pYX212t和FBA1t-1)及基因序列(tLPPs、tTps、BTS1和ERG20)，详细信息见表4；其次，将克隆的DNA片段进行连接，采用融合PCR的方法(Yu et al.，2004，Fungal genetics and biology.41：973-981)，融合PCR法共分两轮PCR反应，第一轮是按照表5的片段组合，d：4(40ng)、5(400ng)、3(100ng)和9(40ng)；e：3(40ng)、9(140ng)、10(500ng)和8(40ng)；f：15(40ng)、16(140ng)、17(140ng)、18(100ng)和4(40ng)，分别加入到PCR反应体系中，不需加额外的引物和模板，体系中各片段即做引物又做模板，反应条件为：1.95℃ 5min；2.98℃ 10s；3.68℃ 4min；4.重复步骤2和步骤3，14个循环；5.72℃ 10min；第二轮是以第一轮PCR产物为模板，按照表5加入上下游引物，反应条件为：1.95℃ 5min；2.98℃ 10s；3.68℃ 4min；4.重复步骤2和步骤3，34个循环；5.72℃ 10min。分别连接成三个融合模块(表5③、④、⑧)；最后，将各融合模块和EcoRI和Xho I双酶切的线性化质粒pYX212(Ingenius，R&D systems，Madison，WI，USA)电转化至酿酒酵母感受态细胞，利用酿酒酵母高效重组效率(Shao，Z.，and H.Zhao.2009.Nucleic acids research.37：e16)，各融合模块及线性质粒可在胞内自行重组成质粒。利用营养缺陷平板筛选并测序验证正确连接的质粒，命名为pSclaerol-3，相应的菌株命名为S3。所用引物见表6。

其中，电击感受态制备及转化步骤如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜16h；

2.转接2ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，于30℃剧烈摇动约6h，直到细胞密度达到1×10⁸细胞/ml(OD600＝0.8-1.0)；以下3-7步操作均在0-4℃下进行：

3.2000g离心10min收集菌体细胞；

4.20ml冰预冷的无菌水洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

5.20ml冰预冷的1mol/L山梨醇洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

6.0.4ml冰预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞，50μl每管分装；

7.往感受态细胞中加入等摩尔比的各融合模块(表5③、④、⑧)和EcoRI和Xho I双酶切质粒pYX212片段(每片段约200-600ng，总体积≤5ul)，冰浴10min；

8.将细胞与待转化DNA混合物转移到冰预冷的0.2cm间隙的电转杯中，以1.5KV、25uF、200Ω做脉冲转化；

9.迅速加入1ml冰预冷的1mol/L山梨醇于电转杯中，枪头轻轻吹吸混匀，于30℃培养1-3h；

10.将酵母菌涂布在山梨醇选择培养基平板上(山梨醇180g/l，YNB 1.7g/l，NH₄SO₄ 5g/l，葡萄糖20g/l，组氨酸20mg/l，琼脂粉13g/l)，于30℃培养3-6天，直到转化子出现。

表4质粒pSclaerol-3各启动子、终止子和基因的克隆信息

^a启动子：TEF1p-1、TDH3p-6和TPIp-1；终止子：TDH2t、pYX212t和FBA1t-1；基因：tLPPs(编码截短N端63aa的LPP合酶)，tTps(编码截短N端50aa的香紫苏醇合酶)，BTS1(编码GGPP合酶)和ERG20(编码FPP合酶)。

^b基因组：酿酒酵母基因组。

表5质粒pSclaerol-3融合模块的克隆信息

表6质粒pSclaerol-3构建所用引物序列

重组菌株S3的摇瓶发酵及香紫苏醇的抽提过程如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜48h；

2.转接约1ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，使初始OD600nm＝0.05，于30℃剧烈摇动约48h；

3.等体积正己烷剧烈震荡混匀30-60min，抽提香紫苏醇；

4.1800rpm离心8min，使两相分层；

5.将上层有机相50ml转移至梨形烧瓶中，旋转蒸干，重悬于400μl正己烷中，4℃暂存待测。

对重组菌株S3的香紫苏醇产量的检测方法如下：

1.设置气谱(Agilent 5975)面板上参数：柱温250℃，进样270℃，检测290℃；

2.取4℃暂存样品进样，并采集图谱；

3.根据香紫苏醇标准曲线，计算重组菌株S3的香紫苏醇合成量为5.00±0.66mg/l。

实施例4

重组菌株S4生产香紫苏醇

重组菌株S4是过表达融合LPP合酶和香紫苏醇合酶及过表达融合FPP合酶和GGPP合酶的菌株，见图1(4)，其构建过程如下。首先，以酿酒酵母基因组或质粒为模板，克隆启动子(TEF1p-1和TPIp-1)、终止子(pYX212t和FBA1t-1)及基因序列(LPPs、Tps、BTS1和ERG20)，详细信息见表7；其次，将克隆的DNA片段进行连接，采用融合PCR的方法(Yu et al.，2004，Fungalgenetics and biology.41：973-981)，融合PCR法共分两轮PCR反应，第一轮是按照表8的片段组合，g：1(30ng)、11(500ng)、12(500ng)和8(40ng)；c：15(40ng)、16(140ng)、17(140ng)、18(100ng)和1(40ng)，分别加入到PCR反应体系中，不需加额外的引物和模板，体系中各片段即做引物又做模板，反应条件为：1.95℃ 5min；2.98℃ 10s；3.68℃ 4min；4.重复步骤2和步骤3，14个循环；5.72℃ 10min；第二轮是以第一轮PCR产物为模板，按照表2加入上下游引物，反应条件为：1.95℃ 5min；2.98℃ 10s；3.68℃ 4min；4.重复步骤2和步骤3，34个循环；5.72℃ 10min。分别连接成三个融合模块(表8⑤、⑦)；最后，将各融合模块和EcoR I和Xho I双酶切的线性化质粒pYX212(Ingenius，R&D systems，Madison，WI，USA)电转化至酿酒酵母感受态细胞，利用酿酒酵母高效重组效率(Shao，Z.，and H.Zhao.2009.Nucleicacids research.37：e16)，各融合模块及线性质粒可在胞内自行重组成质粒。利用营养缺陷平板筛选并测序验证正确连接的质粒，命名为pSclaerol-4，相应的菌株命名为S4。所用引物见表9。

其中，电击感受态制备及转化步骤如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜16h；

2.转接2ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，于30℃剧烈摇动约6h，直到细胞密度达到1×10⁸细胞/ml(OD600＝0.8-1.0)；以下3-7步操作均在0-4℃下进行：

3.2000g离心10min收集菌体细胞；

4.20ml冰预冷的无菌水洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

5.20ml冰预冷的1mol/L山梨醇洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

6.0.4ml冰预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞，50μl每管分装；

7.往感受态细胞中加入等摩尔比的各融合模块(表8⑤、⑦)和EcoR I和Xho I双酶切质粒pYX212片段(每片段约200-600ng，总体积≤5ul)，冰浴10min；

8.将细胞与待转化DNA混合物转移到冰预冷的0.2cm间隙的电转杯中，以1.5KV、25uF、200Ω做脉冲转化；

9.迅速加入1ml冰预冷的1mol/L山梨醇于电转杯中，枪头轻轻吹吸混匀，于30℃培养1-3h；

10.将酵母菌涂布在山梨醇选择培养基平板上(山梨醇180g/l，YNB 1.7g/l，NH₄SO₄ 5g/l，葡萄糖20g/l，组氨酸20mg/l，琼脂粉13g/l)，于30℃培养3-6天，直到转化子出现。

表7质粒pSclaerol-4各启动子、终止子和基因的克隆信息

^a启动子：TEF1p-1、TDH3p-6和TPIp-1；终止子：TDH2t、pYX212t和FBA1t-1；基因：LPPs(编码LPP合酶)，Tps(编码香紫苏醇合酶)，BTS1(编码GGPP合酶)和ERG20(编码FPP合酶)。

^b基因组：酿酒酵母基因组。

表8质粒pSclaerol-4融合模块的克隆信息

表9质粒pSclaerol-4构建所用引物序列

重组菌株S4的摇瓶发酵及香紫苏醇的抽提过程如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜48h；

2.转接约1ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，使初始OD600nm＝0.05，于30℃剧烈摇动约48h；

3.等体积正己烷剧烈震荡混匀30-60min，抽提香紫苏醇；

4.1800rpm离心8min，使两相分层；

5.将上层有机相50ml转移至梨形烧瓶中，旋转蒸干，重悬于400μl正己烷中，4℃暂存待测。

对重组菌株S4的香紫苏醇产量的检测方法如下：

1.设置气谱(Agilent 5975)面板上参数：柱温250℃，进样270℃，检测290℃；

2.取4℃暂存样品进样，并采集图谱；

3.根据香紫苏醇标准曲线，计算重组菌株S3的香紫苏醇合成量为6.22±0.77mg/l。

实施例5

重组菌株S5生产香紫苏醇

重组菌株S5是过表达融合截短的LPP合酶和截短的香紫苏醇合酶及过表达融合FPP合酶和GGPP合酶的菌株，见图1(5)，其构建过程与菌株S4的构建过程基本相同，不同点是LPP合酶与香紫苏醇合酶为去掉N端部分序列的截短基因，其中，N端截短的序列长度参考Schalk的专利(WO.Pa t.NO.2009101126-A1)，分别截短63aa和50aa。

首先，以酿酒酵母基因组或质粒为模板，克隆启动子(TEF1p-1和TPIp-1)、终止子(pYX212t和FBA1t-1)及基因序列(tLPPs、tTps、BTS1和ERG20)，详细信息见表10；其次，将克隆的DNA片段进行连接，采用融合PCR的方法(Yu et al.，2004，Fungal genetics and biology.41：973-981)，融合PCR法共分两轮PCR反应，第一轮是按照表11的片段组合，h：4(40ng)、13(550ng)、14(530ng)和8(40ng)；f：15(40ng)、16(140ng)、17(140ng)、18(100ng)和4(40ng)，分别加入到PCR反应体系中，不需加额外的引物和模板，体系中各片段即做引物又做模板，反应条件为1.95℃ 5min；2.98℃ 10s；3.68℃ 4min；4.重复步骤2和步骤3，14个循环；5.72℃ 10min；第二轮是以第一轮PCR产物为模板，按照表2加入上下游引物，反应条件为：1.95℃ 5min；2.98℃ 10s；3.68℃4min；4.重复步骤2和步骤3，34个循环；5.72℃ 10min。分别连接成三个融合模块(表11⑥、⑧)；最后，将各融合模块和EcoR I和Xho I双酶切的线性化质粒pYX212(Ingenius，R&D systems，Madison，WI，USA)电转化至酿酒酵母感受态细胞，利用酿酒酵母高效重组效率(Shao，Z.，andH.Zhao.2009.Nucleic acids research.37：e16)，各融合模块及线性质粒可在胞内自行重组成质粒。利用营养缺陷平板筛选并测序验证正确连接的质粒，命名为pSclaero1-5，相应的菌株命名为S5。所用引物见表12。

其中，电击感受态制备及转化步骤如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜16h；

2.转接2ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，于30℃剧烈摇动约6h，直到细胞密度达到1×10⁸细胞/ml(OD₆₀₀＝0.8-1.0)；以下3-7步操作均在0-4℃下进行：

3.2000g离心10min收集菌体细胞；

4.20ml冰预冷的无菌水洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

5.20ml冰预冷的1mol/L山梨醇洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

6.0.4ml冰预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞，50μl每管分装；

7.往感受态细胞中加入等摩尔比的各融合模块(表11⑥、⑧)和EcoR I和Xho I双酶切质粒pYX212片段(每片段约200-600ng，总体积≤5ul)，冰浴10min；

8.将细胞与待转化DNA混合物转移到冰预冷的0.2cm间隙的电转杯中，以1.5KV、25uF、200Ω做脉冲转化；

9.迅速加入1ml冰预冷的1mol/L山梨醇于电转杯中，枪头轻轻吹吸混匀，于30℃培养1-3h；

10.将酵母菌涂布在山梨醇选择培养基平板上(山梨醇180g/l，YNB 1.7g/l，NH₄SO₄ 5g/l，葡萄糖20g/l，组氨酸20mg/l，琼脂粉13g/l)，于30℃培养3-6天，直到转化子出现。

表10质粒pSclaerol-5各启动子、终止子和基因的克隆信息

^a启动子：TEF1p-1、TDH3p-6和TPIp-1；终止子：TDH2t、pYX212t和FBA1t-1；基因：tLPPs(编码截短N端63aa的LPP合酶)，tTps(编码截短N端50aa的香紫苏醇合酶)，BTS1(编码GGPP合酶)和ERG20(编码FPP合酶)。

^b基因组：酿酒酵母基因组。

表11质粒pSclaerl-5融合模块的克隆信息

表12质粒pSclaerol-5构建所用引物序列

重组菌株S5的摇瓶发酵及香紫苏醇的抽提过程如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜48h；

2.转接约1ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，使初始OD600nm＝0.05，于30℃剧烈摇动约48h；

3.等体积正己烷剧烈震荡混匀30-60min，抽提香紫苏醇；

4.1800rpm离心8min，使两相分层；

5.将上层有机相50ml转移至梨形烧瓶中，旋转蒸干，重悬于400μl正己烷中，4℃暂存待测。

对重组菌株S5的香紫苏醇产量的检测方法如下：

1.设置气谱(Agilent 5975)面板上参数：柱温250℃，进样270℃，检测290℃；

2.取4℃暂存样品进样，并采集图谱；

3.根据香紫苏醇标准曲线，计算重组菌株S5的香紫苏醇合成量为0.81±0.15mg/l。

实施例6

重组菌株S6生产香紫苏醇

重组菌株S6是过表达融合LPP合酶和香紫苏醇合酶、过表达融合FPP合酶和GGPP合酶及过表达截短HMGR的菌株，即为重组质粒p424-tHMG1转入重组菌株S4得到的双质粒菌株。

S6的构建过程如下：首先，以酿酒酵母基因组为模板，用引物

P424：tHMG1-F(CAGAACTTAGTTTCGACGGATTCTAGAACTAGTAAAAATGGCTGCAGACCAATTGGTG)和

p424：HMG1-R(GTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATTAGGATTTAATGCAGGTGAC)克隆tHMG1基因序列；其次，以克隆的PCR产物为引物，采用RF克隆的方法(vanden Ent et al.，2006.Journal of biochemical and biophysical methods.67：67-74)将该PCR产物连接到空载体p424(Mumberg，D.，R.Muller，andM.Funk.1995.Gene.156：119-122)上，其中，p424上的色氨酸标签(TRP1)替换成组氨酸标签(HIS3)，RF克隆反应条件如下：95℃5min；98℃45s；67℃ 30s，每循环降1℃；68℃ 9min；重复步骤2到步骤4，14个循环；95℃ 45s；55℃ 30s；68℃ 9min；重复步骤6到步骤8，15个循环；68℃ 15min；Dpn I过夜消化，消化产物转化E.coli感受态，氨苄青霉素抗性平板筛选正确转化子，所得正确质粒命名为p424-tHMG1，将质粒转化至菌株S4中，得到双质粒重组菌株S6。

其中，电击感受态制备及转化步骤如下：

1.挑取酵母菌株S4单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜16h；

2.转接2ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，于30℃剧烈摇动约6h，直到细胞密度达到1×10⁸细胞/ml(OD₆₀₀＝0.8-1.0)；以下3-7步操作均在0-4℃下进行：

3.2000g离心10min收集菌体细胞；

4.20ml冰预冷的无菌水洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

5.20ml冰预冷的1mol/L山梨醇洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

6.0.4ml冰预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞，50μl每管分装；

7.往感受态细胞中加入质粒p424-tHMG1(200-600ng，总体积≤5ul)，冰浴10min；

8.将细胞与待转化DNA混合物转移到冰预冷的0.2cm间隙的电转杯中，以1.5KV、25uF、200Ω做脉冲转化；

9.迅速加入1ml冰预冷的1mol/L山梨醇于电转杯中，枪头轻轻吹吸混匀，于30℃培养1-3h；

10.将酵母菌涂布在山梨醇选择培养基平板上(山梨醇180g/l，YNB 1.7g/l，NH₄SO₄ 5g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉13g/l)，于30℃培养3-6天，直到转化子出现。

重组菌株S6的摇瓶发酵及香紫苏醇的抽提过程如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜48h；

2.转接约1ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，使初始OD600nm＝0.05，于30℃剧烈摇动约48h；

3.等体积正己烷剧烈震荡混匀30-60min，抽提香紫苏醇；

4.1800rpm离心8min，使两相分层；

5.将上层有机相50ml转移至梨形烧瓶中，旋转蒸干，重悬于400μl正己烷中，4℃暂存待测。

对重组菌株S6的香紫苏醇产量的检测方法如下：

1.设置气谱(Agilent 5975)面板上参数：柱温250℃，进样270℃，检测290℃；

2.取4℃暂存样品进样，并采集图谱；

3.根据香紫苏醇标准曲线，计算重组菌株S6的香紫苏醇合成量为8.96±0.96mg/l。

对比例1

重组菌株S1生产香紫苏醇

重组菌株S1是过表达融合FPP合酶和GGPP合酶的菌株，见图1(1)，其构建过程如下。首先，以酿酒酵母基因组或质粒为模板，克隆启动子(TEF1p-1、TDH3p-6和TPIp-1)、终止子(TDH2t、pYX212t和FBA1t-1)及基因序列(LPPs和Tps)，详细信息见表13；其次，将克隆的DNA片段进行连接，采用融合PCR的方法(Yu et al.，2004，Fungal genetics and biology.41：973-981)，融合PCR法共分两轮PCR反应，第一轮是按照表14的片段组合，a：1(35ng)、2(450ng)、3(100ng)和6(35ng)；b：3(40ng)、6(140ng)、7(500ng)和8(40ng)；i：19(30ng)、20(140ng)和1(30ng)，分别加入到PCR反应体系中，不需加额外的引物和模板，体系中各片段即做引物又做模板，反应条件为1.95℃ 5min；2.98℃ 10s；3.68℃ 4min；4.重复步骤2和步骤3，14个循环；5.72℃ 10min；第二轮是以第一轮PCR产物为模板，按照表14加入上下游引物，反应条件为：1.95℃ 5min；2.98℃ 10s；3.68℃ 4min；4.重复步骤2和步骤3，34个循环；5.72℃ 10min。分别连接成三个融合模块(表14①、②、⑨)；最后，将各融合模块和EcoR I和Xho I双酶切的线性化质粒pYX212(Ingenius，R&D systems，Madison，WI，USA)电转化至酿酒酵母感受态细胞，利用酿酒酵母高效重组效率(Shao，Z.，and H.Zhao.2009.Nucleicacids research.37：e16)，各融合模块及线性质粒可在胞内自行重组成质粒。利用营养缺陷平板筛选并测序验证正确连接的质粒，命名为pSclaerol-1，相应的菌株命名为S1。所用引物见表15。

其中，电击感受态制备及转化步骤如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜16h；

2.转接2ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，于30℃剧烈摇动约6h，直到细胞密度达到1×10⁸细胞/ml(OD₆₀₀＝0.8-1.0)；

以下3-7步操作均在0-4℃下进行：

3.2000g离心10min收集菌体细胞；

4.20ml冰预冷的无菌水洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

5.20ml冰预冷的1mol/L山梨醇洗涤菌体细胞2次，2000g离心10min收集菌体细胞；

6.0.4ml冰预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞，50μl每管分装；

7.往感受态细胞中加入等摩尔比的各融合模块(表14①、②、⑨)和EcoRI和Xho I双酶切质粒pYX212片段(每片段约200-600ng，总体积≤5ul)，冰浴10min；

8.将细胞与待转化DNA混合物转移到冰预冷的0.2cm间隙的电转杯中，以1.5KV、25uF、200Ω做脉冲转化；

9.迅速加入1ml冰预冷的1mol/L山梨醇于电转杯中，枪头轻轻吹吸混匀，于30℃培养1-3h；

10.将酵母菌涂布在山梨醇选择培养基平板上(山梨醇180g/l，YNB 1.7g/l，NH₄SO₄ 5g/l，葡萄糖20g/l，组氨酸20mg/l，琼脂粉13g/l)，于30℃培养3-6天，直到转化子出现。

表13质粒pSclaerol-1各启动子、终止子和基因的克隆信息

^a启动子：TEF1p-1、TDH3p-6和TPIp-1；终止子：TDH2t、pYX212t和FBA1t-1；基因：LPPs(编码LPP合酶)，Tps(编码香紫苏醇合酶)。

^b基因组：酿酒酵母基因组。

表14质粒pSclaerol-1融合模块的克隆信息

表15质粒pSclaerol-1构建所用引物序列

重组菌株S1的摇瓶发酵及香紫苏醇的抽提过程如下：

1.挑取酵母菌株单菌落接种于5ml YPD培养基中，30℃剧烈摇动培养过夜48h；

2.转接约1ml过夜培养物于100ml的YPD培养基中，使初始OD600nm＝0.05，于30℃剧烈摇动约48h；

3.等体积正己烷剧烈震荡混匀30-60min，抽提香紫苏醇；

4.1800rpm离心8min，使两相分层；

5.将上层有机相50ml转移至梨形烧瓶中，旋转蒸干，重悬于400μl正己烷中，4℃暂存待测。

对重组菌株S1的香紫苏醇产量的检测方法如下：

1.设置气谱(Agilent 5975)面板上参数：柱温250℃，进样270℃，检测290℃；

2.取4℃暂存样品进样，并采集图谱；

3.根据香紫苏醇标准出峰时间，可见重组菌株S1没有香紫苏醇的合成，说明仅表达植物来源的香紫苏醇合成相关基因(LPP合酶和香紫苏醇合酶)，不能在酵母中生成香紫苏醇。

1       ATGACTTCTG TTAACTTGTC TAGAGCTCCA GCTGCTATCA CTAGAAGAAG ATTGCAATTG

61      CAACCAGAAT TCCATGCTGA ATGTTCTTGG TTGAAGTCTT CTTCTAAGCA TGCTCCATTG

121     ACTTTGTCTT GTCAAATCAG ACCAAAGCAA TTGTCTCAAA TCGCTGAATT GAGAGTTACT

181     TCTTTGGAC

TCTCAAGC TTCTGAAAAG GACATCTCTT TGGTTCAAAC TCCACATAAG

241     GTTGAAGTTA ACGAAAAGAT CGAAGAATCT ATCGAATACG TTCAAAACTT GTTGATGACT

301     TCTGGTGACG GTAGAATCTC TGTTTCTCCA TACGACACTG CTGTTATCGC TTTGATCAAG

361     GACTTGAAGG GTAGAGACGC TCCACAATTC CCATCTTGTT TGGAATGGAT CGCTCATCAT

421     CAATTGGCTG ACGGTTCTTG GGGTGACGAA TTCTTCTGTA TCTACGACAG AATCTTGAAC

481     ACTTTGGCTT GTGTTGTTGC TTTGAAGTCT TGGAACTTGC ATTCTGACAT CATCGAAAAG

541     GGTGTTACTT ACATCAAGGA AAACGTTCAT AAGTTGAAGG GTGCTAACGT TGAACATAGA

601     ACTGCTGGTT TCGAATTGGT TGTTCCAACT TTCATGCAAA TGGCTACTGA CTTGGGTATC

661     CAAGACTTGC CATACGACCA TCCATTGATC AAGGAAATCG CTGACACTAA GCAACAAAGA

721     TTGAAGGAAA TCCCAAAGGA CTTGGTTTAC CAAATGCCAA CTAACTTGTT GTACTCTTTG

781     GAAGGTTTGG GTGACTTGGA ATGGGAAAGA TTGTTGAAGT TGCAATCTGG TAACGGTTCT

841     TTCTTGACTT CTCCATCTTC TACTGCTGCT GTTTTGATGC ATACTAAGGA CGAAAAGTGT

901     TTGAAGTACA TCGAAAACGC TTTGAAGAAC TGTGACGGTG GTGCTCCACA TACTTACCCA

961     GTTGACATCT TCTCTAGATT GTGGGCTATC GACAGATTGC AAAGATTGGG TATCTCTAGA

1021    TTCTTCCAAC ATGAAATCAA GTACTTCTTG GACCATATCG AATCTGTTTG GGAAGAAACT

1081    GGTGTTTTCT CTGGTAGATA CACTAAGTTC TCTGACATCG ACGACACTTC TATGGGTGTT

1141    AGATTGTTGA AGATGCATGG TTACGACGTT GACCCAAACG TTTTGAAGCA TTTCAAGCAA

1201    CAAGACGGTA AGTTCTCTTG TTACATCGGT CAATCTGTTG AATCTGCTTC TCCAATGTAC

1261    AACTTGTACA GAGCTGCTCA ATTGAGATTC CCAGGTGAAG AAGTTTTGGA AGAAGCTACT

1321    AAGTTCGCTT TCAACTTCTT GCAAGAAATG TTGGTTAAGG ACAGATTGCA AGAAAGATGG

1381    GTTATCTCTG ACCATTTGTT CGACGAAATC AAGTTGGGTT TGAAGATGCC ATGGTACGCT

1441    ACTTTGCCAA GAGTTGAAGC TGCTTACTAC TTGGACCATT ACGCTGGTTC TGGTGACGTT

1501    TGGATCGGTA AGTCTTTCTA CAGAATGCCA GAAATCTCTA ACGACACTTA CAAGGAATTG

1561    GCTATCTTGG ACTTCAACAG ATGTCAAACT CAACATCAAT TGGAATGGAT CCATATGCAA

1621    GAATGGTACG ACAGATGTTC TTTGTCTGAA TTCGGTATCT CTAAGAGAGA ATTGTTGAGA

1681    TCTTACTTCT TGGCTGCTGC TACTATCTTC GAACCAGAAA GAACTCAAGA AAGATTGTTG

1741    TGGGCTAAGA CTAGAATCTT GTCTAAGATG ATCACTTCTT TCGTTAACAT CTCTGGTACT

1801    ACTTTGTCTT TGGACTACAA CTTCAACGGT TTGGACGAAA TCATCTCTTC TGCTAACGAA

1861    GACCAAGGTT TGGCTGGTAC TTTGTTGGCT ACTTTCCATC AATTGTTGGA CGGTTTCGAC

1921    ATCTACACTT TGCATCAATT GAAGCATGTT TGGTCTCAAT GGTTCATGAA GGTTCAACAA

1981    GGTGAAGGTT CTGGTGGTGA AGACGCTGTT TTGTTGGCTA ACACTTTGAA CATCTGTGCT

2041    GGTTTGAACG AAGACGTTTT GTCTAACAAC GAATACACTG CTTTGTCTAC TTTGACTAAC

2101    AAGATCTGTA ACAGATTGGC TCAAATCCAA GACAACAAGA TCTTGCAAGT TGTTGACGGT

2161    TCTATCAAGG ACAAGGAATT GGAACAAGAC ATGCAAGCTT TGGTTAAGTT GGTTTTGCAA

2221    GAAAACGGTG GTGCTGTTGA CAGAAACATC AGACATACTT TCTTGTCTGT TTCTAAGACT

2281    TTCTACTACG ACGCTTACCA TGACGACGAA ACTACTGACT TGCATATCTT CAAGGTTTTG

2341    TTCAGACCAG TTGTTTGA

序列1

1       ATGTCTTTGG CTTTCAACGT TGGTGTTACT CCATTCTCTG GTCAAAGAGT TGGTTCTAGA

61      AAGGAAAAGT TCCCAGTTCA AGGTTTCCCA GTTACTACTC CAAACAGATC TAGATTGATC

121     GTTAACTGTT CTTTGACTAC TATCGACTTC

GCTAAGA  TGAAGGAAAA  CTTCAAGAGA

181     GAAGACGACA AGTTCCCAAC TACTACTACT TTGAGATCTG AAGACATCCC ATCTAACTTG

241     TGTATCATCG ACACTTTGCA AAGATTGGGT GTTGACCAAT TCTTCCAATA CGAAATCAAC

301     ACTATCTTGG ACAACACTTT CAGATTGTGG CAAGAAAAGC ATAAGGTTAT CTACGGTAAC

361     GTTACTACTC ATGCTATGGC TTTCAGATTG TTGAGAGTTA AGGGTTACGA AGTTTCTTCT

421     GAAGAATTGG CTCCATACGG TAACCAAGAA GCTGTTTCTC AACAAACTAA CGACTTGCCA

481     ATGATCATCG AATTGTACAG AGCTGCTAAC GAAAGAATCT ACGAAGAAGA AAGATCTTTG

541     GAAAAGATCT TGGCTTGGAC TACTATCTTC TTGAACAAGC AAGTTCAAGA CAACTCTATC

601     CCAGACAAGA AGTTGCATAA GTTGGTTGAA TTCTACTTGA GAAACTACAA GGGTATCACT

661     ATCAGATTGG GTGCTAGAAG AAACTTGGAA TTGTACGACA TGACTTACTA CCAAGCTTTG

721     AAGTCTACTA ACAGATTCTC TAACTTGTGT AACGAAGACT TCTTGGTTTT CGCTAAGCAA

781     GACTTCGACA TCCATGAAGC TCAAAACCAA AAGGGTTTGC AACAATTGCA AAGATGGTAC

841     GCTGACTGTA GATTGGACAC TTTGAACTTC GGTAGAGACG TTGTTATCAT CGCTAACTAC

901     TTGGCTTCTT TGATCATCGG TGACCATGCT TTCGACTACG TTAGATTGGC TTTCGCTAAG

961     ACTTCTGTTT TGGTTACTAT CATGGACGAC TTCTTCGACT GTCATGGTTC TTCTCAAGAA

1021    TGTGACAAGA TCATCGAATT GGTTAAGGAA TGGAAGGAAA ACCCAGACGC TGAATACGGT

1081    TCTGAAGAAT TGGAAATCTT GTTCATGGCT TTGTACAACA CTGTTAACGA ATTGGCTGAA

1141    AGAGCTAGAG TTGAACAAGG TAGATCTGTT AAGGAATTCT TGGTTAAGTT GTGGGTTGAA

1201    ATCTTGTCTG CTTTCAAGAT CGAATTGGAC ACTTGGTCTA ACGGTACTCA ACAATCTTTC

1261    GACGAATACA TCTCTTCTTC TTGGTTGTCT AACGGTTCTA GATTGACTGG TTTGTTGACT

1321    ATGCAATTCG TTGGTGTTAA GTTGTCTGAC GAAATGTTGA TGTCTGAAGA ATGTACTGAC

1381    TTGGCTAGAC ATGTTTGTAT GGTTGGTAGA TTGTTGAACG ACGTTTGTTC TTCTGAAAGA

1441    GAAAGAGAAG AAAACATCGC TGGTAAGTCT TACTCTATCT TGTTGGCTAC TGAAAAGGAC

1501    GGTAGAAAGG TTTCTGAAGA CGAAGCTATC GCTGAAATCA ACGAAATGGT TGAATACCAT

1561    TGGAGAAAGG TTTTGCAAAT CGTTTACAAG AAGGAATCTA TCTTGCCAAG AAGATGTAAG

1621    GACGTTTTCT TGGAAATGGC TAAGGGTACT TTCTACGCTT ACGGTATCAA CGACGAATTG

1681    ACTTCTCCAC AACAATCTAA GGAAGACATG AAGTCTTTCG TTTTCTGA

序列2

TPIp启动子序列(915bp)

1      GATCTACGTA TGGTCATTCT TCTTCAGATT CCCTCATGGA GAAGTGCGGC AGATGTATAT

61     GACAGAGTCG CCAGTTTCCA AGAGACTTTA TTCAGGCACT TCCATGATAG GCAAGAGAGA

121    AGACCCAGAG ATGTTGTTGT CCTAGTTACA CATGGTATTT ATTCCAGAGT ATTCCTGATG

181    AAATGGTTTA GATGGACATA CGAAGAGTTT GAATCGTTTA CCAATGTTCC TAACGGGAGC

241    GTAATGGTGA TGGAACTGGA CGAATCCATC AATAGATACG TCCTGAGGAC CGTGCTACCC

301    AAATGGACTG ATTGTGAGGG AGACCTAACT ACATAGTGTT TAAAGATTAC GGATATTTAA

361    CTTACTTAGA ATAATGCCAT TTTTTTGAGT TATAATAATC CTACGTTAGT GTGAGCGGGA

421    TTTAAACTGT GAGGACCTTA ATACATTCAG ACACTTCTGC GGTATCACCC TACTTATTCC

481    CTTCGAGATT ATATCTAGGA ACCCATCAGG TTGGTGGAAG ATTACCCGTT CTAAGACTTT

541    TCAGCTTCCT CTATTGATGT TACACCTGGA CACCCCTTTT CTGGCATCCA GTTTTTAATC

601    TTCAGTGGCA TGTGAGATTC TCCGAAATTA ATTAAAGCAA TCACACAATT CTCTCGGATA

661    CCACCTCGGT TGAAACTGAC AGGTGGTTTG TTACGCATGC TAATGCAAAG GAGCCTATAT

721    ACCTTTGGCT CGGCTGCTGT AACAGGGAAT ATAAAGGGCA GCATAATTTA GGAGTTTAGT

781    GAACTTGCAA CATTTACTAT TTTCCCTTCT TACGTAAATA TTTTTCTTTT TAATTCTAAA

841    TCAATCTTTT TCAATTTTTT GTTTGTATTC TTTTCTTGCT TAAATCTATA ACTACAAAAA

901    ACACATACAT AAACT

TEF1p启动子序列(409bp)

1      ATAGCTTCAA AATGTTTCTA CTCCTTTTTT ACTCTTCCAG ATTTTCTCGG ACTCCGCGCA

61     TCGCCGTACC ACTTCAAAAC ACCCAAGCAC AGCATACTAA ATTTCCCCTC TTTCTTCCTC

121    TAGGGTGTCG TTAATTACCC GTACTAAAGG TTTGGAAAAG AAAAAAGAGA CCGCCTCGTT

181    TCTTTTTCTT CGTCGAAAAA GGCAATAAAA ATTTTTATCA CGTTTCTTTT TCTTGAAAAT

241    TTTTTTTTTT GATTTTTTTC TCTTTCGATG ACCTCCCATT GATATTTAAG TTAATAAACG

301    GTCTTCAATT TCTCAAGTTT CAGTTTCATT TTTCTTGTTC TATTACAACT TTTTTTACTT

361    CTTGCTCATT AGAAAGAAAG CATAGCAATC TAATCTAAGT TTTAATTAC

TDH3p启动子序列(668bp)

1      TCGAGTTTAT CATTATCAAT ACTGCCATTT CAAAGAATAC GTAAATAATT AATAGTAGTG

61     ATTTTCCTAA CTTTATTTAG TCAAAAAATT AGCCTTTTAA TTCTGCTGTA ACCCGTACAT

121    GCCCAAAATA GGGGGCGGGT TACACAGAAT ATATAACATC GTAGGTGTCT GGGTGAACAG

181    TTTATTCCTG GCATCCACTA AATATAATGG AGCCCGCTTT TTAAGCTGGC ATCCAGAAAA

241    AAAAAGAATC CCAGCACCAA AATATTGTTT TCTTCACCAA CCATCAGTTC ATAGGTCCAT

301    TCTCTTAGCG CAACTACAGA GAACAGGGGC ACAAACAGGC AAAAAACGGG CACAACCTCA

361    ATGGAGTGAT GCAACCTGCC TGGAGTAAAT GATGACACAA GGCAATTGAC CCACGCATGT

421    ATCTATCTCA TTTTCTTACA CCTTCTATTA CCTTCTGCTC TCTCTGATTT GGAAAAAGCT

481    GAAAAAAAAG GTTGAAACCA GTTCCCTGAA ATTATTCCCC TACTTGACTA ATAAGTATAT

541    AAAGACGGTA GGTATTGATT GTAATTCTGT AAATCTATTT CTTAAACTTC TTAAATTCTA

601    CTTTTATAGT TAGTCTTTTT TTTAGTTTTA AAACACCAAG AACTTAGTTT CGACGGATCT

661    AGAACAAA

FBA1t终止子序列(401bp)

1      GTTAATTCAA ATTAATTGAT ATAGTTTTTT AATGAGTATT GAATCTGTTT AGAAATAATG

61     GAATATTATT TTTATTTATT TATTTATATT ATTGGTCGGC TCTTTTCTTC TGAAGGTCAA

121    TGACAAAATG ATATGAAGGA AATAATGATT TCTAAAATTT TACAACGTAA GATATTTTTA

181    CAAAAGCCTA GCTCATCTTT TGTCATGCAC TATTTTACTC ACGCTTGAAA TTAACGGCCA

241    GTCCACTGCG GAGTCATTTC AAAGTCATCC TAATCGATCT ATCGTTTTTG ATAGCTCATT

301    TTGGAGTTCG CGATTGTCTT CTGTTATTCA CAACTGTTTT AATTTTTATT TCATTCTGGA

361    ACTCTTCGAG TTCTTTGTAA AGTCTTTCAT AGTAGCTTAC T

TDH2t终止子序列(422bp)

1      GCTTTTCGAG CCAGTCGCGT GAATTTAACT CCTTAAGTTA CTTTAATGAT TTAGTTTTTA

61     TTATTAATAA TTCATGCTCA TGACATCTCA TATACACGTT TATAAAACTT AAATAGATTG

121    AAAATGTATT AAAGATTCCT CAGGGATTCG ATTTTTTTGG AAGTTTTTGT TTTTTTTTCC

181    TTGAGATGCT GTAGTATTTG GGAACAATTA TACAATCGAA AGATATATGC TTACATTCGA

241    CCGTTTTAGC CGTGATCATT ATCCTATAGT AACATAACCT GAAGCATAAC TGACACTACT

301    ATCATCAATA CTTGTCACAT GAGAACTCTG TGAATAATTA GGCCACTGAA ATTTGATGCC

361    TGAAGGACCG GCATCACGGA TTTTCGATAA AGCACTTAGT ATCACACTAA TTGGCTTTTC

421    GC

pYX212t终止子序列(560bp)

1      TAGGGCCCAC AAGCTTACGC GTCGACCCGG GTATCCGTAT GATGTGCCTG ACTACGCATG

61     ATATCTCGAG CTCAGCTAGC TAACTGAATA AGGAACAATG AACGTTTTTC CTTTCTCTTG

121    TTCCTAGTAT TAATGACTGA CCGATACATC CCTTTTTTTT TTGTCTTTGT CTAGCTCCAA

181    TTCGCCCTAT AGTGAGTCGT ATTACAATTC ACTGGCCGTC GTTTTACAAC GTCGTGACTG

241    GGAAAACCCT GGCGTTACCC AACTTAATCG CCTTGCAGCA CATCCCCCTT TCGCCAGCTG

301    GCGTAATAGC GAAGAGGCCC GCACCGATCG CCCTTCCCAA CAGTTGCGCA GCCTGAATGG

361    CGAATGGACG CGCCCTGTAG CGGCGCATTA AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT TACGCGCAGC

421    GTGACCGCTA CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCGCTTTCTT CCCTTCCTTT

481    CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGGCTCCC TTTAGGGTTC

541    CGATTTAGTG GTTTACGGCA

序列3

Claims (7)

1.高产香紫苏醇菌株的构建方法，其特征在于：增加宿主香紫苏醇合成的前体物质——双牻牛基焦磷酸(GGPP)，进而使更多的GGPP流向香紫苏醇的合成过程；

所述宿主为酿酒酵母。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于：

所述酿酒酵母工程菌株构建过程如下：

1)将香紫苏醇合成关键酶基因在酿酒酵母中表达；进而使更多的GGPP流向香紫苏醇的合成过程；

关键酶基因为：焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因(LPPs)和香紫苏醇合酶基因(Tps)；

2)将GGPP合成的相关酶基因在酿酒酵母中过表达；进而增加宿主香紫苏醇合成的前体物质；

相关酶基因为：羟甲基辅酶A还原酶基因(HMG1)、法尼基焦磷酸合酶基因(ERG20)和双牻牛基焦磷酸合酶基因(BTS1)中的一个或二个以上酶基因的组合。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于：

所述的基因LPPs和Tps，按照酿酒酵母密码子偏好性进行优化，优化后序列如序列1和2所示，优化后序列于酿酒酵母中单独表达或共表达或融合表达，表达全长或N端截短的蛋白，LPPs蛋白N端截短长度为50-70aa，Tps蛋白N端截短长度为40-60aa。

4.根据权利要求2的方法，其特征在于：

所述的基因HMG1于酿酒酵母中过表达全长或N端截短的蛋白，N端截短长度为520-540aa；所述的基因ERG20和BTS1于酿酒酵母中单独过表达或共过表达或融合过表达。

5.根据权利要求2的方法，其特征在于：

关键酶基因在酿酒酵母中表达，关键酶基因为：焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因(LPPs)和香紫苏醇合酶基因(Tps)，基因的拷贝数分别由0增加到10-20个；

相关酶基因在酿酒酵母中过表达，基因的拷贝数由1个增加到10-20个。

6.根据权利要求2的方法，其特征在于：将获得的基因工程菌株在YPD培养液中，30℃，200rpm培养48-72h，加入与培养液等体积的正己烷，震荡混匀0.5-1h，离心分层，取上层有机相，旋蒸浓缩后即为含有香紫苏醇的粗品。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于：所述生产的香紫苏醇，可作为香料的有效成分或龙涎香等香料的前体化合物，用于香水、化妆品、调味原料等领域；可作为抗菌、抗炎症、抗肿瘤等医药品或医药品前体化合物，用于医药卫生等领域。

Images