CN103509726B - 一种酿酒酵母工程菌生产β-香树脂醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酿酒酵母工程菌生产β-香树脂醇的方法，属于生物化工领域。本发明从白色念珠菌中克隆2,3-氧化鲨烯单氧酶基因，化学合成经密码子优化的光果甘草β-香树脂醇合酶基因，利用酿酒酵母组成型启动子构建基因表达盒，与双酶切后的质粒共同转化酿酒酵母，通过酿酒酵母的同源重组功能实现基因表达盒与质粒的组装，从而强化了2,3-氧化鲨烯单氧酶并导入了β-香树脂醇合酶。本发明的酿酒酵母工程菌代谢葡萄糖直接合成β-香树脂醇，β-香树脂醇的合成与酿酒酵母生长耦合，实现了植物次生代谢产物β-香树脂醇的酿酒酵母人工合成，该方法不需要效应剂诱导、工艺简单，可用于发酵生产β-香树脂醇。
Description
技术领域
本发明涉及一种酿酒酵母工程菌的构建及发酵生产β-香树脂醇的方法，属于生物化工领域。
背景技术
萜类是一类具有特殊价值的植物次生代谢产物，在抵御感染、紫外辐射、干旱等生物和非生物胁迫方面具有重要功能，许多萜类物质显示出抵御人类疾病的药物活性。甘草酸是中国传统药用植物甘草的最重要萜类化合物，具有抗感染、抗炎、抗溃疡、抗病毒和防治肿瘤等多方面的作用。β-香树脂醇是甘草酸生物合成的重要前体物，不仅具有与甘草酸相似的生物功能，还在抗高血压和降血脂等方面具有特殊作用。但由于β-香树脂醇在甘草中的积累量很少，直接提取工艺复杂、能耗高、且生产周期长，而复杂的分子结构使其化学合成也难以实现。利用微生物发酵方法生产β-香树脂醇生长周期短、过程可控，能够缓解对甘草资源的依赖，具有可观的经济效益和绿色环保的社会效益。
β-香树脂醇经萜类共同合成途径的中间产物鲨烯，通过2,3-氧化鲨烯单氧酶和β-香树脂醇合酶催化形成。由于2,3-氧化鲨烯单氧酶在微生物细胞内的比活力很低，且其催化产物2,3-氧化鲨烯具有多个分支代谢，被认为是植物三萜生物合成途径中的关键限速酶之一。另外，在微生物中还未发现β-香树脂醇合酶，因此，异源表达β-香树脂醇合酶是实现微生物合成β-香树脂醇的必要条件。
在微生物体系中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由于自身次生代谢途径有限，因而对外源途径的竞争或干扰较少，且酿酒酵母的代谢途径与基因组信息清楚，认为是合成植物次生代谢产物的优秀潜在宿主。通过强化2,3-氧化鲨烯单氧酶的表达和引入β-香树脂醇合酶实现酿酒酵母生产植物天然产物β-香树脂醇，将为植物天然产物的微生物高效合成提供技术支持。
发明内容
本发明的目的是为解决β-香树脂醇在甘草中积累量低和化学法难以合成的局限，提供一种利用酿酒酵母工程菌生产β-香树脂醇的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种酿酒酵母工程菌的构建，从白色念珠菌CGMCC2.2086(Candida albicans)中克隆2,3-氧化鲨烯单氧酶SQE基因片段(Genbank注册序列号为U69674)，化学合成光果甘草(Glycyrrhiza glabra)中的β-香树脂醇合酶bAS基因片段(Genbank注册序列号为AB037203)，然后利用从酿酒酵母INVSc1中克隆的组成型启动子PTYS1、PFBA1和终止子TTYS1、TFBA1通过重叠延伸PCR构建2,3-氧化鲨烯单氧酶基因表达盒PTYS1-SQE-TTYS1和β-香树脂醇合酶基因表达盒PFBA1-bAS-TFBA1，与Sal I和BamH I双酶切后的pRS41H质粒共同转入酿酒酵母INVSc1中，通过酿酒酵母自身的同源重组实现两个基因表达盒和质粒的连接，以质粒形式存在。
本发明构建的酿酒酵母工程菌是INVSc1/pRS41H-(PTYS1-SQE-PTYS1)-(PFBA1-bAS-TFBA1)，其中启动子PTYS1和终止子TTYS1分别来源于细胞质酪氨酰-tRNA合酶基因5’上游的253个碱基序列和3’下游的400个碱基序列，组成型启动子PFBA1和终止子TFBA1分别来源于果糖-二磷酸醛缩酶基因5’上游的630个碱基序列和3’下游的295个碱基序列。
本发明的酿酒酵母工程菌在其中强化表达了2,3-氧化鲨烯单氧酶和导入了β-香树脂醇合酶，能够发酵生产β-香树脂醇，实现了β-香树脂醇的酿酒酵母合成。
本发明的酿酒酵母工程菌，具有以下优点：
1、本发明构建的酿酒酵母工程菌，通过酿酒酵母自身的同源重组功能实现基因表达盒和质粒的连接，与传统的限制性酶切、连接组装方法相比，不需要酶切和连接反应，基因操作容易，基因组装过程高效。
2、2,3-氧化鲨烯单氧酶和β-香树脂醇合酶分别受组成型启动子PTYS1和PFBA1控制，β-香树脂醇的合成与酿酒酵母生长耦合，不需要效应剂的诱导，简化了发酵工艺，降低了成本。
3、本发明的酿酒酵母工程菌代谢葡萄糖直接合成β-香树脂醇，实现了植物次生代谢产物β-香树脂醇的酿酒酵母人工合成，最高生产浓度达25.5mg/L。
附图说明
图1是本发明实验例中酿酒酵母工程菌发酵生产β-香树脂醇的组分分析总离子色谱图；
图2是本发明实验例中酿酒酵母工程菌发酵生产的β-香树脂醇的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：酿酒酵母基因工程菌的构建
1、从白色念珠菌CGMCC2.2086中克隆出2,3-氧化鲨烯单氧酶SQE基因片段，与Genbank公布的白色念珠菌2,3-氧化鲨烯单氧酶基因序列(Genbank注册序列号为U69674)作BLAST比对，同源性分析显示，克隆的SQE基因片段与Genbank基因库公布的白色念珠菌2,3-氧化鲨烯单氧酶基因的同源性为100％(如SEQ ID No.1所示)。
引物序列为：
引物1：5’>GATTAGCATCCATAACCGCATACTCTAATTGACGATAACATGAGTTCAGTTAAGTATGA<3’(如SEQ ID No.2所示)，下划线序列为与启动子PTYS1重叠序列。
引物2：5’>GCCAAGTAGGCAATTATTTAGTACTGTCAGTATTGTTATCTATCTTACAATCTCGTTCC<3’(如SEQ ID No.3所示)，下划线序列为与终止子TTYS1重叠序列。
2、从Genbank基因库中查询获得光果甘草β-香树脂醇合酶bAS基因片段(Genbank注册序列号为AB037203)，利用酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，化学合成后扩增获得bAS基因片段(如SEQ ID No.4所示)。
引物序列为：
引物3：5’>TTGTCATATATAACCATAACCAAGTAATACATATTCAAAATGTGGAGATTGAAGATCGC<3’(如SEQ ID No.5所示)，下划线序列为与启动子PFBA1重叠序列。
引物4：5’>ATACTCATTAAAAAACTATATCAATTAATTTGAATTAACTTAAGTCAAACAAACTGGAG<3’(如SEQ ID No.6所示)，下划线序列为与终止子TFBA1重叠序列。
3、从酿酒酵母INVSc1中克隆组成型启动子和终止子基因片段
从酿酒酵母INVSc1中克隆组成型启动子PTYS1基因片段(如SEQ ID No.7所示)。
引物序列为：
引物5：5’>CCAATTGCAAAGGGAAAAGCTGAATGGGCAGTTCGAATACCTTGCGCTTACTCG AATAG<3’(如SEQ ID No.8所示)，下划线序列为与质粒pRS41H重叠序列。
引物6：5’>TGCACCAATAATAATAGCATCATACTTAACTGAACTCATGTTATCGTCAATTAGAGTAT<3’(如SEQ ID No.9所示)，下划线序列为与SQE上游基因重叠序列。
从酿酒酵母INVSc1中克隆终止子TTYS1基因片段(如SEQ ID No.10所示)
引物序列为：
引物7：5’>ATCTTTACTCCATATTTATGGAACGAGATTGTAAGATAGGCATAGCTTAATCCGTTTTC<3’(如SEQ ID No.11所示)，下划线序列为与SQE下游基因重叠序列。
引物8：5’>GCCAAGTAGGCAATTATTTAGTACTGTCAGTATTGTTATCAGGATGCTACTATTAAAAT<3’(如SEQ ID No.12所示)，下划线序列为与PFBA1上游基因重叠序列。
从酿酒酵母INVSc1中克隆组成型启动子PFBA1基因片段(如SEQ ID No.13所示)
引物序列为：
引物9：5’>CATTTAACAAAAGCAAACTATTTTAATAGTAGCATCCTGATAACAATACTGACAGTACT<3’(如SEQ ID No.14所示)，下划线序列为与TTYS1下游基因重叠序列。
引物10：5’>TGGGTCCTTCCCTCCTTCCGCTATCTTCAGCCTCCACATTTTGAATATGTATTACTTGG<3’(如SEQ ID No.15所示)，下划线序列为与bAS上游基因重叠序列。
从酿酒酵母INVSc1中克隆终止子TFBA1基因片段(如SEQ ID No.16所示)
引物序列为：
引物11：5’>AGAGTTCCATTGCCATCTACTCCAGTTTGTTTGACTTAAGTTAATTCAAATTAATTGAT<3’(如SEQ ID No.17所示)，下划线序列为与bAS下游基因重叠序列。
引物12：5’>ACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTGCTATCAAAAACGATAGATC<3’(如SEQ ID No.18所示)，下划线序列为与质粒pRS41H重叠序列。
4、通过重叠延伸PCR构建2,3-氧化鲨烯单氧酶基因表达盒PTYS1-SQE-PTYS1和β-香树脂醇合酶基因表达盒PFBA1-bAS-TFBA1，与Sal I和BamH I双酶切后的pRS41H质粒共同电击转入酿酒酵母INVSc1中，通过酿酒酵母自身的同源重组实现两个基因表达盒和质粒的连接，外源基因以质粒形式存在，构建酿酒酵母工程菌，具体过程如下：
利用引物5和引物8，以PTYS1、SQE和PTYS1基因片段为共同模板，通过重叠延伸PCR方法构建2,3-氧化鲨烯单氧酶基因表达盒PTYS1-SQE-PTYS1；
利用引物9和引物12，以PFBA1、bAS、TFBA1基因片段为共同模板，通过重叠延伸PCR方法构建β-香树脂醇合酶基因表达盒PFBA1-bAS-TFBA1；
采用Sal I和BamH I双酶切pRS41H质粒，使其线性化；
将PTYS1-SQE-PTYS1、PFBA1-bAS-TFBA1基因表达盒和线性化的pRS41H质粒混合；
电击转化酿酒酵母INVSc1，由于基因表达盒和线性化质粒之间彼此具有重叠序列，通过酿酒酵母自身的同源重组功能完成基因表达盒和质粒的组装连接，形成质粒pRS41H-(pTYS1-SQE-tTYS1)-(pFBA1-bAS-tFBA1)，获得酿酒酵母转化子。
5、酿酒酵母工程菌的鉴定
将上述电击转化后的酿酒酵母INVSc1涂布在含有潮霉素B抗性筛选平板上，由于pRS41H质粒含有潮霉素B抗性基因，转化成功的工程菌株在潮霉素B抗性平板上生长，菌落PCR筛选获得阳性酿酒酵母工程菌，进一步发酵培养验证。
实施例2：酿酒酵母工程菌发酵生产β-香树脂醇的验证
挑选实施例1筛选出的酿酒酵母工程菌，在含有2％的葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母粉的培养基中30℃摇瓶培养，5天后5000rpm离心5min，沉淀用10mL的20％氢氧化钾溶液(含有50％乙醇)重悬，然后在沸水中煮沸10min，室温冷却后用正己烷萃取2次，萃取液合并后浓缩至1mL，然后在浓缩液中添加100μL嘧啶和50μL N，O-双(三甲基硅基)三氟代乙酰胺，37℃反应2h。利用安装有Agilent色谱柱DB-1(30m*0.25mm*0.25um)的岛津气相色谱-质谱联用仪GCMS-QP2010进行酿酒酵母工程菌发酵生产β-香树脂醇的分析，组分总离子色谱图(图1)中箭头所示的峰为β-香树脂醇质谱图(图2)。结果说明酿酒酵母工程菌中成功强化了2,3-氧化鲨烯单氧酶和导入了β-香树脂醇合酶，能够合成β-香树脂醇。
实施例3：酿酒酵母工程菌在发酵生产β-香树脂醇中的应用
种子液培养：从平板上挑取经实施例1和2筛选到的酿酒酵母工程菌单菌落，接种于含有2％的葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母粉的40mL培养基中，30℃、170rpm振荡培养36h。
发酵试验：按照初始吸光值0.10的接种量转接种子液至盛有100mL发酵培养基(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉，pH7.0)的300mL摇瓶中，30℃、170rpm振荡培养120h，每24h取样一次，测定酿酒酵母细胞中β-香树脂醇的含量，结果显示，酿酒酵母工程菌发酵结束后β-香树脂醇含量达到11.7mg/L。
实施例4：
如实施例3所述的酿酒酵母工程菌在发酵生产β-香树脂醇中的应用，不同之处在于：
发酵试验中发酵培养基中葡萄糖含量为3％，按照初始吸光值0.10的接种量转接种子液至盛有100mL发酵培养基的摇瓶中，30℃、170rpm振荡培养120h至发酵结束后，β-香树脂醇含量达到25.5mg/L。
Claims (3)
1.一种酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，从白色念珠菌CGMCC2.2086中克隆2,3-氧化鲨烯单氧酶SQE基因(Genbank注册序列号为U69674)，对光果甘草中的β-香树脂醇合酶bAS基因(Genbank注册序列号为AB037203)进行密码子优化并化学合成，然后利用酿酒酵母INVSc1的组成型启动子PTYS1、PFBA1和终止子TTYS1、TFBA1分别构建2,3-氧化鲨烯单氧酶基因表达盒PTYS1-SQE-TTYS1和β-香树脂醇合酶基因表达盒PFBA1-bAS-TFBA1，与双酶切后的pRS41H质粒共同转入酿酒酵母INVSc1中，利用酿酒酵母的同源重组功能实现两个基因表达盒和质粒的组装连接。
2.根据权利要求1所述的构建的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述的酿酒酵母工程菌是INVSc1/pRS41H-(PTYS1-SQE-PTYS1)-(PFBA1-bAS-TFBA1)，其中用于基因表达盒构建的组成型启动子和终止子来源于酿酒酵母，启动子PTYS1和终止子TTYS1分别来源于细胞质酪氨酰-tRNA合酶基因5’上游的253个碱基序列和3’下游的400个碱基序列，组成型启动子PFBA1和终止子TFBA1分别来源于果糖-二磷酸醛缩酶基因5’上游的630个碱基序列和3’下游的295个碱基序列。
3.权利要求2所述的酿酒酵母工程菌在发酵生产β-香树脂醇中的应用。
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