CN104846000B - 利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途 - Google Patents
利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104846000B CN104846000B CN201510264006.4A CN201510264006A CN104846000B CN 104846000 B CN104846000 B CN 104846000B CN 201510264006 A CN201510264006 A CN 201510264006A CN 104846000 B CN104846000 B CN 104846000B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gastrodin
- hydroxy
- benzyl alcohol
- coli
- arog
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途，利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌，是所述重组大肠杆菌包括pCDFDuet‑aroG*‑ppsA‑pgm‑galU及pETDuet‑ubiC‑CAR‑Sfp‑ugt73b6FS两种表达载体，所述aroG*基因用SEQ ID No：1所示。本发明通过构建新的对羟基苄醇合成通路，调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，得到高产天麻素苷元对羟基苄醇的大肠杆菌，对羟基苄醇产量达到240mg/L；引入高效UDP葡萄糖基转移酶突变体，将天麻素与对羟基苄醇的生物合成途径有机地结合在一起，显著提高天麻素产量，使天麻素最高产量可达265mg/L。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地涉及一种利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途。
背景技术
天麻是兰科植物天麻(Gastrodia elata B1.)的茎块，为常用名贵中药。植物天麻生于疏林下，林中空地、林缘，灌丛边缘，海拔400-3200米，已被世界自然保护联盟(IUCN)评为易危物种，并被列入《濒危野生动植物物种国际贸易公约》(CITES)的附录Ⅱ中，同时也被列入中国《国家重点保护野生植物名录(第二批)》中，为Ⅱ级保护植物。其根茎入药用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风癫痫抽搐等症。另据研究表明，天麻还具有刺激神经系统、健脑、延缓衰老、增强机体免疫力和预防骨质疏松等作用。天麻的主要药用活性成分是天麻素及其苷元对羟基苄醇等。近年来，以天麻素作为主要原料生产的药剂和食品等产品种类越来越多，其苷元对羟基苄醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，对羟基苄醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。人们对天麻素及其苷元对羟基苄醇的关注程度不断提高。除天麻素和对羟基苄醇外，天麻植物中还含有其它一些化学物质，例如，对羟基苯甲醛。对羟基苯甲醛主要用于医药工业和香料工业的重要中间体，目前工业生产主要有苯酚、对甲酚、对硝基甲苯等原料路线。
天麻素(Gastrodin,GAS)具有以下特征：化学名称为4-(hydroxymethyl)phenylbeta-D-glucopyranoside，分子式为C13H18O7，分子量为286.2778，CAS号为62499-27-8，结构式为对羟基苯甲醛(4-Hydroxybenzaldehyde)具有以下特征：化学名称为p-Hydroxybenzaldehyde，分子式为C7H6O2，分子量为122.12，CAS号为123-08-0，结构式为其苷元对羟基苄醇(4-Hydroxybenzyl alcohol)具有以下特征：化学名称为p-Hydroxybenzyl alcohol，分子式为C7H8O2，分子量为124.14，CAS号为623-05-2，结构式为
目前，天麻素的生产主要是通过化学合成及对天麻植株进行萃取。化学合成法从前体开始需要多步反应,且副产物多、反应专一性差,另外该过程中需要使用毒性较强的溴素、红磷等物质造成了严重的三废问题；植株萃取法存在含量太低,资源浪费、成本高、破坏生态环境等缺陷，比如西藏波密县仿野生种植天麻的天麻素含量在0.41-2.28g/kg，其平均含量为0.88g/kg，而野生天麻的天麻素含量不到其四分之一。除化学合成和植株萃取外，微生物转化及组织培养生产天麻素也是研究热点。
周俊等以对溴代2′,3′,4′,6′-四乙酰-α-D-吡喃葡萄糖及对羟基苯甲醛为原料，成功合成了天麻苷。(周俊，杨雁宾，杨崇仁，天麻的化学研究--天麻苷及其类似物的合成，化学学报，1980，38(2)：162-166)。
戴晓畅等以溴代乙酰糖基化化合物中间体和酚性化合物为底物，探索出了一种无需红磷和溴素合成天麻苷的方法，产率在20％左右。(戴晓畅，彭啸，吴松福，杨万松，毛宇，天麻素及其类似酚性糖甙的化学合成工艺研究，催化学报，2004，13(2)：83-85)。
朱宏莉等在38株霉菌和12株细菌中筛选出一株华根霉(Rhizopus chinensisStaito AS3.1165)，具有将对羟基苯甲醛转化成天麻素的能力。转化过程中发挥主要作用的是糖基化酶和还原酶；底物对羟基苯甲醛的转化率为87.6％，天麻素的得率为11％。(朱宏莉，宋纪蓉，黄建新，张嘉，马震宇，杨明琰，微生物转化法合成天麻素，药学学报，2006，41(11)：1074-1077)。
蔡洁等报道了在人参毛状根中进行天麻素的生物合成，在B5液体培养基中培养22d的人参毛状根，添加1M对羟基苄醇的生物转化，24h合成的天麻素含量占干重的6.65％，对羟基苄醇的转化率达到84.8％。(蔡洁，家宜，华亚男，李楠，人参毛状根生物合成天麻素转化体系的建立，植物资源与环境学报，2005，14(2)：29-31)。
化学合成工艺较为成熟，但是由于重金属催化剂的添加会对环境造成较大破坏；而不需要红磷和溴素的化学合成方法，得率较低；微生物转化效率较低，需要添加外源底物；植物组织培养反应周期长，效价较低。至今还没有天麻素微生物从头合成的相关报道。因此，实现天麻素的微生物体内生物全合成途径具有重要的科研价值及社会效益。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种表达载体。
本发明的第二个目的是提供一种利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌。
本发明的第三个目的是提供上述利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌发酵生产对羟基苄醇的用途。
本发明的第四个目的是提供一种利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌。
本发明的第五个目的是提供一种利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌发酵生产对天麻素的用途。
本发明的第六个目的是提供第二种利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌。
本发明的第七个目的是提供第二种利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌发酵生产天麻素的的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种表达载体pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU，aroG*基因用SEQ ID No：1所示。
利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包括pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU及pETDuet-ubiC-CAR-Sfp两种表达载体，所述aroG*基因用SEQ IDNo：1所示。
上述利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌发酵生产对羟基苄醇的用途。
一种利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包括pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU及pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6两种表达载体，所述aroG*基因用SEQ ID No：1所示。
上述一种利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌发酵生产天麻素的用途。
第二种利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包括pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU及pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS两种表达载体，所述aroG*基因用SEQ ID No：1所示。
上述第二种利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌发酵生产天麻素的用途。
本发明通过构建新的对羟基苄醇合成通路，调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，得到高产天麻素苷元对羟基苄醇的大肠杆菌，对羟基苄醇产量达到240mg/L；进一步引入高效UDP葡萄糖基转移酶突变体，将天麻素与对羟基苄醇的生物合成途径有机地结合在一起，能够显著提高天麻素的产量，从头合成大肠杆菌表达菌株的最高产量可达265mg/L。
附图说明
图1为本发明的在大肠杆菌表达菌株中生物合成对羟基苄醇、天麻素的途径示意图；
图2为重组大肠杆菌的发酵产物以及对羟基苄醇和天麻素标准品的HPLC结果，其中，
1是对羟基苄醇和天麻素的标准品，
2是BL21(DE3)(含空载体)
3是菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp)的发酵产物，
4是菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS)的发酵产物，
5是菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6)的发酵产物，峰Ⅰ为对羟基苄醇峰，峰Ⅱ为天麻素峰。
图3为菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS)发酵产物的HPLC对羟基苄醇峰(峰Ⅰ,图3-1)天麻素峰(峰Ⅱ,图3-2)的MS图谱。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明的发明人在研究中发现，可以通过调控大肠杆菌酪氨酸代谢通路实现对羟基苄醇的高产：
通过导入含有aroG*，ppsA，pgm，galU，ubiC，CAR，Sfp和UGT基因的载体，使这些基因进行过表达；调控从葡萄糖到分支酸的代谢流，来增强对羟基苄醇的合成，构建高产天麻素苷元对羟基苄醇的大肠杆菌表达菌株；然后通过在大肠杆菌表达菌株中表达糖基转移酶UGT73B6，异源合成天麻素，从而实现天麻素在大肠杆菌中的生物全合成，得到一种从头合成大肠杆菌表达菌株。
基于此，一方面，本发明提供了一种利用葡萄糖生产天麻素的大肠杆菌表达菌株，其中，所述大肠杆菌表达菌株含有并能够表达如SEQ ID No：1所示的aroG*基因，以及ppsA，pgm，galU，ubiC，CAR，Sfp和ugt73b6基因，优选地，所述大肠杆菌表达菌株还含有并能够表达ugt73b6FS基因。
本发明中，基因aroG，ppsA为酪氨酸代谢途径的相关基因，分别为3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate(DAHP)合酶基因aroG(GenBank：U00096.3(1,386,720..1,388,261))和磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsA(GenBank：U00096.3(1,784,734..1,787,112))。其中，如SEQ ID No：1所示的aroG*基因由aroG基因进行定点突变获得。进行点突变的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
本发明中，基因CAR为由酪氨酸合成对羟基苄醇过程中的相关基因，可以来自诺卡氏菌属。
基因Sfp为基因CAR的激活蛋白，可以来自枯草芽孢杆菌属。
基因ugt73b6为由对羟基苄醇合成天麻素过程中的相关基因，可以来自红景天植物。
优选地，CAR来自诺卡氏菌属(Nocardia iowensis)的羧酸还原酶基因CAR(GenBank:AY495697.1)；
Sfp来自枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因Sfp(GeneID:3075005)
ugt73b6来自红景天(Rhodiola sachalinensis)的UDP-葡萄糖基转移酶RsUGT73B6(GenBank：AY547304)。
优选的，为了提高CAR基因的表达量，还可以对其进行大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后的CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
优选的，为了提高Sfp基因的表达量，还可以对其进行大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后的Sfp基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
优选的，为了提高ugt73b6的表达量，还可以对其进行大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后的ugt73b6基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
优选的，为了提高ugt73b6的催化效率，还可以对其进行定向进化，进化后的ugt73b6FS基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
本发明中，需要说明的是，所述利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌表达菌株含有并能够表达aroG*，ppsA，pgm，galU，ubiC，CAR，Sfp基因或者含有并能够表达aroG*，ppsA，pgm，galU，ubiC，CAR，Sfp和ugt73b6基因或者含有并能够表达aroG*，ppsA，pgm，galU，ubiC，CAR，Sfp和ugt73b6FS基因，是指大肠杆菌在发酵培养时，上述aroG*，ppsA，pgm，galU，ubiC，CAR，Sfp，ugt73b6，ugt73b6FS等基因能被翻译为相应的蛋白，并使相应蛋白发挥其作用。
本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。
本发明中，对上述导入大肠杆菌中的基因的排列顺序没有特别的限制，只要能够进行有效地表达即可。优选的，见实施例1。
实施例1
大肠杆菌表达载体为pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU，该载体的制备方法优选包括以下步骤：
(a)参照中国专利(专利申请号：201410115011.4.)，毕慧萍，白艳芬等，一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用，以质粒pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA为模板，经PstI和AflII酶切后连入经PstI和AflII酶切的质粒pCDFDuet-1中，得到质粒pCDFDuet-aroG*-ppsA。
(b)以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，以引物pgm-5FPFseI(SEQ ID No：6)/pgm-3RFPAatII(SEQ ID No：7)/galU-5FPBamHI(SEQ ID No：8)/galU-3RPXhoI(SEQ ID No：9)为引物扩增得到pgm和galU片段，pgm片段用FseI/AatII双切连入载体pCDFDuet中，得到大肠杆菌表达载体pCDFDuet-pgm。同时，galU片段用BamHI/XhoI双切连入pCDFDuet载体上，得到载体pCDFDuet-galU。之后用AatII/XhoI双酶切回收片段T7-galU，连入用AatII/XhoI双酶切的载体pCDFDuet-pgm中得到表达载体pCDFDuet-pgm-galU。
(c)以质粒pCDFDuet-pgm-galU为模板，经FseI和XhoI双酶切后连接入经FseI和XhoI双酶切的质粒pCDFDuet-aroG*-ppsA中，得到大肠杆菌表达载体pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU。
实施例2
大肠杆菌表达载体为pETDuet-ubiC-CAR-Sfp，大肠杆菌表达载体pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6，大肠杆菌表达载体pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS基因制备方法优选包括以下步骤：
(a)根据文献报道，设计合适的酶切位点，从上海捷瑞生物工程有限公司优选合成已经密码子优选的CAR-Sfp基因，合成片段经EcoRI和PstI酶切后连入经EcoRI和PstI酶切的质粒pETDuet中，构建得到质粒pETDuet-CAR-Sfp。
(b)以引物ubiC-5FPNdeI(SEQ ID No：10)/ubiC-3RPBglII(SEQ ID No：11)为引物，以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)的基因组DNA为模板进行PCR，扩增得到ubiC的ORF，扩增产物经NdeI和BglII酶切后连入经NdeI和BglII酶切的质粒pETDuet-CAR-Sfp中，构建得到质粒pETDuet-ubiC-CAR-Sfp。
(c)在优选的情况下，根据文献报道，设计合适的酶切位点，从上海捷瑞生物工程有限公司优选合成已经密码子优选的ugt73b6基因，合成片段经NdeI和BamHI酶切后连入经NdeI和BamHI酶切的质粒pET28a中，构建得到质粒pET28a-ugt73b6。用BglII和EcoRI酶切得到t7-ugt73b6片段，连入经BglII和MfeI双切的质粒pETDuet-ubiC-CAR-Sfp中，得到质粒pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6。EcoRI与MfeI为同尾酶。由质粒pET28a-ugt73b6出发进行定向进化得到质粒pET28a-ugt73b6FS，并按照上述方法得到质粒pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS。
在以上载体的制备中使用的引物的序列如表1所示。
将所述载体pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU和pETDuet-ubiC-CAR-Sfp转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp)；
将所述载体pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU和pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6)
将所述载体pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU和pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到第二种利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS)。
利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌和利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌株通过调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，进行对羟基苄醇的高量表达，调控从葡萄糖到UDP-葡萄糖的代谢流，然后表达经过定向进化得到的ugt73b6突变体ugt73b6FS，异源合成天麻素(如图1所示)。
本领域技术人员应该理解的是，大肠杆菌与植物等在表达蛋白质时，都表现有不同程度的密码子偏爱性。将来自植物红景天的糖基转移酶基因进行密码子优化，可以使目标蛋白在大肠杆菌表达系统中更有效地表达。所述密码子优化的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。将密码子优化的植物红景天的糖基转移酶基因进行定向进化，可以使目标蛋白在大肠杆菌表达系统中更有效地工作。所述定向进化的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
本发明中，在上述步骤中，PCR扩增反应的反应体系可以为常规的PCR扩增反应体系，优选为：5×phusion HF缓冲液10μl，2.5mM dNTP 2.5μl，50μM正向引物0.5μl，50μM反向引物0.5μl，模板0.5μl，Phusion DNA聚合酶0.5μl，水35.5μl。
本发明中，在上述步骤中，PCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序，例如可以为：94-95℃预变性4-5分钟；96-98℃变性20-30秒，55-60℃退火30-60秒，72℃延伸30-120秒，28-32个循环；72℃延伸8-10分钟。优选为：95℃预变性5分钟；98℃变性20秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸5分钟。
本发明中，对用于构建大肠杆菌表达菌株的大肠杆菌的种类没有特殊要求，可以为能够表达目的基因的本领域常用的各种大肠杆菌，例如，所述大肠杆菌可以为MG1655或BL21(DE3)。为了使目的基因能够得到更好的表达，所述大肠杆菌优选为BL21(DE3)。
另一方面，本发明提供了如上所述的大肠杆菌表达菌株在生物合成天麻素，和/或在制备含有天麻素的产品中的应用。
其中，BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp)可用于合成对羟基苄醇，
BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6)和BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS)可用于合成对羟基苄醇和天麻素。
再一方面，本发明还提供了一种在大肠杆菌中生物合成天麻素的方法，其中，该方法包括：将如上所述的大肠杆菌表达菌株进行发酵培养，使其生物合成天麻素。
本发明中，所述发酵培养的方法可以包括以下步骤：
(1)将如上所述的构建的大肠杆菌表达菌株接种至含有作为筛选标记用抗生素的LB液体培养基中，并在35-38℃下培养10-16小时，得到大肠杆菌种子液；
(2)将步骤(1)中得到的大肠杆菌种子液接种至含有所述作为筛选标记用抗生素的M9Y液体培养基中，并在35-38℃下培养，当OD600达到0.4-0.6时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28-30℃下诱导培养36-72小时。
M9Y培养基：葡萄糖20g/L，酵母提取物0.25g/L，Na2PO4·7H2O 12.8g/L，KH2PO43.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，MgSO40.49g/L,CaCl20.11g/L。
本领域技术人员应该理解的是，在发酵培养时，LB液体培养基和M9Y液体培养基中加入的抗生素为大肠杆菌表达菌株中含有的表达载体上的作为筛选标记用的抗生素，例如，链霉素和氨苄青霉素；所述抗生素的浓度为本领域的常规选择，例如，所述链霉素的加入量使其终浓度为80-100mg/mL；所述氨苄青霉素的加入量使其终浓度为100-150mg/mL。
另外，所述大肠杆菌种子液的接种量也可以为本领域常规的选择，例如，接种量为1-2体积％，也即，每100ml的M9Y液体培养基中加入1-2ml所述大肠杆菌种子液。
此外，本发明对异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度也没有特别的限制，优选地，其加入量可以使其在M9Y液体培养基中的终浓度为0.5-1.0mM。
根据本发明，能够理解的是，当需要生产对羟基苄醇时，可以对BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp)进行发酵培养；当需要生产对羟基苄醇、天麻素时，可以对BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6)、BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS)进行发酵培养。
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
以下实施例中，大肠菌株BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α均可市售获得，大肠菌株BL21(DE3)用于本发明中所有基因的表达，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆。
大肠杆菌表达载体pET28a，购自Novagen，货号69864。大肠杆菌表达载体pCDFDuet-1，购自Novagen，货号71340。大肠杆菌表达载体pETDuet-1，购自Novagen，货号71146。
Phusion高保真DNA聚合酶购自Thermo公司。
所用引物均由深圳华大基因科技有限公司合成，引物序列见表1，其中下划线部分表示酶切位点。
表1
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。
实施例3
利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌的重构和利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌株的重构
将质粒pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU和pETDuet-ubiC-CAR-Sfp用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)；
将质粒pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU和pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)；
将质粒pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU和pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)；
所述转化方法具体为：取100μl感受态大肠杆菌菌株BL21(DE3)细胞于冰上，10分钟后加入2μl质粒pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU和2μl质粒pETDuet-ubiC-CAR-Sfp或者pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6或者pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入600μl LB液体培养基，37℃，150rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含链霉素和氨苄青霉素的LB平板上。利用链霉素和氨苄青霉素抗性筛选同时携带两种表达载体的转化菌株，并通过提取质粒进行酶切验证，得到对羟基苄醇高产途径的
利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp)，
以及天麻素生物合成途径的利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6))和利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS)。
实施例4
对实施例3获得的三种重组菌株进行培养：
将上述菌株依次分别在2ml加入有100mg/L链霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。
然后将种子液按1体积％的转接量(0.5ml)分别转接入50ml加入有25mg/L链霉素和100mg/L氨苄青霉素的M9Y液体培养基中，37℃培养，当OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃继续培养48个小时。分别得到表达有对羟基苄醇的发酵液1，和表达有对羟基苄醇和天麻素的发酵液2、3。
2为利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS)的发酵液。
3为利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌株BL21(DE3,pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU&pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6)的发酵液。
对比例1
本对比例大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)(含有空载体)的发酵培养
将菌株BL21(DE3)(含有空载体)分别在2ml加入有25mg/L链霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。
然后将种子液按1体积％的转接量(0.5ml)分别转接入50ml加入有25mg/L链霉素和100mg/L氨苄青霉素的M9Y液体培养基中，37℃培养，当OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃继续培养48个小时。得到发酵液D1。
测试例
对羟基苄醇和天麻素的检测
(1)产物的HPLC检测：分别取实施例4中的发酵液1、2、3，对比例1中的发酵液D1，各1ml 12000rpm离心10min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇；流速＝1ml/min；梯度洗脱条件：0–35min 10％体积B；进样量20μL。
发酵液1、发酵液2和发酵液3的结果见图2。箭头1，2，3，4，5分别表示对羟基苄醇和天麻素标准品(1mg对羟基苄醇标品与1mg天麻素标品混溶于1ml甲醇，进样量5μL)、发酵液D1、发酵液1、发酵液2和发酵液3。如图所示，发酵液1、发酵液2和发酵液3中在保留时间13min时均存在一个峰，与对羟基苄醇标准品(峰Ⅰ)的出峰时间一致；发酵液2和发酵液3中除了前述对羟基苄醇峰，在6.8min时均出现了一个新峰，与天麻素标准品(峰Ⅱ)的出峰时间一致。
(2)产物的LC-MS分析：对步骤(1)中各发酵液中看到的新峰进行LC-MS分析，其中，进行LC-MS分析的条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1体积％甲酸)，B＝甲醇；流速＝1ml/min；洗脱条件：0–35min 10％体积B；进样量20μl；ESI正离子源，分子量扫描范围50–800。发酵液2的扫描结果见图3。峰Ⅰ的MS图谱上有对羟基苄醇的MS特征峰107.0466。峰Ⅱ的MS图谱上有天麻素的MS特征峰309.0954。
且经测定，发酵液1中对羟基苄醇的产量为240mg/L，发酵液2中的对羟基苄醇产量为43mg/L，天麻素的产量为265mg/L,发酵液3中的对羟基苄醇产量为99mg/L，天麻素的产量为128mg/L。
本发明的高产对羟基苄醇大肠杆菌中对羟基苄醇产量可达240mg/L，在此基础上进一步实现了天麻素的生物合成，天麻素的产量可达265mg/L。因此，本发明提供了一种高产对羟基苄醇及天麻素的新的生物合成途径，为对羟基苄醇及天麻素的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (7)
1.一种表达载体pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU，其特征是所述aroG*基因用SEQ IDNo：1所示；所述ppsA基因是GenBank：U00096.3(1,784,734..1,787,112)；所述pgm和galU基因来源于大肠杆菌BL21(DE3)。
2.利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌，其特征是所述重组大肠杆菌包括pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU及pETDuet-ubiC-CAR-Sfp两种表达载体，所述aroG*基因用SEQ ID No：1所示；所述ppsA基因是GenBank：U00096.3(1,784,734..1,787,112)；所述pgm和galU基因来源于大肠杆菌BL21(DE3)；所述ubiC基因来源于大肠杆菌BL21(DE3)；CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；Sfp基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
3.权利要求2的利用葡萄糖生产对羟基苄醇的重组大肠杆菌发酵生产对羟基苄醇的用途。
4.利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌，其特征是所述重组大肠杆菌包括pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU及pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6两种表达载体，所述aroG*基因用SEQ ID No：1所示；所述ppsA基因是GenBank：U00096.3(1,784,734..1,787,112)；所述pgm和galU基因来源于大肠杆菌BL21(DE3)；所述ubiC基因来源于大肠杆菌BL21(DE3)；CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；Sfp基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；ugt73b6基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
5.权利要求4的利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌发酵生产天麻素的用途。
6.利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌，其特征是所述重组大肠杆菌包括pCDFDuet-aroG*-ppsA-pgm-galU及pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6FS两种表达载体，所述aroG*基因用SEQ ID No：1所示，所述ppsA基因是GenBank：U00096.3(1,784,734..1,787,112)；所述pgm和galU基因来源于大肠杆菌BL21(DE3)；所述ubiC基因来源于大肠杆菌BL21(DE3)；CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；Sfp基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；ugt73b6FS基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
7.权利要求6的利用葡萄糖生产天麻素的重组大肠杆菌发酵生产天麻素的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510264006.4A CN104846000B (zh) | 2015-05-21 | 2015-05-21 | 利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510264006.4A CN104846000B (zh) | 2015-05-21 | 2015-05-21 | 利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104846000A CN104846000A (zh) | 2015-08-19 |
| CN104846000B true CN104846000B (zh) | 2018-11-06 |
Family
ID=53845988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510264006.4A Active CN104846000B (zh) | 2015-05-21 | 2015-05-21 | 利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104846000B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107435049B (zh) * | 2016-05-26 | 2020-03-31 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用 |
| CN106916855A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-07-04 | 天津科技大学 | 利用二氧化碳生物转化方法对酚类物质进行修饰的方法及应用 |
| CN112011493B (zh) * | 2019-05-29 | 2021-10-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 生产天麻素的重组大肠杆菌、构建方法及应用 |
| CN111763663B (zh) * | 2020-07-09 | 2022-04-15 | 昆明理工大学 | 一种天麻葡糖基转移酶基因及应用 |
| CN112481336B (zh) * | 2020-11-27 | 2022-12-13 | 上海交通大学 | 利用木质纤维素衍生物生物合成化合物的方法 |
| CN112852697B (zh) * | 2021-01-22 | 2023-02-10 | 湖南中医药大学 | 一种重组菌株及制备天麻苷元的方法 |
| CN115058400B (zh) * | 2022-04-19 | 2023-04-25 | 湖北大学 | 来自于玫瑰的糖基转移酶RrUGT3在生物合成天麻素中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104099379A (zh) * | 2013-04-08 | 2014-10-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用 |
-
2015
- 2015-05-21 CN CN201510264006.4A patent/CN104846000B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104099379A (zh) * | 2013-04-08 | 2014-10-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 利用大肠杆菌工程菌廉价高效生产聚羟基丁酸酯;魏国清 等;《生物工程学报》;20101231;第26卷(第9期);1257-1262 * |
| 利用重组大肠杆菌产聚-4-羟基T酸的研究;宋水山;《微生物学通报》;20021231;第29卷(第1期);10-14 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104846000A (zh) | 2015-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104846000B (zh) | 利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途 | |
| Mei et al. | Biocatalysis and biotransformation of resveratrol in microorganisms | |
| CN104774816B (zh) | 催化天麻素合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用 | |
| CN104946575B (zh) | 一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用 | |
| CN104805110B (zh) | 利用葡萄糖生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及重组方法及应用 | |
| CN103898037B (zh) | 一种联产香叶醇和橙花醇的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN107435049A (zh) | 一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用 | |
| CN104774815B (zh) | 催化天麻素或红景天苷合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用 | |
| CN107201331A (zh) | 表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌及构建方法及应用 | |
| CN103898177B (zh) | 制备高手性纯(r)-3-哌啶醇及其衍生物的方法 | |
| CN106520715B (zh) | 一种短链脱氢酶及其基因、重组表达载体、基因工程菌及其在虾青素手性中间体合成中的应用 | |
| CN103509728B (zh) | 生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法 | |
| Zhao et al. | Comparison of different fermentation processes for the vitamin K2 (Menaquinone-7) production by a novel Bacillus velezensis ND strain | |
| Cario et al. | High hydrostatic pressure increases amino acid requirements in the piezo-hyperthermophilic archaeon Thermococcus barophilus | |
| CN109266592A (zh) | 一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法 | |
| Rossi et al. | Growth of the ectomycorrhizal fungus Pisolithus microcarpus in different nutritional conditions | |
| CN104046586B (zh) | 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用 | |
| CN107119001A (zh) | 基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法 | |
| CN108546722A (zh) | 一种利用丹参功能基因从头生物合成迷迭香酸的方法 | |
| CN107365715A (zh) | 一种高产2‑苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌的制备方法及应用 | |
| Sheu et al. | Production of high-purity neofructooligosaccharides by culture of Xanthophyllomyces dendrorhous | |
| CN110117582A (zh) | 融合蛋白、其编码基因及在生物合成上的应用 | |
| CN104480127B (zh) | 超嗜热糖苷酶突变体及其在人参皂苷ck制备中的应用 | |
| CN103898178A (zh) | 酶法制备高手性纯(s)-3-哌啶醇及其衍生物的方法 | |
| CN103409486A (zh) | 一种通过流加次黄嘌呤提高腺苷发酵产量的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |