CN104774816B - 催化天麻素合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用 - Google Patents

催化天麻素合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了催化天麻素合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用，催化天麻素合成的糖基转移酶，是用SEQ ID No：1所示。另一种催化天麻素合成的糖基转移酶，是用SEQ ID No：2所示。本发明的两种催化天麻素合成的糖基转移酶均可以催化对羟基苄醇转化为天麻素，能够显著提高天麻素的产量。

Description

催化天麻素合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及两种催化天麻素合成的糖基转移酶及应用。
背景技术
天麻是兰科植物天麻(Gastrodia elata B1.)的茎块，为常用名贵中药。植物天麻生于疏林下，林中空地、林缘，灌丛边缘，海拔400-3200米，已被世界自然保护联盟(IUCN)评为易危物种，并被列入《濒危野生动植物物种国际贸易公约》(CITES)的附录Ⅱ中，同时也被列入中国《国家重点保护野生植物名录(第二批)》中，为Ⅱ级保护植物。其根茎入药用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风癫痫抽搐等症。另据研究表明，天麻还具有刺激神经系统、健脑、延缓衰老、增强机体免疫力和预防骨质疏松等作用。天麻的主要药用活性成分是天麻素及其苷元对羟基苄醇等。近年来，以天麻素作为主要原料生产的药剂和食品等产品种类越来越多，其苷元对羟基苄醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，对羟基苄醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。人们对天麻素及其苷元对羟基苄醇的关注程度不断提高。除天麻素和对羟基苄醇外，天麻植物中还含有其它一些化学物质，例如，对羟基苯甲醛。对羟基苯甲醛主要用于医药工业和香料工业的重要中间体，目前工业生产主要有苯酚、对甲酚、对硝基甲苯等原料路线。
天麻素(Gastrodin,GAS)具有以下特征：化学名称为4-(hydroxymethyl)phenylbeta-D-glucopyranoside，分子式为C13H18O7，分子量为286.1053，CAS号为62499-27-8，结构式为其苷元对羟基苄醇(4-Hydroxybenzyl alcohol)具有以下特征：化学名称为p-Hydroxybenzyl alcohol，分子式为C7H8O2，分子量为124.0524，CAS号为623-05-2，结构式为
目前，天麻素的生产主要是通过化学合成及对天麻植株进行萃取。化学合成法从前体开始需要多步反应,且副产物多、反应专一性差,另外该过程中需要使用毒性较强的溴素、红磷等物质造成了严重的三废问题；植株萃取法存在含量太低,资源浪费、成本高、破坏生态环境等缺陷，比如西藏波密县仿野生种植天麻的天麻素含量在0.41-2.28g/kg，其平均含量为0.88g/kg，而野生天麻的天麻素含量不到其四分之一。除化学合成和植株萃取外，微生物转化及组织培养生产天麻素也是研究热点。
周俊等以对溴代2′,3′,4′,6′-四乙酰-α-D-吡喃葡萄糖及对羟基苯甲醛为原料，成功合成了天麻苷。(周俊，杨雁宾，杨崇仁，天麻的化学研究Ⅱ-天麻苷及其类似物的合成，化学学报，1980,38(2):162-166)。
戴晓畅等以溴代乙酰糖基化化合物中间体和酚性化合物为底物，探索出了一种无需红磷和溴素合成天麻苷的方法，产率在20％左右。(戴晓畅，彭啸，吴松福，杨万松，毛宇，天麻素及其类似酚性糖甙的化学合成工艺研究，催化学报，2004,13(2):83-85)。
朱宏莉等在38株霉菌和12株细菌中筛选出一株华根霉(Rhizopus chinensisStaito AS3.1165)，具有将对羟基苯甲醛转化成天麻素的能力。转化过程中发挥主要作用的是糖基化酶和还原酶；底物对羟基苯甲醛的转化率为87.6％，天麻素的得率为11％。(朱宏莉，宋纪蓉，黄建新，张嘉，马震宇，杨明琰，微生物转化法合成天麻素，药学学报，2006,41(11):1074-1077)。
蔡洁等报道了在人参毛状根中进行天麻素的生物合成，在B5液体培养基中培养22天的人参毛状根，添加1M对羟基苄醇的生物转化，24h合成的天麻素含量占干重的6.65％，对羟基苄醇的转化率达到84.8％。(蔡洁，家宜，华亚男，李楠，人参毛状根生物合成天麻素转化体系的建立，植物资源与环境学报，2005,14(2)：29-31)。
化学合成工艺较为成熟，但是由于重金属催化剂的添加会对环境造成较大破坏；而不需要红磷和溴素的化学合成方法，得率较低；微生物转化效率较低，需要添加外源底物；植物组织培养反应周期长，效价较低。至今还没有天麻素微生物从头合成的相关报道。因此，实现天麻素的微生物体内生物全合成途径具有重要的科研价值及社会效益。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供催化天麻素合成的糖基转移酶。
本发明的第二个目的是提供编码上述催化天麻素合成的糖基转移酶的基因。
本发明的第三个目的是提供含有上述基因的大肠杆菌。
本发明的第四个目的是提供催化天麻素合成的糖基转移酶的应用。
本发明的第五个目的是提供另一种催化天麻素合成的糖基转移酶。
本发明的第六个目的是提供编码另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的基因。
本发明的第七个目的是提供含有编码另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的基因的大肠杆菌。
本发明的第八个目的是提供另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的应用。
本发明的技术方案概述如下：
催化天麻素合成的糖基转移酶，用SEQ ID No：1所示。
编上述催化天麻素合成的糖基转移酶的基因，用SEQ ID No：3所示。
含有上述基因的大肠杆菌。
催化天麻素合成的糖基转移酶在催化合成天麻素的应用。
另一种催化天麻素合成的糖基转移酶，是用SEQ ID No：2所示。
编码另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的基因，是用SEQ ID No：4所示。
含有编码另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的基因的大肠杆菌。
另一种催化天麻素合成的糖基转移酶在催化合成天麻素的应用。
本发明的两种催化天麻素合成的糖基转移酶均可以催化对羟基苄醇转化为天麻素，能够显著提高天麻素的产量。
附图说明
图1为菌株发酵产物以及对羟基苄醇和天麻素标准品的HPLC检测结果，其中，
1是天麻素标准品，
2是对羟基苄醇标准品，
3是菌株BL21(DE3，pET28a)的发酵产物，
4是菌株BL21(DE3，pET28a-ugt73b6)的发酵产物，
5是菌株BL21(DE3，pET28a-ugt73b6FS)的发酵产物的发酵产物，峰Ⅰ为对羟基苄醇，峰Ⅱ为天麻素，
6是菌株BL21(DE3，pET28a-ugt73b6FS+MK)的发酵产物的发酵产物，峰Ⅰ为对羟基苄醇，峰Ⅱ为天麻素，
图2为菌株BL21(DE3，pET28a-ugt73b6FS)、BL21(DE3，pET28a-ugt73b6FS+MK)发酵产物的对羟基苄醇(峰Ⅰ)天麻素(峰Ⅱ)的MS图谱。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。
以下实施例中，大肠菌株BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α均可市售获得，大肠菌株BL21(DE3)用于本发明中所有基因的表达，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆。
大肠杆菌表达载体pET28a，购自Novagen，货号69864。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。
实施例1
基因ugt73b6FS、ugt73b6FS+MK及大肠杆菌表达载体pET28a-ugt73b6FS、pET28a-ugt73b6FS+MK获得方法：
对ugt73b6(SEQ ID No：5，该序列文献已报道，来源于植物库页红景天Rhodiolasachalinensis)进行error-PCR随机突变，将得到的片段酶切连接到商业化载体pET28a中，之后经定向进化筛选(Richard W.Gantt,Pauline Peltier-Pain,Shanteri Singh,Maoquan Zhou,and Jon S.Thorson,Broadening the scope of glycosyltransferase-catalyzed sugar nucleotide synthesis,PNAS,2013,110(19):7648-7653；GavinJ.Williams,Randal D.Goff,Changsheng Zhang,and Jon S.Thorson,Optimizingglycosyltransferase specificity via‘hot spot’saturation mutagenesis presentsa new catalyst for novobiocin glycorandomization,Chem Biol.2008,15(4):393-409)，获得含突变基因ugt73b6FS的大肠杆菌表达载体pET28a-ugt73b6FS。具体的糖基转移酶ugt73b6第389位苯丙氨酸突变为丝氨酸，得到的催化天麻素合成的糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID No：1，相应的碱基由ttc突变为tcc、其核苷酸序列为SEQ ID No：3(该序列的最后3个核苷酸为终止密码子)。
表达载体pET28a-ugt73b6FS+MK是由pET28a-ugt73b6FS进行定点突变得到，点突变的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。具体的糖基转移酶ugt73b6第264位甲硫氨酸突变为赖氨酸、第389位苯丙氨酸突变为丝氨酸，得到的另一种催化天麻素合成的糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID No：2，相应的碱基由atg突变为aag、由ttc突变为tcc，其核苷酸序列为SEQ ID No：4(该序列的最后3个核苷酸为终止密码子)。
在上述步骤中，errorPCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序，例如可以为：94-95℃预变性4-5分钟；96-98℃变性20-30秒，55-60℃退火30-60秒，72℃延伸30-120秒，28-32个循环；72℃延伸8-10分钟。优选为：95℃预变性5分钟；98℃变性20秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸5分钟。
对用于构建大肠杆菌表达菌株的大肠杆菌的种类没有特殊要求，可以为能够表达目的基因的本领域常用的各种大肠杆菌，例如，大肠杆菌可以为MG1655或BL21(DE3)。为了使目的基因能够得到更好的表达，所述大肠杆菌优选为BL21(DE3)。
实施例2
含有用SEQ ID No：3所示的催化天麻素合成的糖基转移酶的基因的大肠杆菌的构建
将质粒pET28a-ugt73b6FS用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)：
取100μl感受态大肠杆菌菌株BL21(DE3)细胞于冰上，10分钟后加入2μl质粒pET28a-ugt73bFS，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入600μl LB液体培养基，37℃，150rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含卡那霉素的LB平板上。利用卡那霉素抗性筛选携带表达载体的转化菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)，并通过提取质粒进行酶切验证，得到含有用SEQ ID No：2所示的催化天麻素合成的糖基转移酶的基因的大肠杆菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)。
含有用SEQ ID No：4所示的催化天麻素合成的糖基转移酶的基因的大肠杆菌的构建
将质粒pET28a-ugt73b6FS+MK用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)：
取100μl感受态大肠杆菌菌株BL21(DE3)细胞于冰上，10分钟后加入2μl质粒pET28a-ugt73b6FS+MK，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入600μl LB液体培养基，37℃，150rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含卡那霉素的LB平板上。利用卡那霉素抗性筛选携带表达载体的转化菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS+MS)，并通过提取质粒进行酶切验证，得到含有用SEQ ID No：4所示的催化天麻素合成的糖基转移酶的基因的大肠杆菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS+MK)。
实施例3
(1)菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)的发酵培养
将菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)在2mL加入有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。
然后将种子液按1体积％的转接量(0.5ml)转接入50ml加入有50mg/L卡那霉素及2mM对羟基苄醇的M9Y(M9基本培养基+0.025％yeast extract)液体培养基中，37℃培养，当OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，30℃继续培养48个小时。得到表达有天麻素的菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)发酵液。
(2)菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS+MK)的发酵培养
用BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS+MK)替代本实施例中的菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)，其它同本实施例，得到表达有天麻素的菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS+MK)发酵液。
对比例1
大肠杆菌表达菌株BL21(DE3,pET28a)的发酵培养
将质粒pET28a用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到菌株BL21(DE3,pET28a)
将菌株BL21(DE3,pET28a)分别在2ml加入有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。
然后将种子液按1体积％的转接量(0.5ml)分别转接入50mL加入有50mg/L卡那霉素及2mM对羟基苄醇的M9Y液体培养基中，37℃培养，当OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃继续培养48个小时。得到菌株BL21(DE3,pET28a)发酵液。
对比例2
大肠杆菌表达菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6)的发酵培养
将ugt73b6(SEQ ID No：5)连接到商业化载体pET28a中，将质粒pET28a-ugt73b6用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6)
将菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6)分别在2ml加入有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。
然后将种子液按1体积％的转接量(0.5ml)分别转接入50mL加入有50mg/L卡那霉素及2mM对羟基苄醇的M9Y液体培养基中，37℃培养，当OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃继续培养48个小时。得到菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6)发酵液。
测试例
对羟基苄醇和天麻素的检测
(1)产物的HPLC检测：分别取实施例3、对比例1和对比例2获得的发酵液各1ml，12000rpm离心10min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇；流速＝1ml/min；梯度洗脱条件：0–35min 10％体积B；进样量20μL。
标准品及发酵液的HPLC检测结果见图1。其中，
1是天麻素标准品，
2是对羟基苄醇标准品，
3是菌株BL21(DE3,pET28a)发酵液，
4是菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6)发酵液，
5是菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)发酵液，
6是菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS+MK)发酵液。
如图所示，菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6)、BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)和BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS+MK)发酵液中在12min时均存在一个峰，与对羟基苄醇标准品(峰Ⅰ)的出峰时间一致；菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6)、BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)和BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS+MK)的发酵产物除了前述对羟基苄醇峰，在6.5min时均出现了一个新峰，与天麻素标准品(峰Ⅱ)的出峰时间一致。
(2)产物的LC-MS分析：对步骤(1)中各发酵液中看到的6.5min的新峰进行LC-MS分析，其中，进行LC-MS分析的条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1体积％甲酸)，B＝甲醇；流速＝1ml/min；洗脱条件：0–35min 10％体积B；进样量20μL；ESI正离子源，分子量扫描范围50–800。菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)的LC-MS检测结果见图2。峰Ⅰ的MS图谱上有对羟基苄醇的MS特征峰107.0466。峰Ⅱ的MS图谱上有天麻素的MS特征峰309.0954。
且经测定，菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)发酵液中天麻素的产量分别为391mg/L，菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS+MK)发酵液中天麻素的产量分别为418/L，而对比例野生型BL21(DE3,pET28a-ugt73b6)发酵液中天麻素的产量为52mg/L。本发明中的突变体菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS)和BL21(DE3,pET28a-ugt73b6FS+MK)对于对羟基苄醇的转化率分别是野生型菌株BL21(DE3,pET28a-ugt73b6)的7.5倍和8.0倍，为天麻素的微生物异源合成奠定了坚实基础。

Claims (8)

1.催化天麻素合成的糖基转移酶，其特征是用SEQ ID No：1所示。
2.编码权利要求1催化天麻素合成的糖基转移酶的基因，其特征是用SEQ ID No：3所示。
3.含有权利要求2基因的大肠杆菌。
4.权利要求1的催化天麻素合成的糖基转移酶在催化合成天麻素的应用。
5.一种催化天麻素合成的糖基转移酶，其特征是用SEQ ID No：2所示。
6.编码权利要求5催化天麻素合成的糖基转移酶的基因，其特征是用SEQ ID No：4所示。
7.含有权利要求6基因的大肠杆菌。
8.权利要求5的催化天麻素合成的糖基转移酶在催化合成天麻素的应用。
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