CN107201331A - 表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌及构建方法及应用 - Google Patents

表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌及构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌及构建方法及应用，一种表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌，所述大肠杆菌含有并能够表达ARO10、HpaBC和UGT基因。本发明的重组大肠杆菌酪氨酸通路相关基因进行了过表达，能够显著提高羟基酪醇、羟基酪醇‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷和羟基酪醇‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的产量，其中羟基酪醇产量可达401mg/L、羟基酪醇‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的产量可达406mg/L，羟基酪醇‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的产量可达928mg/L，为其大规模工业生产应用奠定了基础。

Description

表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌及构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌及构建方法及应用。
背景技术
羟基酪醇(hydroxytyrosol)，中文别名：3,4-二羟基苯乙基醇。分子式：C8H10O3。结构式：分子量：154.1632。羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(Hydroxytyrosol-3-O-β-D-glycoside)，分子式：C14H20O8，结构式：分子量：316.31。羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷(Hydroxytyrosol-4-O-β-D-glycoside)，分子式：C14H20O8，结构式：分子量：316.31。
羟基酪醇是一种天然的具有脂溶性、水溶性以及生物活性的多酚类化合物，它主要是以酯化物橄榄苦苷的形式存在于橄榄的各个部位，橄榄苦苷经过水解后可得到游离的羟基酪醇。羟基酪醇展现了大量有益的特性，例如癌症化学预防、抗动脉粥样硬化、抑制DNA氧化损伤、保护皮肤光损伤以及抗炎等活性，近年来深受生物和医学界的重视。国外已经相继有羟基酪醇的胶囊、片剂和粉末产品问世。
糖苷是单糖或者低聚糖的半缩醛羟基与另一分子中的羟基、氨基、巯基等经脱水缩合而产生的一类具有广泛生理活性的化合物。糖苷可分为两部分，一部分是糖残基，另一部分是配基(非糖部分)，糖基与配体之间通过糖苷键连接。糖苷广泛分布于植物的根、茎、叶、花和果实中。糖苷的化学结构种类很多，主要有含硫苷、氰醇苷、酚苷类、黄酮苷等。糖基化能够改变小分子化合物的活性、稳定性和溶解性(Kren V,Martinkova L.2001.Glycosides inmedicine:“The role of glycosidic residue in biological activity.”Curr Med Chem8(11):1303–1328.)，许多天然产物的活性成分也都以糖苷的形式存在，如红景天苷、天麻素、豆腐果苷、熊果苷就是从植物中分离得到的具有良好活性的小分子酚糖苷化合物。
在这些发现的影响下，化合物的糖苷化成为研究的热点。2009年，Seeberger等人研究了糖苷化的化学方法，但是这种方法受环境影响较大，而且生产效率低(Seeberger PH,FinneyN,Rabuka D,Bertozzi CR.2009.Chemical and Enzymatic Synthesis of Glycans andGlycoconjugates.)；2006年，Mao等在微生物中通过生物转化的方式进行糖基化反应，但是糖基化菌株产量及产率都普遍较低(Mao Z,Shin HD,Chen RR.2006.Engineering the E.coliUDP-glucose synthesis pathway for oligosaccharide synthesis.Biotechnol Prog 22(2):369–374.)；2015年，Frederik De Bruyn等人通过在重组大肠杆菌中引入蔗糖代谢途径，并在糖基转移酶UvGT2作用下，成功获得没食子酸糖基化产物没食子酸吡喃葡萄糖(Frederik De Bruyn,BrechtDe Paepe,Jo Maertens,Joeri Beaupreze.Development of an In Vivo Glucosylation Platform byCoupling Production to Growth:Production of Phenolic Glucosides by a Glycosyltransferase ofVitis Vinifera.Biotechnology and Bioengineering 112:1594-1603.)，为糖苷化过程提供了一种新思路。
研究发现，橄榄中的各种提取物都具有一定的抑菌特性，通过比较发现低浓度的羟基酪醇就能够对革兰式阴性菌产生明显的抑制作用，这是因为羟基酪醇能够穿透细菌的细胞黏膜，分解细菌黏肽从而引发细菌黏膜受损，而橄榄苦苷的抑菌性要明显弱于羟基酪醇，这可能是因为橄榄苦苷具有的糖苷结构连到羟基酪醇的羟基结构上，从而使其不容易穿透细菌黏膜，显示出较弱的抑菌性。(Bisignano G,Tomaino A,Lo Cascio R,et al.On the in-vitro antimicrobialactivity of oleuropein and hydroxytyrosol[J].J.Pharm.Pharmacol.,1999,51(8):971-974)。
综上所述，羟基酪醇葡萄糖苷化合物大多通过植物提取、化学合成得到，从植物直接提取工艺复杂，成本高；化学法存在需要进行选择性保护、产生有毒污染物，而且往往残留少量或痕量的其它有毒化学品，具有不安全性，而且生产成本仍然较高；生物转化方法产率低，难以大规模生产。目前还没有大肠杆菌利用葡萄糖等简单碳源生产羟基酪醇葡萄糖苷化合物的相关报道，因此，创建大肠杆菌利用简单碳源如葡萄糖生产羟基酪醇葡萄糖苷化合物的方法具有重要的科研价值及社会效益。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用简单碳源如葡萄糖生产羟基酪醇、羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷的表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌。
本发明的第二个目的是提供表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌发酵制备羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的应用。
本发明的技术方案概述如下：
表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌，所述大肠杆菌含有并能够表达ARO10、HpaBC和UGT基因。
UGT基因优选UGT73B6基因或UGT73B6FS基因。
表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
1)用NotI和XhoI双酶切质粒pTrcHisB-PTrcARO10-PTrcHpaBC，得到带有PTrc启动子的基因片段PTrcARO10-PTrcHpaBC，将PTrcARO10-PTrcHpaBC和NotI和XhoI双酶切的pET28a-UGTFS连接并转化至E.coli DH5α，得到质粒pET28a-UGTFS-PTrcARO10-PTrcHpaBC；
2)以SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示序列为上、下游引物，以大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板PCR扩增T7聚合酶基因片段，将T7聚合酶基因片段用EcoRI和PstI双酶切并连接入经过EcoRI和PstI双酶切的表达载体pBb0，得到载体pBb0-T7；
3)以SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示序列为上、下游引物，以pBb0-T7为模板，PCR扩增获得带有PlacUV5启动子的T7聚合酶基因，将XhoI酶切的带有PlacUV5启动子的T7聚合酶基因片段和步骤1)获得的质粒连接并转化至E.coli DH5α，得到质粒pET28a-UGTFS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7；
4)将步骤3)所获得的质粒pET28a-UGTFS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7和质粒pBb3共同转入大肠杆菌，得到一种表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌，命名为BMGHG。
步骤4)所述大肠杆菌优选MG1655、BL21(DE3)或BMGA。
上述表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌发酵制备羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的应用。
所述羟基酪醇葡萄糖苷为羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和/或羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷。
本发明的优点：
大肠杆菌作为最简单的模式生物，其背景清晰，生长快速，易于规模化发酵培养，成本低廉；而且本发明通过构建新的羟基酪醇葡萄糖苷生物合成通路，同时，重组大肠杆菌酪氨酸通路相关基因进行了敲除或者过表达，能够显著提高羟基酪醇、羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷的产量，其中羟基酪醇产量可达401mg/L、羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷的产量可达406mg/L，羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷的产量可达928mg/L，为其大规模工业生产应用奠定了基础。
附图说明
图1为菌株BMGHG利用葡萄糖生产羟基酪醇、羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷的生物合成途径。
图2为菌株BMGHG发酵产物以及羟基酪醇标准品的HPLC检测结果，其中，
1为菌株BMGH发酵产物，峰Ⅲ为羟基酪醇；
2为菌株BMGHG发酵产物，峰Ⅰ为羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷，峰Ⅱ为羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷；
3是羟基酪醇的标准品。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。
以下实施例中，大肠杆菌菌株MG1655、BL21(DE3)和DH5α为市售，大肠杆菌菌株MG1655用于本发明中所有基因的表达，DH5α用于载体构建。
大肠杆菌表达载体pET28a，购自Novagen，货号69864-3。
Phusion高保真DNA聚合酶、限制性内切酶购自Thermo公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。
实施例1
基因UGT73B6或其突变体UGT73B6FS具体获得方式参见中国专利201510160497.8。
pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC构建方法：
NotI和XhoI双酶切质粒pTrcHisB-PTrcARO10-PTrcHpaBC，得到带有PTrc启动子的基因片段PTrcARO10-PTrcHpaBC，和NotI和XhoI双酶切的载体pET28a-UGT73B6FS片段连接并转入至E.coli DH5α，得到中间质粒pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC。
其中，pTrcHisB-PTrcARO10-PTrcHpaBC的构建方法与中国专利201510242626.8中一致(一种大肠杆菌利用简单碳源如葡萄糖生产羟基酪醇的方法及应用)；pET28a-UGT73B6FS的构建方法与文献构建pET28a-UGT73B6的方法一致(Bai Y,Bi H,Zhuang Y,et al.Production ofsalidroside in metabolically engineered Escherichia coli[J].Scientific reports,2014,4：6640-6647.)。
实施例2
质粒pBb0-T7的构建方法：
以大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，以引物T7Pol-5FPEcoRI(SEQ ID No：1)/T7Pol-3RPPstI(SEQ ID No：2)扩增T7聚合酶基因片段，EcoRI和PstI双酶T7聚合酶基因片段和表达载体pBb0，并转入至E.coli DH5α，得到载体pBb0-T7。其中，pBb0的构建方法与文献(Bai Y,Bi H,Zhuang Y,et al.Production of salidroside in metabolically engineeredEscherichia coli[J].Scientific reports,2014,4：6640-6647.)报道一致。
SEQ ID No：1序列：CCGGAATTCATGAACACGATTAACATCGCTAAG
SEQ ID No：2序列：GTTCTGCAGTTACGCGAACGCGAAGTCCGACTC
在上述步骤中，PCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序，例如可以为：94-95℃预变性4-5分钟；96-98℃变性20-30秒，55-60℃退火30-60秒，72℃延伸30-120秒，28-32个循环；72℃延伸8-10分钟。优选为：95℃预变性5分钟；98℃变性20秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸5分钟。
实施例3
质粒pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7的构建方法：
以pBb0-T7为模板，PCR扩增带有PlacUV5启动子的T7聚合酶基因。PCR引物为T7-5FP-XhoI，序列见SEQ ID No：3，和T7-3RP-XhoI，序列见SEQ ID No：4.利用XhoI单酶切带有PlacUV5启动子的T7聚合酶基因和载体pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC，并转入至E.coli DH5α，得到最终表达载体pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7。
SEQ ID No：3序列：CCGCTCGAGTTTACACTTTATGCTTCCG
SEQ ID No：4序列：CCGCTCGAGTTACGCGAACGCGAAGTCC
在上述步骤中，PCR扩增反应的反应程序同实施例2。
实施例4
含有表达载体pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7的大肠杆菌菌株BMGHG(pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7&pBb3)获得方法：
对用于构建大肠杆菌表达菌株的大肠杆菌的种类没有特殊要求，可以为能够表达目的基因的本领域常用的各种大肠杆菌，例如，大肠杆菌可以为MG1655或BL21(DE3)。为了提高羟基酪醇的产量，优选酪氨酸高产菌株BMGA，该菌株构建方法与文献和专利(Bai Y,Bi H,Zhuang Y,et al.Production of salidroside in metabolically engineered Escherichia coli[J].Scientific reports,2014,4：6640-6647；一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用，申请号：201310133238.7)报道一致。
除质粒pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7外，本申请还采用了另一表达质粒pBb3，该质粒含有酪氨酸通路优化相关过表达基因，包括基因tyrA*、aroG*(*代表解除了酪氨酸对其反馈抑制)、ppsA、tktA、aroE、aroD和aroB。pBb3的构建方法与文献Bai Y,Bi H,Zhuang Y,et al.Production of salidroside in metabolically engineered Escherichia coli[J].Scientific reports,2014,4：6640-6647报道一致。
取LB平板培养的BMGHG单克隆置于3mL LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。取1mL过夜培养菌液转接入50mL液体LB培养基，37℃下振荡培养至OD600达到0.4-0.5。从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却30min。细胞在4℃，4000rpm下离心10min，弃清液。用等体积灭菌的冰水重悬细胞。照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。用1/2体积灭菌的冰水重悬细胞。重复上述步骤一次。用灭菌冰水重悬浮细胞至最终体积为1mL。将细胞按100μL等份分装入微量离心管，添加质粒pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7和pBb3各1-2μL，冰上培育约5min。转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电击杯中。电击转化。立即添加1mL的LB至电击杯中。37℃下培养细胞40分钟至1小时以复原。转移细胞至含有卡那霉素及氯霉素的LB平板上培养。利用卡那霉素及氯霉素抗性筛选携带表达载体的转化菌株BMGHG(pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7&pBb3)，并通过提取质粒进行酶切验证。
用UGT73B6基因替代上述各实施例中的UGT73B6FS基因，其它同各实施例，制备的出大肠杆菌菌株BMGHG(pET28a-UGT73B6-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7&pBb3)。
另外，其它的糖基转移酶也有类似的功能。
实施例5
大肠杆菌菌株BMGHG的发酵培养：
将菌株BMGHG在3mL含有50mg/L卡那霉素及25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。然后将种子液按2体积％的转接量(1mL)转接入50mL加入50mg/L卡那霉素及25mg/L氯霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.7-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，16℃诱导培养16个小时。4℃，4000rpm下离心10min收集菌体。转接到50mL M9Y(M9基本培养基+0.025％酵母提取物)液体培养基中，30℃继续培养48个小时。得到大肠杆菌菌株BMGHG的发酵液。
对比例1
含有表达载体pET28a-PTrcARO10-PTrcHpaBC的大肠杆菌菌株BMGH(pET28a-PTrcARO10-PTrcHpaBC&pBb3)获得方法：
用NotI和XhoI双酶切质粒pTrcHisB-PTrcARO10-PTrcHpaBC，得到带有PTrc启动子的基因片段PTrcARO10-PTrcHpaBC，和NotI和XhoI双酶切的pET28a片段连接并转入到E.coliDH5α，得到质粒pET28a-PTrcARO10-PTrcHpaBC。
将质粒pET28a-PTrcARO10-PTrcHpaBC和质粒pBb3用电转化的方法转入大肠杆菌菌株BMGA，命名为BMGH。具体获得方法同实施例4。
对比例2
大肠杆菌菌株BMGH的发酵培养：
将菌株BMGH在3mL含有50mg/L卡那霉素及25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。然后将种子液按2体积％的转接量(1mL)转接入50mL加入50mg/L卡那霉素及25mg/L氯霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.7-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，16℃诱导培养16个小时。4℃，4000rpm下离心10min收集菌体。转接到50mL M9Y液体培养基中，30℃继续培养48个小时，得到大肠杆菌菌株BMGH的发酵液。
实施例6
羟基酪醇、羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷的发酵及制备：
将菌株BMGHG在50mL含有50mg/L卡那霉素及25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。然后将种子液按2体积％的转接量(20mL)转接入1L加入50mg/L卡那霉素及25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.7-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，16℃诱导培养16个小时。4℃，4000rpm下离心10min收集菌体。转接到50mL M9Y(M9基本培养基+0.025％酵母提取物)液体培养基中，30℃继续培养48个小时。得到大肠杆菌菌株BMGHG的发酵液，12000rpm离心10min，取上清。
将预处理好的大孔吸附树脂SP-825(树脂用量为发酵液体积的50％)装入层析柱，加入发酵液离心后的上清，流速可控制在2mL/min，使树脂充分吸附发酵产物，待发酵液流尽后，用两倍柱体积的水洗脱残留在树脂柱中的杂质，之后用30％乙醇洗脱两个柱体积，收集洗脱液，减压浓缩得粗品，纯度可达80％以上，经半制备HPLC得95％以上羟基酪醇、羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷。HPLC分离条件为：流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇，流速＝4mL/min，洗脱条件：80％A和20％B。
测试例
羟基酪醇加糖产物的检测
(1)产物的HPLC检测：分别取实施例6和对比例2获得的发酵液各1mL，12000rpm离心10min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：岛津液相色谱仪，测定条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇；流速＝1mL/min；梯度洗脱条件：0–20min，80％A和20％B；21–45min，80％A和20％B到100％B；46–50min，100％B。进样量20μL。
发酵液及标准品的HPLC检测结果见图2。其中，1是菌株BMGH发酵液，2是菌株BMGHG发酵液，3是羟基酪醇的标准品。
如图2所示，菌株BMGH的发酵液中在9.4min时存在一个峰(1，峰Ⅲ)，与羟基酪醇标准品的出峰时间一致，为羟基酪醇(刘涛，李晓林，白艳芬，毕慧萍，庄以彬，马延和.利用葡萄糖生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及重组方法及应用，2015.05，专利申请号：201510242626.8)；菌株BMGHG的发酵液在5.6min，6.3min，7min时存在三个峰(2，峰Ⅰ，峰Ⅱ，峰Ⅲ)。
(2)产物的LC-MS、1H-NMR分析：对步骤(1)发酵液中看到的5.6min，6.3min的峰Ⅰ，峰Ⅱ进行LC-MS分析，其中，进行LC-MS分析的条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长224nm；流动相A＝水(含0.1体积％甲酸)，B＝甲醇；流速＝1mL/min；洗脱条件0–20min，80％A和20％B；21–45min，80％A和20％B到100％B；46–50min，100％B。进样量20μL。ESI正离子源，分子量扫描范围50–800。峰Ⅰ，峰Ⅱ的MS图谱上分别有羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷的MS特征峰317.1，并进一步通过1H-NMR确定，其中羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷NMR数据如下：[1H-NMR(400MHz,CD3OD,J in Hz):7.12(d,J＝8.2,1H-5)；6.76(d,J＝2.0,1H-2)；6.67(dd,J＝8.2,2.0,1H-6)；4.73(d,J＝7.5,1H-1′)；3.91(dd,J＝12.0,2.5,1Ha-6′)；3.74(dd,J＝12.0,5.0,1Hb-6′)；3.72(t,J＝7.1,2H-8)；3.41～3.50(m,4H-2′～5′)；2.73(t,J＝7.1,10.0,2H-7)；羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷NMR数据如下：[1H-NMR(400MHz,CD3OD,J in Hz):7.09(d,J＝1.5,1H-2)；6.79(dd,J＝8.2,1.5,1H-5)；6.78(dd,J＝8.2,1H-6)；4.77(d,J＝7.5,1H-1′)；3.92(dd,J＝12.0,1.7,1Ha-6′)；3.74(dd,J＝12.0,5.0,1Hb-6′)；3.72(t,J＝7.1,2H-8)；3.41～3.51(m,4H-2′～5′)；2.74(t,J＝7.1,2H-7)]。
且经测定，菌株BMGHG(发酵液中羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷、羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇的产量分别为906，401，406mg/L，而对比例BMGH发酵液中只有羟基酪醇的产生。本发明中的菌株BMGHG实现了从葡萄糖到羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷的从头合成，产量较高，为羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷的微生物异源合成奠定了坚实基础。
实验证明，将质粒pET28a-UGT73B6FS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7和质粒pBb3共同转入大肠杆菌BMGA，得到一种表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌BMGHG,菌株BMGHG的发酵液中羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷、羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和羟基酪醇的产量也比将上述质粒转入大肠杆菌MG1655或BL21(DE3)后的产量有很大的提高。

Claims (6)

1.表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌，其特征在于所述大肠杆菌含有并能够表达ARO10、HpaBC和UGT基因。
2.根据权利要求1所述大肠杆菌，其特征是所述UGT基因为UGT73B6基因或UGT73B6FS基因。
3.权利要求1的表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷大肠杆菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
1)用NotI和XhoI双酶切质粒pTrcHisB-PTrcARO10-PTrcHpaBC，得到带有PTrc启动子的基因片段PTrcARO10-PTrcHpaBC，将PTrcARO10-PTrcHpaBC和NotI和XhoI双酶切的pET28a-UGTFS连接并转化至E.coli DH5α，得到质粒pET28a-UGTFS-PTrcARO10-PTrcHpaBC；
2)以SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示序列为上、下游引物，以大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板PCR扩增T7聚合酶基因片段，将T7聚合酶基因片段用EcoRI和PstI双酶切并连接入经过EcoRI和PstI双酶切的表达载体pBb0，得到载体pBb0-T7；
3)以SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示序列为上、下游引物，以pBb0-T7为模板，PCR扩增获得带有PlacUV5启动子的T7聚合酶基因，将XhoI酶切的带有PlacUV5启动子的T7聚合酶基因片段和步骤1)获得的质粒连接并转化至E.coli DH5α，得到质粒pET28a-
UGTFS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7；
4)将步骤3)所获得的质粒pET28a-UGTFS-PTrcARO10-PTrcHpaBC-PlacUV5T7和质粒pBb3共同转入大肠杆菌，得到一种表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌，命名为BMGHG。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是步骤4)所述大肠杆菌为MG1655、BL21(DE3)或BMGA。
5.权利要求1表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌发酵制备羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是所述羟基酪醇葡萄糖苷为羟基酪醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和/或羟基酪醇-4-O-β-D-葡萄糖苷。
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