CN111763663A

CN111763663A - 一种天麻葡糖基转移酶基因及应用

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Publication number: CN111763663A
Application number: CN202010654798.7A
Authority: CN
Inventors: 李昆志; 李珩珺; 刘云霞; 周春艳; 徐慧妮
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2040-07-09
Also published as: CN111763663B

Abstract

本发明公开了一种天麻葡糖基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；本发明根据天麻转录组提供的CDS序列筛选出葡糖基转移酶基因序列，并设计巢式PCR的引物通过扩增拼接得到葡糖基转移酶基因全长序列；构建原核表达载体pGEX4T‑UGT，表达纯化获得蛋白，构建真核表达载体对UGT基因的表达进行亚细胞定位，将构建的真核表达载体pH2GW7.0‑35S‑UGT通过农杆菌侵染法将葡糖基转移酶转入单核蜜环菌菌丝中获得转基因蜜环菌，使用其生物合成天麻素，以期用转基因蜜环菌人工栽培天麻，增加天麻中天麻素含量，同时也可以通过培养基因工程蜜环菌生产天麻素。

Description

一种天麻葡糖基转移酶基因及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和植物基因工程领域，具体涉及一种天麻天麻葡糖基转移酶基因以及将该基因转入到单核蜜环菌中，通过生物合成的方法将4-羟苯基甲醇转化为天麻素。

背景技术

天麻是一种名贵中药材，以前主要依赖于野生资源，但是野生天麻资源总量少，远远不能满足人们对它的需求。20世纪60年代开始人工栽培天麻，并且随着人们对天麻生活习性研究越来越多，人工栽培天麻的技术不断提高，但是人工栽培天麻仍面临生长周期长，受外界环境影响大等多方面因素使得天麻仍然满足不了人们的需求。天麻素是天麻的主要成分，天麻素有巨大的药用价值，常用的获取天麻素的方法有化学合成法，植物提取法和生物合成三种方法。植物提取法是人们最早使用的提取方法，用这种方法提取出来的天麻素更天然健康，无毒副作用，但是植物提取成本高，工作量大，提取效率低，且因为天麻由种子生长成为商品麻箭麻大概需要三年半时间而造成原料严重供应不足问题。为了满足人们对天麻素的需求,人们开始通过合成的方法来获取天麻素。

周俊等人于1979年首次从中药天麻中分离得到一个新化合物，经鉴定为4-羟甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为天麻素。并于次年采用红磷和溴素等原材料化学合成了天麻素，总产率达24%。几年后，有研究者将合成工艺改进，将总产率提高到31.80%。但是用这种方法获得天麻素的过程中产生很多有害气体。为了降低对环境的危害，戴晓畅于2004年采用三溴化磷代红磷和溴素，这在一定程度改善了对环境的危害。后来，有人以五乙酰-β-D-葡萄糖和对甲酚为原料，经糖苷化反应和自由基卤代反应等反应化学合成天麻素。王多平于2014年用对羟基苯甲醇代替对羟基苯甲醛，优化了上述加工过程得到天麻素。但是整体而言人们不能从根本上彻底解决化学合成天麻素过程中产生的危害环境的气体等物质。

为了减少对环境的危害并获得高质量的天麻素，人们开始研究用生物合成的方法获得天麻素。近年来，微生物已被设计制造出一系列经济上重要的天然产物，如皂苷类物质三萜皂苷、类黄酮类物质、生物碱等。同时也早已有人研究用生物合成法合成酚类化合物天麻素。2005年，蔡洁等利用转基因人参毛状根将外源物质对羟基苯甲醇转化为天麻素，对羟基苯甲醇在经过24h转化后转化率达到百分之八十以上；2006年，朱宏莉用华根霉将对羟基苯甲醛转化为天麻素；后来有人用白花曼陀罗细胞或者紫花曼陀罗毛状根悬浮培养转化外源对羟基苯甲醛合成天麻素；2016年，Bai等利用药用植物红景天(Rhodiolarosea)来源的尿苷二磷酸葡糖基转移酶和诺卡氏菌(Nocardiaiowensis)来源的羧酸还原酶在大肠杆菌中构建了天麻素合成途径；2018年，钟贝芬通过整合谷氨酸棒状杆菌来源的cre基因簇中部分基因和红景天来源的糖基转移酶基因ugt (UGT73B6FS编码基因)，构建以4-甲酚为原料生产天麻素的重组大肠杆菌。

生物合成法是近年来的研究热点，用该方法合成天麻素等物质弥补了化学合成法污染环境的缺点，它对环境友好，原材料利用率高且整个过程耗时短，很多研究者利用该方法合成了各种各样的次生代谢产物，表明该方法具有可行性。

目前未见与本发明技术方案相关的文献报道。

发明内容

本发明提供了一种天麻葡糖基转移酶基因（UGT），其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，本发明将UGT基因转入单核蜜环菌中，形成天麻素生物合成途径，促进单核蜜环菌将4-羟苯基甲醇转化为天麻素，提高天麻素的含量，产生能合成天麻素的基因工程蜜环菌，为大量生物合成天麻素奠定基础。

本发明目的通过以下技术方案实现：

1、基于转录组数据筛选获得天麻素合成酶基因

本发明首先对箭麻与蜜环菌白头麻共生天麻进行转录组测序，分析蜜环菌与白头麻共生天麻与箭麻生长代谢过程中相关差异基因表达水平变化，揭示两者间的基因表达水平的差异；

箭麻与共生天麻间共获得72244条序列，其中有26312条得到注释；在FDR<0.05和log2|FC|>=2筛选条件下，共有12498条基因发生显著差异表达，其中9000条基因呈上调表达，3498条呈下调表达，在上调表达的基因中筛选到高表达的葡糖基转移酶基因，该基因与合成天麻素有关，能将4-羟基苯甲醇转化合成天麻素；

2、克隆葡糖基转移酶基因获得全长基因

在天麻转录组中筛选出葡糖基转移酶基因并找到其CDS序列，通过巢式PCR获得UGT全长序列后，通过RACE-PCR 技术克隆葡糖基转移酶全长基因1764 bp，编码588个氨基酸；

3、构建了UGT的原核表达载体pGEX4T-UGT并诱导该蛋白的表达

研究结果表明当IPTG浓度为0.5mmol/L，诱导时间为6h，诱导温度为28℃时蛋白诱导表达效果最好；

4、构建该基因真核过表达载体，转入蜜环菌，合成天麻素

得到UGT全长基因CDS序列后构建真核表达载体pK7EG2.0-35s-UGT，转洋葱薄皮细胞进行观察，该基因在细胞核进行表达，定位于细胞核，构建pK7EG2.0-35s-UGT载体并培养蜜环菌单核菌丝，通过农杆菌转化法将UGT基因转入到单核蜜环菌中，获得将4-羟基苯甲醇转化为天麻素的工程蜜环菌；

5、工程蜜环菌将4-羟基苯甲醇转化为天麻素

培养工程蜜环菌，然后向培养基加入天麻素前体物质4-羟基苯甲醇，工程蜜环菌能将4-羟基苯甲醇转化为天麻素。

本发明优点和技术效果：

本发明对箭麻与蜜环菌白头麻共生天麻进行转录组测序，分析蜜环菌与白头麻共生天麻与箭麻生长代谢过程中相关差异基因表达水平变化，揭示两者间的基因表达水平的差异。然后基于转录组数据从白头麻筛选出和天麻素合成相关的葡糖基转移酶基因（UGT），通过巢式PCR获得UGT全长序列后，克隆葡糖基转移酶全长基因，构建原核表达载体pGEX4T-UGT以研究其酶学特性；构建真核过表达载体pH2GW7.0-35S-UGT并转入单核蜜环菌中，获得合成天麻素的工程蜜环菌，该基因能促进蜜环菌将天麻素的前提物质4-羟苯基甲醇转化为天麻素，提高天麻素的含量，为大量生物合成天麻素奠定基础。

附图说明

图1是本发明中UGT基因未知序列扩增电泳检测结果；

图2是本发明中葡糖基转移酶全长基因 PCR 检测结果；

图3是本发明中UGT基因双酶切验证及转BL21 PCR检测结果，其中图a是pMD18T-UGT 双酶切验证；图b是pGEX4T-UGT 酶切验证；图 c是转 BL21 PCR 检测；

图4是本发明中不同诱导时间和诱导剂浓度下UGT蛋白的表达结果；

图5是本发明中UGT重组蛋白纯化结果；

图6是本发明中pENTRTM2B-UGT载体的构建，其中图a 为pMD18T-UGT 双酶切验证；图b为pENTRTM2B-UGT 双酶切验证；

图7是本发明中pk7EGC2.0-355-UGT/ pH2GW7.0-35S-UGT载体检测结果，其中图a为pk7EGC2.0-355-UGT/ pH2GW7.0-35S-UGT载体菌液PCR检测，M:DL 2000 DNAmaker；1:水做空白对照；2-3：pk7EGC2.0-355-UGT载体菌液PCR检测；4-5：pH2GW7.0-35S-UGT载体菌液PCR检测；图b为pk7EGC2.0-355-UGT/ pH2GW7.0-35S-UGT载体双酶切检测， M:DL 2000DNAmaker；1-2：pk7EGC2.0-355-UGT载体双酶切检测；3-4：pH2GW7.0-35S-UGT载体双酶切检测；

图8是本发明中pk7EGC2.0-355-UGT/ pH2GW7.0-35S-UGT转农杆菌菌液PCR检测结果；

图9是本发明中pk7EGC2.0-355-UGT亚细胞定位，实验组a:明场； b: pk7EGC2.0-355-UGT 载体的荧光场；c:PI染色荧光；d:叠加场，共定位到细胞核；对照组：e:明场；f，g: 空载pk7EGC2.0荧光场，空载分布于洋葱下表皮细胞整个组织；

图10是本发明中单核蜜环菌培养过程及过程中的菌丝状态，其中图a为蜜环菌双核菌丝；b为蜜环菌小菌球；c为蜜环菌菌蕾；d为单核蜜环菌菌丝；

图11是本发明中蜜环菌菌丝观察结果；其中图a: 蜜环菌双核菌丝（锁状联合结构）；图b: 蜜环菌单核菌丝（隔膜）；

图12是蜜环菌生长状况；其中图a:对照组，野生型蜜环菌的生长情况；图b:实验组，转基因蜜环菌的生长情况；

图13为UGT基因成功转入蜜环菌中验证结果；

图14为天麻素标准品的标准曲线；

图15为天麻素的产量；

图16为天麻素标准品（a）和4-羟基苯甲醇（b）的 HPLC 峰图；

图17为转基因蜜环菌发酵液的 HPLC 峰图，其中a：野生型天麻对照度；b：蜜环菌发酵液6小时色谱图；c:蜜环菌发酵液24小时色谱图。

具体实施方式

下面通过实例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂，如无特殊说明方法中百分数均为质量百分数。

实施例1：天麻葡糖基转移酶基因（UGT基因）的获取

1、天麻 cDNA的获取

选取昭通乌天麻（G. elata Bl. f. glauca S. Chow）作为提取材料，取0.1g天麻放入液氮中冷冻后储存入-80℃冰箱中用于后续实验，采用Trizol Reagent（Invitrogen）提取乌天麻RNA；将0.1g样品放入用液氮预冷的研钵中，磨碎后加入1mL的Trizol提取液于研钵中继续研磨至研磨液呈红色透明状，于室温静置5min后移入1.5mL离心管并加入0.2mL氯仿振荡混匀；随后在12000 rpm、4℃的条件离心15min后吸取上清液至新的离心管中；再加入0.25mL异丙醇、0.25mL氯化钠与柠檬酸钠混合高盐液，混匀-20℃放置30min后在12000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，沉淀用1mL（-20℃预冷）的75%乙醇清洗，随后在7500rpm、4℃条件下离心5min，弃乙醇，重复清洗两次；然后将沉淀在室温条件下自然晾干，最后用20μL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA；本实验中用分光光度计测量样品RNA的纯度和浓度，检测RNA样品的完整性；本研究用 Prime script RT reagengtRit with gDNAEraser 试剂盒合成cDNA；

向用焦碳酸二乙酯水浸泡过12小时并经高压蒸汽灭菌的20μL离心管中加入gDNAEraser、5×gDNA Eraser和提取成功的RNA模板，并加ddH₂O定容至10μL，放42℃金属浴热击2min后放于冰上；再向离心管中加入Rt Prime Mix、Prime Script Rt Enzyme Mix和5×PSBuffer，再加ddH₂O定容至20μL，放至37℃金属浴15min，随后立即置于85℃金属浴5s；将合成的cDNA放于-20℃备用。

2、根据从转录组中筛选出葡糖基转移酶基因具有 5’端的前段基因序列，设计巢式PCR的引物，由昆明擎科公司合成；

（1）巢式 PCR 第一阶段：

上游引物：UGTF-2 ；下游引物：UN36

扩增体系:1μL的上游引物、1μL下游引物、2μL的天麻 cDNA模板、10μL 的2×Es TaqMasterMix、ddH₂O 6μL ；

扩增条件：94℃，1min； (94℃ 40s， 56℃ 30s，72℃ 2min) ×30 cycle；72℃10min。

巢式 PCR 第二阶段：将第一阶段得到的PCR产物稀释 10 倍后使用

上游引物：UGT-1；下游引物：UN36

扩增体系：1μL的上游引物、1μL下游引物、稀释过后的 DNA 模板 2μL、2×Es TaqMasterMix 10μL、ddH₂O 6μL ；

扩增条件：94℃ 1min；(94℃ 40s， 51℃ 1min，72℃ 2min)×30 cycle；72℃10min；

（2）目的条带的回收和克隆

1）将第二阶段的PCR产物用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测到目的条带后，初步认定该基因3’端大概有350bp碱基（图1）；使用上海生工生产的胶回收试剂盒进行 DNA回收，操作按说明书进行；

2）使用TaKaRa公司生产的 PMD-18T Vector kit 进行 TA 克隆，反应体系如下：

目的基因 4μL、载体 1μL、SolutionΙ5μL ；将上述反应液加入 1.5mLEP 管中，吹打混匀后置于 16℃金属浴中反应4h；

3）转化大肠杆菌：

采用热机法转化感受态大肠杆菌，感受态细胞DH5α购于上海擎科生物有限公司，步骤如下：

将反应4h后的TA克隆反应液在无菌环境下加至100μL 的感受态细胞DH5α中吹打混匀，并将其放置冰上0.5h；然后将感受态细胞DH5α放入42℃的金属浴上热击45s后冰浴2min，然后在无菌环境下加入890μL无抗性的LB液体培养基。将其放于摇床（37℃、180rmp）中培养1h后离心(5000rmp、2min)，然后在无菌环境下去除970μL上清，并将剩余30μL的上清与沉淀菌体吹打混匀后涂布于Amp抗性的固体LB平板上，放于37℃的电热恒温培养箱培养约12h；

（3）目的基因的拼接与检测

1）挑取平板上单菌落于含有 Amp 抗生素的10mL LB 液体培养基中，然后放置于37℃摇床培养约12h；

2）12h后取2μL菌液进行菌液 PCR，将PCR扩增得到的产物在1 %的琼脂糖凝胶中进行电泳检测；

3）取阳性克隆送至上海擎科生物有限公司进行测序；

4）将测序获得的结果分别和 UGT基因的 UGTF-1 和UN36 两条引物序列进行比对，将比对成功的基因与UGT基因已知片段进行拼接；

5）通过DNAMAN软件得知拼接好的片段的终止密码子，获得 UGT基因的全长 DNA 序列；

（4）对拼接得到葡糖基转移酶基因全长进行全长扩增；用Primer 5 设计拼接好的UGT基因全长序列上游引物 UGT-F 和下游引物UGT-R，进行 PCR 扩增。

UGT-F: gaattcATGTCAGAAAACGGTGGC

UGT-R: gcggccgTTAGAGACAGAAGAAGCATTTC

扩增体系：上游引物1μL、下游引物1μL、cDNA 2μL、高保真酶 1μL、ddH₂O 6μL；

扩增条件：94℃ 1min30s；（94℃ 40s，58℃ 1min30s，72℃ 2min） ×30 cycle，72℃10min。

PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图2，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，全长基因1764 bp，编码588个氨基酸。

实施例2：UGT基因原核表达载体的构建及鉴定

使用DNAman将UGT全长基因进行酶切位点分析，以该模板设计带有酶切位点的特异性引物进行 PCR 扩增，得到带有酶切位点的 cDNA 片段，连接至高拷贝的 pMD-18T 线性载体上，转化到大肠杆菌感受态DH5α中；使用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切检测，结果见图3a，能成功切开后将目的片段胶回收，连接至pGEX-4T，得到pGEX4T-UGT；从DH5α中提取重组质粒pGEX4T-UGT做酶切检测（图3b），切出约1700 bp片段表明扩增的UGT 片段已经插入载体pGEX-4T中；质粒pGEX4T-UGT测序比对结果 100%吻合，获得了正确的UGT原核表达质粒；将质粒转入BL21感受态中，筛选扩培之后再次提取质粒，PCR检测扩增得到目的条带，说明转化 BL21成功（图3c)。

实施例3：UGT基因原核表达蛋白的诱导分析

使用IPTG法诱导蛋白。挑取成功转入pGEX4T-UGT的BL21菌株于LB液体培养基中，放到37℃摇床震荡至菌液OD为0.6-0.8。然后加入IPTG使菌液中IPTG终浓度分别为0.5mM和1mM，放入28℃摇床，分别取0、2、4、6、8h的菌液约1.5mL提取总蛋白进行SDS-PAGE分析。

葡糖基转移酶的蛋白大小约为65kDa，pGEX-4T载体含有GST标签，大小约为25kDa，所以pGEX4T-UGT表达出的蛋白含量为90kDa左右；结果显示，当诱导剂浓度为0.5mM，诱导时间为6h时诱导效果更好，结果见图4。

向500mLOD值为0.6-0.8的菌液中加入IPTG，使其终浓度为0.5mM；将其置于28℃摇床中低速（150rpm）诱导6h；进行诱导表达后，将菌液离心并用PBS缓冲液清洗，然后使用细胞超声破碎仪对菌液进行破碎，将破碎后的菌液高速（12000rpm）离心10min后收集上清，利用GST纯化柱进行蛋白纯化，结果如图5。

实施例4：构建UGT的真核表达载体

将含 pENTR^TM-2B质粒的大肠杆菌菌种划线于含有Kan抗生素的固体培养基上后放于37℃恒温箱约12h，然后挑取单菌落于20mLKan抗性的LB液体培养基中在37℃摇床摇12h，使用购买于上海生工的质粒抽提试剂盒提取上述测序正确的pMD18T-UGT及pENTR^TM-2B质粒。

质粒提取之后，同时使用EcoRⅤ和NotⅠ分别对pMD18T-UGT质粒和pENTR^TM-2B载体进行同步双酶切，使用的酶切体系如下：质粒5 µL、EcoRⅤ 1 µL、Not Ⅰ 1µL、ddH₂O 11 µL、Buffer 2µL；加完酶切体系后将其放于37℃金属浴4h左右，然后在体系加入2 µL 10×Loading Buffer，随后在1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测；检测出有所需片段后将目的片段使用胶回收试剂盒回收。

将回收过后的目的片段进行连接，然后菌液涂于含有Kan抗生素的平板上，然后将其置于37℃恒温培养箱培养12h；随后挑取单菌落于20mL含Kan抗生素的LB培养液中震荡培养12h后，提取质粒检测双酶切检测（图6）；检测正确的入门克隆载体pENTR^TM2B-UGT与过表达载体pK7WGY2.0/pH2GW7.0进行LR反应，LR反应体系为pENTR^TM2B-UGT质粒3µL、pK7WGY2.0/pH2GW7.0载体5µL、10×LR ClonaseTM-buffer 1µL；混匀后放入25℃金属浴8h后加入Proteinase K在37℃金属浴上10min使LR反应停止；随后将体系TA克隆后转入Spe(50µg/mL)抗生素的LB平板上，放置于37℃的培养箱中培养12h，挑取单菌落转入Spe抗性的LB液体培养基中37℃震荡培养12h；12h后取2μL菌液进行菌液PCR检测；同时提取质粒做双酶切检测筛选出阳性菌（图7）。

实施例5：单核蜜环菌培养

将蜜环菌株接种于PDA 平板上，随后将其放置于25℃恒温箱培养10天左右；待蜜环菌菌丝体长满平板后在无菌环境中取少量菌丝体转接于液体培养基中静置1天；然后将其置于摇床上振荡(25℃、115rmp/min)培养3天至长出细小的蜜环菌菌球；取20mL菌球加入装有200mL发酵培养基的1L的三角瓶中，在黑暗环境下静置培养1 天，随后放入摇床（120rpm/min、26℃）振荡培养7-10 天，观察到发酵培养基中出现子实体菌蕾后终止培养；然后在无菌环境下挑取菌蕾于无菌水中清洗3-4次，用滤纸吸去洗干净的子实体上的水分并将其放入PDA培养基中央，放入25℃恒温培养箱培养进行孢子弹射；待见到菌蕾周围长出蜜环菌单菌落后，挑出新长出的菌丝，在光学显微镜下观察是否有锁状结构以确定是否有单核蜜环菌产生。

PDA培养基的制备

单倍体蜜环菌菌丝具体培养过程如图10所示；从10a显示的平板中挑取菌丝接种到液体培养基中得到体积极小的菌球（10b），然后吸取20mL图10b中的菌球到发酵培养基中震荡培养（115rmp/min、 25℃）15天左右得到蜜环菌子实体菌蕾（10c）；将蜜环菌菌蕾用无菌水清洗数次并吹干后接种于PDA固体培养基上，子实体中的孢子弹射出到单孢子单核菌丝（10d）；取图10a和图10d的菌丝放于显微镜下观察可以看到图10a的菌丝有锁状结构，而图10d的菌丝明显的隔膜（图11），说明图10d中的菌丝为蜜环菌单核菌丝。

实施例6：表达载体pK7WGY2.0/pH2GW7.0-35S-UGT转化农杆菌

通过冻融法将PK7WGY2.0/pH2GW7.0-35S-UGT 转入农杆菌感受态pMP90中，具体步骤为:1）取2μL PK7WGY2.0/pH2GW7.0-35S-UGT质粒在无菌环境中加入到含有100μL pMP90的1.5mLEP管中，然后在冰上放置30min； 2）将EP管放入-80℃的液氮中冷冻5min；3）随后将EP管放于37℃金属浴热击5min；4）再将EP管放置于冰上5min；5）在无菌环境下向EP管中加入900μL的LB培养液，后放置于28℃摇床震荡培养3-5h；震荡培养3-5h后将EP管离心（8000rmp、5min）后去除970μL上清，将沉淀菌种与30μL上清吹打混匀后涂布于有相应浓度的Spe和Rif抗生素的LB平板，倒置于28℃恒温箱中培养36h，挑取单菌落于含有Spe抗生素的LB液体培养基中28℃震荡培养36h，随后取菌液使用特异性引物进行菌液PCR（图8），保存成功检测到目的条带的阳性菌。

实施例7：转化蜜环菌及转基因蜜环菌的培养

为了了解UGT的表达部位，我们构建pK7WGY2.0-35S-UGT载体并做瞬时表达，具体步骤为：1）活化上述筛选出的阳性菌，随后挑取农杆菌单菌落于25mL 的LB 液体培养基（含Spe100 μg/mL）28℃震荡培养36h；2）取200µL菌液放于配好的诱导培养基中，放置于28℃摇床震荡培养36h左右；3）将培养36h的诱导培养基以3000rmp/min的转速离心10mim，随后在无菌环境下加入渗透溶液20mL，吹打混匀后继续离心，重复此步骤3-4次；4）在最后一次的沉淀中加入渗透溶液约15mL吹打混匀至OD600在1-1.2；5）将洋葱内部切块置于渗透溶液中30min；6）30min后取洋葱下表皮置于含有约25mL1/2 MS (Murashige and Skoog盐，30g蔗糖/L和0.7%（g/v）琼脂，pH5.7)的培养皿，放28℃恒温箱培养3天左右；7）约三天后取洋葱下表皮于浓度为100µg/mL的PI染料中15min左右，随后用无菌水清洗数次后在Nikon A1激光扫描共聚显微镜（Confocal laser scanning microcope, CLSM）下观察荧光，以确定UGT基因表达部位；对pk7EGC2.0-355-UGT于洋葱内表皮细胞瞬时表达，通过激光共聚焦对其进行亚细胞定位，激发光波长为 488nm，发射光波长为 535nm；所有图像均使用 Nikon NISElements 软件扫；描获得可以观察到pk7EGC2.0-355-UGT表达于细胞核部分（图9）。

使用实验室构建的农杆菌侵染蜜环菌的方法转染蜜环菌，具体步骤为: 1)活化上述筛选出的阳性菌，随后挑取农杆菌单菌落于25mL 的LB 液体培养基(含Spe 100μg/mL)28℃震荡培养36h左右至菌液OD600为1.0-1.2；2)将培养好的单核蜜环菌用均质仪打碎，分装，静置避光；3)将破碎的菌丝体离心尽量去除更多的上清只留下蜜环菌菌丝，后在无菌环境下将其重悬于农杆菌菌液，放入25℃恒温培养箱共培养10h；4)10h后低速离心（5000rmp/min）后去除上清，在无菌环境下使用无菌去离子水洗涤蜜环菌菌丝3-4次至上清颜色为无色透明且农杆菌被清洗干净；5)去除上清后将其放于吹风口一段时间使尽可能多的水分清除，后将蜜环菌菌丝涂布在含潮霉素(50μg /mL)的PDA 培养基上,25℃恒温箱培养15d左右。4)挑取生长出的菌丝体于液体培养基种培养7d 后提取基因组进行检测。按上述方法侵染蜜环菌后将其置于有Hyg（50mg/mL）的 PDA 培养基上25℃恒温培养两周，同时设置对照组为野生型蜜环菌菌株。如图12所示，野生型菌株无法在含Hyg抗生素的PDA固体培养基上生长，转基因蜜环菌可以在含Hyg抗生素的固体培养基上生长。

实施例8：转基因蜜环菌对4-羟苯基甲醇转化效果

（1）转基因蜜环菌的筛选

用特异性引物进行 PCR 扩增（引物序列见实施例1第2步的步骤（4）），验证外源基因是否插入，通过PCR， WT不能扩增出1764片段的外源基因，而转基因菌株能够扩增出目的片段；结果见图13，结果表明UGT基因成功转入蜜环菌中；

（2）菌株培养及生物转化

将转基因蜜环菌接种液体培养基中，26℃培养7d；将培养好的转基因蜜环菌离心后，重新悬浮于诱导培养基中，测OD600≈2.0，在4℃静置24h，在培养基中添加0.1mol/L 4-羟苯基甲醇进行转化；

蜜环菌液体培养基配方

诱导培养基配方

（3）HPLC检测天麻素的含量

HPLC 分析条件：A液为ddH₂O；B液为甲醇，90%A和10%B洗脱35min，流速1.0mL/min，进样量 20µL，检测波长为 225nm；

天麻素标准曲线绘制：用甲醇溶解天麻素标准品，分别配制 14.7、29.4、58.8、88.2、147µg/mL 的标准品，并绘制标准曲线（图14）；反相色谱柱 C18：4.6*250mm；particlesize，5µm。

步骤（2）培养液在 2、6、10、12、20、24h 小时分别取样，10000rmp/min 离心取上清，45µm有机相滤膜过滤；

通过 HPLC高效液相色谱检测上清液中蜜环菌对 4-羟苯基甲醇的转化效率；结果见图15，从图中可以看出在第2-12h 之间天麻素产量基本不变，12-24小时内的天麻素产量增高，最高时浓度可达16.266µg/mL；

图16为转基因蜜环菌发酵液的 HPLC 峰图，从图中可以看出天麻素标准品在7.141min出峰（图16a），4-羟基苯甲醇在14.841min出峰（图16b），野生型对照组没有检测到天麻素峰值（图17a），蜜环菌发酵6小时和24小时的发酵液（图17b和图17c)，通过与对照组的对比，发现转基因蜜环菌可以将4-羟基苯甲醇转化为天麻素。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种天麻葡糖基转移酶基因及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1764

<212> DNA

<213> 昭通乌天麻(Gastrodiaelata)

<400> 1

atgtcagaaa acggtggcgg tccgccggga atgaacggcg agggctcgag ttcttctcca 60

cccgtgattt ctgacaggaa tgtacataga gcaagctcaa ttcctcgagg acgaaaaagt 120

gacgtggaaa cagaaatatg cagcggtcca cattctctgg agagatcaaa aactgagaac 180

cgaagacagc acagcttgcg cactgatcca gctgcacagt tgtttgatgg caacatatct 240

gatagaaaga agcttaggat gcttaatagg atagctacag tgaaagatga tggaactgtg 300

gaagtacaag ttccacgtga tatagagcgt gcagcacttg attataaatc ggattatgtt 360

gttcccggag cagttgatga agaacaacca ctggaattaa ctgatatttt agatgtgcct 420

cttcttcaaa tagtcattct cattgttggc acccggggag atgtgcagcc atttgttgct 480

attggtaaac gattacagga ctatggacat cgtgtcagat tagcaactca tgcaaatttt 540

aaagagtttg tattgactgc tggccttgag ttttacccat taggaggaga ccctaaagtc 600

ctagctgaat atatggtaaa gaataaagga tttctgccat catcaccttc agagatacct 660

attcaacgga aacaaatcaa agaaattatt ttttctttgc ttccagcatg caaggatcca 720

gatatggata ctggaatacc gttcaaagcg gatgccatta ttgctaatcc accagcttat 780

gggcacacac atgtggcaga ggcattaaag gttccaattc acatattctt cacaatgcca 840

tggacgccaa ctagtgaatt tccacatcct ctttctcgtg tcaaacaatc cgctggatac 900

agactttcat atcagatagt tgattctatg atttggcttg gtatccgaga catgataaat 960

gaatttagga agaaaaaact gaagctacgc cctgttacat atttgagtgg tgttcaaggc 1020

tcttcgtctg acataccgca tggatatatt tggagcccac atcttgttcc caaacccaag 1080

gattggggat ctaaaattga tgttgttgga ttttgctttc tcgatctagc ttcaaactat 1140

cagcctcctg agccacttgt caagtggctt gaagctggtg aaaagcccat ctacattggc 1200

tttggcagtc ttcctgttca agaaccggag aaaatgacaa aaactattgt caaggctctg 1260

gaaataactg gacagagagg tattattaat aaaggttggg gtggccttgg aaatttggca 1320

gaaccaaaag actttgtgta tttactggat aatgttcctc atgactggct tttcctccag 1380

tgcaaggcag tagttcatca cggaggtgcc ggaaccacag cagccggtct taaagctgcg 1440

tgtccaacaa caatcgtgcc cttctttggc gatcagcctt tctggggaga aagagtgcac 1500

gccagggggt tgggaccccc tcctattcca gttgatcaat tctcactcac aaagcttgtt 1560

gaatcaataa gatttatgat gaatccgcag gtgaagcagc gggcggttga acttgcaaaa 1620

gacatggaat ctgaggacgg cgtcaccggc gctgtgaaag ctttcttcaa gcaactgcct 1680

cgaaattccc cgctgatgca gactcaacaa tctcccccag ccatgcctta ctttggttca 1740

gtcaagaaat gcttcttctg tctc 1764

<210> 2

<211> 588

<212> PRT

<213> 昭通乌天麻(Gastrodiaelata)

<400> 2

Met Ser Glu Asn Gly Gly Gly Pro Pro Gly Met Asn Gly Glu Gly Ser

1 5 10 15

Ser Ser Ser Pro Pro Val Ile Ser Asp Arg Asn Val His Arg Ala Ser

20 25 30

Ser Ile Pro Arg Gly Arg Lys Ser Asp Val Glu Thr Glu Ile Cys Ser

35 40 45

Gly Pro His Ser Leu Glu Arg Ser Lys Thr Glu Asn Arg Arg Gln His

50 55 60

Ser Leu Arg Thr Asp Pro Ala Ala Gln Leu Phe Asp Gly Asn Ile Ser

65 70 75 80

Asp Arg Lys Lys Leu Arg Met Leu Asn Arg Ile Ala Thr Val Lys Asp

85 90 95

Asp Gly Thr Val Glu Val Gln Val Pro Arg Asp Ile Glu Arg Ala Ala

100 105 110

Leu Asp Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Val Pro Gly Ala Val Asp Glu Glu

115 120 125

Gln Pro Leu Glu Leu Thr Asp Ile Leu Asp Val Pro Leu Leu Gln Ile

130 135 140

Val Ile Leu Ile Val Gly Thr Arg Gly Asp Val Gln Pro Phe Val Ala

145 150 155 160

Ile Gly Lys Arg Leu Gln Asp Tyr Gly His Arg Val Arg Leu Ala Thr

165 170 175

His Ala Asn Phe Lys Glu Phe Val Leu Thr Ala Gly Leu Glu Phe Tyr

180 185 190

Pro Leu Gly Gly Asp Pro Lys Val Leu Ala Glu Tyr Met Val Lys Asn

195 200 205

Lys Gly Phe Leu Pro Ser Ser Pro Ser Glu Ile Pro Ile Gln Arg Lys

210 215 220

Gln Ile Lys Glu Ile Ile Phe Ser Leu Leu Pro Ala Cys Lys Asp Pro

225 230 235 240

Asp Met Asp Thr Gly Ile Pro Phe Lys Ala Asp Ala Ile Ile Ala Asn

245 250 255

Pro Pro Ala Tyr Gly His Thr His Val Ala Glu Ala Leu Lys Val Pro

260 265 270

Ile His Ile Phe Phe Thr Met Pro Trp Thr Pro Thr Ser Glu Phe Pro

275 280 285

His Pro Leu Ser Arg Val Lys Gln Ser Ala Gly Tyr Arg Leu Ser Tyr

290 295 300

Gln Ile Val Asp Ser Met Ile Trp Leu Gly Ile Arg Asp Met Ile Asn

305 310 315 320

Glu Phe Arg Lys Lys Lys Leu Lys Leu Arg Pro Val Thr Tyr Leu Ser

325 330 335

Gly Val Gln Gly Ser Ser Ser Asp Ile Pro His Gly Tyr Ile Trp Ser

340 345 350

Pro His Leu Val Pro Lys Pro Lys Asp Trp Gly Ser Lys Ile Asp Val

355 360 365

Val Gly Phe Cys Phe Leu Asp Leu Ala Ser Asn Tyr Gln Pro Pro Glu

370 375 380

Pro Leu Val Lys Trp Leu Glu Ala Gly Glu Lys Pro Ile Tyr Ile Gly

385 390 395 400

Phe Gly Ser Leu Pro Val Gln Glu Pro Glu Lys Met Thr Lys Thr Ile

405 410 415

Val Lys Ala Leu Glu Ile Thr Gly Gln Arg Gly Ile Ile Asn Lys Gly

420 425 430

Trp Gly Gly Leu Gly Asn Leu Ala Glu Pro Lys Asp Phe Val Tyr Leu

435 440 445

Leu Asp Asn Val Pro His Asp Trp Leu Phe Leu Gln Cys Lys Ala Val

450 455 460

Val His His Gly Gly Ala Gly Thr Thr Ala Ala Gly Leu Lys Ala Ala

465 470 475 480

Cys Pro Thr Thr Ile Val Pro Phe Phe Gly Asp Gln Pro Phe Trp Gly

485 490 495

Glu Arg Val His Ala Arg Gly Leu Gly Pro Pro Pro Ile Pro Val Asp

500 505 510

Gln Phe Ser Leu Thr Lys Leu Val Glu Ser Ile Arg Phe Met Met Asn

515 520 525

Pro Gln Val Lys Gln Arg Ala Val Glu Leu Ala Lys Asp Met Glu Ser

530 535 540

Glu Asp Gly Val Thr Gly Ala Val Lys Ala Phe Phe Lys Gln Leu Pro

545 550 555 560

Arg Asn Ser Pro Leu Met Gln Thr Gln Gln Ser Pro Pro Ala Met Pro

565 570 575

Tyr Phe Gly Ser Val Lys Lys Cys Phe Phe Cys Leu

580 585

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gtatttactg gataatgttc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

cattggcttt ggcagtcttc 20

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gactcgagtc gacatcgatt tttttttttt tttttt 36

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

gaattcatgt cagaaaacgg tggc 24

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

gcggccgtta gagacagaag aagcatttc 29

Claims

1.一种天麻葡糖基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的天麻葡糖基转移酶基因在单核蜜环菌合成天麻素中的应用。