CN104004065B

CN104004065B - 一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法

Info

Publication number: CN104004065B
Application number: CN201310060071.6A
Authority: CN
Inventors: 段燕文; 沈奔; 朱湘成; 杨虎
Original assignee: Changsha Cihang Pharmaceutical Institute Co ltd; Hayao Cihang Pharmaceutical Co ltd; Changsha Tianci Biomedicine Technology Co ltd
Current assignee: Changsha Cihang Pharmaceutical Institute Co ltd; Hayao Cihang Pharmaceutical Co ltd; Changsha Tianci Biomedicine Technology Co ltd
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2013-02-26
Publication date: 2017-10-20
Anticipated expiration: 2033-02-26
Also published as: CN104004065A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种从黄绿链霉重组工程菌SB9026（保藏号CCTCC M2011292）的发酵液中分离和纯化博来霉素族衍生物6’‑脱羟基‑BLM S的方法。该方法包括沉淀分离前处理、D‑113和Diaion HP‑20树脂吸附洗提、Silica Flash柱等梯度洗提、脱铜精制等步骤。该方法简化和减少了分离纯化步骤，降低了生产成本，增加了回收率。本发明的博来霉素族衍生物其化学结构通式如说明书中所示。

Description

一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种从黄绿链霉菌重组工程菌SB9026的发酵液中高效分离和纯化新型活性博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM S的方法。

背景技术

肿瘤是危害人类健康的严重疾病之一,目前全世界有恶性肿瘤病人约1400万，我国每年癌症发病人数约180万至200万，死亡140万至150万。我国居民每死亡5人中，即有1人死于癌症。世界卫生组织预测，到2020年，每年新发癌症病人数将达到1500万，癌症已经成为新世纪人类的第一杀手，并成为全球最大的公共卫生问题。

博莱霉素(Bleomycin，缩略BLM)是从轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)中分离发现的一类糖肽类抗肿瘤抗生素，目前已发现十余种博莱霉素天然组分，其中主要成分为博莱霉素A2(55％～70％)和博莱霉素B2(25％～32％)。随后发现的泰莱霉素、佐伯霉素和腐草霉素等糖肽类天然产物与博莱霉素的结构和活性都极为相似，因此这一类天然产物被统称为博莱霉素族糖肽类抗肿瘤抗生素。博莱霉素族抗生素能够选择性地诱导单链或双链DNA的断裂，从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。以BLM A2和B2为主要成分的商品药作为一种重要的有效抗肿瘤药物，在临床上与其他试剂一起联合广泛应用于治疗睾丸癌，及霍奇金淋巴瘤、鳞状上皮细胞癌、生殖细胞瘤和其他肿瘤。但是，博莱霉素诱导的剂量依赖性肺纤维化作为主要的副作用严重限制了其在临床的应用。

要推广博莱霉素类化合物在临床上的应用，就必须解决其诱导的肺毒性以及肿瘤细胞逐渐形成的耐药性等关键性问题，因此必须开发新型的高效低毒的博莱霉素族衍生物。因为博莱霉素族化合物的分子结构较为复杂，所以通过传统的化学全合成方法来获取其相关衍生物的过程及其繁琐且效率低下，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用，并且合成的博莱霉素衍生物也并未展示出更好的活性或更低的毒性。新兴的组合生物合成方法通过遗传操纵次代谢产物生物合成基因来获取目标天然产物衍生物，是一种非常有应用前景的高新技术。

专利申请号201110276318.9，从佐伯霉素的原始高产菌株黄绿链霉菌SB9001出发，我们应用基因重组技术将黄绿链霉菌SB9001中的zbmVIII基因完全失活后得到不生产佐伯霉素的黄绿链霉菌突变株，然后以该突变株作为异源宿主，将包含完整博莱霉素生物合成基因簇(blm基因簇)的人造细菌染色体质粒blm1-6E转入其中获得黄绿链霉菌重组工程菌SB9026(保藏号CCTCC M 2011292)。从该重组工程菌的发酵培养产物中我们成功得到一种新型博莱霉素衍生物6’-脱羟基-BLM S，并且初步生物活性测试表明6’-脱羟基-BLM S的DNA裂解活性至少是博莱霉素-A₂的10倍以上。这说明在更少用量的条件下，6’-脱羟基-BLM S比目前临床使用的任何一种博莱霉素类抗癌药物的毒性都要低，因此作为迄今为止发现的最有效的博莱霉素衍生物，6’-脱羟基-BLM S很有希望成为博莱霉素族化合物中的新型抗癌药物。因此，无论是从现阶段研究的需要，还是将来工业化应用的需求，如何建立一套快速高效的6’-脱羟基-BLM S的分离纯化方法都迫在眉睫。

发明内容

现有的分离纯化方法步骤较多，增加了生产的成本和目标产物在过程中的损耗；尤其是最后通过EDTA进行脱铜精制的步骤，使得6’-脱羟基-BLM S的回收率大大降低。针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种利用黄绿链霉重组工程菌SB9026来高效合成新型活性博莱霉素衍生物的分离和纯化方法，该方法简化并减少了分离纯化步骤，降低了生产成本，提高了脱铜率，增加了目标产物的回收率。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法，具体步骤为：

(1)收集黄绿链霉重组工程菌SB9026经过发酵培养后得到的发酵液，加入十二水合硫酸铝钾，每升发酵液中加入十二水合硫酸铝钾0.4g-0.6g，充分搅拌后，静置25-30分钟后再加入硅藻土，每升发酵液中加入硅藻土5g-6g，搅拌后进行固液分离，得到pH值为6-8的发酵上清液；所述黄绿链霉重组工程菌SB9026的保藏号为CCTCC M 2011292；

(2)向步骤(1)得到的发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂富集吸附1-2小时，每升发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂90ml-110ml；将吸附后的D113型弱酸性阳离子交换树脂装入分离柱I并用去离子水冲洗至洗提液无色，然后用1.5-2.5倍于分离柱I柱体积的质量浓度为0.4％-0.5％的NaCl溶液冲洗树脂柱，最后用质量浓度为10％-12％的NaCl溶液进行洗提，收集洗提液；

(3)将步骤(2)得到的洗提液与450ml-550ml Diaion HP-20树脂混合并在20℃-25℃的温度下震荡25min-35min进行吸附，将Diaion HP-20树脂装入分离柱II后用4.5-5.5倍于分离柱II柱体积的去离子水冲洗并排干残余水，然后用0.5-1.5倍分离柱体积的纯甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液浓缩蒸干后得到粗提物；

(4)将步骤(3)得到的粗提物用质量浓度为4％-5％的甲醇去离子水溶液溶解，离心去除不溶物后所得的上清液载入Silica Flash柱，并用4％-5％的甲醇去离子水溶液进行等梯度洗提，直至洗提液中不含目标产物6’-脱羟基-BLM S为止，收集洗提液合并浓缩后得到浅蓝色铜离子复合物粗品；

(5)将步骤(4)得到的铜离子复合物粗品脱铜精制：每1克铜离子复合物粗品用15ml-20ml甲醇溶解，得复合物溶液；每0.2g二乙基二硫代氨基甲酸钠用2ml-3ml甲醇溶解，得二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液；将复合物溶液与二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液充分混合，得混合溶液，使得混合溶液中铜离子复合物粗品与二乙基二硫代氨基甲酸钠的质量比为1:0.2-0.3；将混合溶液离心得到上清液，将上清液与丙酮按1:4-5的体积比充分混合，离心后去上清液，沉淀物用丙酮淋洗2-3次后在62℃-68℃下常压恒温干燥，得到不含铜离子的粗纯化产物；每1克的粗纯化产物用50ml-60ml去离子水充分溶解后，加入丙酮直至丙酮质量浓度达到65％-70％，在4℃-5℃的环境下静置18-20小时后进行离心处理，将离心处理后所得的上清液浓缩蒸干，得到不含铜离子的纯化6’-脱羟基-BLM S。

优选的具体步骤为：

(1)收集黄绿链霉重组工程菌SB9026经过发酵培养后得到的发酵液，加入十二水合硫酸铝钾，每升发酵液中加入十二水合硫酸铝钾0.5g，充分搅拌后，静置30分钟后再加入硅藻土，每升发酵液中加入硅藻土5g，搅拌后进行固液分离，得到pH值为7-8的发酵上清液；所述黄绿链霉重组工程菌SB9026的保藏号为CCTCC M 2011292；

(2)向步骤(1)得到的发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂富集吸附1-2小时，每升发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂100ml；将吸附后的D113型弱酸性阳离子交换树脂装入分离柱I并用去离子水冲洗至洗提液无色，然后用2倍于分离柱I柱体积的质量浓度为0.5％的NaCl溶液冲洗树脂柱，再用质量浓度为10％的NaCl溶液进行洗提，收集洗提液；

(3)将步骤(2)得到的洗提液与500ml Diaion HP-20树脂混合并在20℃-25℃的温度下震荡30min进行吸附，然后将Diaion HP-20树脂装填入分离柱II，用5倍于柱体积的去离子水冲洗并排干残余水，用1倍于分离柱II柱体积的纯甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液浓缩蒸干后得到粗提物；

(4)将步骤(3)得到的粗提物用质量浓度为5％的甲醇去离子水溶液溶解，离心去除不溶物后所得的上清液载入Silica Flash柱，并用5％的甲醇去离子水溶液进行等梯度洗提，直至洗提液中不含目标产物6’-脱羟基-BLM S为止，收集洗提液合并浓缩后得到浅蓝色铜离子复合物粗品；

(5)将步骤(4)得到的铜离子复合物粗品脱铜精制：每1克铜离子复合物粗品用15ml甲醇溶解，得复合物溶液；每0.2g二乙基二硫代氨基甲酸钠用2ml甲醇溶解，得二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液；将复合物溶液与二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液充分混合，得混合溶液，使得混合溶液中铜离子复合物粗品与二乙基二硫代氨基甲酸钠的质量比为1:0.2；将混合溶液离心得到上清液，将上清液与丙酮按1:4-5的体积比充分混合，离心后去上清液，沉淀物用丙酮淋洗3次后在65℃下常压恒温干燥，得到不含铜离子的粗纯化产物；将1克的粗纯化产物用50ml去离子水充分溶解后，加入丙酮直至丙酮质量浓度达到65％，在4℃-5℃的环境下静置18-20小时进行离心处理，将离心处理后得到的上清液浓缩蒸干，得到不含铜离子的纯化6’-脱羟基-BLM S。

步骤(2)、(3)、(4)、(5)中优选用以下分析方法来检测洗提液或粗提物中是否含有目标产物：采用高效液相色谱分析，以下百分含量均为质量百分含量，流动相A为99.0％去离子水和1.0％醋酸；流动相B为99.0％甲醇和1.0％醋酸，流速为1.0mL/min，紫外检测器波长为300nm，线性梯度分析程序为：0-10分钟，95％A/5％B至65％A/35％B；10-15分钟，65％A/35％B至95％A/5％B；15-20分钟，95％A/5％B。

本发明的原理是：

本发明的一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法，第(1)步是通过前处理尽可能地将发酵液中的不溶物和悬浮物去除，提高发酵上清液的质量，保证后继树脂吸附时的效率和延长树脂的使用寿命；第(2)步是通过离子交换将发酵上清液中的目标产物吸附富集，以达到初步分离的效果；第(3)步是通过大孔吸附树脂除去部分盐和色素，同时达到溶剂置换的效果(溶剂由水变为洗提液甲醇)，便于后继处理；第(4)步是通过柱层析方法将目标产物和其他副产物有效的分离，同时除去色素，以达到分离纯化的目的；第(5)步是将得到的铜离子复合物粗品进行脱铜精制，将复合物中的铜离子去掉，得到最终的目标产物，同时通过丙酮沉淀进行最后的精制，进一步提高目标产物的纯度。

第(1)步收集发酵液后，加入十二水合硫酸铝钾，充分搅拌后，再加入硅藻土搅拌后进行固液分离，得到pH值为7.5左右的发酵上清液。其中十二水合硫酸铝钾作为絮凝剂可以去除发酵液中的悬浮物质，硅藻土作为助滤剂可以帮助沉淀菌丝体和由十二水合硫酸铝钾絮凝下来的固体悬浮物质，添加两者极大地提高了固液分离效率，使得分离后得到的发酵上清液质量大幅提高，减少了后继处理过程中对树脂的影响(例如发酵上清液质量不好，清度不高时，容易导致树脂中毒，降低树脂的吸附效率和使用寿命，极大地增加生产成本等)。同时，得到的发酵上清液pH值为7.5左右，无须再进行pH值调节的前处理，简化了分离过程。

第(2)步中向发酵上清液中直接加入国产D113型弱酸性阳离子交换树脂进行富集吸附和洗涤，相比使用进口树脂而言可以明显地降低生产成本。

本方法在第(4)步分离前不需要用“sephadexLH-20柱和甲醇溶液进行洗提”的过程，减少了提纯工艺步骤，减少了目标产物的损失。

本方法第(4)步通过简单的Flash柱和等梯度洗脱分离方法，便可有效地将目标产物6’-脱羟基-BLM S纯化分离，无须使用诸如制备液相色谱这类高端仪器来分离和纯化，极大地降低了生产成本，简化了分离纯化过程。

第(5)步在进行最后的脱铜精制时，原始方法使用EDTA脱铜效率较低，脱铜不完全，脱铜率仅为80％左右，大大降低了最后的纯化产物回收率；本发明利用铜试剂对铜离子极强的捕捉能力，对脱铜工艺进行了改进，脱铜率提高到90％左右，提高了目标产物的回收率。

使用原始的分离纯化工艺(实施例2的工艺)，由于步骤繁多，且脱铜效率不高，产物回收率仅为15％左右；采用本发明中建立的分离提纯工艺，减少了分离纯化步骤，提高了脱铜的效率，使目标产物回收率提高到20％-25％。

下面对本发明做进一步的解释和说明：

本发明所述的博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，其化学结构通式如式(I)所示：

其中，R₁选自H、烷基、氨基、烃基、酰基、磺酰基、卤代烷基、杂烷基、羟基烷基、氨基烷基或-(CH₂)_n-C(NH₂)＝NH，其中n＝1-6；

R₂选自H或-OH；

所述烷基为C1-C6直链或支链脂族烃；

所述杂烷基指C1-C6直链或支链脂族烃，其中一个或者多个碳被O、S或N取代；

所述卤代烷基指C1-C6直链或支链脂族烃，其中一个或者多个碳被F、Cl或Br取代。

其中R₁优选为-(CH₂)_n-C(NH₂)＝NH，n＝1-4，优选n＝2。

当R₁为-(CH₂)₂-C(NH₂)＝NH，R₂为-OH时，对于本发明中的一种具体的化合物，化合物1，其标准分子式C₅₃H₇₉N₁₉O₂₁S₂([C₅₃H₇₉N₁₉O₂₁S₂+H]⁺，分子量为1382.5212，简称为BLM S(天赐102)，具体结构鉴定和活性测试参见实施例。

当R₁为-(CH₂)₂-C(NH₂)＝NH，R₂为H时，对于本发明中的另一种具体的化合物，化合物2，其标准分子式C₅₃H₇₉N₁₉O₂₀S₂([C₅₃H₇₉N₁₉O₂₀S₂+H]⁺，分子量为1366.5263，简称为6’-脱羟基-BLM S(天赐103)，具体结构鉴定和活性测试实施例。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1、本发明收集发酵液后，提高了固液分离效率，使得分离后得到的发酵上清液质量大幅提高，减少了后继处理过程中对树脂的影响，无须再进行pH值调节的前处理，简化了分离过程。

2、本发明的方法通过简单的Flash柱和等梯度洗脱分离方法，便可有效地将目标产物6’-脱羟基-BLM S纯化分离，无须使用诸如制备液相色谱这类高端仪器来分离和纯化，极大地降低了生产成本，简化了分离纯化过程；本发明的方法降低生产成本，减少了提纯工艺步骤，减少了目标产物的损失。

3、在进行最后的脱铜精制时，原始方法使用EDTA脱铜效率较低，脱铜不完全，脱铜率仅为80％左右，大大降低了最后的纯化产物回收率；本发明利用铜试剂对铜离子极强的捕捉能力，对脱铜工艺进行了改进，脱铜率提高到90％左右，提高了目标产物的回收率。

4、使用原始的分离纯化工艺，由于步骤繁多，且脱铜效率不高，产物回收率仅为15％左右；采用本发明中建立的分离提纯工艺，减少了分离纯化步骤，提高了脱铜的效率，使目标产物回收率提高到20％-25％。

附图说明

图1是通过pBluescript II SK(+)质粒松弛活性分析来测试BLM S(化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(化合物2)的DNA裂解活性，并与BLM A₂进行比较；

其中，图1(a)是固定浓度下的终点分析比较化合物1、化合物2和博来霉素A₂的DNA裂解活性；图1(b)以6’-脱羟基-BLM S(化合物2)诱导的DNA裂解为例通过动力学分析确定EC₅₀值；其中A代表超螺旋质粒DNA；B代表开环质粒DNA；C代表线形质粒DNA。

另外，本发明的保藏号CCTCC M 2011292的菌种保藏信息如下：

菌种名称为：黄绿链霉菌SB9026.

拉丁文学名为：streptomyces flavoviridis SB9026,

保藏编号为：CCTCC NO:M 2011292，

保藏日期为：2011年8月19日，

保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，

保藏单位地址：中国武汉，武汉大学。

具体实施方式

下面结合实施例进一步解释和说明本发明，以下所有百分含量均指质量百分含量。

实施例1：

黄绿链霉菌SB9001和实验中得到的基因工程突变菌株均在30℃的ISP4琼脂固体培养基上培养以获取孢子。轮枝链霉菌ATCC15003在含有0.5％甘氨酸的TSBY液体培养基中，28℃和250rpm转速下生长以获取基因组DNA。大肠杆菌在LB液体培养基中，37℃和250rpm转速下生长用于日常的质粒克隆，BAC文库的建立。

1)黄绿链霉菌SB9025突变株的构建

从包含一部分佐伯霉素生物合成基因簇zbm的科斯质粒中分离得到了大小为10kb的含有完整的zbmVIII基因的DNA片段，并通过BamHI和BglII酶切位点将该10kb DNA片段克隆到Litmus 28质粒上。所得质粒经SbfI酶切后将约3.7kb大小的插入片段移除，然后质粒再进行自我连接，完成zbmVIII基因的敲除。将这一更改过的DNA插入片段经过BamHI和BglII酶切后释放，并转移连接至pOJ260质粒中，所得质粒转入大肠杆菌S17-1中作为配体菌株与黄绿链霉菌SB9001进行接合转移实验。通过PCR实验对接合体进行筛选后分离得到双交换重组的黄绿链霉菌SB9025突变株，并最终通过DNA印迹实验对zbmVIII基因的敲除进行验证。

2)轮枝链霉菌ATCC15003基因组BAC文库的建立和筛选

基因组BAC文库的构建按照标准试验操作进行。对插入DNA片段的平均大小进行检查后，从平板上挑选的BAC克隆被转入冷冻的96孔板上并在-80℃冷藏过夜。随后这些克隆被转移到Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia,美国)上通过杂交进行固定，并与BlmA探针进行杂交实验。BlmA探针由引物BlmAF(5'-CATATGGTGAAATTCTTGGGTGCCG-3')和BlmAR(5'-AAGCCTCTCCCCCGCGGTGAAGTG-3')扩增得到。最后通过ORF32引物C-PHNA-F1(5'-GCAGCGTCATGAACAGGGTG-3')和C-PHNA-r1(5'-CCGGACCATCATGTAGCGAC-3')对杂交所得的阳性克隆进行PCR筛选，PCR扩增程序为：94℃2分钟；94℃30秒,55℃30秒，72℃1分钟共35个循环；72℃7分钟。最终筛选出包含完整blm基因簇的BAC质粒pBS54。

上述基因序列号码均在美国的Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上公开发布，zbmVIII基因(Genbank accession number：EU670723)，blm基因簇，以及BlmA探针和ORF32(Genbank accession number：AF149091，AF210249)。

3)黄绿链霉菌SB9026的构建和发酵培养

将BAC质粒pBS54转入黄绿链霉菌SB9025突变株中得到黄绿链霉菌SB9026，并通过PCR实验和DNA印迹实验对blm基因簇的转入进行验证。将黄绿链霉菌SB9026的孢子悬浮液接种至50ml种子培养基(15g/L甘油，15g/L药用培养基药媒，3g/L NaCl，2g/L天冬酰胺酸，pH值用1N盐酸调至7.0)中生长。在30℃和250rpm转速下培养2天后，50ml种子培养基被转接到500ml发酵培养基(6.4g/L粟米果冻，5g/L葡萄糖，35g/L黄豆粉，7.5g/L玉米浆，2g/LNaNO₃，3g/L NaCl，1g/L K₂HPO₄，0.1g/L CuSO₄·5H₂O，0.5g/L ZnSO₄·7H₂O，pH值用1N盐酸调至7.0)中，在30℃和250rpm转速下发酵12天。

实施例2：

新型博莱霉素类似物BLM S(天赐102，化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(天赐103，化合物2)的分离提纯和检测

将发酵液离心后所得的上清溶液进行高效液相(HPLC)检测分析，流动相A为99.9％去离子水和0.1％醋酸，流动相B为99.9％甲醇和0.1％醋酸，流速为0.8mL/min，紫外检测器波长为300nm。线性梯度分析程序为：0-30分钟，100％A/0％B至0％A/100％B。其余上清液用1N盐酸调至pH 7.0后载入Amberlite IRC50(NH₄ ⁺ type)树脂柱，经10倍柱体积去离子水冲洗后，用2升20％醋酸铵溶液进行洗提。得到的洗提液与Diaion HP-20树脂混合并在室温下温和震荡45分钟进行吸附，然后将HP-20树脂装填入柱用10倍柱体积去离子水冲洗并排干残余水，用5倍柱体积的甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液进行浓缩后得到粗提物。将粗提物再次载入Sephadex LH-20柱并用甲醇进行洗提，含有化合物1和2的组分被分别合并蒸干，最后通过半制备高效液相进行提纯。制备柱首先用100％A进行平衡，然后用线性梯度程序(0-20分钟，100％A/0％B至36％A/64％B)进行洗脱，流量为3mL/min，紫外探测波长为300nm。化合物1在11.1分钟被洗脱，化合物2在11.4分钟被洗脱，所得的洗脱液冻干蒸发后得到纯的浅蓝色铜离子复合物1和2。将铜离子复合物用0.5M EDTA-Na(pH 7.0)溶液处理后得到不含铜离子的纯化产物，白色粉末状化合物1和化合物2。

BLM S(天赐102，化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(天赐103，化合物2)的结构分析说明：

两种新型博莱霉素类似物通过全面的光谱分析进行了完整的结构表征。紫外光谱分析(最大波长分别为200、248和294nm)证明了化合物1和2含有博莱霉素族化合物中特有的双噻唑发光基团。高分辨基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)分析得到化合物1的[M+H]⁺分子离子峰(m/z)为1382.5274，与其标准分子式C₅₃H₇₉N₁₉O₂₁S₂([C₅₃H₇₉N₁₉O₂₁S₂+H]⁺,分子量为1382.5212)的数值一致。¹H与¹³C核磁共振谱(NMR)，以及二维NMR的联合分析表明化合物1中含有博莱霉素的特征结构部分，包括金属离子结合功能域(嘧啶并blamic酸(PBA)子单元以及临近的羟基化组氨酸)、(2S,3S,4R)-4-氨基-3-羟基-2-甲基戊酸(AHM)子单元、糖基团和双噻唑基团。此外，化合物1的核磁共振数据表明其结构中还含有佐伯霉素的末端胺基链3-氨基丙酰胺(APA)[δ_C 169.2(s),33.0(t),and 36.9(t)；δ_H 3.82(m)and 2.83(t,J＝6.8Hz)]。通过对HMBC和COSY的进一步详细分析，尤其是对HMBC中H₂-51(δ_H 3.82)与两个三级碳原子(C-53和C-49)的主要交联信号峰的分析，化合物1被推断为由BLM骨架和ZBM的末端胺基基团组成(表1和2)。

化合物2的高分辨基质辅助激光解吸电离质谱[M+H]⁺分子离子峰(m/z)为1366.5198，与其标准分子式C₅₃H₇₉N₁₉O₂₀S₂([C₅₃H₇₉N₁₉O₂₀S₂+H]⁺,分子量为1366.5263)的数值一致。化合物2与化合物1的核磁共振数据对比表明(表1和2)两者结构十分相似，仅仅在二糖侧链的C-50位置上存在差异，化合物1在C-50位置连接了一个羟基，而在化合物2中则被甲基取代了。这说明化合物2的结构中含有与佐伯霉素相同的糖基团和末端胺基基团。

BLM S(天赐102，化合物1):[α]_D ²³+26.5(c 0.1,CH₃OH)；LC-MS(阳离子)m/z 722.3[M+Cu]²⁺；HR-MALDIMS(阳离子)m/z 1382.52121(C₅₃H₈₀N₁₉O₂₁S₂[M+H]⁺,1382.52745)。¹H和¹³CNMR数据见表1和2。

6’-脱羟基-BLM S(天赐103，化合物2)：[α]_D ²³+18.1(c 0.10,CH₃OH)；LC-MS(阳离子)m/z 714.4[M+Cu]²⁺；HR-MALDIMS(阳离子)m/z 1366.51983(C₅₃H₈₀N₁₉O₂₀S₂[M+H]⁺,1366.51983).¹H和¹³C NMR数据见表1和2。

BLM S(天赐102，化合物1)与6’-脱羟基-BLM S(天赐103，化合物2)的结构式如下：

表1.BLM S(天赐102，化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(天赐103，化合物2)在D₂O中的¹H核磁共振数据(500Hz,δ：ppm，J＝Hz)

表2.BLM S(天赐102，化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(天赐103，化合物2)在D₂O中的¹³C核磁共振数据(125Hz,δ：ppm)及对应的结构

实施例3：

BLM S(天赐102，化合物1)和6’-脱羟基-BLM S(天赐103，化合物2)DNA裂解活性测试

在Fe²⁺存在条件下，分别对BLM S、6’-脱羟基-BLM S和博莱霉素A₂(BLM A₂)的生物活性进行测试比较。以超螺旋质粒DNApBluescript II SK(+)的质粒松弛活性分析为依据，博莱霉素族化合物介导的单链裂解首先将超螺旋质粒DNA(form A)转化为开环质粒DNA(form B)，随后的双链裂解再将其变为线形质粒DNA(form C)。DNA裂解活性测试实验的反应总体积为10μl，其中包含25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，约0.65μg的pBluescript SKII(+)质粒DNA，5μM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O(在1mM H₂SO₄溶液中新鲜配制)和一定浓度的待测活性化合物(BLM S、6’-脱羟基-BLM S和BLM A₂)。该体系在35℃下反应30min后加入5mMEDTA和5μl染液(30％甘油中含有0.25％(w/v)苯酚蓝)结束反应，待测样品进行电泳实验后于紫外灯下观察DNA条带分布。

观察结果发现在所有测试中，待测活性化合物对DNA裂解活性均与其浓度相关。BLM S与BLM A₂的活性相当，两者的EC₅₀值分别为300nM和320nM。而6’-脱羟基-BLM S的活性至少是BLM A₂的10倍以上，其EC₅₀值仅为30nm(图1)。

BLM S和6’-脱羟基-BLM S的结构差异与其抗癌活性之间的关系

因为博莱霉素族抗癌抗生素的临床重要性，为了开发高效低毒的新型抗癌药物进行了大量的研究来确定其分子结构与生物活性之间的关联。一般认为博莱霉素分子骨架中的双噻唑和C-末端的胺基部分对博莱霉素化合物与DNA之间的亲和作用起了主导作用，而且有可能影响着对DNA的辨识和DNA裂解的选择性；而糖基团的功能尚未明确，很有可能参与了博莱霉素与细胞的辨识过程，尤其是细胞的摄取和金属离子的配位等。本发明涉及的BLM S是由博莱霉素的多肽分子骨架包括糖基团部分与佐伯霉素的C-末端胺基链结合而成，而6’-脱羟基-BLM S则是由博莱霉素的多肽分子骨架与佐伯霉素的C-末端胺基链和糖基团部分结合而成。根据BLM S、6’-脱羟基-BLM S和BLM A₂的DNA裂解活性测试比较，BLM S(EC₅₀＝320nM)与BLM A₂(EC₅₀＝300nM)的生物活性相当，因此博莱霉素与佐伯霉素的末端胺基基团互换以后并未明显影响其生物活性；对于6’-脱羟基-BLM S和BLM A₂而言，6’-脱羟基-BLM S(EC₅₀＝30nM)强于10倍以上的DNA裂解活性则首次揭示了糖基团在决定博莱霉素族化合物的生物活性中扮演了重要的角色。

博莱霉素有独特的分子结构和生物活性，能够介导激活氧分子，并选择性地引起单链和双链DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。此外，博莱霉素还可以选择性地裂解RNA从而抑制蛋白质的合成。因此博莱霉素族化合物的DNA裂解活性的强弱直接反映了其抗癌活性的高低。6’-脱羟基-BLM S极强的DNA裂解活性也预示其更好的抗癌活性，因此可以减少其临床用量并极大地降低其剂量依赖性肺毒性，从而克服了当前博莱霉素临床治疗应用的一大挑战，很有希望成为博莱霉素族化合物中的新型抗癌药物。

实施例4：制备方法的进一步改进

黄绿链霉重组工程菌SB9026在30℃，ISP4琼脂固体培养基上培养以获取孢子。在摇瓶条件下进行6’-脱羟基-BLM S的发酵制备时，首先将200μl黄绿链霉重组工程菌SB9026的孢子悬浮液接种至容纳50ml优化种子培养基的250ml广口三角锥形瓶中，在30℃和210rpm转速下培养48小时；然后按照10％(v/v体积比)的发酵接种量，将10ml上述培养48小时的种子培养基转接到含有100ml发酵培养基的250ml三角锥形瓶中，在30℃和210rpm转速下发酵10天。目标产物6’-脱羟基-BLM S的分离提取和分析检测方法见实施例1-3。以下所有百分含量均指质量百分含量。

1：新型博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM S(天赐103)的稳定高产菌株筛选

原始的黄绿链霉重组工程菌SB9026为氨基糖苷类抗生素阿普拉霉素(Apramycin)抗性菌株。为获得纯化的单一菌落，SB9026的孢子悬浮液被稀释了10⁶倍后被均匀涂布在含有50mg/L阿普拉霉素的ISP4琼脂固体培养基平板上，并置于30℃下培养。培养7天后观察单菌落生长情况，挑选并标记生物形态特异的单菌落，在培养至10天左右，孢子接近成熟时，挑选所标记的单菌落进行进一步培养和目标产物效价测试评定，筛选6’-脱羟基-BLM S的稳定高产菌株。最终，我们在分离得到的352个单菌落中挑选了36株进行筛选(挑选及分类的有关描述详见表1)，并从中得到了一株生长和形态稳定且6’-脱羟基-BLM S产量较高的生产菌种，用于后继的研究和生产。

表3 分离所得单菌落的生长形态描述以及筛选测试菌种的来源

菌种编号为23和24的菌种为优良的高产菌株，菌落生长形态为灰色孢子中间间零星白色菌丝的状态。

2：新型博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM S(天赐103)的微生物发酵制备培养基优化改良

1)黄绿链霉重组工程菌SB9026的优化种子培养基

黄绿链霉重组工程菌SB9026的原始种子培养基中包含15g/L甘油、15g/L药用培养基药媒、3g/L NaCl和2g/L天冬酰胺酸，然后pH值用1N盐酸调至7.0。

考虑到原料的常规性和价格，我们用常规棉籽粉替代药用培养基药媒，用蛋白胨替代天冬酰胺酸，并对相关用量进行比较后得到了优化改良的种子培养基，其中包含15g/L甘油、15g/L棉籽粉、3g/L NaCl和5g/L蛋白胨，充分溶解后用2M NaOH调节pH值至7.0。使用优化种子培养基后，在相同接种量和培养条件下，菌体的生长速度及接种发酵时的菌体密度与使用原始种子培养基时的情况相当，最后的6’-脱羟基-BLM S发酵产量也基本相同，但是使用优化种子培养基时要略好与使用原始种子培养基时，且优化种子培养基的生产成本要明显低于原始种子培养基。

2)黄绿链霉重组工程菌SB9026的优化发酵培养基

黄绿链霉重组工程菌SB9026的原始发酵培养基中包含6.4g/L粟米果冻、5g/L葡萄糖、35g/L黄豆粉、7.5g/L玉米浆、2g/L NaNO₃、3g/L NaCl、1g/L K₂HPO₄、0.1g/L CuSO₄·5H₂O和0.5g/L ZnSO₄·7H₂O，然后pH值用1N盐酸调至7.0。

首先进行碳源的优化改良，分别使用葡萄糖、果糖、甘露醇、甘油、麦芽糖、糊精、玉米粉、可溶性淀粉、半乳糖、乳糖、山梨醇、鼠李糖和豆油作为初始碳源，并评价各个条件下的6’-脱羟基-BLM S产量。最终的比较结果表明，葡萄糖和甘露醇作为单一碳源时能较好的支持6’-脱羟基-BLM S的生物合成，考虑到甘露醇的价格至少是葡萄糖的7倍，我们采用葡萄糖作为发酵培养基的第一速效碳源，随后经过多元优化将可溶性淀粉定为第二长效碳源，并经过一系列测试比较后最终确定两者的用量为20g/L葡萄糖和15g/L可溶性淀粉时为最佳组合。

在确定了碳源组成后，氮源优化对包括蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、酵母膏、麦芽提取物、牛肉浸膏、酶解干酪素、玉米浆、玉米粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米蛋白粉、胰蛋白粉和小麦胚芽粉在内的14种常用氮源进行了比较。最终的比较结果表明，胰蛋白胨、酵母粉、酶解干酪素和黄豆饼粉均可很好地支持6’-脱羟基-BLM S的生物合成，随后的多元组合优化表明酵母粉和黄豆饼粉的组合在效价和生产成本等方面要明显优于其它化合物组合，经过一系列测试比较后最终确定两者的用量为20g/L黄豆粉和5g/L酵母粉时为最佳组合。

最后对培养基中的无机盐进行优化，比较测试结果表明，Cu²⁺和Zn²⁺的用量都已经达到最佳，无需再次调整；磷酸盐虽然能促进菌体的生长，但是对6’-脱羟基-BLM S的生物合成有一定抑制作用，不加时6’-脱羟基-BLM S的产量反而略有提升；NaNO₃和NaCl的添加与否对菌体生长和6’-脱羟基-BLM S的产量毫无影响；根据文献报道和经验，添加一定量的CaCO₃可以平衡发酵液的pH值，并且有利于菌丝体的生长，最终确定优化后无机盐的组成为0.1g/L CuSO₄·5H₂O、0.5g/L ZnSO₄·7H₂O和3g/L CaCO₃。

在对碳源、氮源和无机盐等主要成分进行单因素和多元响应面优化后，最终确定的优化发酵培养基包含20g/L葡萄糖，15g/L可溶性淀粉，20g/L黄豆粉，5g/L酵母粉，0.1g/LCuSO₄·5H₂O，0.5g/L ZnSO₄·7H₂O和3g/L CaCO₃，充分溶解后用2M NaOH调节pH值至7.0，该组成与原始发酵培养基相比得到了明显的简化，大大降低了生产成本。

在使用优化的种子培养基和发酵培养基对新型博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLMS进行微生物发酵制备时，发酵周期由原始的12天缩短到9至10天，6’-脱羟基-BLM S的产量可达15mg/L左右，比原始产量提高了近3倍。

3：新型博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM S(天赐103)的发酵罐发酵制备工艺

采取逐级放大的方式对黄绿链霉重组工程菌SB9026进行上罐发酵培养。先将300μl黄绿链霉重组工程菌SB9026的孢子悬浮液接种到60ml优化种子培养基中进行第一级放大，在32℃下培养24小时后转至600ml发酵培养基中进行第二级放大，并在32℃再次培养24至36小时直至菌丝体密度达到肉眼可见密集程度；随后将此600ml发酵培养基转接至装有6L发酵培养基的15L发酵罐中进行最后的发酵培养以制备新型博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM S。发酵罐开始培养时，初始温度为32℃；初始pH值为6.8左右；溶氧值与转速设置成联动，溶氧的下限值为30％，转速范围为210-400rpm。当发酵罐培养至24小时左右，溶氧和转速开始联动时，将培养温度降低至30℃。当发酵罐培养至60小时左右，发酵液溶氧值跌至最低，转速在最高值运转，此时将培养温度进一步降低至28℃。在发酵培养后期约120小时左右，发酵液溶氧值和pH值开始上升时，开始按照补加葡萄糖溶液，并通过二硝基水杨酸(DNS)试剂法实时测定发酵液中残留的还原糖浓度，通过调节补料的频率和速度以及葡萄糖溶液的浓度，使发酵液中残糖浓度维持在1g/L左右，同时pH值维持在7.5以下，溶氧在40％-60％。当发酵罐维持补充葡萄糖3天左右，溶氧和pH值开始进一步上升，此时整个发酵周期结束，按照标准流程对发酵液进行处理后，分离提取和纯化目标产物6’-脱羟基-BLM S并进行定量分析。

经过对发酵过程中温度、转速、pH值控制及原料补充控制等重要发酵参数的人工调控，最终的发酵制备周期缩短至8天左右，6’-脱羟基-BLM S的产量可达30mg/L左右，比原始产量提高了近6倍，并且总产物中目标化合物6’-脱羟基-BLM S和副产物BLM S的组成由原始的1:1变为3:1，简化了后继的分离和纯化等工作。

实施例5：分离和纯化方法的进一步改进

现有的分离纯化方法步骤多，增加了生产的成本和目标产物在过程中的损耗；尤其是最后通过EDTA进行脱铜精制的步骤，使得6’-脱羟基-BLM S的回收率大大降低。针对以上现有技术的不足，现对分离和纯化方法做进一步改进：

(1)收集发酵培养后得到的发酵液，加入十二水合硫酸铝钾，每升发酵液中加入十二水合硫酸铝钾0.5g，充分搅拌后，再加入硅藻土，每升发酵液中加入硅藻土5g，搅拌后进行固液分离，得到pH值为7-8的发酵上清液；

(2)向步骤(1)得到的发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂富集吸附1-2小时，每升发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂100ml；吸附后填充分离柱I并用去离子水冲洗至洗提液无色，然后用2倍于分离柱I柱体积的质量浓度为0.5％的NaCl溶液冲洗树脂柱，再用质量浓度为10％的NaCl溶液进行洗提，收集洗提液；

(3)将步骤(2)得到的洗提液与Diaion HP-20树脂混合并在20℃-25℃的温度下震荡30min进行吸附，然后将Diaion HP-20树脂装填入分离柱II，用5倍于分离柱II柱体积的去离子水冲洗并排干残余水，用1倍分离柱II柱体积的纯甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液浓缩蒸干后得到粗提物；

(4)将步骤(3)得到的粗提物用质量浓度为5％的甲醇去离子水溶液溶解，离心去除不溶物后所得的上清液载入Silica Flash柱(25g，月旭材料科技有限公司)，并用5％的甲醇去离子水溶液进行等梯度洗提，直至洗提液中不含目标产物6’-脱羟基-BLM S为止，收集洗提液合并浓缩后得到浅蓝色铜离子复合物粗品；

(5)将步骤(4)得到的铜离子复合物粗品脱铜精制：每1克铜离子复合物粗品用15ml甲醇溶解，得复合物溶液；每0.2g二乙基二硫代氨基甲酸钠用2ml甲醇溶解，得二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液；将复合物溶液与二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液充分混合，得混合溶液，使得混合溶液中铜离子复合物粗品与二乙基二硫代氨基甲酸钠的质量比为1:0.2；将混合溶液离心得到上清液，将上清液与丙酮按1:4-5的体积比充分混合，离心后去上清液，沉淀用丙酮淋洗3次后在65℃下常压恒温干燥，得到不含铜离子的粗纯化产物；将1克的粗纯化产物用50ml去离子水充分溶解后，加入丙酮直至丙酮量浓度达到65％，在4℃-5℃的环境下静置18-20小时离心，离心所得的上清液浓缩蒸干，得到不含铜离子的纯化6’-脱脱羟基-BLM S。

原始方法(也就是实施例2所述的方法)使用EDTA脱铜效率较低，脱铜不完全，脱铜率80％左右，原始方法的目标产物回收率只有15％左右，本发明利用铜试剂对铜离子极强的捕捉能力，对脱铜工艺进行了改进，脱铜率提高到90％左右，同时改进后的方法减少了工艺步骤，减少目标产物的损失，从而达到降低成本并增加了回收率的目的，通过改进后的分离和纯化方法，目标产物回收率提高到20％-25％。

分析检测方法：

针对检测样品的来源不同开发出两套分析检测方法。离心处理后所得的发酵上清液通过高效液相色谱仪(HPLC)在C-18反相柱上(4.6x150mm)进行检测分析，流动相A为99.0％去离子水和1.0％醋酸；流动相B为99.0％甲醇和1.0％醋酸，流速为1.0mL/min，紫外检测器波长为300nm，线性梯度分析程序为：0-10分钟，95％A/5％B至65％A/35％B；10-20分钟，65％A/35％B至5％A/95％B；20-30分钟，5％A/95％B至95％A/5％B；30-35分钟，95％A/5％B。针对经过树脂分离提纯后的样品进行检测和分析时，其它条件不变，线性梯度分析程序为：0-10分钟，95％A/5％B至65％A/35％B；10-15分钟，65％A/35％B至95％A/5％B；15-20分钟，95％A/5％B。这样可以提高分析检测的效率，节省分析时间。

对不同来源样品采用不同的分析检测方法，可以有效地节省分析时间，提高了分析效率；同时对流动相和梯度程序进行重新改进后，提高了分析方法的灵敏度，有效地延长了HPLC中紫外探测灯和反相分析柱的工作寿命，最终降低了生产成本。

Claims

1.一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法，其特征是，具体步骤为：

(3)将步骤(2)得到的洗提液与450ml-550ml Diaion HP-20树脂混合并在20-25℃的温度下震荡25min-35min进行吸附，将Diaion HP-20树脂装入分离柱II后4.5-5.5倍于分离柱II柱体积的去离子水冲洗并排干残余水，然后用0.5-1.5倍分离柱体积的纯甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液浓缩蒸干后得到粗提物；

2.根据权利要求1所述一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法，其特征是，具体步骤为：

3.根据权利要求1或2所述一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法，其特征是，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中用以下分析方法来检测洗提液或粗提物中是否含有目标产物：采用高效液相色谱分析，以下百分含量均为质量百分含量，流动相A为99.0％去离子水和1.0％醋酸；流动相B为99.0％甲醇和1.0％醋酸，流速为1.0mL/min，紫外检测器波长为300nm，线性梯度分析程序为：0-10分钟，95％A/5％B至65％A/35％B；10-15分钟，65％A/35％B至95％A/5％B；15-20分钟，95％A/5％B。