CN101445784B - 布雷正青霉变种zjb082702及其发酵制备布雷菲德菌素a的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种布雷菲德菌素A高产菌株——布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)变种ZJB082702，及其在发酵制备布雷菲德菌素A中的应用。布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)变种ZJB082702，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2008年07月31日，保藏编号CCTCCNo：M 208113。利用该菌株发酵制备布雷菲德菌素A，产率较高，布雷菲德菌素A浓度最高可达943.8mg/L发酵液。
Description
(一)技术领域
本发明提供了一株布雷菲德菌素A高产菌株——布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)变种ZJB082702，及其在发酵制备布雷菲德菌素A中的应用。
(二)背景技术
布雷菲德菌素A(Brefeldin A)是一种天然存在的大环内酯类抗生素，化学名[(1R，2E，6S，10E，11as，14aR)-1，6，7，8，9，11a，12，13，14，14a-Decahydro-1，13-dihydroxy-6-methyl-4H-cyclopent[f]oxacyclotridecin-4-one]，分子式为C16H24O4，分子量为280，结构式如下：
1958年，首次报道从Penicillium decumbens发酵液中分离得到布雷菲德菌素A(Singleton等，1958)。早期研究发现，布雷菲德菌素A抑制蛋白质由内质网向高尔基体复合物转运过程，具有抗细菌、抗真菌和抗病毒性质。由于布雷菲德菌素A影响蛋白质转运、加工过程，布雷菲德菌素A已成为细胞生物学家研究哺乳动物细胞信号转导途径的重要分子工具。1963年，NCI发现，在小鼠肿瘤模型上布雷菲德菌素A表现出抗肿瘤活性，小鼠的LD50大于200mg/kg。研究发现，布雷菲德菌素A通过不依赖于p53凋亡机制诱导人前列腺癌细胞凋亡，Akira等联合使用低剂量布雷菲德菌素A提高吉西他滨(Gemcitabine)对人胰腺癌细胞MIAPaCa-2细胞线的作用效果，布雷菲德菌素A及其化学衍生物具有除草活性。
布雷菲德菌素A生产方法分为化学合成法和发酵法，化学法合成布雷菲德菌素A具有反应步骤冗长、收率低等缺陷；发酵法生产布雷菲德菌素A具有高效和环境友好的特点，但已报道的菌种发酵水平偏低，难以满足商品化生产的要求。文献报道产布雷菲德菌素A的菌种包括青霉属(Penicillium)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、蓝青霉(Penicilliumcyaneum)、苜蓿假盘菌(Phyllosticta medicaginis)、壳二孢属(Ascochyta)、拟青霉(Paecilomyces sp.)、布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、分支孢属(Cladosporium sp.)、链格孢菌属(Alternaria zinniae)、茎点霉属(Phoma)、踝节菌属(Talaromyces sp.)。目前关于布雷菲德菌素A生产制备的文献报道较少，美国专利U.S.3896002公开了产布雷菲德菌素A的菌株苜蓿假盘菌(P.medicaginis)及布雷菲德菌素A制备过程，P.medicaginis 25℃发酵5天，布雷菲德菌素A浓度达300mg/L。在中试规模上，E.brefeldianum ATCC 58665合成布雷菲德菌素A发酵单位达到169mg/L(McCloud等，1995)。赵玉芬等进行了布雷菲德菌素A产生菌选育和布雷菲德菌素A结构改造工作，她们报道的布雷菲德菌素A小试发酵水平为151.6mg/L。除制备工艺外，改性是布雷菲德菌素A研究的另一个热点，美国专利U.S.6,362,218、U.S.5,824,674、U.S.5,696,154、U.S.5,112,607、U.S.4,608,078公开了布雷菲德菌素A的衍生化反应及衍生物的生物学活性。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株布雷菲德菌素A高产菌株(布雷菲德菌素A浓度最高可达943.8mg/L发酵液)——布雷正青霉(Eupenicilliumbrefeldianum)变种ZJB082702，及其在发酵制备布雷菲德菌素A中的应用。
本发明采用的技术方案是：
布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)变种ZJB082702，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏日期2008年07月31日，保藏编号CCTCC No：M 208113。
本发明菌株出发菌株是从采集于杭州周边景区的植物内生真菌样本中分离到的布雷正青霉，菌株编号为A1163。
本发明还涉及布雷正青霉变种ZJB082702在微生物发酵制备布雷菲德菌素A中的应用。
具体的，所述应用为：将布雷正青霉变种ZJB082702接种至适用于布雷正青霉的发酵培养基，20～35℃发酵3～9天，发酵结束后，发酵液经分离纯化得到所述布雷菲德菌素A。
本发明设计的分离工艺如下：发酵液离心，收集沉淀和上清液，上清液经乙酸乙酯充分萃取后收集萃取相；沉淀用乙酸乙酯浸提，离心收集乙酸乙酯液相；合并萃取液，水洗，无水硫酸钠脱水，回收乙酸乙酯，得到粗提取物用丙酮溶解，过滤，室温下过夜结晶，重结晶，得到布雷菲德菌素A晶体。
本发明公开适用于专利保藏菌株布雷正青霉的发酵培养基，本发明中所述发酵培养基终浓度组成如下：淀粉5～25.0g/L，葡萄糖10～40.0g/L，酵母膏0.5～2.5g/L，玉米浆0.5～2.5g/L，黄豆饼粉0.25～1.0g/L，麦芽浸出物0.5～4.0g/L，硫酸镁1～5.0g/L，磷酸二氢钾2～6.0g/L，碳酸钙2～8.0g/L，硝酸钠0.25～1.5g/L，硫酸铜0.5～4.0×10-2g/L，吐温800.5～5.0g/L，pH值4～9。
优选的，所述应用如下：
(1)布雷正青霉变种ZJB082702接种至PDA斜面培养基，25～35℃培养2～7天，以生理盐水洗下孢子，配成孢子悬液；
(2)孢子悬液接种至种子培养基，25～35℃培养2～3天，得到种子液，所述种子培养基终浓度组成为：麦芽糖20～40.0g/L，麦芽浸出粉0.5～1.5g/L，酵母浸出粉1～4.0g/L，磷酸二氢钾1～3.0g/L，硫酸镁1～3.0g/L，碳酸钙2～6.0g/L，pH4～9，121℃高压灭菌20分钟；
(3)种子液以1～15％体积比接种至发酵培养基，25～35℃培养4～8天，得到发酵液，所述发酵培养基终浓度组成如下：淀粉5～25.0g/L，葡萄糖10～40.0g/L，酵母膏0.5～2.5g/L，玉米浆0.5～2.5g/L，黄豆饼粉0.25～1.0g/L，麦芽浸出物0.5～4.0g/L，硫酸镁1～5.0g/L，磷酸二氢钾2～6.0g/L，碳酸钙2～6.0g/L，硝酸钠0.25～1.5g/L，硫酸铜0.5～4.0×10-2g/L，吐温800.5～5.0g/L，pH值4～9，121℃高压灭菌20分钟；
(4)发酵液离心，收集沉淀和上清液，上清液浓缩，经乙酸乙酯充分萃取后收集萃取相；沉淀用乙酸乙酯浸提，离心收集乙酸乙酯液相；合并萃取液，水洗，无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到粗提取物用丙酮溶解，过滤，室温下过夜结晶、重结晶，得到无色棱状布雷菲德菌素A晶体。
发酵液中布雷菲德菌素A浓度采用高效液相色谱分析：发酵液振荡均匀，移取6.0ml置于10ml离心管中，加入3.0ml乙酸乙酯，混合均匀，充分萃取，吸取1.0ml萃取液，吹风机吹干后加入1.0ml甲醇溶解样品，离心，0.45μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析；HPLC分析条件：色谱柱，250mm×4.6mm Rascil C18反相柱；流动相采用甲醇∶水(70∶30，v/v流速0.6mL/min，进样量为5.0μL，柱后流出物依次经UV检测；UV检测波长为230nm。
本发明所涉及的抗肿瘤抗生素及其合成微生物是通过以下的程序获得的：
1)菌种筛选将采集的植物内生真菌样本接种到含抗细菌抗生素富集培养基中，富集培养基组成：麦芽糖培养基，pH值调节至酸性。在28℃、150rpm条件下振荡培养6天。从富集培养物中分离单菌落，单一菌株逐一接种至新鲜无菌PDA培养基，在28℃，150rpm摇床上培养6天。发酵液8000rpm离心10分钟，弃沉淀，收集澄清发酵液，发酵液经处理后，4℃保藏，备用。选择白色念珠菌为模型致病菌，考察上述发酵液的抑菌活性。抑菌实验结果揭示，7株菌株呈阳性，其中编号为A1163菌株抑菌圈最大，活性最强。
2)菌种鉴定菌株A1163接种于新鲜无菌MEM液体培养基(培养基组成：葡萄糖20.0g/L，麦芽汁2.0g/L，酵母膏2.5g/L，蛋白胨2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，水合硫酸镁2.0g/L，碳酸钙4.0g/L，pH值自然)，28℃培养6天。发酵液经乙酸乙酯萃取次级代谢产物，水洗，无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到粗提取物，用丙酮溶解粗提取物，过滤，室温下过夜结晶，重结晶，得到无色棱状结晶，即菌株A1163次级代谢产物化合物A。
该新菌株的特征如下：
菌落形态：菌株A1163在固体PDA、查氏、马丁氏、沙氏培养基上生产良好。在固体沙氏培养基上，菌落呈绒毛状，有绒毛边缘；中央产生菌核，早期呈白色，之后菌落中间逐渐变为中间黄绿色，并稍有隆起，后期菌落变成灰褐色；菌落有皱褶，菌落不透明，有无色透明渗出液，不合成水溶性色素；背面棕黄色，培养4天后菌落直径约4.1cm；显微观察发现，菌丝体有横隔，分生孢子梗有横隔，顶端无膨大的顶囊，但观察到扫帚状的分枝；小梗顶端有串生分生孢子，分生孢子呈椭圆形(见图1)。
菌株A1163次级代谢产物化合物A结构鉴定：化合物A结晶为无色、棱形晶体，易溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于水、氯仿。红外光谱图揭示，样品在3366cm-1处强烈的-OH伸缩振动吸收峰，在1712cm-1、1644cm-1、1257cm-1出现的特征吸收峰分别对应于C＝O、C＝C、C-O伸缩振动。13C-NMR谱(MeOD)揭示该化合物含有16个碳信号：C16(δ21.22)，C13(δ28.15)，C12(δ33.12)，C14(δ35.12)，C6(δ41.99)，C8(δ44.23)，C9(δ45.59)，C5(δ53.31)，C7(δ73.11)，C15(δ73.34)，C4(δ76.76)，C2(δ117.92)，C11(δ131.54)，C10(δ138.27)，C3(δ155.25)，C1(δ168.50)，1H-NMR谱(MeOD)揭示该化合物A含有24个氢信号，化合物A不饱和度为5。
样品结晶TIC色谱分析，在保留时间7.05分钟处有一个主要的单一峰。该单一洗脱峰质谱分析显示，化合物A的具有2种准分子离子峰303.2[M+Na]+、583.3[2M+Na]+，因此，化合物A计算分子量为280。
X-射线晶体衍射分析：化合物A单晶X-射线衍射分析结果，晶胞参数分别为：a＝7.3943(3)
b＝11.0212(6)c＝18.8768(8)，V＝1538.15
3，P 212121，目标化合物的分子式为C16H24O4，分子结构式如图2所示，化合物A结构为布雷菲德菌素A。
ITS序列分析：以提取到的菌株A1163细胞总DNA为模板，利用引物：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’扩增菌株A1163的ITS基因，将基因产物同T载体连接，经测序确认该片段实际长度为591bp，将该序列与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，该菌与菌(Eupenicilliumbrefeldianum)的同源性最高(homology，99.47％，based on ITS)。
综合上述鉴定结果，该菌株A1163属于布雷正青霉(Eupenicilliumbrefeldianum)。
3)菌种特性28℃，野生型布雷正青霉A1163在液体PDA培养基中培养5天，发酵液中除了主要的次级代谢产物布雷菲德菌素A以外，还存在咪唑类核酸物质咪唑立宾(Mizoribine，bredinin)；发酵培养基中补充0～1.0mol/l乙酸酯和(或)丙二酸酯对菌种布雷菲德菌素A发酵单位无显著影响；37℃，野生型布雷正青霉A1163不能生长繁殖；布雷正青霉A1163发酵液具有特征性气味，发酵液没有皂甙水解酶活性；在最适条件下，布雷菲德菌素A发酵单位接近5.6mg/l发酵液。
4)菌种诱变鉴于野生型布雷正青霉A1163发酵水平有限，达不到工业化生产的要求，对菌种孢子采用低能离子注入技术进行诱变育种，低能离子注入诱变育种程序如下：1.孢子悬浊液制备：布雷正青霉A1163接种至PDA固体培养基上，28℃培养至淡形成黄色孢子，使用无菌0.95％(w/v)生理盐水收集孢子，制备孢子悬液(终浓度105～7孢子/ml)；孢子悬液稀释102～5倍，移取100μL稀释过的孢子悬液均匀涂布于干燥的无菌平板上，置于无菌超净台上自然风干；2.低能离子注入辐射：布雷正青霉A1163孢子在能量1.5～2.0kV、离子束剂量2.08～2.6×1015N+/cm2条件下处理8～15s，对处理过的孢子进行全面筛选，选择基于白色念珠菌抑制作用的高通量筛选模型。分离获得2株正突变株，其中布雷正青霉ZJB082702布雷菲德菌素A合成能力较出发菌株提高约20倍，培养物中检测不到咪唑立宾，发酵液无皂甙水解酶活性；吐温80能显著提高布雷正青霉ZJB082702发酵液中布雷菲德菌素A浓度，发酵培养基中添加0～1.0mol/L乙酸盐和(或)丙二酸盐对布雷菲德菌素A浓度没有显著影响；37℃，分离菌种仍能生长繁殖，但不能合成布雷菲德菌素A；这些变化与低能离子注入导致的代谢流改变有关，因此，布雷正青霉ZJB082702是菌株布雷正青霉A1163的一株变种。布雷正青霉变种ZJB082702已于2008年07月31日保藏于中国典型物培养中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC No：M 208113。
表1：布雷正青霉变种ZJB082702与其它专利报道的具有布雷菲德菌素A合成能力的布雷正青霉菌种比较
| 相关专利菌株 | 菌株特征 | 专利号 |
| Eupenicillium brefeldianumC39686(ATCC 74184) | 菌落表面呈绒毛状，边缘无色，中央隆起、淡黄色，背面淡黄色；<u>无渗出液</u>，无可溶性色素；分生孢子结构非常少，分生孢子短而光滑，单轮生，1-2个短分枝。 | U.S.5,284,866 |
| Eupenicillium brefeldianumM-2116(FERM P-1104)，Eupenicillium brefeldianumM-2199 | 具有合成咪唑类核酸物质<u>咪唑立宾</u>能力。 | U.S.5,442,051；U.S.5,462,929 |
| Eupenicillium brefeldianumPF1226(FERM BP-7476) | 在固体麦汁培养基上，菌落白色至淡棕色，绒毛状，背面黄棕色；<u>37℃停止生</u><u>长</u>：具有皂甙水解酶活性。 | U.S.6,878,535 |
| Penicillium brefeldianumDodge(NRRL 2083) | 分泌<u>有颜色的渗出液</u>，利用乙酸钠形成亮黄色色素；布雷菲德菌素A的合成前体为<u>乙酸酯和(或)丙二酸酯</u>。 | J.Am.Chem.Soc.，1977，99(23)：7718-7720. |
| 野生型布雷正青霉A1163 | 野生型布雷正青霉A1163菌落表面呈绒毛状，边缘白色，中央隆起、淡黄色，背面棕黄色；后期菌核呈灰褐色，有无色透明渗出液，菌落<u>产生无色透明液滴</u>，不能合成可溶性色素；37℃，布雷正青霉A1163<u>不能生长繁</u><u>殖</u>；布雷正青霉A1163发酵液具有特征性气味，具<u>有咪唑立宾合成能力</u>，无皂甙水解酶活性；最高布雷菲德菌素A发酵单位5.6mg/l发酵液。 | 本专利菌株 |
| 布雷正青霉变种CCTCCNo.M 208113 | 布雷正青霉变种CCTCC No.M 208113菌落表面呈绒毛状，边缘白色，中央隆起、淡黄色，背面棕黄色；后期菌核呈灰褐色，菌落<u>有皱褶</u>，菌落不透明，<u>产生无色透明</u><u>液滴</u>，不能合成水溶性色素；<u>37℃，菌种</u><u>仍能生长繁殖</u>，但不能合成布雷菲德菌素A；布雷正青霉变种CCTCC No.M 208113发酵液无特征性气味，不能合成咪唑立宾，无皂甙水解酶活性；最高布雷菲德菌素A发酵单位943.8mg/l发酵液；0～1.0mol/l乙酸盐和(或)丙二酸盐对菌种布雷菲德菌素A发酵单位无显著效应，<u>吐温80</u>能显著促进布雷正青霉合成。 | 本专利菌株 |
5)布雷正青霉变种CCTCC No.208113发酵制备布雷菲德菌素A过程配制培养基：
布雷正青霉变种CCTCC No.208113保存于固体PDA培养基上，固体PDA斜面培养基制备程序：马铃薯去皮，称取200.0g去皮马铃薯，切成小块，加水煮沸30分钟，使用6层纱布过滤，在滤液中加入20.0g葡萄糖，加水定容至1000.0ml。煮沸后加入琼脂15～20.0g，溶解后分装至小试管，在121℃灭菌20分钟。
将菌种布雷正青霉变种CCTCC No.208113孢子悬液接种到装有160ml种子培养基的500ml三角瓶中，种子培养基终浓度组成如下：麦芽糖20～40.0g/L，麦芽浸出粉0.5～1.5g/L，酵母浸出粉1～4.0g/L，磷酸二氢钾1～3.0g/L，硫酸镁1～3.0g/L，碳酸钙2～6.0g/L，pH4～9，种子培养基121℃灭菌20分钟；培养温度控制在28～35℃范围内培养2天，获得种子液。
上述制备的种子液按照体积比1～10％(v/v)接种于发酵培养基中，培养基组成：淀粉5～25.0g/L，葡萄糖10～40.0g/L，酵母膏0.5～2.5g/L，玉米浆0.5～2.5g/L，黄豆饼粉0.25～1.0g/L，麦芽浸出物0.5～4.0g/L，硫酸镁1～5.0g/L，磷酸二氢钾2～6.0g/L，碳酸钙2～8.0g/L，硝酸钠0.25～1.5g/L，硫酸铜0.5～4.0×10-2g/L，吐温-800.5～5.0g/L，pH值4～9。发酵培养的装量为160ml/500ml摇瓶，摇瓶为带挡板发酵瓶，将种子液转接于无菌发酵培养基中，在20～35℃下培养3～9天。
发酵结束后，发酵液经4000～12000rpm离心4～10分钟，分别收集沉淀和上清液。上清液经减压浓缩20倍，加入1/2体积乙酸乙酯萃取，充分萃取后收集萃取相；固体沉淀直接采用乙酸乙酯浸提，离心收集液相；合并萃取液，水洗，无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到粗提取物，用丙酮溶解粗提取物，过滤，室温下过夜结晶，重结晶，得到无色棱状结晶。
本发明有益效果主要体现在：提供了一株布雷菲德菌素A高产菌株——布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)变种ZJB082702，及其在发酵制备布雷菲德菌素A中的应用；利用该菌株发酵制备布雷菲德菌素A，产率较高，布雷菲德菌素A浓度最高可达943.8mg/L发酵液。
(四)附图说明
图1为菌株A1163光学显微照片(×1000)；
图2为X-射线衍射测定的化合物A分子结构；
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
配制培养基：
(1)斜面培养基，布雷正青霉变种CCTCC No.208113保存于固体PDA培养基上，固体PDA斜面培养基制备：马铃薯去皮，称取200.0g去皮马铃薯，切成小块，加水煮沸30分钟，使用6层纱布过滤，在滤液中加入20.0g葡萄糖，加水定容至1000ml。煮沸后加入琼脂20.0g，溶解后分装至小试管，在121℃灭菌20分钟，冷却，得斜面，接种CCTCC No.208113，32～35℃培养3天，以无菌水洗下孢子，配成孢子悬液(孢子浓度约4.7×106孢子/ml)，备用。
(2)种子培养基终浓度组成：麦芽糖20～40g/L，麦芽浸出粉(市售)0.5～1.5g/L，酵母浸出粉(市售)1～4.0g/L，磷酸二氢钾1～3.0g/L，硫酸镁1～3.0g/L，碳酸钙2～6.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH4～9；
(3)发酵培养基终浓度组成g/L：淀粉5～25.0g/L，葡萄糖10～40.0g/L，酵母膏0.5～2.5g/L，玉米浆(市售)0.5～2.5g/L，黄豆饼粉(市售)0.25～1.0g/L，麦芽浸出物(市售)0.5～4.0g/L，硫酸镁1～5.0g/L，磷酸二氢钾2～6.0g/L，碳酸钙2～8.0g/L，硝酸钠0.25～1.5，硫酸铜0.5～4.0×10-2g/L，草酰乙酸0.5～5.0g/L，吐温800.5～5.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH值4～9。
实施例1：布雷正青霉变种CCTCC No.208113发酵制备布雷菲德菌素A
将菌种布雷正青霉CCTCC No.208113孢子悬液接种到装有160.0ml种子培养基的500ml三角瓶中，28℃培养2天，获得种子液。种子培养基配制：麦芽糖30.0g，麦芽浸出粉1.5g，酵母浸出粉2.5g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁2.0g，碳酸钙4.0g，蒸馏水1000.0mL，pH7.0，种子培养基121℃灭菌20分钟；
为了考察培养基复合氮源对布雷菲德菌素A发酵水平的影响，设计了5种不同的发酵培养基，生物反应器采用带挡板的摇瓶，装液量均为160mL/500mL摇瓶，发酵培养基组成分别为：
培养基I：葡萄糖20.0g/L，淀粉10.0g/L，麦芽浸出物1.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸镁2.0g/L，碳酸钙4.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；
培养基II：葡萄糖20.0g/L，淀粉10.0g/L，麦芽浸出物1.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.5g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸镁2.0g/L，碳酸钙4.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；
培养基III：葡萄糖20.0g/L，淀粉10.0g/L，麦芽浸出物1.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.5g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁2.0g/L，碳酸钙4.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；
培养基IV：葡萄糖20.0g/L，淀粉10.0g/L，麦芽浸出物1.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.75g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁2.0g/L，碳酸钙4.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；
培养基V：葡萄糖20.0g/L，淀粉10.0g/L，麦芽浸出物1.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠2.5g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁2.0g/L，碳酸钙4.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然；
发酵培养基均在121℃菌20分钟。发酵培养的装量为160ml/500ml摇瓶，摇瓶为带挡板发酵瓶将种子液按照体积比3.0％转接于5种无菌发酵培养基中，在28℃下培养4天。
发酵结束后，移取5ml发酵液，加入2.5ml乙酸乙酯，室温萃取30分钟；收集上层萃取相，吹风机吹干萃取液，加入500μl甲醇，10000rpm离心10分钟，上清液经0.45μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析。HPLC分析条件：色谱柱，250mm×4.6mm Rascil C18反相柱；流动相采用甲醇∶水(70∶30，v/v流速0.6mL/min，进样量为5.0μL，柱后流出物依次经UV检测；UV检测波长为230nm。发酵液I、II、III、IV、V中布雷菲德菌素A的浓度分别为324mg/L、426.3mg/L、537.1mg/L、651.3mg/L、298.5mg/L。
实施例2：布雷正青霉变种CCTCC No.208113发酵制备布雷菲德菌素A
将菌种布雷正青霉ZJB082702(CCTCC No.208113)孢子悬液接种到装有160.0ml种子培养基的500ml三角瓶中，种子培养基按如下组成配制：麦芽糖30.0g，麦芽浸出粉1.5g，酵母浸出粉2.5g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁2.0g，碳酸钙4.0g，蒸馏水1000.0mL，pH7.0，种子培养基121℃灭菌20分钟；28℃培养2天，获得种子液。
为了考察培养基中碳酸钙用量对布雷菲德菌素A发酵水平的影响，本专利设计了4种不同的发酵培养基，生物反应器采用带挡板的摇瓶，装液量均为160mL/500mL摇瓶，发酵培养基组成分别为：
培养基a：葡萄糖20.0g/L，淀粉10.0g/L，麦芽浸出物1.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.50g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁2.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然；
培养基b：葡萄糖20.0g/L，淀粉10.0g/L，麦芽浸出物1.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.50g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁2.0g/L，碳酸钙4.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然；
培养基c：葡萄糖20.0g/L，淀粉10.0g/L，麦芽浸出物1.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.50g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁2.0g/L，碳酸钙6.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然；
培养基d：葡萄糖20.0g/L，淀粉10.0g/L，麦芽浸出物1.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.50g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁2.0g/L，碳酸钙10.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然；
发酵培养基均在121℃菌20分钟。发酵培养的装量为160ml/500ml摇瓶，摇瓶为带挡板发酵瓶将种子培养物按照体积比3.0％转接于4种无菌发酵培养基中，在28℃下培养4天。
发酵结束后，发酵液经预处理、HPLC分析，发酵液a、b、c、d中布雷菲德菌素A的浓度分别为151.6mg/L、667mg/L、710mg/L、521mg/L。
实施例3：布雷正青霉变种CCTCC No.208113发酵制备布雷菲德菌素A
将菌种布雷正青霉CCTCC No.208113孢子悬液接种到装有160mL种子培养基的500ml三角瓶中，种子培养基按如下组成配制：麦芽糖30.0g，麦芽浸出粉1.5g，酵母浸出粉2.5g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁2.0g，碳酸钙4.0g，蒸馏水1000.0mL，pH7.0，种子培养基121℃灭菌20分钟；28℃培养2天，获得种子液。
为了考察不同培养基起始pH值对布雷菲德菌素A发酵水平的影响，本专利设计了4种不同的发酵培养基，生物反应器采用带挡板的摇瓶，装液量均为160mL/500mL摇瓶，发酵培养基组成分别为：
培养基A，葡萄糖26.7g/L，淀粉13.3g/L，麦芽浸出物2.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.75g/L，磷酸二氢钾4.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁3.0g/L，碳酸钙6.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH 5.0；
培养基B，葡萄糖26.7g/L，淀粉13.3g/L，麦芽浸出物2.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.75g/L，磷酸二氢钾4.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁3.0g/L，碳酸钙6.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH 6.0；
培养基C，葡萄糖26.7g/L，淀粉13.3g/L，麦芽浸出物2.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.75g/L，磷酸二氢钾4.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁3.0g/L，碳酸钙6.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0；
培养基D，葡萄糖26.7g/L，淀粉13.3g/L，麦芽浸出物2.5g/L，酵母膏1.0g/L，玉米浆1.0g/L，黄豆饼粉0.50g/L，硝酸钠0.75g/L，磷酸二氢钾4.0g/L，硫酸铜1.0×10-2g/L，硫酸镁3.0g/L，碳酸钙6.0g/L，溶剂为蒸馏水，pH 8.0；
发酵培养基均在121℃灭菌20分钟。发酵培养的装量为160ml/500ml，摇瓶为带挡板发酵瓶将种子培养物按照体积比3.0％转接于4种无菌发酵培养基中，在28℃下培养4天。
发酵结束后，发酵液经预处理、HPLC分析，发酵液A、B、C、D中布雷菲德菌素A的浓度分别为749.3mg/L、943.8mg/L、731.1mg/L、682.6.1mg/L。
实施例4：从布雷正青霉变种CCTCC No.208113发酵液中提炼布雷菲德菌素A结晶
收集3.0L布雷正青霉ZJB082702发酵液，发酵液经12000rpm离心10分钟，分别收集沉淀和上清液。上清液经减压浓缩至1/20原始体积，再加入体积为浓缩液体积1/2的乙酸乙酯萃取，充分萃取后收集萃取相；固体沉淀直接采用乙酸乙酯浸提，离心收集液相；合并萃取液，水洗两次，无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得粗提取物2.96g，用丙酮溶解粗提取物，过滤，室温下过夜结晶，重结晶，得2.07g无色棱状晶体，纯度99.07％。
Claims (6)
1.布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)变种ZJB082702，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏日期2008年07月31日，保藏编号CCTCC No：M 208113。
2.布雷正青霉变种ZJB082702在微生物发酵制备布雷菲德菌素A中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将布雷正青霉变种ZJB082702接种至适用于布雷正青霉的发酵培养基，20～35℃发酵3～9天，发酵结束后，发酵液经分离纯化得到所述布雷菲德菌素A。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述布雷菲德菌素A分离纯化方法如下：发酵液离心，收集沉淀和上清液，上清液经乙酸乙酯充分萃取后收集萃取相；沉淀用乙酸乙酯浸提，离心收集乙酸乙酯液相；合并萃取相和乙酸乙酯液相，水洗，无水硫酸钠脱水，回收乙酸乙酯，得到粗提取物用丙酮溶解，过滤，室温下过夜结晶，重结晶，得到布雷菲德菌素A晶体。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述适用于布雷正青霉的发酵培养基终浓度组成如下：淀粉5～25g/L，葡萄糖10～40g/L，酵母膏0.5～2.5g/L，玉米浆0.5～2.5g/L，黄豆饼粉0.25～1g/L，麦芽浸出物0.5～4g/L，硫酸镁1～5g/L，磷酸二氢钾2～6g/L，碳酸钙2～8g/L，硝酸钠0.25～1.5g/L，硫酸铜0.5×10-2～4.0×10-2g/L，吐温-80 0.5～5g/L，pH值4～9。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用如下：
(1)布雷正青霉变种ZJB082702接种至PDA斜面培养基，25～35℃培养2～7天，以生理盐水洗下孢子，配成孢子悬液；
(2)孢子悬液接种至种子培养基，25～35℃培养2～3天，得到种子液，所述种子培养基终浓度组成为：麦芽糖20～40g/L，麦芽浸出粉0.5～1.5g/L，酵母浸出粉1～4g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，硫酸镁1～3g/L，碳酸钙2～6g/L，pH4～9，121℃高压灭菌20分钟；
(3)种子液以体积比1～15％接种至发酵培养基，25～35℃培养4～8天，得到发酵液，所述发酵培养基终浓度组成如下：淀粉5～25g/L，葡萄糖10～40g/L，酵母膏0.5～2.5g/L，玉米浆0.5～2.5g/L，黄豆饼粉0.25～1g/L，麦芽浸出物0.5～4g/L，硫酸镁1～5g/L，磷酸二氢钾2～6g/L，碳酸钙2～6g/L，硝酸钠0.25～1.5g/L，硫酸铜0.005～0.04g/L，吐温-800.5～5g/L，pH值4～9，121℃高压灭菌20分钟；
(4)发酵液离心，收集沉淀和上清液，上清液浓缩，经乙酸乙酯充分萃取后收集萃取相；沉淀用乙酸乙酯浸提，离心收集乙酸乙酯液相；合并萃取相和乙酸乙酯液相，水洗，无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到粗提取物用丙酮溶解，过滤，室温下过夜结晶、重结晶，得到布雷菲德菌素A晶体。
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