CN104694401A - 纯绿青霉菌株及用其生产麦角甾醇过氧化物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明保护一种制备麦角甾醇5,8过氧化物的方法：发酵Penicillium verrucosum LPPV001，经乙酸乙酯萃取，过硅胶柱层析，以石油醚和丙酮的混合溶剂洗脱，得到麦角甾醇5,8过氧化物纯品。所述发酵的条件具体可为种子液摇床2天，5%的接种量，26.7℃，转速为150转/分钟，摇床15天。以及一种麦角甾醇5,8过氧化物的生产用菌株，其特征在于，该菌株LPPV001为纯绿青霉Penicillium verrucosum。

Description

纯绿青霉菌株及用其生产麦角甾醇过氧化物的方法
技术领域
本发明涉及一种用菌株生产化学品的技术领域，具体涉及一种用纯绿青霉菌株LPPV001制备麦角甾醇5,8过氧化物的方法。
背景技术
纯绿青霉菌株LPPV001来源于四川凉山产地衣植物内生真菌，经自采方式提取，菌株保藏编号：10145，保藏日期：2015年1月4日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。植物甾醇具有营养价值高、生物活性强的特点，是多种激素、维生素D及甾族化合物合成的前体，广泛应用在医药、化妆品、动物生长剂及纸张加工、印刷、纺织、食品等领域。研究发现过氧麦角甾醇具有促进白血病细胞HL60细胞（Toshiyuki Takei, Mitsuru Yoshida, Mayumi Ohnishi-kameyama, et al. Ergosterol peroxide, an apoptosis-inducing component isolated from Sarcodon aspratus (Berk.) S. ito, Biosci, biotechnol biochem, 2005, 69 (1): 212-215）和肝癌细胞(HepG2)（苏日古格, 包海鹰, 图力古尔等. 蒙古口蘑子实体的抗肿瘤活性, 食品科学, 2012, 33 (21): 280-284）凋亡的活性，同时具有抗氧化（冯建, 秦淑亮, 胡兵等. 色钉菇子实体化学成分及其生物活性初探, 菌物学报, 2014, 33 (2): 355-364）、抗菌（麻兵继, 文春南，吴婷婷等，麦角甾醇过氧化物的抑菌活性研究, 食品研究与开发, 2012, 33 (7): 42-44）以及抗结核（魏丹丹等，2009）等广泛的药理作用。麦角甾醇5,8过氧化物是在真菌中较为广泛存在的一个具有较广泛生物活性的植物甾醇类化合物。而本发明提取的该纯绿青霉菌株LPPV001，可以通过发酵产生麦角甾醇5,8过氧化物且产率极高，经简单提纯即可得到麦角甾醇5,8过氧化物纯净物。
在对地衣内生真菌化学成分的研究过程中，课题组从四川产拟肺衣植物中分离得到一株纯绿青霉菌(Penicillium verrucosum LPPV001，中国科学院微生物研究所命名)，经研究发现其菌丝体提取物中麦角甾醇过氧化物的含量极高，最高可达到0.45g/g（麦角甾醇/菌丝体）。该菌株具有生长速度快，生长条件温和，代谢过程简单等优点，适于工业大规模培育，且产物产率高，适于提取。发酵培养基采用土豆培养基，成本低，制备简单，易于操作，产量高，发酵周期短，可实现规模生产。
本发明具备较大的实践意义，麦角甾醇5,8过氧化物是重要的有机中间体，目前尚未发现其他菌株能够实现对此物质的发酵产率能达到如此高的水平，以及如此方便简单的提纯条件，为麦角甾醇5,8过氧化物的提取开辟了一条简单易操作的技术路线。
发明内容
本发明旨在提供Penicillium verrucosum LPPV001及其产物麦角甾醇5,8过氧化物制备方法，所述麦角甾醇5,8过氧化物结构如图1。
本发明所涉及的麦角甾醇5,8过氧化物的生产菌是Penicillium verrucosum LPPV001，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号：10145，保藏日期：2015年1月4日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明保护一种制备麦角甾醇5,8过氧化物的方法：发酵Penicillium verrucosum LPPV001，经乙酸乙酯萃取，过硅胶柱层析，以石油醚和丙酮的混合溶剂洗脱，得到麦角甾醇5,8过氧化物纯品。所述发酵的条件具体可为种子液摇床2天，5%的接种量，26.7℃，转速为150转/分钟，摇床15天。
一种麦角甾醇5,8过氧化物的生产用菌株，其特征在于：该菌株LPPV001为纯绿青霉（Penicillium verrucosum），已于2015年1月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心并成活，保藏号为CGMCC NO.4468。
一种用菌株LPPV001生产麦角甾醇5,8过氧化物的生产方法，其特征在于：
       取斜面培养3天的纯绿青霉LPPV001适量；将所述适量LPPV001接种到若干瓶500mL的三角瓶中，其均装有土豆培养基培养出的150mL培养液；将上述三角瓶装载于26.7℃、150转/分钟摇床上，摇床培养5-31天，使得发酵液与菌丝体分离，分离出发酵液，连续用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并3次的萃取液，减压浓缩得浓缩液A；分离出菌丝体，连续以3倍量95%乙醇超声提取3次，合并3次乙醇提取液，减压浓缩，对超声提取后的菌丝体，连续以2倍量的乙酸乙酯萃取三次，合并3次乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得浓缩液B；合并浓缩液A与B，得麦角甾醇5,8过氧化物粗提物，加入100-200目过筛的硅胶拌样，以石油醚/丙酮=48:5的混合溶剂进行300-400目硅胶柱层析，得流份f1-f10，分离流份f7，经反复控制温度下重结晶，得化合物麦角甾醇5,8过氧化物的纯品。
前述生产的麦角甾醇5,8过氧化物的纯品的纯度检测方法，其特征在于：
       1）溶解性判断，将其用氯仿、丙酮溶解，观察其溶解性；
       2）观测其熔点，常温下其熔点在176-178℃之间；
       3）用ESI-MS检测，观察其是否在m/z429.07给出[M+H]+峰；
       4）通过1HNMR谱检测，分析其是否具有环内双键，以及是否具备反式直链烯烃结构；通过13CNMR谱检测，分析其是否具有28个碳原子信号，以及是否有4个烯碳原子信号。
前述生产方法中利用的土豆培养基，其特征在于：   土豆培养基的组成配比为：马铃薯：200g、琼脂：20g、葡萄糖：20g、水：1000mL。
前述的土豆培养基，其特征在于：所述的土豆培养基的组成配比为：马铃薯：200g、琼脂：20g、葡萄糖：20g、水：1000mL；       摇床培养时间具体为5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31天。
本发明提供的纯绿青霉Penicillium verrucosum LPPV001主产两种产物，其中一个产物麦角甾醇5,8过氧化物产量高，分离工艺简单，易于操作，该菌株稳定，培养基配方简单，成本低，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产。
附图说明
图1为麦角甾醇5,8过氧化物的化学结构式。
图2为麦角甾醇5,8过氧化物标准品的HPLC，浓度：50 μg/mL。
图3为麦角甾醇5,8过氧化物的HPLC标准曲线。
图4麦角甾醇5,8过氧化物粗提液的HPLC分析图，浓度：145.84 μg/mL。
图5为麦角甾醇5,8过氧化物的质谱图。
图6为麦角甾醇5,8过氧化物的核磁共振氢谱图。
图7为麦角甾醇5,8过氧化物的核磁共振碳谱图。
具体实施方式
实施例1  LPPV001菌株的分离和鉴定
1、菌株分离
采用内生真菌分离的方法分离纯绿青霉。
（A）选取新鲜的拟肺衣地衣一小块(约1×1cm)，在解剖镜下用刀片小心除去其上下表面附着的杂质；
（B）将地衣上下表面放自来水下分别冲洗3-5分钟，拿出待用；
（C）将地衣体放入超净工作台，上下表面紫外线照射分别灭菌15分钟。将刀片在火焰上灼烧灭菌，待冷却后，在解剖镜下小心翼翼刮去皮层，露出髓层到可以挑取约0.5×0.5μm菌丝块时，挑取一块菌丝放在事先准备好的载有无菌水的擦镜纸上，将包有髓层菌丝碎片的擦镜纸放于漏斗中，用400mL无菌自来水冲洗髓层碎片，冲洗后的髓层碎片在解剖镜观察下，小心接种入培养基斜面培养，所述培养基组成为马铃薯200g、琼脂20g、葡萄糖20g、水：1000mL。26.7℃条件下，培养箱中培养14天，观察，将不纯菌落再培养，直至得到纯的菌落。
2、LPPV001菌株的鉴定
该纯绿青霉菌株LPPV001为凉山彝族自治州西昌大凉山产拟肺衣植物的内生真菌，经多项分类学研究鉴定为Penicillium verrucosum；并由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号：10145，保藏日期：2015年1月4日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
用CTAB法提取LPPV001菌株的DNA,并以此DNA为模板，以ITS1和ITS4为通用引物，进行PCR扩增,纯化回收扩增产物后测定其基因序列，序列如下：
1 taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ccgagtgagg gccctctggg
       61 tccaacctcc cacccgtgtt tattttacct tgttgcttcg gcgggcccgc ctttactggc
      121 cgccgggggg ctcacgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acaccctcga actctgtctg
      181 aagattgaag tctgagtgaa aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg
      241 ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt
      301 gaatcatcga gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc
      361 cgagcgtcat tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg
      421 gggacgggcc cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg
      481 tcacccgctc tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac ccaaattttt atccaggttg
      541 acctcggatc aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaata
将所得基因序列登录Genbank，对比同源性，发现测试结果与Penicillium verrucosum同源性达到99%。该Penicillium verrucosum LPPV001菌株具有如下形态学特征：在察氏或PDA霉菌培养基上菌落平展，生长缓慢，呈淡青色至灰褐色，中间粉状，可见黄褐色分泌物，2周直径达2cm，菌落圆形、边缘白色，偶见边缘辐射状，背面灰白色或者淡褐色。菌丝体部分表生或者埋生，菌丝无色或者极淡褐色，有隔膜，菌丝宽1.5-2.5um，表面光滑，有分枝，圆柱状。孢子梗直立，圆柱状，有隔膜，无分枝，端部不膨大，但具有可继续再分的指状分枝，呈扫帚状，每枝顶端有2-3个瓶状细胞，其上各生一串灰绿色或者淡青色分生孢子。分生孢子圆球形或者近球形，直径2-5 um，淡青色或者浅绿色，表面光滑，与Penicillium verrucosum的特征十分一致，因此结合以上Its同源性比较和形态学特征、将该菌株鉴定为Penicillium verrucosum。
 实施例2  麦角甾醇5,8过氧化物的制备和检测
1、麦角甾醇5,8过氧化物纯品的制备和标准曲线的制定
取斜面培养3天的Penicillium verrucosum LPPV001适量，接种到20瓶装有150mL培养液的500mL的三角瓶中，生成培养液用土豆培养基，pH值自然无需调节，装载于26.7℃、150转/分钟摇床上，摇床培养26天，将发酵液与菌丝体分离，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩。菌丝体以3倍量95%的医用酒精超声提取3次，合并乙醇提取液减压浓缩至无醇味，再以2倍量的乙酸乙酯萃取三次，合并所有乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗提物1.5g。粗提物以100-200目的硅胶拌样，以石油醚/丙酮=48:5的混合溶剂进行300-400目硅胶柱层析，得流份f1-10，其中流份f7中有白色针晶析出，经反复重结晶，得化合物麦角甾醇5,8过氧化物的纯品。
化合物麦角甾醇5,8过氧化物的纯度检测：
麦角甾醇5,8过氧化物的结构经NMR、MS和熔点鉴定；其纯度用薄层色谱TLC检测，采用多种展开剂，多种显色方式均呈现单一斑点；采用高效液相色谱分析，通过面积归一法，采用208nm,210nm,215nm,220nm和227nm 5个不同的波长测定，记录色谱图的时间宽度为麦角甾醇5,8过氧化物出峰时间的2倍以上。结果表明，在所选定的5个波长下，麦角甾醇5,8过氧化物的纯度均大于98%，如图3，符合标准品的纯度要求。
依据该纯品进行标准曲线绘制：
以上述纯度大于98%的麦角甾醇5,8过氧化物为标准品，通过面积归一法，采用反相HPLC法测定标准曲线，如图4，条件为，流动相80%的乙腈水溶液，流速1mL/min、样品浓度200 μg/mL，依次稀释为100, 50, 10和5 μg/mL，进样量10 μL、检测波长208nm。麦角甾醇5,8过氧化物的标准曲线为: y=21.17x+147.6,式中x为麦角甾醇5,8过氧化物含量，Y为峰面积；R2=0.998表明曲线的线性关系良好，可用于麦角甾醇5,8过氧化物含量的测定。
2、发酵工艺
将Penicillium verrucosum LPPV001的孢子接入到种子培养基，种子培养基组成为马铃薯200g、琼脂20g、葡萄糖20g、水1000mL，得到种子液，发酵时间为4天。从种子培养基中以5%的比例接种到与种子培养基培养条件完全相同的发酵培养基中，瓶装液量150/500Ml，温度为26.8℃，转速为150转/分钟，发酵16瓶，摇床培养。发酵时间分别为5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31天。获得发酵液，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩。菌丝体以3倍量95%的医用酒精超声提取3次，合并乙醇提取液减压浓缩至无醇味，以2倍量的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩。合并发酵液与菌丝体的乙酸乙酯萃取液，得粗提液。粗提液的HPLC图谱见图5，通过HPLC分析发现，发酵24天，得到的麦角甾醇5,8过氧化物产量最高。
3、麦角甾醇5,8过氧化物的检测
从外观形状上来看，该化合物为白色针晶，易溶于氯仿、丙酮，熔点在176-178℃之间。由ESI-MS于m/z429.07给出[M+H]+峰，该化合物的质谱图见图5。该化合物的氢谱图见图6，1HNMR谱图显示：δ6.49和6.22处，各1H，d，J=8.5 Hz，提示为一对环内双键，偶合简单，提示两侧与季碳相连；δ5.22处，1H, dd, J=12.0, 8.0 Hz和δ5.14，1H，dd，J=12.0, 8.0 Hz，提示含有直链烯烃结构，且为反式结构，。该化合物的碳谱图见图7，13CNMR谱显示了28个碳原子信号，δ135.41, 135.20, 132.31, 130.75为四个烯碳原子信号，δ82.15和δ79.42处在较低场，化学位移较环上羟基的季碳大，推测两个碳原子之间有过氧桥相连。从以上数据可基本确认麦角甾醇5,8过氧化物的定性，有文献《蓝黄红菇的化学成分》（高锦明等, 云南植物研究, 2000, 22卷1期，85-89页）记载了关于麦角甾醇5,8过氧化物的多项检测数据，经比较基本一致，从侧面佐证了所得化合物化合物为麦角甾醇-5,8-过氧化物。
随附麦角甾醇5,8过氧化物的NMR数据（条件：CDCl3，1H:400MHz，13C:100MHz）
1H-NMR (400MHz, CDCl3): 6.49 (1H, d, J=8.5Hz, C7-H), 6.26 (1H, d, J=8.5Hz, C6-H), 5.20 (1H, dd, C23-H), 5.17 (1H, dd. C22-H), 3.97 (1H,m,C3-H), 1.01 (3H, d, J=8Hz, C21-Me), 0.92 (3H, d, J=8Hz, C28-Me), 0.88 (3H, s, C19-Me), 0.84-0.81 (9H, 3-Me)。   13C-NMR (100MHz): 36.96 (C-1), 30.12 (C-2), 66.47 (C-3), 51.08 (C-4), 79.42 (C-5), 130.75 (C-6), 135.41 (C-7), 82.15 (C-8), 34.69 (C-9), 36.93 (C-10), 20.63 (C-11), 39.34 (C-12), 44.56 (C-13), 51.68 (C-14), 28.65 (C-15), 23.40 (C-16), 56.19 (C-17), 12.87 (C-18), 18.18 (C-19), 39.74 (C-20), 20.88 (C-21), 132.31 (C-22), 135.20 (C-23), 42.77 (C-24), 33.06 (C-25), 19.95 (C-26), 19.64 (C-27), 17.56 (C-28)。
4、应用意义
发酵培养基简单易得，发酵稳定，成本低，制备简单，易于操作，产量高，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产，对于工业化生产以及化合物的结构修饰提供了药源。

Claims (5)

1.一种麦角甾醇5,8过氧化物的生产用菌株，其特征在于：
    该菌株LPPV001为纯绿青霉Penicillium verrucosum，已于2015年1月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心并成活，保藏号为CGMCC NO.4468。
2.一种利用权利要求1所述生产用菌株生产麦角甾醇5,8过氧化物的生产方法，其特征在于：
    取斜面培养3天的纯绿青霉LPPV001适量；
将所述适量LPPV001接种到若干瓶500mL的三角瓶中，其均装有土豆培养基培养出的150mL培养液；
将上述三角瓶装载于26.7℃、150转/分钟摇床上，摇床培养5-31天，使得发酵液与菌丝体分离，分离出发酵液，连续用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并3次的萃取液，减压浓缩得浓缩液A；
分离出菌丝体，连续以3倍量95%乙醇超声提取3次，合并3次乙醇提取液，减压浓缩，对超声提取后的菌丝体，连续以2倍量的乙酸乙酯萃取三次，合并3次乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得浓缩液B；
合并浓缩液A与B，得麦角甾醇5,8过氧化物粗提物，加入100-200目过筛的硅胶拌样，以石油醚/丙酮=48:5的混合溶剂进行300-400目硅胶柱层析，得流份f1-f10，分离流份f7，经反复控制温度下重结晶，得化合物麦角甾醇5,8过氧化物的纯品。
3.一种针对权利要求2所述生产方法生产的麦角甾醇5,8过氧化物的纯品的纯度检测方法，其特征在于：
    1）溶解性判断，将其用氯仿、丙酮溶解，观察其溶解性；
    2）观测其熔点，常温下其熔点在176-178℃之间；
    3）用ESI-MS检测，观察其是否在m/z429.07给出[M+H]+峰；
    4）通过1HNMR谱检测，分析其是否具有环内双键，以及是否具备反式直链烯烃结构；通过13CNMR谱检测，分析其是否具有28个碳原子信号，以及是否有4个烯碳原子信号。
4.一种如权利要求2所述的生产方法中利用的土豆培养基，其特征在于：
    土豆培养基的组成配比为：马铃薯：200g、琼脂：20g、葡萄糖：20g、水：1000mL。
5.一种如权利要求2所述的生产方法，其特征在于：
    所述的土豆培养基的组成配比为：马铃薯：200g、琼脂：20g、葡萄糖：20g、水：1000mL；
    摇床培养时间具体为5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31天。
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