CN109971651A - 一种烟草内生真菌及其在制备麦角甾醇5,8过氧化物中的应用 - Google Patents
一种烟草内生真菌及其在制备麦角甾醇5,8过氧化物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种利用烟草内生真菌制备麦角甾醇5,8过氧化物的制备方法：无菌条件下将TE‑3菌丝体转接于内装有已灭菌的液体PDB培养基中；静置发酵，过滤分离发酵液与菌丝体；发酵液以乙酸乙酯萃取3次，合并减压浓缩得浓缩液A；菌丝体丙酮超声提取3次，减压浓缩后以乙酸乙酯萃取3次，合并后得浓缩液B；合并A和B，得发酵物浸膏；加入硅胶拌样，石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1进行硅胶柱层析；采用凝胶柱层析分离得到麦角甾醇5，8过氧化物的纯品，该菌株TE‑3为芦竹节菱孢Arthrinium arundinis TE‑3。该制备方法适宜于工业大规模培养，并且产率高，易于分离纯化；发酵培养基成本低，制备简单，可实现工业规模生产，为角甾醇5，8过氧化物的研究应用、工业化生产提供了药源。
Description
技术领域
本发明涉及一种烟草内生真菌及其在制备麦角甾醇5，8过氧化物中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
麦角甾醇(ergosterol)，又称麦角固醇，大量存在于酵母菌、霉菌等真菌和某些植物中，是一种重要的植物甾醇，具有重要的生理作用，可以增强人体抵抗疾病的能力，是重要的脂溶性维生素D2源，具有显著的抗菌、抗肿瘤功效。麦角甾醇也是一种食品、饲料及医药等工业中常用的化工原料，可用于可的松、激素黄体酮等药物的生产。麦角甾醇5，8过氧化物是麦角甾醇的C5、C8位发生氧化形成过氧桥的衍生物，是一类较少见的甾醇，多见于一些海洋低等生物中，少见于一些真菌类生物，偶见于高等植物。该化合物是近年来发现的一个热点分子，文献报道该化合物具有促进肿瘤细胞凋亡、抗炎、抗氧化、抑菌等广泛药理作用。特别是在抗肿瘤活性方面，已被证实能诱导人卵巢癌SKOV3、肝癌HepG2等细胞凋亡并对耐药性癌细胞表现出抑制活性。因此，该化合物具有成为新型抗肿瘤药物先导化合物的潜力，具有较高的研究价值和应用价值。
目前，麦角甾醇5，8过氧化物的市场价格约为30万元/克，随着研究的深入，对其市场需求越来越大。麦角甾醇5，8过氧化物的制备方法主要有微生物发酵法及化学合成法，化学合成法过程复杂且成本高，不能满足于临床研究的需要，因此微生物发酵法成为解决药源问题的重要途径。中国发明专利CN104694401A公开了一种微生物发酵制备麦角甾醇5，8过氧化物的方法。其采用的菌株LPPV001为纯绿青霉Penici//ium verrucosum，保藏号为CGMCC NO.4468。通过所述菌株所述方法发酵生产麦角甾醇5，8过氧化物产率高，且经简单提纯即可制得。
但是关于一种能够通过微生物发酵制备麦角甾醇5，8过氧化物的烟草内生真菌及其应用目前还未见报道。在对烟草内生真菌化学成分研究过程中，从一株芦竹节菱孢(Arthrinium arundinis TE-3)中大量分离获得麦角甾醇5，8过氧化物，其含量可达2.3％(单体化合物/ 发酵产物)。该菌株具有生长速度快，生长条件温和等有点，适宜于工业大规模培养，并且产率高，易于分离纯化。发酵培养基采用传统的PDB培养基，成本低，制备简单，可实现工业规模生产。
本发明的意义在于通过微生物发酵法，为麦角甾醇5，8过氧化物的制备提供了新的可供选择的菌株，同时为其提取纯化开辟了一条简单易操作的技术路线。
发明内容
基于上述问题，本发明目的在于提供一种烟草内生真菌及其在制备麦角甾醇5，8过氧化物中的应用，所述麦角甾醇5，8过氧化物化学结构如图1。
本发明涉及一种应用于制备麦角甾醇5，8过氧化物的烟草内生真菌，所述烟草内生真菌从茄科植物烟草(Nicotinana tabacum L.)的健康植株中采用组织分离法分离获得，所述烟草内生真菌分类命名为芦竹节菱孢(Arthrinium arundinis TE-3)，已于2017年10月31 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.14792；保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
上述烟草内生真菌在PDA固体培养基上的培养特征为：28℃培养条件下生长迅速，菌丝体呈白色，绒毛状辐射生长，边缘锯齿状，背面为淡黄色，见图2。
上述烟草内生真菌在PDB液体培养基上的培养特征为：28℃下静置培养，培养30天。培养初期(1-5天)，培养基表面出现白色菌丝体；中期(5-15天)菌丝体快速生长形成白色菌膜，均匀铺于培养基表面；后期(15-30天)菌膜增厚，并渐变为浅粉色。见图3。
上述烟草内生真菌的ITS序列如图4所示。将测序结果于NCBI网站 (https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Blast比对。所述内生真菌同芦竹节菱孢Arthrinium arundinis(序列号：LT719147.1)具有较高的同源性，其相似度为99％。
一种利用所述烟草内生真菌制备麦角甾醇5，8过氧化物的制备方法，包括以下步骤：
(1)无菌条件下，挑取适量斜面培养3天的所述菌株TE-3；
(2)无菌条件下，将该TE-3菌丝体转接于事先内装有已灭菌的300mL液体PDB培养基的1000mL三角烧瓶中；
(3)将三角烧瓶于28℃下静置发酵培养30天，发酵完毕后过滤使发酵液与菌丝体分离；发酵液连续用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，减压浓缩得浓缩液A；菌丝体连续以3倍量80％丙酮超声提取3次，合并3次丙酮提取液，减压浓缩后连续用3倍量乙酸乙酯萃取3次，合并3次乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得浓缩液B；
(4)合并浓缩液A和浓缩液B，得发酵物浸膏；加入100-200目硅胶拌样，以石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1的混合溶剂作为洗脱剂进行硅胶柱层析；然后采用凝胶柱层析的方法分离该组分，得到化合物麦角甾醇5，8过氧化物的纯品。
进一步，上述的利用所述烟草内生真菌制备麦角甾醇5，8过氧化物的制备方法中，所述的液体PDB培养基的配方为：马铃薯粉200g/L，蔗糖20g/L。
进一步，上述的利用所述烟草内生真菌制备麦角甾醇5，8过氧化物的制备方法中，所述麦角甾醇5，8过氧化物纯品通过核磁共振1H NMR谱图检测分析其是否具有环内双键以及反式烯烃基团，并通过13C NMR检测分析是否具有28个碳原子信号及2个连氧季碳信号。
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于制备麦角甾醇5，8过氧化物的烟草内生真菌菌株及其在制备麦角甾醇5，8过氧化物中的应用；该菌株具有生长速度快，生长条件温和等优点，适宜于工业大规模培养，并且产率高，易于分离纯化。发酵培养基采用传统的PDB培养基，成本低，制备简单，可实现工业规模生产。本发明的意义在于通过微生物发酵法，为麦角甾醇5，8过氧化物的制备提供了新的可供选择的菌株，同时为其提纯开辟了一条简单易操作的技术路线。本发明通过可行的大规模发酵方式实现活性物质麦角甾醇5，8过氧化物的大量生产，为该活性物质的研究应用、工业化生产提供了药源。
附图说明
图1为本发明中麦角甾醇5，8过氧化物化学结构式；
图2为本发明中所述烟草内生真菌在PDA固体培养基上的形态；
图3为本发明中所述烟草内生真菌在PDB液体培养基中的形态；
图4为本发明中所述烟草内生真菌的ITS序列；
图5为本发明中麦角甾醇5，8过氧化物核磁共振1H谱图(氘代氯仿)；
图6为本发明中麦角甾醇5，8过氧化物核磁共振13C谱图(氘代氯仿)；
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
一种烟草内生真菌及其在制备麦角甾醇5，8过氧化物中的应用，包括烟草内生真菌的分离、鉴定、麦角甾醇5，8过氧化物的制备及检测。
实施例1菌株TE-3的分离及鉴定
1、烟草内生真菌TE-3的分离
本发明的烟草内生真菌TE-3为从湖北省恩施州采集的健康烟草叶中得到的菌株。
烟草内生真菌的分离采用组织分离法。首先将烟草叶在自来水下充分冲洗，除去表面的泥土；然后将冲洗的叶片组织按“75％乙醇(1min)-2.5％次氯酸钠(30s)-75％乙醇(1min)”三步消毒法进行表面灭菌，之后用无菌水冲洗3遍；将叶片切成0.5cm×0.5cm大小的小块，将切口插入含有氯霉素的PDA培养基上，28℃恒温培养箱内培养3～7天；待培养基中组织切口处有菌丝长出，用灭菌的接种环挑取菌丝至新的PDA培养基上，划线稀释分离，直至获得纯培养。
2、烟草内生真菌TE-3的分类学鉴定
采用CTAB法提取纯化菌株TE-3的基因组DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测条带完整性，利用nanodrop检测DNA的纯度和浓度，以ITS1和ITS4通用引物进行PCR扩增，然后将PCR产物利用Sanger测序平台进行测序。该菌株序列如下：
AGGTAACACTCCATACCATCTGTTAACCTACCCAGTTATGCCTCGGCGTAAGCTCGGTTGGAGGCACCTGCAGCTACCCTGTAGTTGCGGACTGCCAACTCCAGCCGCGGCCCGCCGGCGGTACACTAAACTCTGTTTTATTTTATATTCTGAGCG TCTTATTTTAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATCAGTATTCTGGTGGGCATGCC TGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTGCTGTACTGCAGTTCCTTAAAGACAGTGGCG GAGCGGCGGTAGTCCTCTGAGCGTAGTAATTTATTTCTCGCTTTTGTCAGGCTCTGTCCTCCCGCCATAAAACCCCCAAT TTTTTAGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAACCCCGAAGGAAAAACCAA
将该菌株基因序列登录Genbank，通过Blast比对同源性，发现测试结果与芦竹节菱孢 Arthrinium arundinis(序列号：LT719147.1)具有较高的同源性，其相似度为99％。结合形态学将该菌株鉴定为Arthrinium arundinis。该菌株已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.14792，保藏日期：2017年10月31日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例2麦角甾醇5，8过氧化物的制备及检测
1、麦角甾醇5，8过氧化物的制备
无菌条件下，挑取斜面培养3天的所述菌株TE-3适量；挑取适量TE-3菌丝体转接于1000 mL三角烧瓶中，三角烧瓶内事先装有已灭菌的300mL液体PDB培养基；将三角烧瓶于28℃下静置发酵培养30天；发酵完毕后过滤使发酵液与菌丝体分离，发酵液连续用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，减压浓缩得浓缩液A；菌丝体连续以3倍量80％丙酮超声提取 3次，合并3次丙酮提取液，减压浓缩后连续用3倍量乙酸乙酯萃取3次，合并3次乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得浓缩液B；合并浓缩液A和B，得发酵物浸膏，加入100-200目硅胶拌样，以石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1的混合溶剂作为洗脱剂进行硅胶柱层析；采用凝胶柱层析的方法分离该组分，得到化合物麦角甾醇5，8过氧化物的纯品。
2、麦角甾醇5，8过氧化物的检测
分离获得的化合物为白色针状晶体，易溶于甲醇、二氯甲烷，熔点为176℃；该化合物的核磁共振谱图见图5和图6。其1H NMR谱图显示，在化学位移δH 6.50和6.24处，各出现一个相互耦合的d峰信号，耦合常数J＝8.5Hz，提示存在环内双键；在δH 5.22和5.14 处，各存在一对dd峰信号，耦合常数分别为J＝15.3，7.5Hz和15.3，8.3Hz，提示存在反式直链烯烃结构。其13C NMR谱图显示28个碳原子信号，较低场的δC 135.4，135.2，132.3，130.7四个信号为不饱和碳原子信号，82.2和79.4的两个季碳信号位于较低场，推测两个信号之间具有过氧桥基团。该化合物的核磁数据和文献(Yue et al. Phytochemistry，2001，56：801-806)报道的数据基本一致，因此可以确定该化合物为麦角甾醇5，8过氧化物。
3、应用意义
该制备方法适宜于工业大规模培养，并且产率高，易于分离纯化；发酵培养基采用传统的PDB培养基，成本低，制备简单，可实现工业规模生产，为该活性物质角甾醇5，8过氧化物的研究应用、工业化生产提供了药源。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，上述假设的这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种应用于制备麦角甾醇5，8过氧化物的烟草内生真菌，其特征在于：所述烟草内生真菌分类命名为芦竹节菱孢(Arthrinium arundinis TE-3)，已于2017年10月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.14792。
2.一种利用权利要求1所述烟草内生真菌制备麦角甾醇5，8过氧化物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)无菌条件下，挑取适量斜面培养3天的所述菌株TE-3；
(2)无菌条件下，将该TE-3菌丝体转接于事先内装有已灭菌的300mL液体PDB培养基的1000mL三角烧瓶中；
(3)将三角烧瓶于28℃下静置发酵培养30天，发酵完毕后过滤使发酵液与菌丝体分离；发酵液连续用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取液，减压浓缩得浓缩液A；菌丝体连续以3倍量80％丙酮超声提取3次，合并3次丙酮提取液，减压浓缩后连续用3倍量乙酸乙酯萃取3次，合并3次乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得浓缩液B；
(4)合并浓缩液A和浓缩液B，得发酵物浸膏；加入100-200目硅胶拌样，以石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1的混合溶剂作为洗脱剂进行硅胶柱层析；然后采用凝胶柱层析的方法分离该组分，得到化合物麦角甾醇5，8过氧化物的纯品。
3.根据权利要求2所述的一种利用权利要求1所述烟草内生真菌制备麦角甾醇5，8过氧化物的制备方法，其特征在于：所述的液体PDB培养基的配方为：马铃薯粉200g/L，蔗糖20g/L。
4.根据权利要求2所述的一种利用权利要求1所述烟草内生真菌制备麦角甾醇5，8过氧化物的制备方法，其特征在于：所述麦角甾醇5，8过氧化物纯品通过核磁共振1H NMR谱图检测分析其是否具有环内双键以及反式烯烃基团，并通过13C NMR检测分析是否具有28个碳原子信号及2个连氧季碳信号。
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