TWI486452B - 以微生物轉化生產白藜蘆醇（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）的方法 - Google Patents

以微生物轉化生產白藜蘆醇（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）的方法 Download PDF

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Description

以微生物轉化生產白藜蘆醇(resveratrol)的方法
本發明關於一種生產白藜蘆醇(resveratrol)的方法，且特別關於以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法。
白藜蘆醇(resveratrol)為一種植物多酚，主要為植物受到環境逆境時如：外力傷害、UV過度照射、昆蟲及微生物入侵感染時所生成的抵禦機制，為一種植物抗菌素(phytoalexins)(Anastasiadi et al.,2012；Burns et al.,2002；Fremont,2000；Potrebko and Resurreccion,2009)。白藜蘆醇化學名稱為三羥基二苯乙烯(3,5,4’-trihydrozystibene)(Abbott et al.)，最早於1940學者Takaoka由白藜蘆(white hellebore；Veratrum grandiflorum O.Loes)的根部分離出鑑定，隨後於1963由中國傳統中藥材-虎杖(Polygonum cuspidatum )的根莖部中亦被分離出有白藜蘆醇成分。白藜蘆醇除了於上述植物中被發現，其亦存在一些特定的植物中，如葡萄、藍莓等某些莓果類，或是花生及石榴等(Burns et al.,2002；Counet et al.,2006；Jerkovic et al.,2010；Manach et al.,2004；Tome-Carneiro et al.,2012；Wang,2012)，然而這些的植物所含的白藜蘆醇含量差異很大，同時，在某些植物 中白藜蘆醇會以糖苷(piceid；polydatin)的形式存在體內。
目前已知白藜蘆醇其具有抗老化、降低糖尿病、肝病、心臟病、癌症及其他代謝症候群相關疾病的罹患機率，然而因其於植物中含量稀少且萃取不易，使其售價及應用上均受限制。
白藜蘆醇化合物有兩種異構物分別為順式(cis)與反式(trans)結構，反式結構才有生理活性，反式結構經UV照射後會變為順式結構而失去生理活性(Potrebko and Resurreccion,2009)，於植物中白藜蘆醇會與糖結合形成較穩定的糖苷形式，糖苷形式有接單糖於不同位置(Counet et al.,2006；Jerkovic et al.,2010；Sun et al.,2010；Wang et al.,2007；Zhang et al.,2007)，亦有同時接兩個單糖的形式，但在虎杖中主要以單糖接於3’-位置上的羥基形式居多數(Sun et al.,2010；Wang et al.,2007；吳佳穎，2007)，這些不同的接糖形式主要為穩定白藜蘆醇於生物體內，於適當時機時生物體可直接轉化生成白藜蘆醇應用。
目前生產白藜蘆醇的方法，有植物萃取法、化學合成法、植物轉化法以及微生物基因工程等，然而植物中白藜蘆醇主要經由酪胺酸與苯丙氨酸途徑合成，其中主要關鍵步驟為合成二苯乙烯合成酶(stilbene synthase)(Donnez et al.,2009)，目前文獻所列以微生物基因工程生產白藜蘆醇的方式，可分為酵母菌與細菌兩部份(Donnez et al.,2009)。
文獻研究指出：目前萃取虎杖中白藜蘆醇方法主要有五種，分別以鹼萃取法(Alkaline extraction)、溶劑萃取法(Solvent extraction)、超音波輔助法(Ultrasonic extraction)、索式回流萃取(Soxhlet extraction)以及CO2 超臨界流萃取法(SFE- CO2)(Benova et al.,2010；Cho et al.,2006；Du et al.,2007；Lei et al.,2007；吳佳穎，2007)。所有的萃取方法均有其優缺點，然而就單純以萃取效果而言，超音波輔助法萃取效果最佳(Lei et al.,2007)。
本發明提供一種以微生物轉化生產白藜蘆醇(resveratrol)的方法，包括：(a)提供一德克酵母屬(Dekkera )之酵母菌或其突變株與一基質，其中該基質包括白藜蘆醇前驅物或含有白藜蘆醇前驅物的一植物基質；(b)將該德克酵母屬之酵母菌或其突變株與該基質加入至一培養基中以形成一混合物；以及(c)對該混合物進行發酵，以使於該混合物中存在之該白藜蘆醇前驅物被該德克酵母屬之酵母菌或其突變株生物轉化而產生白藜蘆醇。
本發明也提供一種新穎之布魯塞爾德克酵母菌(Dekkera bruxellensis )突變株，其於中華民國102年1月9日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 920084之布魯塞爾德克酵母菌。
第1A圖顯示，初步選擇之各菌株使用虎杖為基質之轉化生成白藜蘆醇的實驗結果。
第1B圖顯示，初步選擇之各菌株使用石榴皮為基質之轉化生成白藜蘆醇的實驗結果。
第2圖顯示，不同之布魯塞爾德克酵母菌使用虎杖為基質之轉 化生成白藜蘆醇的實驗結果。
第3圖顯示，所挑選之12株突變株其於不同培養時間點產生的β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)量。
第4A圖顯示利用5公升發酵槽並以虎杖為植物基質且以水、醋酸緩衝溶液或福格爾最小鹽類培養基(Vogel minimal salts medium,VMSM)來培養編號72號之突變株進行白藜蘆醇轉化生成之結果。
第4B圖顯示利用20公升發酵槽並以虎杖為植物基質且以醋酸緩衝溶液來培養編號72號之突變株進行白藜蘆醇轉化生成之結果。
在本發明一實施態樣中，本發明提供一種以上微生物轉化生產白藜蘆醇(resveratrol)的方法。本發明之以微生物轉化生產白藜蘆醇方法可包括下述步驟，但不限於此。
首先，提供一德克酵母屬(Dekkera )之酵母菌或其突變株與一基質。上述基質可包括，但不限於，白藜蘆醇前驅物或含有白藜蘆醇前驅物的一植物基質。
上述德克酵母屬之酵母菌或其突變株可包括一布魯塞爾德克酵母菌(Dekkera bruxellensis )或其突變株，但不限於此。上述布魯塞爾德克酵母菌或其突變株的例子，可包括，布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440或其突變株等，但不限於此。又，布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440之突變株的例子則可包括，但不限於，於中華民國102年1月9日寄存於中華民國食品工業發展研究所生 物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 920084之布魯塞爾德克酵母菌等。
在一實施例中，於本發明之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法中所使用的德克酵母屬之酵母菌或其突變株可為布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440。在另一實施例中，於本發明之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法中所使用的德克酵母屬之酵母菌或其突變株可為，於中華民國102年1月9日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 920084之布魯塞爾德克酵母菌(此菌也於2013年7月11日寄存於德國微生物菌種保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)，寄存編號為DSM 27483)。
於本發明之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法中，上述白藜蘆醇前驅物可包括白藜蘆醇糖苷等，但不限於此，而白藜蘆醇糖苷的例子可包括，但不限於虎杖糖苷等。又，於本發明之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法中，上述含有白藜蘆醇前驅物的該植物基質的例子可包括，但不限於，虎杖、葡萄或葡萄皮、石榴或石榴皮、花生、可可、藍莓、桑葚、蔓越莓或、波蘿蜜等。在一實施例中，上述含有白藜蘆醇前驅物的植物基質可為虎杖，而含於虎杖之白藜蘆醇糖苷為虎杖糖苷。
在一特定實施例中，於本發明之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法中，所述基質為含有白藜蘆醇前驅物的植物基質。又，於此實施例中含有白藜蘆醇前驅物的植物基質的例子可為虎杖。
接著，在提供一德克酵母屬之酵母菌或其突變株與 一基質之後，將上述德克酵母屬之酵母菌或其突變株與上述基質加入至一培養基中以形成一混合物。
上述德克酵母屬之酵母菌或其突變株之添加量為培養基體積的1-65%。在一實施例中，上述德克酵母屬之酵母菌或其突變株之添加量為培養基體積的1-40%。又，上述基質之添加量為培養基體積的1-65%。在一實施例中，上述基質之添加量為培養基體積的1-40%。
又，適用於本發明之培養基的例子，可包括，水、醋酸緩衝溶液與福格爾最小鹽類培養基(Vogel minimal salts medium,VMSM)等，但不限於此。
然後，將上述德克酵母屬之酵母菌或其突變株與上述基質加入至一培養基中以形成一混合物之後，對混合物進行發酵，以使於混合物中存在之白藜蘆醇前驅物被上述德克酵母屬之酵母菌或其突變株生物轉化而產生白藜蘆醇。
上述發酵所進行之時間可為約12-72小時。在一實施例中，上述發酵所進行之時間可為約18-48小時。又，上述發酵可於約20-35℃之溫度進行。在一實施例中，上述發酵可於約23-30℃之溫度進行。
另外，上述發酵可於一搖瓶或發酵槽中進行。
在一實施例中，於本發明之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法中，發酵於一發酵槽中進行，且該德克酵母屬之酵母菌之添加量為培養基體積的1-65%，而該基質之添加量為培養基體積的1-65%。又於此實施例中，上述發酵所進行之時間可為約18-48小時，而上述發酵可於約23-30℃之溫度進行。又，於此實 施例中，基質為含有白藜蘆醇前驅物的該植物基質，而植物基質可為虎杖或石榴皮等。
再者，在另一實施例中，本發明以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，於上述對混合物進行發酵，以使於混合物中存在之白藜蘆醇前驅物被上述德克酵母屬之酵母菌或其突變株生物轉化而產生白藜蘆醇的步驟之後，還可更包括一從該混合物中萃取白藜蘆醇的步驟。
而上述從該混合物中萃取白藜蘆醇的步驟，可包括下列步驟，但不限於此。
先將酒精加入於上述發酵後混合物中並進行超音波震盪以形成一萃取液。上述酒精可包括1-80%之酒精，在一實施例中，上述酒精為80%酒精。另外，所使用之酒精與上述混合物之體積比為1：5-1：20。在一實施例中，所使用酒精與上述混合物之體積比為1：10。
接著，在形成上述萃取液之後將上述萃取液進行乾燥，然後再加入水及乙醚以形成一水層與一乙醚層。所使用的水與上述經乾燥之萃取液的重量比為1：5-1：20。在一實施例中，所使用的水與上述經乾燥之萃取液的重量比為1：10。又，所使用的乙醚與上述經乾燥之萃取液的重量比為1：5-1：20。在一實施例中，所使用的乙醚與上述經乾燥之萃取液的重量比為1：10。
然後，收集上述乙醚層並將上述乙醚層乾燥以獲得白藜蘆醇產物。
另外，在本發明之另一實施態樣中，本發明提供一種新穎之布魯塞爾德克酵母菌突變株，其於中華民國102年1月9 日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 920084之布魯塞爾德克酵母菌。
實施例
A.材料與方法
(A)材料
1.標準品：
白藜蘆醇及糖苷為購自Aldrich公司。
2.試劑及培養基：
酵母抽出物蛋白腖葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)、乙酸(acetic acid)、醋酸鈉(sodium acetate)、乙醇(ethanol)、氯仿(chloroform)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、苯(benzene)、乙醚(ethyl ether)、甲苯(toluene、正己烷(hexane)、乙腈(acetonitrile)、pNP、pNPG、NaCl、NH4 Cl、Na2 CO3 、葡萄糖(glucose)、麥芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、KNO3 、NH4 NO3 、(NH4 )2 SO4 、酵母抽出物(yeast extract)、蛋白腖(peptone)、MgSO4 、KCl、Tween 80等為購自Merck公司。
3.儀器
各種溫度之培養箱、電磁加熱攪拌器、高效液相層析(high-performance liquid chromatography,HPLC)、分光光度計、5公升發酵槽、20公升發酵槽、冷凍乾燥機、迴旋濃縮機、大型蒸汽式濃縮機、版框壓濾機、直立式壓濾機等。
(B)方法
1.搖瓶培養：
將菌接種於酵母抽出物蛋白腖葡萄糖培養基，並以150rpm， 25℃進行培養形成菌液。當菌液之OD600 值達到10時，於一培養基(例如，醋酸緩衝液(1M~5mM，pH 4.5~6.5))中，加入上述菌液(添加量為培養基體積之5%)與白藜蘆醇前驅物或含有白藜蘆醇前驅物的一植物基質(添加量為培養基體積之5%)，並於150rpm，25℃進行發酵24小時。之後將培養液進行凍乾、80%酒精萃取後，以高效液相層析來分析糖苷及白藜蘆醇含量。
2.菌株之β-葡萄糖苷酶的活性測定
(1)將pNP以1M Na2 CO3 配成不同濃度，並以分光光度計測各濃度之pNP於OD 405nm之吸光值以做為檢量線。
(2)將待測菌株進行培養，並於不同時間取樣分析。
(3)將菌液分成兩部份。一部份以100℃加熱5分鐘使於其中之酵素失去活性後，將其冷卻離心並取上清液1mL至透明玻璃管中做為空白對照組；而另一部份則為將其離心並取上清液1mL至透明玻璃管做為實驗組。
(4)將對照組及實驗組分別加入10mM的pNPG(溶於20mM醋酸緩衝液，pH 5)1mL，接著於50℃加熱並攪拌30分鐘以進行反應以形成一反應溶液。之後於反應溶液中加入2mL冰1M Na2 CO3 以終止反應。然後，將反應溶液混合均勻後，取一部份測定其OD 405nm之吸光值。若所測得吸光值超過檢量線之範圍，則以對照組作稀釋後測，並依檢量線推其酵素活性。
3.甲基硝基亞硝基胍(N-methyl-N' -nitro-N-nitrosoguanidine,NTG)突變
根據先前試驗得知，以100ppm的甲基硝基亞硝基胍處理菌株5分鐘來產生突變具有較佳結果，於是將布魯塞爾德克酵母菌 (Dekkera bruxellensis )BCRC 21440先以不同濃度的甲基硝基亞硝基胍處理5分鐘以產生突變。結果顯示，經100ppm的甲基硝基亞硝基胍處理5分鐘之布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440其致死率為約58%。於是重新將布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440以100ppm的甲基硝基亞硝基胍進行不同時間長度的處理。結果顯示，隨甲基硝基亞硝基胍處理時間增加，菌株致死率增加。於處理20分鐘後，菌株之致死率達70%，但之後隨著處理時間的延長，致死率則呈趨緩。另外，重新配置不同濃度之甲基硝基亞硝基胍，並布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440分別以不同濃度的甲基硝基亞硝基胍處理5分鐘以進行突變。結果顯示，隨甲基硝基亞硝基胍濃度增加，菌株之致死率提昇。當甲基硝基亞硝基胍濃度為300ppm時，菌株之致死率達70%，但之後隨著處理濃度的增加，致死率則呈趨緩。
甲基硝基亞硝基胍突變之實驗方法如下所述：(i)將菌株活化；(ii)將經活化之菌株轉移至培養液；(iii)培養16-24小時之後，以8000rpm將培養液離心5分鐘以收菌；(iv)去除上清液，將沉澱物以等量PBS緩衝溶液回溶清洗3次；(v)將菌液濃度調整為106 CFU/mL左右；(vi)將菌液與甲基硝基亞硝基胍混合(不同濃度之甲基硝基亞硝基胍或不同之處理時間)；(vii)將菌液離心以去除上清液，之後將沉澱物以等量PBS緩衝溶液清洗3次； (viii)將菌液進行適量之稀釋，並塗佈於平板培養基上以進行培養；(ix)挑選菌株以進行其β-葡萄糖苷酶的活性測定；(x)將β-葡萄糖苷酶的活性較佳之菌株再進行突變或進行穩定性分析。
將經挑選之甲基硝基亞硝基胍處理突變株調整菌體濃度後，接種至96孔ELISA盤中，培養24小時。之後取出上清液加入pNPG及Na2 CO3 呈色，以ELISA讀取儀判讀其OD 405nm之值，並將此值與原始菌株相較，以選擇β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)產量較好的菌株。將所選擇之β-葡萄糖苷酶產量較好的菌株以ELISA讀取儀進行β-葡萄糖苷酶之穩定性分析，若同個樣本經多次測量，ELISA之讀值穩定，顯示菌株突變後分泌β-葡萄糖苷酶性狀穩定。
4.植物基質之製備、白藜蘆醇之微生物轉化生產及轉化率之計算
(1)將虎杖、石榴皮等植物基質以果汁機攪碎備用。
(2)將菌株以酵母抽出物蛋白腖葡萄糖培養基培養基活化。之後將菌株加入含植物基質培養基中以使基質進行轉化，並不同時間點進行收集樣品。
(3)樣品進行凍乾，之後加入50%乙醇並於70℃以超音波輔助萃取30分鐘。將所萃取之萃取液冷卻後以0.22um濾膜過濾。
(4)然後以高效液相層析來分析濾液之虎杖糖苷(piceid)與白藜蘆醇(resverotrol)含量，並計算虎杖糖苷轉化為白藜蘆醇之轉化率。
轉化率為：基質轉化率(%)= M：莫耳數
5.白藜蘆醇的萃取：
(1)將經凍乾之含轉化後植物基質的培養基加入1：10之80%酒精(w/w)並進行30分鐘超音波(40kHz)震盪。以此步驟進行兩次萃取；(2)合併萃取液並進行乾燥。以1：10進行覆水(w/w)形成溶液，再以1：1之比例將乙醚加入此溶液中，之後收集乙醚層，以此步驟進行兩次萃取；(3)將乙醚層進行乾燥得白藜蘆醇產物。
6.糖苷與白藜蘆醇的分析：
(1)分別取糖苷與白藜蘆醇標準品，以50%酒精將其分別配製成0.5、5、25、75、100、150與175mg/L濃度並以HPLC分析，以獲得其分別之檢量線；(2)將萃取後樣品稀釋至檢量線濃度內，以0.22μm濾膜過濾後，以HPLC分析白藜蘆醇及糖苷含量；(3)HPLC分析以C18 管柱4.6x250nm，5μm(Waters ODS II)作為分離管柱進行分析；(4)移動相為A：0.1%乙酸；B：乙腈。初始以95%A與5%B，25.3分鐘後轉為55%之A與45%之B，31分鐘轉為100%之B，33分鐘後調回初始值95%之A與5%之B，維持至45分鐘；(5)移動相流速為1.5mL/分鐘，樣品注射量為20μL。
B.實驗與結果
1.菌株之轉化基質生成白藜蘆醇之能力的分析
(1)菌株之初步篩選
首先由生資中心微生物資源庫進行初步篩選，初步篩選出如表1所示之細菌、酵母菌及絲狀真菌，並將其分別進行培養與β -葡萄糖苷酶的活性測試。
於測定各菌株之β-葡萄糖苷酶表現後，篩選出表現β- 葡萄糖苷酶較高的微生物菌株，其分別為2株酵母菌，為布魯塞爾德克酵母菌(Dekkera bruxellensis )BCRC 21440與啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae )BCRC 20855，以及9株真菌，為黑黴菌(Aspergillus niger )BCRC 32734與BCRC 30883、百脈根輪紋菌(Stemphylium loti )BCRC 31890、疣孢漆斑黴(Myrothecium verrucaria )BCRC 31545、米麴菌(Aspergillus oryzae )BCRC 30230與BCRC 32271以及嗜熱側孢黴菌(Sporotrichum thermophile )BCRC 31852
2.菌株之轉化基質生成白藜蘆醇之能力的分析
對於所篩選出之各菌株進行下述之實驗。將作為植物基質之虎杖或石榴皮的粉末以及一菌株加入水中，並進行發酵。於發酵之後將培養液加入80%乙醇以進行萃取。將所獲得之萃取液以HPLC分析白藜蘆醇及糖苷之含量。使用虎杖為基質之各菌株的實驗結果如第1A圖所示，而使用石榴皮為基質之各菌株的實驗結果如第1B圖所示。
根據第1A與1B圖之結果，可以清楚得知，相同之菌株對於不同之植物基質的白藜蘆醇及糖苷含量的增加或減少能力不同，且不同之菌株對於相同之植物基質的白藜蘆醇及糖苷含量的增減情況也不相同。而根據整個實驗結果初步看來，以酵母菌之布魯塞爾德克酵母菌(Dekkera bruxellensis )BCRC21440對於白藜蘆醇之生成具有較佳轉化基質生成白藜蘆醇的效果。
3.不同之布魯塞爾德克酵母菌(Dekkera bruxellensis )菌株之轉化基質生成白藜蘆醇之能力的分析
由上述菌株轉化測試結果顯示，酵母菌之布魯塞爾 德克酵母菌BCRC 21440對於白藜蘆醇之生成具有較佳轉化基質生成白藜蘆醇的效果，因此嘗試蒐集不同布魯塞爾德克酵母菌之菌株，其分別為布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440、布魯塞爾德克酵母菌BCRC 20932、布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21518、布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21519與布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517，並將所蒐集到的菌株以虎杖作為植物基質進行轉化生成白藜蘆醇的試驗。轉化結果如第2圖所示。
根據第2圖可知，所蒐集之布魯塞爾德克酵母菌對於虎杖基質皆具有良好轉化基質生成白藜蘆醇之能力，而後續以布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440菌株進行進一步突變以提升其轉化基質生成白藜蘆醇之能力。
虎杖中糖苷含量約為白藜蘆醇之2-4倍，較其他植物基質高很多，故利用虎杖作為菌株轉化的植物基質，可得到較佳的白藜蘆醇產量，且有助於後續純化回收白藜蘆醇。
4.布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440之甲基硝基亞硝基胍(N-methyl-N' -nitro-N-nitrosoguanidine,NTG)突變
將布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440經由一連串系列NTG突變後，共挑選226株突變株進行分析，結果以其中12株結果較佳，其分別為編號11、16、34、39、41、53、58、61、63、67、70與72之突變株，於是進一步分別分析此12株突變株於不同培養時間點所產生之β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)的量。結果如第3圖所示。
根據第3圖所示可知，上述之12株突變株的β-葡萄糖苷酶產量均較原始菌株佳，其中又以編號11、53、61及72之突變 株較佳。
之後，將上述編號11、53、61及72之突變株所產生之β-葡萄糖苷酶進行穩定性分析。將每株挑選23個菌落並調整至相同OD值後，培養48小時。之後測定所培養之菌的OD405 吸光值，分析其穩定性。結果顯示4株菌產β-葡萄糖苷酶能力差異不大，而編號11之突變株產β-葡萄糖苷酶能力的變異性較大(>10%)，其他3株都在10%以下，此外，由於編號72號之突變株的β-葡萄糖苷酶產量略高，因此將其作為後續培養基探討之菌株，並將其命名為布魯塞爾德克酵母菌(Dekkera bruxellensis )NTG-72，且於中華民國102年1月9日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 920084，並於2013年7月11日寄存於德國微生物菌種保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)，寄存編號為DSM 27483。
連續培養之菌株的轉化基質生成白藜蘆醇之能力的分析
經由一連串篩選與突變篩選，以上述編號72號之突變株進行後續實驗。以YPD培養基進行種菌活化，之後將經活化種菌接種並培養，當其以OD600 測定值達到10，再進行後續轉化試驗。
(1)5公升之發酵槽連續培養
利用5公升發酵槽並以虎杖為植物基質來培養編號72號之突變株進行生產白藜蘆醇，而培養條件為：25℃、100~200rpm、通氣量為1vvm、5%接菌量(相對於培養基之體基)。分別 以福格爾最小鹽類培養基(Vogel minimal salts medium,VMSM)、20mM醋酸緩衝液pH 5.0與水作為生產的培養基，添加2%虎杖(相對於培養基之體基)作為轉化白藜蘆醇的植物基質來培養編號72號之突變株，結果如第4A圖所示。
第4A圖顯示，以醋酸緩衝液作為培養基具有最高之白藜蘆醇產量。最高的白藜蘆醇的含量為7455.6μ g/g，之後隨時間的增加而緩慢降低，而此時的虎杖糖苷含量只剩下198.6μ g/g，而其次為水作為培養基，最差的為福格爾最小鹽類培養基。
(2)20公升之發酵槽連續培養
利用20公升發酵槽與並以虎杖為植物基質來培養編號72號之突變株進行生產白藜蘆醇，以100-200rpm、0.2vvm的條件進行培養。以20mM醋酸緩衝液pH5.0作為培養基，並添加2%虎杖(相對於培養基之體基)作為基質，結果第4B圖所示。
第4B圖顯示，白藜蘆醇含量隨時間而增加，直到40小時趨於平緩，從2177.6ug/g增加到最高值為7266.4ug/g，而虎杖糖苷的趨勢則相反。另外，計算虎杖糖苷轉化成白藜蘆醇的轉化率，結果轉化率可以達到95%以上。
綜合前述結果可知，將β-葡萄糖苷酶高產量之酵母菌(編號72號之突變株)以虎杖為植物基質進行發酵，以轉化虎杖糖苷生成白藜蘆醇。從搖瓶初步測試轉化率、5公升發酵槽測試轉速及通氣量參數、20公升發酵槽測試放大製程之轉化率均可行後，共進行多次發酵(包括5公升、20公升、250公升和2000公升，均進行三次以上)。結果顯示，在所有發酵體積之實驗中，在培養第30-72小時期間，糖苷含量降至0.5mg/g或以下，而白藜蘆醇從 30小時後則漸趨於穩定，大約含量為8-12mg/g，其轉化率更可達95%以上。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、102/1/9、BCRC 920084
國外寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
德國微生物菌種保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)、2013/7/11、DSM 27483

Claims (25)

  1. 一種以微生物轉化生產白藜蘆醇(resveratrol)的方法，包括：(a)提供一德克酵母屬(Dekkera )之酵母菌與一基質，其中該基質包括白藜蘆醇前驅物或含有白藜蘆醇前驅物的一植物基質；(b)將該德克酵母屬之酵母菌與該基質加入至一培養基中以形成一混合物；以及(c)對該混合物進行發酵，以使於該混合物中存在之該白藜蘆醇前驅物被該德克酵母屬之酵母菌生物轉化而產生白藜蘆醇。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該德克酵母屬之酵母菌包括一布魯塞爾德克酵母菌(Dekkera bruxellensis )。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該布魯塞爾德克酵母菌包括布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440或於中華民國102年1月9日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 920084之布魯塞爾德克酵母菌。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該德克酵母屬之酵母菌為，布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該德克酵母屬之酵母菌為，於中華民國102年1月9日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 920084之布魯塞爾德克酵母菌。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該白藜蘆醇前驅物包括白藜蘆醇糖苷。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該白藜蘆醇糖苷包括虎杖糖苷。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中含有白藜蘆醇前驅物的該植物基質包括虎杖、葡萄或葡萄皮、石榴或石榴皮、花生、可可、藍莓、桑葚、蔓越莓或波蘿蜜。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該含有白藜蘆醇前驅物的該植物基質為虎杖。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中含於該虎杖之該白藜蘆醇前驅物為虎杖糖苷。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該基質為含有白藜蘆醇前驅物的該植物基質。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該植物基質為虎杖。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該德克酵母屬之酵母菌之添加量為培養基體積的1-65%。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該基質之添加量為培養基體積的1-65%。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該培養基包括水、醋酸緩衝溶液或福格爾最小鹽類培養基(Vogel minimal salts medium,VMSM)。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該發酵時間為約12-72小時。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該發酵溫度為約20-35℃。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該發酵於一搖瓶或發酵槽中進行。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該發酵於一發酵槽中進行，且該德克酵母屬(Dekkera )之酵母菌添加量為培養基體積的1-65%，而該基質之添加量為培養基體積的1-65%。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該發酵時間為約18-48小時。
  21. 如申請專利範圍第19項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該發酵溫度為約23-30℃。
  22. 如申請專利範圍第19項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該基質為含有白藜蘆醇前驅物的該植物基質。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中該植物基質為虎杖或石榴皮。
  24. 如申請專利範圍第1項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中於該步驟(c)之後，更包括(d)從該混合物中萃取該白藜蘆醇。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之以微生物轉化生產白藜蘆醇的方法，其中於該步驟(d)包括：(i)於經發酵之該混合物中加入酒精並進行超音波震盪以形成一萃取液；(ii)將該萃取液進行乾燥後再加入水及乙醚以形成一水層與一乙醚層；以及(iii)收集該乙醚層並將該乙醚層乾燥以獲得白藜蘆醇產物。
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