CN103224890A - 高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低产色素的红曲霉菌及其用途和由该红曲霉菌制备的功能红曲 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低产色素的红曲霉菌，名称为：C002，分类命名为：红曲（Monascus sp.），保藏编号为：CGMCC NO.6860，保藏日期：2012年11月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。本发明的红曲霉菌具有高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸；不产、极低产桔霉素，无苦味，并具有低产红曲色素的特点，红曲霉菌CGMCC NO.6860菌株可利用包括大米、黄米、玉米、木薯等多种培养基质生产功能性红曲；该红曲霉菌的低产红曲色素的特性尤其适合相关功能性饮料的产品开发。

Description

高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低产色素的红曲霉菌及其用途和由该红曲霉菌制备的功能红曲

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，涉及红曲霉菌，尤其是一种高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低产色素的红曲霉菌及其用途和由该红曲霉菌制备的功能红曲。

背景技术

在探寻有效降血脂药物的科学研究中，日本学者远藤章和美国学者Albert分别于1979和1980年在红曲菌（Monascus ruber)和土曲霉（Aspergillus terreus)中发现了胆固醇合成抑制剂，他们分别将其命名为莫纳可林K（Monacolin k)和Mivinolin。Monacolin K与Mivinolin为结构相同的同一类活性物质，国际上后来将这两种物质统一命名为洛伐他汀(Lovastatin)。1985年，远藤章教授等人从红色红曲菌M.ruber中又分离出与Monacolin K结构相似的其它活性成分：Monacolin L，MonacolinX，Monacolin M，Dihydromevinolin和Dihydromonacolin L，他们被统称为他汀同系物（Monacolins）,它们均具有与Monacolin K类似的降血脂的功能。上述他汀类化合物是一类高效的降脂药物，它能有效地抑制胆固醇合成限速酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰CoA 还原酶（HMGCR）的活性，降低人体内源性胆固醇合成，减少细胞内胆固醇贮存；降低血中低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）的浓度，从而有效地预防动脉粥样硬化；甚至能逆转动脉粥样硬化。

红曲是由红曲菌在米上发酵而形成，因色泽深红，称之为红曲，味微苦。红曲菌又称为红曲霉，属于真菌界（The Fungi）真菌门（Eumycota）、子囊菌亚门（Ascomycotina）、不整囊菌纲（Plectomyhcetes）、散囊菌目（Eurtotiales）、红曲科（Monascaceae）、红曲菌属（Monascus Van．tiegh）。红曲产品在我国有近千年的应用历史，在20世纪80年代以前，红曲产品主要由红曲色素和红曲酒两大系列构成。80年代后，随着胆固醇合成抑制剂—Monacolin K在红曲产品中的发现，它又被冠以功能红曲的美誉，其预防保健功效日益受到广泛关注。

近年来有多篇文献报道显示功能性红曲米对于不耐受他汀类药物治疗的患者能起替代治疗作用，且其副作用发生率低于他汀类药物治疗的患者。

通过对红曲进一步的深入研究，人们发现：除了Monacolin k及其同系物，红曲菌还能产生多种对人类有益的代谢产物，其中γ-氨基丁酸（简称GABA）是一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质。GABA具有降低血压、辅助治疗相关神经系统退行性疾病，如帕金森症、老年痴呆症等功效。当人体内缺乏GABA时，会产生焦虑、不安、疲倦、忧虑等情绪，GABA可提升睡眠品质，降低失眠的发生频率。日本厚生劳动省和台湾卫生署分别于2001年和2005年将GABA成分列为食品，中华人民共和国卫生部也于2009年9月27日将GABA列为新资源食品。红曲中还含有多种其它活性成分：支链氨基酸等(减肥)；Dimerumic acid (护肝)；黄酮酚（抗氧化）；红曲橙色素 (抗癌)；麦角固醇（预防骨质疏松）等等。红曲还具有降血糖、抗炎和减肥功效。红曲中的更多功能因子正逐步被人们挖掘和利用。

1995年，法国学者Blanc等证实一种肾毒性抗生素——桔霉素存在于红曲产品中，使得红曲产品的开发受到了阻碍。为了降低红曲产品中桔霉素的含量和提高洛伐他汀产量，国内外学者进行了从菌种筛选及发酵工艺调控到分子水平方面的基础性研究。2000年，日本厚生劳动省在世界上首次颁布红曲色素产品中桔霉素的限量标准（0.2mg/kg）,直到2009年9月， 台湾卫生署才制定并实施了红曲产品中的桔霉素限量标准：红曲色素中桔霉素要求不超过0.2mg/kg（同日本），原料用红曲米的桔霉素限量为5 mg/kg。使用红曲原料制成的食品，其桔霉素限量为2mg/kg。桔霉素在红曲米中的限量标准是其在红曲色素中的25倍，这从一个侧面反应了红曲米中桔霉素的控制难度远大于红曲色素。我国是红曲的发祥地和使用大国，但至今仍未出台对国际公认的真菌毒素-桔霉素的限量法规。

因此，急需一种同时兼具高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低产色素并不产或极低产桔霉素特性的红曲霉菌及由该红曲霉菌制备的功能红曲。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的公开专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸；不产、极低产桔霉素，无苦味，并具有低产红曲色素的红曲霉菌，由该红曲霉菌制备的功能红曲可以应用在制备降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性饮料和抑制肿瘤细胞增殖的药物中。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低产色素的红曲霉菌，名称为：C002，分类命名为：红曲（Monascus sp.），保藏编号为：CGMCC NO.6860，保藏日期：2012年11月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。

利用上述红曲霉菌制备的功能红曲。

而且，所述功能红曲的制备步骤如下：

固体发酵培养基厚度1~8cm，冷却至室温后将孢子悬液浓度为10⁶~10⁸的红曲霉菌种子液按体积质量比ml/g为10~25%的接种量混合入固体发酵培养基中，于30~37℃培养3~10天，转入20~27℃培养2~6周，湿度40~80%，发酵结束后，置于40~70℃干燥，即得功能红曲。

而且，所述固体发酵培养基制备方法为：将粮食培养基分别与水按质量体积比g：ml为1:1~3的比例浸泡过夜，121℃灭菌20min。

而且，所述粮食培养基为大米、黄米、玉米、豌豆、豆渣、木薯、麦、豌豆、糜子或苡米中的一种或几种的混合物。

而且，所述粮食培养基按粮食培养基：麦麸或米糠或豆粕的重量比为1~10:1的比例将粮食培养基与麦麸或米糠或豆粕进行复配。

而且，所述红曲霉菌种子液的制备方法如下：种子液培养基为葡萄糖10~60g/L，蛋白胨10~40g/L，NaNO₃ 1~10g/L，MgSO4·7H₂O 1~5g/L，KH₂PO₄ 0.1~10g/L，向种子液培养基中接种红曲霉菌CGMCC NO.6860后，于140~220rpm，30~37℃培养12~24小时，得红曲霉菌种子液。

而且，所述功能红曲中无桔霉素或桔霉素含量＜50μg/kg；红曲不产或低产红曲色素；所述红曲中洛伐他汀含量为3~12mg/g，γ-氨基丁酸含量为2~5 mg/g；所述低产红曲色素的红曲色素色调为淡黄色，410nm测定黄色素的色价＜20U/g。

如上所述的红曲霉菌在制备降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性饮料和抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

如上所述的功能红曲在制备降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性饮料和抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

本发明的有益效果和优点是：

1、本发明的红曲霉菌具有高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸；不产、极低产桔霉素，无苦味，并具有低产红曲色素的特点，红曲霉菌CGMCC NO.6860菌株可利用包括大米、黄米、玉米、木薯等多种培养基质生产功能性红曲；该红曲霉菌的低产红曲色素的特性尤其适合相关功能性饮料的产品开发。

2、本发明红曲霉菌制备得到的功能红曲主要功能性成分含有洛伐他汀3-12mg/g，γ-氨基丁酸（GABA）含量2-5 mg/g, 桔霉素含量＜50μg/kg，具有抑制肿瘤细胞增殖的功效；该功能性红曲可用于开发有助于降血脂和改善睡眠的保健食品，应用于制备功能性饮料和抑制肿瘤细胞增殖的药物中。

附图说明

图1为本发明红曲菌株CGMCC NO.6860在不同培养基上生长的菌落形态图；其中，A为黄米培养基上生长的菌落形态图，B为燕麦培养基上生长的菌落形态图，C为玉米培养基上生长的菌落形态图，D为大米培养基上生长的菌落形态图。

图2为本发明红曲菌株CGMCC NO.6860发酵大米功能红曲产品的实物照片；其中图2-1为发酵大米功能红曲上层俯视图片，其中图2-2为发酵大米功能红曲底层俯视图片。

图3为本发明红曲霉菌CGMCC NO.6860发酵大米的功能红曲产品乙醇提取液照片。该图显示低色价的功能红曲其乙醇提取物淡黄色的色调。该色调非常适合于相关功能饮料的开发。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明提供一种红曲属红曲霉（Monascus sp.）及其发酵制备的功能性红曲。本发明提供的红曲菌株具有高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸；不产、极低产桔霉素；无苦味；并具有低产红曲色素的特点。该功能性红曲主要功能性成分含有洛伐他汀3-12mg/g, γ-氨基丁酸（GABA）含量2-5 mg/g，桔霉素含量＜50μg/kg; CGMCC NO.6860菌株可利用包括大米、黄米、玉米、木薯等多种培养基质生产功能性红曲；CGMCC NO.6860菌株发酵生产的功能性红曲具有抑制肿瘤细胞增殖的效果；采用CGMCC NO.6860菌株生产的功能性红曲可用于开发有助于降血脂和改善睡眠的保健食品；其低产红曲色素的特性尤其适合相关功能性饮料的产品开发。

一种高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低产色素的红曲霉菌，名称为：C002，分类命名为：红曲（Monascus sp.），保藏编号为：CGMCC NO.6860，保藏日期：2012年11月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。

红曲霉菌CGMCC NO.6860的形态学特征为：在大米、黄米、玉米、木薯、莜麦、豌豆、黄豆、糜子、苡米等多种粮食培养基上菌丝体呈白色，无色素分泌或分泌到培养基中的色素呈淡黄色，见图1。

在黄米培养基、燕麦培养基、玉米培养基和大米培养基4种培养基上红曲菌株CGMCC NO.6860菌丝皆呈现白色，仅有少许淡黄色色素分泌到培养基质中。

光学显微镜观察菌丝无色、有分枝及横隔、多核；分生孢子单生或成链，球形或梨形；子囊球形；子囊孢子卵圆形、光滑、无色或淡黄色。

上述的红曲霉菌CGMCC NO.6860的筛选方法步骤如下：

称取10克红曲米粉（来源于福建泉州市集贸市场），加入到90ml带玻璃珠的无菌生理盐水中，振摇10分钟，10倍梯度稀释。吸取0.1ml稀释液涂布于马铃薯蔗糖（PDA）分离培养基上，30℃培养3-7天，挑取单菌落转移接种到新的分离培养基培养，经反复分离纯化得到纯化的红曲菌株CGMCC NO.6860。

上述红曲霉菌CGMCC NO.6860制备红曲的步骤如下：

种子液培养基（g/L）：葡萄糖10~60g，蛋白胨10~40g，NaNO₃ 1~10g，MgSO4·7H₂O 1~5g，KH₂PO₄ 0.1~10g，接种量3-5%（体积比，ml/ml）红曲霉菌CGMCC NO.6860后，于140~220rpm，30~37℃ 培养12~24小时，得红曲霉菌种子液。

固体发酵培养基：将大米等粮食培养基（粮食培养基为大米、黄米、玉米、豌豆、豆渣、木薯、麦、豌豆、糜子或苡米中的一种或几种的混合物）分别与水以质量体积比为1:1~3的比例浸泡过夜，121℃灭菌20min；

其中，也可将粮食培养基按重量比为1~10:1的比例将粮食培养基与麦麸、米糠或豆粕进行复配。

固态发酵制备红曲：固体发酵培养基厚度1~8cm，物料冷却至室温后将制备好的红曲霉菌种子液（孢子悬液浓度10⁶-10⁸）按10-25%（体积质量比，ml/g）的接种量混合入固体发酵培养基中，于30~37℃培养3~10天，转入20~27℃培养2~6周，湿度40-80%，发酵结束后，置于40~70℃干燥，即获得功能红曲。

本发明红曲菌株CGMCC NO.6860发酵大米功能红曲产品的实物照片见图2；其中图2-1为发酵大米功能红曲上层俯视图片，其中图2-2为发酵大米功能红曲底层俯视图片：显示发酵大米产品表面呈现白色或微弱的淡黄色的低色价红曲的特点。

本发明红曲霉菌CGMCC NO.6860发酵大米的功能红曲产品乙醇提取液照片见图3，该图显示低色价的功能红曲其乙醇提取物淡黄色的色调。该色调非常适合于相关功能饮料的开发。

实施例1

种子液培养基（g/L）：葡萄糖30-60g，蛋白胨10-20g，NaNO₃ 5-10g，MgSO4·7H₂O 1-5g，KH₂PO₄ 1-10g，接种红曲霉菌CGMCC NO.6860后，于180rpm，37℃培养12小时，得种子液。

固体发酵培养基：将大米与水以质量体积比为1:1~3的比例浸泡过夜，121℃灭菌20min。

固态发酵制备红曲：固体发酵培养基厚度2-5cm，物料冷却后将制备好的种子液按10%的接种量混合入固体发酵培养基中，37℃培养3-5天，转入20~27℃培养2~4周，湿度50~80%。发酵结束后，置于70℃干燥，即可获得功能红曲。

红曲霉CGMCC NO.6860制备的功能红曲中Monacolin k含量测定：

高效液相色谱条件为：Agilent TC—18（250mm ×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：乙腈：水=6:4；检测器：紫外检测器；检测波长：λ=237 nm；柱温：室温；流速：1mL/min；进样量：20μL。

样品处理：准确称取0.5000g红曲干燥样品（过100 目筛），置于20mL离心管中，加入8mL 75 %乙醇，超声30 min，3000r/min离心10min，重复3次，合并上清液，容量瓶使用蒸馏水定容至25mL，静置30min，经0.22μm滤膜过滤后待测。检测结果见表1。

红曲霉CGMCC NO.6860制备的功能红曲中GABA含量测定：

高效液相色谱条件： Agilent Eclipse AAA（150mm ×4.6mm，5μm）色谱柱；采用梯度洗脱：流动相A：1.6 ‰醋酸钠，冰醋酸调pH7.2；流动相B：甲醇：乙腈：1.6 ‰醋酸钠=45:45:10，冰醋酸调pH 7.2；0~2min流动相B为20%，2~18min流动相B由20% 上升至100%，然后维持4min，22~26min流动相B由100%降至20%。检测器：紫外检测器；检测波长：λ=338nm；柱温：25℃；流速：1mL/min；进样量：20μL。吸取200μL样品溶液、200μL衍生剂（OPA 80 mg，β-巯基乙醇80μl，甲醇 10ml）和1mL硼酸缓冲液（0.4 mmol/mL，pH 10.4），振荡5 min后经0.22μm滤膜过滤后检测。检测结果见表1。

红曲霉CGMCC NO.6860制备的功能红曲中桔霉素含量测定：

色谱条件：Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：乙腈：甲醇：水=70：10：20（磷酸调pH2.66-2.68）；检测器：荧光检测器；检测波长：λex=331 nm，λem=500 nm；柱温：25℃；流速：1mL/min；进样量：20μL。样品处理方法与检测功能红曲中Monacolin K的方法相同。检测结果见表1。

红曲霉CGMCC NO.6860制备的功能红曲的色价测定方法：

样品烘干研磨（过40目筛），参考国标GB4926-2008所示方法，红曲霉CGMCC NO.6860制备功能红曲仅有淡黄色色素产生，测定波长选择为410nm。检测结果见表1。

表1 红曲霉CGMCC NO.6860制备的功能红曲的检测结果

实施例2

种子液培养基（g/L）：葡萄糖30-60g，蛋白胨10-20g，NaNO₃ 5-10g，MgSO4·7H₂O 1-5g，KH₂PO₄ 1-10g， 接种红曲霉菌CGMCC NO.6860后，于140~180rpm，37℃ 培养24小时，得种子液。

固体发酵培养基：将燕麦、麦麸/水以质量体积比为2-4:1/2-10的比例浸泡过夜，121℃灭菌20min。

固态发酵制备红曲：固体发酵培养基厚度3-6cm，物料冷却后将制备好的种子液按15%的接种量混合入固体发酵培养基中。37℃培养1-3天，转入20-27℃培养2-4周，湿度40~60%。发酵结束后，置于70℃干燥，即可获得本发明的功能红曲。

红曲霉CGMCC NO.6860制备的功能红曲的方法同实施例1中的方法。

红曲霉CGMCC NO.6860制备的功能红曲的各项指标方法同实施例1，检测结果见表2。

表2 红曲霉CGMCC NO.6860制备的功能红曲的检测结果

红曲霉菌CGMCC NO.6860制备的红曲抑制肝癌细胞HepG2增殖效应评价：

样品提取：称取10.0 g红曲霉CGMCC NO.6860制备的功能红曲产品，放入50mL离心管中，加入16mL 75 %乙醇，超声30min，3000r/min离心10min，重复3次。将上清液合并，35 ℃烘干，备用。

MTT法评价红曲霉CGMCC NO.6860制备的功能红曲对肝癌细胞HepG2增殖的抑制效应：

将冻存于液氮中的HepG2肝癌细胞复苏后，加入一定量体积比为1：9的胎牛血清蛋白/DMEM液体培养基（Solarbio，货号：12100-500）1000r/min离心5 min，吸出上清液（清洗细胞，可反复多次）。向沉淀中加入一定量的完全培养基，充分混匀，用血球计数板计数，将细胞浓度稀释至10⁵ 个/mL，于96孔板点样，每孔100 μL。设置实验组和对照组，实验组各样品中加入完全培养基和DMSO（DMSO浓度应保持在质量分数0.1 %以下），配置红曲霉CGMCC NO.6860功能红曲浓度为2、4、8 mg/mL，每个梯度设置4个平行，对照组为培养基（DMSO浓度应保持在质量分数0.1 %以下），每孔100 μL。于37 ℃、饱和湿度、5 %CO₂培养箱培养48 h，实验终止前4 h加入50 μLMTT溶液，继续培养4 h，离心弃上清，加100 μL DMSO，在570nm下测定吸光度，计算抑制率。

细胞抑制率计算公式为：

测定结果显示：浓度为2、4、8 mg/mL CGMCC NO.6860发酵大米的功能红曲对肝癌细胞HepG2增殖的抑制率分别为18%、32%和62%。

综上，可以看出红曲霉菌CGMCC NO.6860制备的功能红曲可以应用在制备降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性饮料和抑制肿瘤细胞增殖的药物中。

Claims (10)

1.一种高产洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低产色素的红曲霉菌，其特征在于：名称为：C002，分类命名为：红曲（Monascus sp.），保藏编号为：CGMCC NO.6860，保藏日期：2012年11月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。

2.利用如权利要求1所述的红曲霉菌制备的功能红曲。

3.根据权利要求2所述的功能红曲，其特征在于：所述功能红曲的制备步骤如下：

固体发酵培养基厚度1~8cm，冷却至室温后将孢子悬液浓度为10⁶~10⁸的红曲霉菌种子液按体积质量比ml/g为10~25%的接种量混合入固体发酵培养基中，于30~37℃培养3~10天，转入20~27℃培养2~6周，湿度40~80%，发酵结束后，置于40~70℃干燥，即得功能红曲。

4.根据权利要求3所述的功能红曲，其特征在于：所述固体发酵培养基制备方法为：将粮食培养基分别与水按质量体积比g：ml为1:1~3的比例浸泡过夜，121℃灭菌20min。

5.根据权利要求4所述的功能红曲，其特征在于：所述粮食培养基为大米、黄米、玉米、豌豆、豆渣、木薯、麦、豌豆、糜子或苡米中的一种或几种的混合物。

6.根据权利要求4所述的功能红曲，其特征在于：所述粮食培养基按粮食培养基：麦麸或米糠或豆粕的重量比为1~10:1的比例将粮食培养基与麦麸或米糠或豆粕进行复配。

7.根据权利要求2所述的功能红曲，其特征在于：所述红曲霉菌种子液的制备方法如下：种子液培养基为葡萄糖10~60g/L，蛋白胨10~40g/L，NaNO₃ 1~10g/L，MgSO4·7H₂O 1~5g/L，KH₂PO₄ 0.1~10g/L，向种子液培养基中接种红曲霉菌CGMCC NO.6860后，于140~220rpm，30~37℃培养12~24小时，得红曲霉菌种子液。

8.根据权利要求7所述的功能红曲，其特征在于：所述功能红曲中无桔霉素或桔霉素含量＜50μg/kg；红曲不产或低产红曲色素；所述红曲中洛伐他汀含量为3~12mg/g，γ-氨基丁酸含量为2~5 mg/g；所述低产红曲色素的红曲色素色调为淡黄色，410nm测定黄色素的色价＜20U/g。

9.如权利要求1所述的红曲霉菌在制备降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性饮料和抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

10.如权利要求2至8任一项所述的功能红曲在制备降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性饮料和抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

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