CN116925926A - 富硒红色红曲霉发酵生产洛伐他汀的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了富硒红色红曲霉发酵生产洛伐他汀的方法,特别涉及一种富硒且高产洛伐他汀红曲的栽培方法及其应用。本发明的红色红曲霉MR1能够高耐受硒,亚硒酸盐和纳米硒对红色红曲霉MR1的半抑制浓度IC50分别为16.77mg/L和218.45mg/L。红色红曲霉MR1能够将亚硒酸盐、纳米硒高效转化为SeCys2、MeSeCys和SeMet三种有机硒形态,无机硒残留低于5%。通过添加0‑500mg/kg的亚硒酸盐和纳米硒,红色红曲霉MR1中洛伐他汀的含量可以在3.12mg/g‑9.11mg/g的范围内定量调控,同时菌体中红色、黄色、橙色色素的色价均能达到200U/g以上。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学和发酵技术领域,具体地说,涉及富硒红色红曲霉发酵生产洛伐他汀的方法。
背景技术
红曲(Monascus spp.),属于子囊菌门、曲霉科、红曲霉属,是一种药食两用真菌。红曲中含有洛伐他汀、红曲色素、麦角固醇、不饱和脂肪酸、多糖、皂苷、黄酮等丰富的生物活性成分,具有优异的降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抑菌抑病毒等功效。洛伐他汀也被称为莫纳克林k(Monacolin K,MK),已广泛用于医药方面,其最重要的发现是具有降脂效果和潜在的治疗癌症的作用,此外,洛伐他汀还有预防和治疗帕金森等神经系统疾病、消炎抗菌、改善血管表皮、抗血管平滑肌细胞增生、抗血小板聚集、提高动脉粥样板块的稳定性等作用。野生红曲受限于自然条件和人为因素难以满足市场需求,且不同红曲品种间存在较大的质量差异,因此通过人工栽培和培养条件优化以获取高营养价值的红曲具有重要意义。
硒是人体必需微量元素之一,人体主要通过食物摄取的方式补充。人体缺硒会导致克山病、大骨节病等地方性病害,同时与心血管疾病、肿瘤、免疫力下降等紧密关联。人体摄入适量硒有益于健康,中国营养学会确定人体硒摄入量适宜范围为60-400μg/d。硒在自然界中主要以硒酸盐、亚硒酸盐、单质硒等无机硒的形式存在,不同形态硒的营养价值存在差异,硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸等有机硒相较于无机硒具有更高的生物活性、生物安全性和生物利用度。食用菌可以通过富硒栽培将无机硒高效转化为有机硒,具有重要的生物学意义,尚未见具有高耐受硒,且能够高产莫纳克林k的红色红曲霉(Monascus ruber)的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供富硒红色红曲霉发酵生产洛伐他汀的方法,特别涉及一种富硒且高产洛伐他汀红曲的栽培方法及其应用。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一株红曲菌,分类命名为红色红曲霉Monascus ruber MR1,该菌株从豆豉发酵物中分离,现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC NO.40664),地址:中国北京,北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编100101,保藏编号CGMCCNO.40664,保藏日期2023年5月30日。
第二方面,本发明提供一种富硒红曲菌的培养方法,在固体发酵培养基中添加亚硒酸盐(如亚硒酸钠)或纳米硒(单质硒,SeNPs),对所述红色红曲霉MR1进行发酵培养。
优选地,固体发酵培养基中亚硒酸盐或纳米硒的添加量为500mg/kg(对应最高洛伐他汀产量)。
需要说明的是,本发明的技术优势之一是可以根据需求,通过调控硒浓度和种类来灵活控制红曲菌中的硒含量和洛伐他汀含量,具有极高的便捷性。具体硒浓度和对应的洛伐他汀含量见表1:
表1硒浓度和对应的洛伐他汀含量
注:表1中的Se(Ⅳ)、SeNPs浓度是指固体发酵培养基中的硒浓度。
所述固体发酵培养基的配制方法如下:葡萄糖15-20g,蛋白胨1.5-3g,酵母提取物3-5g,大豆粉100-150g,大米粉650-700g,NaCl 0.5-1g,添加120-180g水,搅拌混匀,121℃灭菌20min。
固体发酵培养条件为:接种量10%,装样量80g/瓶,pH6.0,先在32℃下黑暗培养3d,然后在23℃下黑暗培养14d;其中,所述接种量10%是指每100g固体发酵培养基中加入红色红曲霉种子液10mL;所述红色红曲霉种子液的菌含量按干重计为15-20mg/mL。
所述红色红曲霉种子液的制备方法包括:将红色红曲霉MR1接种至液体发酵培养基中,于28℃恒温摇床150rpm培养3-5d。
其中,液体发酵培养基的配制方法如下:葡萄糖20-40g,甘油60-90g,蛋白胨5-10g,MgSO4·7H2O 1-2g,加水定容至1000mL,121℃灭菌20min。
采用上述培养方法,红色红曲霉MR1可将亚硒酸盐或纳米硒转化为SeCys2、MeSeCys和SeMet三种有机硒形态;
第三方面,本发明提供一种富硒红色红曲霉发酵生产洛伐他汀的方法,将所述红色红曲霉MR1接种于添加有亚硒酸盐或纳米硒的固体发酵培养基中进行发酵培养,发酵结束后在60℃下烘干至恒重并粉碎,所得发酵产物中含有洛伐他汀。
所述添加有亚硒酸盐或纳米硒的固体发酵培养基的配制方法如下:葡萄糖15-20g,蛋白胨1.5-3g,酵母提取物3-5g,大豆粉100-150g,大米粉650-700g,NaCl0.5-1g,亚硒酸盐或纳米硒500mg/kg,添加120-180g水,搅拌混匀,121℃灭菌20min。
进一步地,固体发酵培养条件为:接种量10%,装样量80g/瓶,pH6.0,先在32℃下黑暗培养3d,然后在23℃下黑暗培养14d;其中,所述接种量10%是指每100g固体发酵培养基中加入红色红曲霉种子液10mL;所述红色红曲霉种子液的菌含量按干重计为15-20mg/mL。
本发明中使用的纳米硒SeNPs可参见ZL201410520106.4。
本发明的红色红曲霉MR1能够高耐受硒,亚硒酸盐和纳米硒对红色红曲霉MR1的半抑制浓度IC50分别为16.77mg/L和218.45mg/L。红色红曲霉MR1能够将亚硒酸盐和纳米硒高效转化为SeCys2、MeSeCys和SeMet三种有机硒形态,无机硒残留低于5%。通过添加0-500mg/kg的亚硒酸盐和纳米硒,红色红曲霉MR1中洛伐他汀的含量可以在3.12mg/g-9.11mg/g的范围内定量调控,同时菌体中红色、黄色、橙色色素的色价均能达到200U/g以上。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中各红曲菌株PCR扩增产物电泳图。
图2为本发明较佳实施例中基于ITS rDNA序列和Neighbor-Joining分析绘制的系统进化树。
图3为本发明较佳实施例中红曲菌株在三种培养基上的菌落形态。
图4为本发明较佳实施例中Se(IV)对红曲各菌种菌丝形态的影响。
图5为本发明较佳实施例中MK标准品的色谱图。(A)内酯型MK,出峰时间11.3min;(B)酸型MK,出峰时间9.9min。
图6为本发明较佳实施例中MCN667040固体发酵米粉中MK的HPLC色谱图。
图7为本发明较佳实施例中不同硒源对红曲菌丝形态的影响。
图8为本发明较佳实施例中硒浓度对红曲菌落生长的影响。(A)Se(IV)对红曲菌落直径的影响;(B)SeNPs对红曲菌落直径的影响;(C)Se(IV)对红曲菌丝生长的剂量效应曲线拟合;(D)SeNPs对红曲菌丝生长的剂量效应曲线拟合。不同字母表示显著性差异(p<0.05)。
图9为本发明较佳实施例中不同形态硒处理下红曲菌丝生物量。(A)Se(IV)处理下红曲菌丝干重;(B)SeNPs处理下红曲菌丝干重。不同字母表示显著性差异(p<0.05)。
图10为本发明较佳实施例中不同形态硒处理下红曲菌丝硒含量。(A)Se(IV)处理下红曲菌丝中硒含量;(B)SeNPs处理下红曲菌丝中硒含量。不同字母表示显著性差异(p<0.05)。
图11为本发明较佳实施例中红曲菌丝体硒形态色谱图(5mg/L硒处理)。(A)硒形态标准曲线;(B)5mg/L Se(IV)处理下红曲菌丝体硒形态;(C)5mg/L SeNPs处理下红曲菌丝体硒形态。
图12为本发明较佳实施例中不同形态硒处理下红曲摇培菌丝体合成MK的影响。(A)Se(IV)处理下红曲摇培菌丝体合成MK的影响;(B)逻辑斯谛模型拟合的Se(IV)的剂量效应曲线;(C)SeNPs处理下红曲摇培菌丝体合成MK的影响;(D)逻辑斯谛模型拟合的SeNPs的剂量效应曲线。不同字母表示显著性差异(p<0.05)。
图13为本发明较佳实施例中不同培养条件下红曲固体发酵米粉MK含量。(A)接种量对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(B)装样量对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(C)pH对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(D)光照对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(E)温度对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(F)23℃培养时间对红曲固体发酵米粉MK含量的影响。不同字母表示显著性差异(p<0.05)。
图14为本发明较佳实施例中不同碳源培养基下红曲固体发酵的MK含量。(A)葡萄糖对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(B)甘油对红曲固体发酵米粉MK含量的影响。不同字母表示显著性差异(p<0.05)。
图15为本发明较佳实施例中不同氮源培养基下红曲固体发酵米粉MK含量。(A)蛋白胨对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(B)酵母提取物对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(C)大豆粉对红曲固体发酵米粉MK含量的影响。不同字母表示显著性差异(p<0.05)。
图16为本发明较佳实施例中不同形态硒对红曲固体发酵合成MK的影响。(A)Se(IV)对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(B)逻辑斯谛模型拟合的Se(IV)的剂量效应曲线;(C)SeNPs对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(D)逻辑斯谛模型拟合的SeNPs的剂量效应曲线;(E)硒酵母对红曲固体发酵米粉MK含量的影响;(F)逻辑斯谛模型拟合的硒酵母的剂量效应曲线。不同字母表示显著性差异(p<0.05)。
图17为本发明较佳实施例中红曲固体发酵硒形态色谱图。(A)硒形态标准样品色谱图;(B)500mg/kg Se(IV)处理硒形态色谱图;(C)500mg/kg SeNPs处理硒形态色谱图;(D)100mg/kg硒酵母处理硒形态色谱图。
图18为本发明较佳实施例中不同形态硒处理下红曲固体发酵合成色素的影响。(A)Se(IV)处理下红曲固体发酵合成色素的影响;(B)SeNPs处理下红曲固体发酵合成色素的影响;(C)硒酵母处理下红曲固体发酵合成色素的影响。不同字母表示显著性差异(p<0.05)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的纳米硒SeNPs可参照ZL201410520106.4说明书实施例1中的方法制备得到。
内酯型MK、酸型MK标准品购自SIGMA公司。
实施例1红曲菌的分离与鉴定
1.红曲菌分离
从豆豉发酵物中用麦芽汁琼脂培养基(MEA)分离真菌,MEA培养基配方为:将蛋白胨4g,葡萄糖10g,酵母提取物3g,麦芽粉10g和琼脂粉13g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。挑选红色和橙色的菌落,共分离获得23个菌株,分别命名为MCN667011、MCN667012、MCN667013、MCN667021、MCN667022、MCN667023、MCN667024、MCN667025、MCN667026、MCN667027、MCN667028、MCN667029、MCN667030、MCN667031、MCN667032、MCN667033、MCN667034、MCN667035、MCN667036、MCN667037、MCN667038、MCN667039和MCN667040。
2.分子生物学鉴定
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将马铃薯200g,葡萄糖20g和琼脂18g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。
使用真菌DNA提取试剂盒提取红曲菌基因组DNA,以ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')为引物扩增ITS rDNA基因。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳观察条带大小,23个条带的大小均约为600bp(图1)。PCR产物纯化后进行测序,测序结果用Snapgene软件拼接,用BLAST程序与NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中红曲菌进行相似性比较。利用Mega软件采用邻接法(neighbour-joining method,Kimura 2-parameter model)绘制的红曲菌ITSrDNA序列进化树(图2)。菌株MCN667040(MR1菌株)(从豆豉发酵物中分离)与红色红曲霉Monascus ruber strain DTO 400-H4(MT316354)、红色红曲霉Monascus ruber strainCGMCC 3.4701(MK359688)、烟色红曲菌Monascus fumeus strain CGMCC 3.2093(MG654473)、发白红曲菌Monascus albidulus strain CGMCC 3.568(MG654472)的ITS碱基序列最为接近;其余22个菌株与橙色红曲菌Monascus aurantiacus strain CGMCC 3.4384(MG654469)、高粱红曲菌Monascus kaoliang strain BCRC31506(AY750726)、火红色红曲霉Monascus rutilus strain CGMCC 3.2636(MG654471)、紫色红曲菌Monascus purpureusstrain CGMCC 3.5833(MK359689)的ITS碱基序列最为接近。菌株MCN667040(MR1菌株)的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
3.形态学鉴定
配置以下培养基用于红曲菌的培养。麦芽汁琼脂培养基(MEA):将蛋白胨4g,葡萄糖10g,酵母提取物3g,麦芽粉10g和琼脂粉13g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。察氏酵母提取物琼脂培养基(CYA):将NaNO3 3g,K2HPO4 1g,KCl 0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,酵母提取物5g,蔗糖30g和琼脂15g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。甘油硝酸盐琼脂培养基(G25N):CYA加25%(质量百分数)甘油。121℃高温高压下灭菌20min。
将以上23株菌株在MEA、CYA、G25N三种培养基上25℃培养7d,菌落形态出现明显差异(图3)。参考李钟庆编著的《红曲菌的形态与分类学》,通过在CYA、MEA培养基上的菌丝颜色和气生菌丝形态以及在G25N培养基上的生长情况,初步判断MCN667040为红色红曲霉(Monascus ruber),MCN667035接近橙色红曲菌(Monascus aurantiacus),其余菌株与紫色红曲菌(Monascus purpureus)相仿(表2)。
表2红曲菌株在三种培养基上的菌落形态(25℃,7d)
分子生物学与形态学鉴定结果相结合,将MCN667040鉴定为红色红曲霉(Monascusruber),MCN667035鉴定为橙色红曲菌(Monascus aurantiacus),MCN667011、MCN667012、MCN667013、MCN667021、MCN667022、MCN667023、MCN667024、MCN667025、MCN667026、MCN667027、MCN667028、MCN667029、MCN667030、MCN667031、MCN667032、MCN667033、MCN667034、MCN667036、MCN667037、MCN667038、MCN667039鉴定为紫色红曲菌(Monascuspurpureus)。为方面表述,将MCN667040鉴定为红色红曲霉(Monascus ruber)重新命名为MR1,并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCCNO.40664。
实施例2耐硒与高产洛伐他汀红曲菌的筛选
1.耐硒红曲菌株的筛选
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将马铃薯200g,葡萄糖20g和琼脂18g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。在PDA培养基中添加过滤灭菌的亚硒酸钠Se(Ⅳ),使最终硒浓度(以硒计)梯度范围为0-1000mg/L。将分离到的23株红曲菌在PDA平板上28℃培养14d后,观察菌落的正反面颜色、质地、边缘等,并统计菌落直径,制作切片,观察其孢子形态及孢子梗形态。
红曲菌在固体培养基上的硒耐受结果(图4)表明,当Se(IV)浓度达到500mg/L时,23株红曲菌均无法生长。在Se(IV)浓度达到100mg/L时,只有MCN667031、MCN667033、MCN667035和MCN667040的菌落直径超过10mm。MCN667031的菌落直径可达到38.0mm,菌落边缘发散不规则,菌丝稀疏,生长抑制率为32.4%;MCN667033次之,菌落直径为26.9mm,菌丝发散成树枝状,生长抑制率为53.3%。根据菌落直径拟合的逻辑斯谛曲线方程可以得出Se(IV)对红曲菌株的半抑制浓度(IC50),结果表明MCN667031和MCN667033对Se(IV)的耐受能力明显强于其他菌株(表3)。
表3 Se(IV)对各菌株的半抑制浓度(IC50)及抑制率
2.高产洛伐他汀红曲菌的筛选
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖培养基(PA):马铃薯200g,葡萄糖20g,加水定容至1000mL,121℃下灭菌20min。基础米粉培养基:籼米粉1000g,蛋白胨3g,酵母提取物3g,葡萄糖20g,NaCl 1g,水200mL。121℃下灭菌20min。在马铃薯葡萄糖液体培养基中放入1块直径为5mm红曲菌饼,在28℃摇床中,180r/min培养4d。基础米粉培养基装样量为80g/瓶,pH6.0,红曲菌接种量为10%,培养箱白光强度为1000-1500lx,于28℃培养箱培养14d。红曲菌固体发酵结束后在60℃下烘干至恒重并粉碎。
MK的检测方法采用高效液相色谱法(HPLC)。色谱柱选用C18(5μm,4.6mm×250mm);流动相为甲醇和0.1%的磷酸水溶液(80∶20,V/V),流速为1.0mL/min;柱温为30℃;检测波长为238nm;进样量为5μL。
准确称取内酯型MK标准品40.0mg,用色谱甲醇溶解后,定容至100mL容量瓶中,此浓度为400mg/L,然后用甲醇分别稀释到1mg/L、5mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L浓度,上机测定。准确称取内酯型MK标准品4.0mg,用0.2mol/L氢氧化钠溶液定容至100mL,在50℃条件下超声转化1h,冷却至室温后再放置1h,用0.2mol/L盐酸溶液调节pH至中性,上机测定(图5)。
称取10g烘干后的红曲样品,研磨后过80目筛,称取混匀后的筛下物1g加入10mL75%的乙醇溶液,于40℃水浴超声1h,待冷却后,5000r/min转速条件下离心10min,将上清液过0.22μm有机滤膜后上机检测。固体发酵米粉中MK主要为开环酸型MK(图6)。仅有三个菌株可检测出MK,其中MCN667040产量最多,含量为1.06mg/g,是其他两个菌株的5倍(表4)。结合红曲在PDA平板耐受硒及红曲固体发酵的MK含量两个结果,选择MCN667040作为后续研究的实验菌株。为表述方便,将MCN667040菌株重新命名为MR1(保藏编号CGMCC NO.40664)。
表4产MK红曲菌株的筛选
实施例3硒对红曲菌丝体生长、总硒、硒形态及洛伐他汀的影响
1.亚硒酸钠(Se(Ⅳ))对固体平板上红曲菌丝生长的影响
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将马铃薯200g,葡萄糖20g和琼脂18g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。在PDA培养基中添加过滤灭菌的亚硒酸钠Se(Ⅳ)水溶液,使最终硒浓度(以硒计)梯度范围为0-1000mg/L。将5mm的红曲MR1菌饼接种到添加梯度Se(Ⅳ)浓度的PDA上,每个处理5个重复,在28℃恒温培养箱中培养14天,用游标卡尺测量菌落直径。
红曲在固体培养基上硒耐受培养结果(图7、图8)显示:培养基中添加Se(Ⅳ),当硒浓度达到1-100mg/L时,MR1菌落直径均较对照组出现显著下降,当硒浓度达到500和1000mg/L时,MR1菌落不再生长。根据菌落直径与硒浓度拟合逻辑斯谛方程,不同硒源对红曲菌落生长的逻辑斯谛曲线结果显示(图8,表5),Se(IV)对红曲菌丝的半抑制浓度(IC50)为16.77±0.01mg/L。
表5逻辑斯谛模型预测的抑制浓度
注:IC10、IC50和IC90分别指对红曲生长抑制10%、50%和90%的硒浓度。
2.单质硒(SeNPs)对固体平板上红曲菌丝生长的影响
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将马铃薯200g,葡萄糖20g和琼脂18g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。在PDA培养基中添加过滤灭菌的SeNPs水溶液,使最终硒浓度(以硒计)梯度范围为0-1000mg/L。将5mm的红曲MR1菌饼接种到添加梯度硒浓度的PDA上,每个处理5个重复,在28℃恒温培养箱中培养14天,用游标卡尺测量菌落直径。
红曲在固体培养基上硒耐受培养结果(图7、图8)显示:培养基中添加SeNPs,在硒浓度在1-10mg/L时,MR1菌落直径与对照相比无显著性差异,当浓度达到50-1000mg/L时,MR1菌落直径显著性小于对照,菌落生长受到抑制,但菌落直径显著大于相同浓度的Se(Ⅳ)处理。根据菌落直径与硒浓度拟合逻辑斯谛方程,不同硒源对红曲菌落生长的逻辑斯谛曲线结果显示(图8,表4),SeNPs对红曲菌丝的半抑制浓度(IC50)为218.45±27.16mg/L,SeNPs处理下的IC50是Se(IV)处理的13倍;另外,SeNPs处理下的10%的抑制浓度(IC10)和90%的抑制浓度(IC90)也均高于Se(IV)处理。
3.亚硒酸钠(Se(Ⅳ))对液体摇培中红曲菌丝生长的影响
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖培养基(PA):马铃薯200g,葡萄糖20g,加水定容至1000mL,121℃下灭菌20min。在PA培养基中添加过滤灭菌的亚硒酸钠Se(Ⅳ)水溶液,使Se(Ⅳ)浓度为0.5、0.75、1、2、3、4、5、10mg/L。取5mm菌饼接种到液体培养基中,在28℃恒温摇床150rpm中培养14天,用20目筛过滤收集菌丝,用0.9% NaCl清洗3遍后,冷冻干燥后称重。
红曲在液体培养基中的硒耐受培养结果(图9)显示:随着硒浓度的升高,红曲菌丝生物量呈现出先上升后下降的趋势。当Se(IV)硒浓度达到4mg/L时,红曲菌丝生物量较对照组显著提高了78.4%;当Se(IV)硒浓度达到9mg/L时,红曲菌丝生物量较对照组显著降低了58.4%;当Se(IV)硒浓度达到15mg/L时,完全抑制红曲菌丝生长。
4.单质硒(SeNPs)对液体摇培中红曲菌丝生长的影响
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖培养基(PA):马铃薯200g,葡萄糖20g,加水定容至1000mL,121℃下灭菌20min。在PA培养基中添加过滤灭菌的SeNPs水溶液,使SeNPs浓度为1、5、10、25、50、100、250、500mg/L。取5mm菌饼接种到液体培养基中,在28℃恒温摇床150rpm中培养14天,用20目筛过滤收集菌丝,用0.9% NaCl清洗3遍后,冷冻干燥后称重。
红曲在液体培养基中的硒耐受培养结果(图9)显示:随着硒浓度的升高,红曲菌丝生物量呈现出先上升后下降的趋势。当SeNPs硒浓度达到1mg/L时,红曲菌丝生物量显著高于对照组,随着硒浓度的升高红曲菌丝生物量也随之升高,SeNPs硒浓度为10mg/L时菌丝生物量最高达到3.5g/100mL,较对照组提高114.3%;当SeNPs硒浓度达到100mg/L时,红曲菌丝生物量相较于对照组开始呈下降的趋势。
5.亚硒酸钠(Se(Ⅳ))对红曲菌丝体中总硒含量的影响
总硒测定方法:称取0.20g粉碎红曲菌丝体样品置于微波消解管中,加入8mL优级纯硝酸,冷浸过夜,利用微波消解炉在180℃下进行2-3小时消解,消解完成冷却至室温,定容至25mL,取1ml消解定容后的样品,加入3ml超纯水和1ml 6mol/L的盐酸,沸水浴2小时后,还原完成冷却至室温,采用氢化物发生-原子荧光法(HG-AFS)测定红曲菌丝体中的总硒含量。样品上机测定时,载流为10% HCl,还原剂为0.5%KOH和2% KBH4;灯电流80mA,负高压270V,载气600ml/min,屏蔽气800mL/min,进样量1mL。通过分析液体摇培中红曲菌丝对Se(IV)的吸收发现,红曲菌丝中的总硒含量随着培养基中硒浓度的增加而增加(图10)。在10mg/L Se(IV)的浓度下,菌丝中硒含量达到最大值397.56±22.34mg/kg。
6.单质硒(SeNPs)对红曲菌丝体中总硒含量的影响
总硒测定方法:称取0.20g粉碎红曲菌丝体样品置于微波消解管中,加入8mL优级纯硝酸,冷浸过夜,利用微波消解炉在180℃下进行2-3小时消解,消解完成冷却至室温,定容至25mL,取1ml消解定容后的样品,加入3ml超纯水和1ml 6mol/L的盐酸,沸水浴2小时后,还原完成冷却至室温,采用氢化物发生-原子荧光法(HG-AFS)测定红曲菌丝体中的总硒含量。样品上机测定时,载流为10% HCl,还原剂为0.5%KOH和2% KBH4;灯电流80mA,负高压270V,载气600ml/min,屏蔽气800mL/min,进样量1mL。通过分析液体摇培中红曲菌丝对SeNPs的吸收发现,红曲菌丝中的总硒含量随着培养基中硒浓度的增加而增加(图10)。在500mg/L SeNPs的浓度下,菌丝中硒含量达到最大值377.46±32.66mg/kg。
7.亚硒酸钠(Se(Ⅳ))对红曲菌丝体中硒形态的影响
硒形态的测定方法:利用高效液相色谱联用氢化物发生-原子荧光法(HPLC-HG-AFS)进行红曲菌丝体中硒形态的测定。取0.2g红曲菌丝体粉末,加入5mL8mg/mL蛋白酶XⅣ,在30℃超声60min后在37℃150r/min摇床中培养8小时,12000rpm离心收上清,过0.22μm的滤膜待测。以Hamilton PRP-X100为分离柱,流动相为(NH4)2HPO4,载流为10%HCl,氧化剂为0.35%KOH和0.2%KI,还原剂为0.35%KOH和2%KBH4,以HG-AFS为检测器分析红曲菌丝体中的硒形态。以硒代半胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、亚硒酸盐(Se(Ⅳ))、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒酸盐(Se(Ⅵ))为标准样品,根据保留时间分析红曲菌丝体中硒形态,以峰面积计算各个硒形态的含量。
硒形态测定结果(图11)显示:红曲菌丝体中共发现两种硒形态,都为有机硒形态,未检测出无机硒残留。红曲菌丝体可以将Se(IV)转化为SeMet和MeSeCys,其中SeMet含量最高,MeSeCys含量次之。在Se(IV)处理中,SeMet和MeSeCys的含量分别为12.16、3.69mg/kg。
8.单质硒(SeNPs)对红曲菌丝体中硒形态的影响
硒形态的测定方法:利用高效液相色谱联用氢化物发生-原子荧光法(HPLC-HG-AFS)进行红曲菌丝体中硒形态的测定。取0.2g红曲菌丝体粉末,加入5mL8mg/mL蛋白酶XⅣ,在30℃超声60min后在37℃150r/min摇床中培养8小时,12000rpm离心收上清,过0.22μm的滤膜待测。以Hamilton PRP-X100为分离柱,流动相为(NH4)2HPO4,载流为10%HCl,氧化剂为0.35%KOH和0.2%KI,还原剂为0.35% KOH和2% KBH4,以HG-AFS为检测器分析红曲菌丝体中的硒形态。以硒代半胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、亚硒酸盐(Se(Ⅳ))、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒酸盐(Se(Ⅵ))为标准样品,根据保留时间分析红曲菌丝体中硒形态,以峰面积计算各个硒形态的含量。
硒形态测定结果(图11)显示:红曲菌丝体中共发现两种硒形态,都为有机硒形态,未检测出无机硒残留。红曲菌丝体可以将SeNPs转化为SeMet和MeSeCys,其中SeMet含量最高,MeSeCys含量次之。在SeNPs处理中,SeMet和MeSeCys的含量分别为10.26mg/kg、3.06mg/kg。
9.亚硒酸钠(Se(Ⅳ))对红曲菌丝体合成洛伐他汀的影响
洛伐他汀的检测方法采用高效液相色谱法(HPLC),详细方法见实施例2。洛伐他汀的测定结果(图12)显示:菌丝中MK主要为酸型MK,MK的含量随着液体培养基中硒浓度的增加而减少。当培养基中添加Se(IV)的硒浓度达1mg/L时,菌丝中MK含量开始减少;当硒浓度达到5mg/L时,菌丝中MK含量达到最低值0.10mg/g,相较于对照组下降了90.6%。根据菌丝中MK含量与硒浓度拟合逻辑斯谛方程,Se(IV)的半抑制浓度(IC50)为3.03±0.98mg/L,R2值为0.9654。
10.单质硒(SeNPs)对红曲菌丝体合成洛伐他汀的影响
洛伐他汀的检测方法采用高效液相色谱法(HPLC),详细方法见实施例2。洛伐他汀的测定结果(图12)显示:菌丝中MK主要为酸型MK,MK的含量随着液体培养基中硒浓度的增加而减少。当培养基中添加SeNPs的硒浓度达1mg/L时菌丝中MK含量开始减少,当硒浓度达到500mg/L时,菌丝中MK含量达到最低值,为0.04mg/g,相较于对照组下降了96.1%。根据菌丝中MK含量与硒浓度拟合逻辑斯谛方程,SeNPs的半抑制浓度(IC50)为21.89±3.19mg/L,R2值为0.9415。
实施例4固体发酵条件、培养基组分、硒对红曲固体发酵代谢产物的影响
1.固体发酵条件对红曲产洛伐他汀的影响
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将马铃薯200g,葡萄糖20g和琼脂18g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。马铃薯葡萄糖培养基(PA):马铃薯200g,葡萄糖20g,加水定容至1000mL,121℃下灭菌20min。基础米粉培养基:籼米粉1000g,蛋白胨3g,酵母提取物3g,葡萄糖20g,NaCl 1g,水200mL。121℃下灭菌20min。在马铃薯葡萄糖液体培养基中放入1块直径为5mm红曲菌饼,在28℃摇床中,180r/min培养4d。基础米粉培养基装样量为80g/瓶,红曲菌接种量为10%,培养箱白光强度为1000-1500lx,于28℃培养箱培养14d。红曲菌固体发酵结束后在60℃下烘干至恒重并粉碎。
考察液体红曲接种量对固体红曲产洛伐他汀的影响(图13),具体如下:分别控制接种量为5.0%、10.0%、15.0%、20.0%(v/w,接种量为5.0%是指每100g米粉中接入液态种子液5mL(液态种子液的菌含量按干重计约为17mg/mL),同时进行发酵,确定最适接种量;随着接种量增大,固体发酵中洛伐他汀含量也增多,当接种量为10%时,MK含量达1.54mg/g,相较于对照组显著增加了13.3%。
考察装样量对固体红曲产MK的影响,具体如下:分别称取40g、60g、80g、100g米粉,同时进行发酵,确定最适装样量;培养基装样量多少影响发酵内部温度及通气情况,当装样量为80g/瓶时,MK含量达到最高,为1.54mg/g。
考察pH对固体红曲产MK的影响,具体如下:分别在培养基中加入乙酸,使固体培养基pH分别为4.0、5.0、6.0,同时进行发酵,确定最适pH;当培养基pH调节为5.0和6.0时,MK的含量显著提高,当pH为6.0时,MK的含量为2.11mg/g,较对照组显著提高了54.2%;当培养基pH调节到4.0时,MK的含量显著降低,较对照组显著降低了20.7%。
考察光照对固体红曲产MK的影响,具体如下:分别控制光照为前3天黑暗、后14天光照,前3天光照、后14天黑暗,前3天光照、后14天光照,前3天黑暗、后14天黑暗,同时进行发酵,确定最适光照条件。全光照,前3d黑暗、后14d光照处理下产生的MK含量显著低于其他几种处理,较对照组降低了6.1%。
考察发酵温度对固体红曲产MK的影响,具体如下:分别将红曲置于前3天32℃、后14天23℃,前3天30℃、后14天23℃,前3天28℃、后14天23℃,前3天32℃、后14天28℃,前3天30℃、后14天28℃,前5天32℃、后12天23℃,前5天30℃、后12天23℃,前5天28℃、后12天23℃,前5天32℃、后12天28℃,前5天30℃、后12天28℃,恒温17天28℃下同时进行发酵,确定最适发酵温度。先在32℃下培养,然后在23℃下培养显著高于其他变温及恒温处理下红曲固体发酵产生MK的含量,其中在32℃下培养3d,然后在23℃下培养14d所产生的MK含量最高,为2.54mg/g,较对照组显著提高了86.0%。培养时间对固体红曲产MK的影响:在32℃培养3d后,将红曲置于23℃下培养28d进行发酵,每2d取样,确定最适培养时间。在23℃条件下发酵2d只能检测到少量MK,4d后MK含量明显增加,至26d后含量达到最高为3.84mg/g;随着时间变化,固体发酵的MK含量符合逻辑斯谛方程,相关系数R2为0.9659,26d后MK含量逐渐达到平台期。12d-14d时,固体发酵的MK含量可达到2.15mg/g,减少最高值一半时间MK含量高于最高值的一半,考虑到培养周期过长,所以选择培养时间为32℃下培养3d后、23℃下培养14d。
通过固体发酵培养条件优化后MK含量可达2.35±0.19mg/g,相比于对照组提高了71.5%。
2.固体发酵培养基组分对红曲产洛伐他汀的影响
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将马铃薯200g,葡萄糖20g和琼脂18g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。马铃薯葡萄糖培养基(PA):马铃薯200g,葡萄糖20g,加水定容至1000mL,121℃下灭菌20min。基础米粉培养基:籼米粉1000g,蛋白胨3g,酵母提取物3g,葡萄糖20g,NaCl 1g,水200mL。121℃下灭菌20min。在马铃薯葡萄糖液体培养基中放入1块直径为5mm红曲菌饼,在28℃摇床中,180r/min培养4d。基础米粉培养基装样量为80g/瓶,pH6.0,红曲菌接种量为10%,培养箱白光强度为1000-1500lx,于28℃培养箱培养14d。红曲菌固体发酵结束后在60℃下烘干至恒重并粉碎。
在基础大米粉培养基中添加葡萄糖和甘油作为碳源,研究不同碳源对红曲固体发酵中MK含量的影响(图14)。当葡萄糖含量为2%时固体发酵中MK含量显著提高,为2.59mg/g,但相较于对照组无显著影响。甘油的增加并不能提高固体发酵中MK的含量,添加甘油的固体发酵后MK含量显著低于未添加甘油的对照组,添加甘油含量为3%时,MK含量显著降低,较对照组显著降低了70.0%。
分别添加不同浓度蛋白胨、酵母提取物和大豆粉到大米粉培养基中,研究不同氮源对红曲固体发酵MK产量的影响(图15)。蛋白胨的加入对固体发酵MK含量无显著影响。随着酵母提取物含量的增高,MK含量显著上升;当酵母提取物含量达到0.4%,固体发酵MK含量显著提高,为2.84mg/g,较对照组显著提高19.1%。随着大豆粉含量的提高,固体发酵MK含量也随之提高,当大豆粉含量到12.5%时MK含量达到最高值2.87mg/g,较对照组显著提高了20.21%。
通过固体发酵培养条件优化后MK含量可达3.10±0.09mg/g,相比于对照组提高了31.9%。
确定固体发酵米粉培养基配方为2%葡萄糖,0.24%蛋白胨,0.4%酵母提取物,12.5%大豆粉,68.94%大米粉,0.08% NaCl,16%水;培养条件为接种量10%(v/w,即每100g大米中加入红曲种子液10mL),装样量80g/瓶,pH6.0,黑暗培养,在32℃下培养3d、后在23℃下培养14d。
3.亚硒酸钠(Se(Ⅳ))对红曲固体发酵中合成洛伐他汀的影响
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将马铃薯200g,葡萄糖20g和琼脂18g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。马铃薯葡萄糖培养基(PA):马铃薯200g,葡萄糖20g,加水定容至1000mL,121℃下灭菌20min。基础米粉培养基:籼米粉1000g,蛋白胨3g,酵母提取物3g,葡萄糖20g,NaCl 1g,水200mL。121℃下灭菌20min。固体发酵红曲中MK含量随着硒浓度的升高,整体呈现上升趋势,到达一定硒浓度后MK含量处于平台期(图16)。对照组中总MK含量为3.12mg/g,其中酸型MK含量为1.51mg/g,内酯型MK含量为1.61mg/g。根据MK含量与硒浓度拟合逻辑斯谛方程,Se(IV)处理下R2为0.9503,半最大效应浓度(EC50)为109.80±64.81mg/kg。在Se(IV)处理中,当Se(IV)的硒浓度达到500mg/kg时,固体发酵红曲中MK含量最高为9.11mg/g,增幅为217.42%,且为所有处理下的最高MK浓度。
4.单质硒(SeNPs)对红曲固体发酵中合成洛伐他汀的影响
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将马铃薯200g,葡萄糖20g和琼脂18g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。马铃薯葡萄糖培养基(PA):马铃薯200g,葡萄糖20g,加水定容至1000mL,121℃下灭菌20min。基础米粉培养基:籼米粉1000g,蛋白胨3g,酵母提取物3g,葡萄糖20g,NaCl 1g,水200mL。121℃下灭菌20min。固体发酵红曲中MK含量随着硒浓度的升高,整体呈现上升趋势,到达一定硒浓度后MK含量处于平台期(图16)。对照组中总MK含量为3.12mg/g,其中酸型MK含量为1.51mg/g,内酯型MK含量为1.61mg/g。根据MK含量与硒浓度拟合逻辑斯谛方程,SeNPs处理下R2为0.9439,半最大效应浓度(EC50)为2.11±0.95mg/kg。在SeNPs处理中,当SeNPs的硒浓度达到1000mg/kg时,固体发酵红曲中MK含量最高为8.87mg/g,增幅为209.06%。
5.硒酵母对红曲固体发酵中合成洛伐他汀的影响
配置以下培养基用于红曲菌的培养。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将马铃薯200g,葡萄糖20g和琼脂18g混合,加水定容至1000mL,于121℃高压灭菌20min。马铃薯葡萄糖培养基(PA):马铃薯200g,葡萄糖20g,加水定容至1000mL,121℃下灭菌20min。基础米粉培养基:籼米粉1000g,蛋白胨3g,酵母提取物3g,葡萄糖20g,NaCl 1g,水200mL。121℃下灭菌20min。固体发酵红曲中MK含量随着硒浓度的升高,整体呈现上升趋势,到达一定硒浓度后MK含量处于平台期(图16)。对照组中总MK含量为3.12mg/g,其中酸型MK含量为1.51mg/g,内酯型MK含量为1.61mg/g。根据MK含量与硒浓度拟合逻辑斯谛方程,硒酵母处理下R2为0.9558,半最大效应浓度(EC50)为2.22±1.15mg/kg。在硒酵母处理中,当硒酵母的硒浓度达到100mg/kg时,固体发酵红曲中MK含量最高为7.54mg/g,增幅为162.71%。在相同硒浓度80mg/kg处理下,Se(IV)、SeNPs和硒酵母中MK含量分别为6.66、6.33、6.67mg/g。
6.亚硒酸钠(Se(Ⅳ))、单质硒(SeNPs)、硒酵母对红曲固体发酵中合成硒氨基酸的影响
硒形态的测定方法:利用高效液相色谱联用氢化物发生-原子荧光法(HPLC-HG-AFS)进行红曲菌丝体中硒形态的测定。详细方法见实施例3。
选取各个不同形态硒处理中具有高MK含量的处理进行硒形态检测(图17,表6)。固体发酵红曲的硒形态结果分析中发现,硒形态主要为SeCys2、MeSeCys和SeMet,有少量无机硒Se(IV)残留。在500mg/kg Se(IV)的处理条件下,红曲能够将Se(IV)转化为另外三种不同的有机硒形态,SeCys2、MeSeCys和SeMet分别为12.52±1.39、51.77±0.56和122.29±4.17mg/kg,无机硒Se(IV)仅为9.91±0.34mg/kg。在500mg/kg SeNPs的处理条件下,红曲主要将纳米硒转化为SeMet,含量为237.85±11.05mg/kg。在100mg/kg硒酵母的处理条件下,红曲主要将硒酵母转化为SeMet,含量为59.51±2.72mg/kg。
表6红曲固体发酵硒形态
注:“/”表示未检出。硒酵母为安琪富硒酵母。
7.亚硒酸钠(Se(Ⅳ))、单质硒(SeNPs)、硒酵母对红曲固体发酵中合成红曲色素的影响
色素的测定采用分光光度计法:称取0.1g样品于试管中,加入10mL 70%的乙醇溶液,60℃水浴1h,6000r/min离心5min。吸取0.2mL上清液,加入3.8mL 70%的乙醇溶液稀释。将稀释液加入1mm比色皿中,以70%的乙醇溶液做对照,在410、465、505nm波长下测定吸光度。
根据下列公式计算色价(U/mL):
红曲色素色价=OD505/OD465/OD410×稀释倍数
410nm时测得的色价为黄色红曲色素色价;465nm时测得的色价为橙色红曲色素色价;505nm时测得的色价为红色红曲色素色价。
硒浓度对红曲固体发酵中色素的影响结果(图18)显示:随着硒浓度的增加,红曲色价并未呈现显著变化。对照组中红曲总色价为215.04U/g,其中黄色、橙色和红色红曲色素占比分别为41.4%、23.6%和35.0%。在Se(IV)处理中,当Se(IV)的硒浓度达到5、20和500mg/kg时色价显著高于其他处理,色价分别为260.49、263.55和266.24U/g。在SeNPs处理中,当SeNPs的硒浓度达到40mg/kg时色价显著高于其他处理,色价为225.30U/g。在硒酵母处理中,除硒酵母的硒浓度为5、10mg/kg的处理之外,其余处理色价都显著低于对照组。其中Se(IV)的硒浓度为500mg/kg的处理,红曲色价为最大值266.24U/g,为,黄色、橙色和红色红曲色素占比分别为43.1%、22.6%和34.3%。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.红色红曲霉Monascus ruber MR1,保藏编号为CGMCC NO.40664。
2.富硒红曲菌的培养方法,其特征在于,在固体发酵培养基中添加亚硒酸盐或纳米硒,对权利要求1所述红色红曲霉MR1进行发酵培养。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,固体发酵培养基中亚硒酸盐或纳米硒的添加量为500mg/kg。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述固体发酵培养基的配制方法如下:葡萄糖15-20g,蛋白胨1.5-3g,酵母提取物3-5g,大豆粉100-150g,大米粉650-700g,NaCl0.5-1g,添加120-180g水,搅拌混匀,121℃灭菌20min。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,固体发酵培养条件为:接种量10%,装样量80g/瓶,pH6.0,先在32℃下黑暗培养3d,然后在23℃下黑暗培养14d;其中,所述接种量10%是指每100g固体发酵培养基中加入红色红曲霉种子液10mL;所述红色红曲霉种子液的菌含量按干重计为15-20mg/mL。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法,其特征在于,红色红曲霉MR1将亚硒酸盐或纳米硒转化为SeCys2、MeSeCys和SeMet三种有机硒形态。
7.富硒红色红曲霉发酵生产洛伐他汀的方法,其特征在于,将权利要求1所述红色红曲霉MR1接种于添加有亚硒酸盐或纳米硒的固体发酵培养基中进行发酵培养,发酵结束后在60℃下烘干至恒重并粉碎,所得发酵产物中含有洛伐他汀;
所述添加有亚硒酸盐或纳米硒的固体发酵培养基的配制方法如下:葡萄糖15-20g,蛋白胨1.5-3g,酵母提取物3-5g,大豆粉100-150g,大米粉650-700g,NaCl0.5-1g,亚硒酸盐或纳米硒500mg/kg,添加120-180g水,搅拌混匀,121℃灭菌20min。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,固体发酵培养条件为:接种量10%,装样量80g/瓶,pH6.0,先在32℃下黑暗培养3d,然后在23℃下黑暗培养14d;其中,所述接种量10%是指每100g固体发酵培养基中加入红色红曲霉种子液10mL;所述红色红曲霉种子液的菌含量按干重计为15-20mg/mL。
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