CN104611236A - 刺孢小克银汉霉FAR3及其发酵制备γ-亚麻酸油脂的方法 - Google Patents

刺孢小克银汉霉FAR3及其发酵制备γ-亚麻酸油脂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能够合成γ-亚麻酸油脂的新菌株——刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxter)thaxter FAR3]，及其在微生物合成γ-亚麻酸油脂中的应用。一种刺孢小克银汉霉FAR3，其主要特点在于：所述刺孢小克银汉霉即刺孢小克银汉霉FAR3，所述的刺孢小克银汉霉属于毛霉目，小克银汉霉科，小克银汉霉属的菌种，该菌种在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏时间为2014年08月07日，保藏编号为CGMCC NO.9504。该方法是将所述的刺孢小克银汉霉FAR3菌种接入含有马铃薯打浆液、葡萄糖、大豆蛋白粉及无机盐的发酵培养基中进行发酵培养，在有氧条件下发酵获得刺孢小克银汉霉菌丝体，然后利用丁烷亚临界萃取设备提取菌丝体中的γ-亚麻酸油脂。所生产的γ-亚麻酸油脂中γ-亚麻酸含量很高，该γ-亚麻酸油脂可以用于食品、药品和高级化妆品的生产。

Description

刺孢小克银汉霉FAR3及其发酵制备γ-亚麻酸油脂的方法
技术领域
本发明涉及能够合成γ-亚麻酸油脂的新菌株——刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxter)thaxter FAR3]，及其在微生物合成γ-亚麻酸油脂中的应用。
背景技术
γ-亚麻酸化学名为：全顺式-6，9，12-十八碳三烯酸，英文名为：Gamma-linolenic acid，γ-亚麻酸为无色或淡黄色液体脂肪酸，不溶于水而易溶于乙醚、石油醚等有机溶剂。γ-亚麻酸又被称为维生素F，属于人体必需脂肪酸，人体自身不能合成，必须从食物中摄取。γ-亚麻酸参与人体新陈代谢，并合成机体所需的活性成分。γ-亚麻酸的主要作用包括：降血脂；抗血栓性心脑血管病；预防和治疗高血压；抗动脉粥样硬化；抗肿瘤；抗菌；抗HIV感染；抗炎；抗糖尿病作用；减肥作用；治疗溃疡；美容养颜等等。因此，γ-亚麻酸被认为是具有特殊医疗保健作用的营养素，已为世界上许多国家用于药品、保健食品和高级化妆品的生产。
目前国内主要是从月见草等富含γ-亚麻酸的植物中提取γ-亚麻酸油脂，由于月见草为一年生植物产量少且需要大面积的耕地，并受地域、气候等因素影响大，因此从月见草等天然植物中提取的γ-亚麻酸价格昂贵；在我国微生物发酵法合成γ-亚麻酸油脂技术仅限于实验室研究阶段，该技术并没有实际应用于工业化放大生产，只出现在一些相关的专利文献报道中，例如南京工业大学的黄和在《一种富含γ-亚麻酸的微生物油脂的制备方法》(发明专利申请号：201010505418.X)中提到利用深黄被孢霉发酵生产γ-亚麻酸；王景恒、葛英华在《富含有机硒的γ-亚麻酸干菌粉及其生产工艺》(发明专利申请号：200610065889.7)中提到以蔗糖、糖蜜、淀粉中任意一种或几种为碳源，以花生饼粉和/或蛋白胨为氮源发酵刺孢小克银汉霉CGMCC N0.1652生产γ-亚麻酸。在国外，日本出光石油化学公司利用被孢霉发酵以及英国的一家公司利用毛霉发酵相继成功商业化生产出γ-亚麻酸。
目前，微生物发酵生产γ-亚麻酸已成为国际趋势，微生物发酵法与传统的从月见草籽油中提取γ-亚麻酸相比具有生产周期短、γ-亚麻酸营养丰富、不受环境和季节的限制、可以人为提高发酵产量等优点。本发明利用廉价的马铃薯打浆液为发酵培养基原料，极大地降低了生产成本，且利用丁烷亚临界萃取设备提取菌丝体中的γ-亚麻酸油脂，可以避免γ-亚麻酸在高温条件下被氧化。
发明内容
本发明的目的在于，为避免现有技术的不足，提供一种刺孢小克银汉霉FAR3。筛选到的能够合成γ-亚麻酸的新菌株——刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxter)thaxter FAR3]。
本发明的又一目的在于提供一种刺孢小克银汉霉FAR3的制备方法。
本发明的还一目的在于提供一种刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxter)thaxter FAR3]发酵制备γ-亚麻酸的方法，可以获得高产、用途广泛的γ-亚麻酸油脂。本发明以马铃薯打浆液为主要的发酵培养基原料，并在发酵培养基中添加少量的葡萄糖、大豆蛋白粉以及无机盐，然后将上述刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxter)thaxter FAR3]接入发酵培养基中进行有氧发酵获得菌丝体，最后利用丁烷亚临界萃取设备提取菌丝体中的γ-亚麻酸油脂。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种刺孢小克银汉霉FAR3，其主要特点在于：所述刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxter)thaxter FAR3]属于毛霉目，小克银汉霉科，小克银汉霉属的菌种，该菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间为2014年08月07日，保藏编号为CGMCC NO.9504，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
所述刺孢小克银汉霉FAR3具有如下形态特征：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上25℃培养5天，菌落圆形，初白色，大量气生菌丝，4天后菌落转为浅灰色，背面灰色，直径4.0～4.5厘米。菌丝无色，平滑，分枝，无隔膜，宽4.4～7.4μm；孢囊球形或卵球形，光滑，成熟孢囊表面疣状突起，后在突起顶端形成孢囊孢子，25.0～30.0μm；孢囊孢子近球形至球形，单胞，浅褐色，短刺或有时平滑，7.0～10.0μm。将已经在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化好的刺孢小克银汉霉菌种接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中25℃培养2天，菌体为灰白色，菌液为淡黄色。
所述的一种刺孢小克银汉霉FAR3，具有如下分子生物学特征：提取菌株FAR3的基因组DNA，选用真菌18S rDNA的特异性引物NS1、NS8进行PCR扩增并纯化PCR产物，测得该菌株18S rDNA的序列如下：
用DNeasy Plant Mini Kit提取了刺孢小克银汉霉FAR3总DNA，以通用引物ITS1与ITS4扩增ITS区段，测序后序列结果如下：
本发明所用菌种来源：以马铃薯葡萄糖培养基从广西松林红土壤中分离纯化得到的高产γ-亚麻酸的丝状真菌——刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxter)thaxter FAR3]。
一种刺孢小克银汉霉FAR3的制备方法，其主要特点在于包括如下步骤：
广西松林红土壤用无菌水分别按10-2～10-6梯度稀释后涂布于固体培养基，25℃～35℃培养24～48小时，挑出单菌落溶于10mL的无菌水中，分别制成10-2～10-6梯度浓度的菌液，各吸取0.15mL于固体培养基，25℃培养24～72小时，分离得到的单个菌落进一步接种于液体种子培养基中25℃摇床培养72小时，然后利用显微镜油镜观察菌丝中的脂肪粒，选择菌丝中脂肪粒较多的菌株接种于发酵培养基中25℃摇床培养144小时，然后将发酵好的菌丝体烘干，利用乙醚索氏提取法提取菌丝体中的油脂，并用气相色谱仪测定各油脂中的γ-亚麻酸含量，选择油脂中γ-亚麻酸含量最高的菌株作为本发明的菌种刺孢小克银汉霉FAR3，用固体斜面培养基4℃保存。
所述的一种刺孢小克银汉霉FAR3的制备方法，还包括有：
所述的固体培养基(1L)：即为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，自然pH。
所述的液体种子培养基(1L)：即为马铃薯葡萄糖液体培养基。马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL，自然pH。
所述的发酵培养基：称取去皮的新鲜土豆200～250g，洗净切丁后加入450mL～500mL自来水利用搅拌机搅拌打碎成浆，然后4层纱布挤压过滤，将液体沉淀2h，除去淀粉定容至1L，然后添加50～100g葡萄糖，20～40g大豆蛋白粉，4～5g MgSO4，2～3g MnSO4，1～2g(NH4)2SO4。
所述的刺孢小克银汉霉发酵FAR3制备γ-亚麻酸油脂的方法，其主要特点在于包括如下步骤：
(1)固体菌种培养：由冻干管或者沙土管保存菌株移接至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，于25℃培养7天，进行菌种活化，再将已活化的斜面菌种移接至三角瓶中进行扩大培养；
(2)液体菌种培养：将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子罐中进行培养，种子培养基为马铃薯葡萄糖培养基，pH为5.5～6.5，种子罐培养温度为25℃，培养时间为2d，通气量(体积分数v/v/h)为1：1～1:1.5；
(3)发酵培养： 
3)发酵培养基制备：按照200g～250g马铃薯/1L发酵培养基的比例准确称取马铃薯，洗净之后加入450mL～500mL自来水利用土豆打浆机打浆，将打浆液，除去土豆渣，置于沉淀池沉淀2h，将上清液泵入发酵罐中并添加自来水至1L容积，然后添加5％～10％葡萄糖，2％～4％大豆蛋白粉，0.4～0.5％MgSO4，0.2～0.3％ MnSO4，0.1～0.2％(NH4)2SO4；
4)发酵培养：按照5％～10％的接种量将生长良好的种子液接入发酵罐中培养，pH为5.0～6.5，发酵培养温度为25℃～28℃，培养时间为6d～7d，通气量(体积分数v/v/h)为1：1～1:1.5；
(4)产品收集； 
1)菌丝体：培养结束后，用板框压滤机对发酵菌液进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，使其含水量达到3.2％～4.5％，粉碎过80～100目筛子，冷藏备用；
2)γ-亚麻酸油脂：将步骤1)的菌丝体，利用粉碎机对菌丝体进行破壁处理，将菌丝体粉碎为80～100目，最后利用丁烷亚临界萃取设备，萃取时间为8h～10h，萃取温度为40℃～45℃，提取破壁后的菌丝体中的γ-亚麻酸油脂；
3)菌丝体蛋白粉：完成油脂提取的菌丝体即为菌丝体蛋白粉；将该菌丝体蛋白粉粉碎过80～100目筛子，冷藏备用。
本发明与现有技术相比，其优点与有益效果在于：
本发明用于生产γ-亚麻酸油脂的微生物刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxter)thaxter FAR3]是一种属于小克银汉霉属的丝状真菌，生长速度快，生命力顽强。本发明发酵培养基主要成分为马铃薯打浆液，成本低廉。本发明所获得的油脂中γ-亚麻酸含量很高，可以到达18％以上。
具体实施方式
以下所示之最佳实例作进一步详述：
实施例1：所述的一种刺孢小克银汉霉FAR3的制备方法，包括如下步骤：
广西松林红土壤用无菌水分别按10-2～10-6梯度稀释后涂布于固体培养基，25℃培养24小时，挑出单菌落溶于10mL的无菌水中，分别制成10-2～10-6梯度浓度的菌液，各吸取0.15mL于固体培养基，25℃培养24小时，分离得到的单个菌落进一步接种于液体种子培养基中25℃摇床培养72小时，然后利用显微镜油镜观察菌丝中的脂肪粒，选择菌丝中脂肪粒较多的菌株接种于发酵培养基中25℃摇床培养144小时，然后将发酵好的菌丝体烘干，利用乙醚索氏提取法提取菌丝体中的油脂，并用气相色谱仪测定各油脂中的γ-亚麻酸含量，选择油脂中γ-亚麻酸含量最高的菌株作为本发明的菌种刺孢小克银汉霉FAR3，用固体斜面培养基4℃保存。
所述的固体培养基：即为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，自然pH。
所述的液体种子培养基：即为马铃薯葡萄糖培养基。马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL，自然pH。
所述的发酵培养基：称取去皮的新鲜土豆200g，洗净切丁后加入450mL自来水利用搅拌机搅拌打碎成浆，然后4层纱布挤压过滤，将液体沉淀2h，除去淀粉定容至1L，然 后添加50g葡萄糖，2g大豆蛋白粉，4g MgSO4，2g MnSO4，1g(NH4)2SO4。
实施例2：所述的一种刺孢小克银汉霉FAR3的制备方法，包括如下步骤：
广西松林红土壤用无菌水分别按10-2～10-6梯度稀释后涂布于固体培养基，30℃培养24～48小时，挑出单菌落溶于10mL的无菌水中，分别制成10-2～10-6梯度浓度的菌液，各吸取0.15mL于固体培养基，25℃培养48小时，分离得到的单个菌落进一步接种于液体种子培养基中25℃摇床培养72小时，然后利用显微镜油镜观察菌丝中的脂肪粒，选择菌丝中脂肪粒较多的菌株接种于发酵培养基中25℃摇床培养144小时，然后将发酵好的菌丝体烘干，利用乙醚索氏提取法提取菌丝体中的油脂，并用气相色谱仪测定各油脂中的γ-亚麻酸含量，选择油脂中γ-亚麻酸含量最高的菌株作为本发明的菌种刺孢小克银汉霉FAR3，用固体斜面培养基4℃保存。
所述的固体培养基(1L)：即为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，自然pH。
所述的液体种子培养基(1L)：即为马铃薯葡萄糖培养基。马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL，自然pH。
所述的发酵培养基(1L)：称取去皮的新鲜土豆225g，洗净切丁后加入475mL自来水利用搅拌机搅拌打碎成浆，然后4层纱布挤压过滤，将液体沉淀2h，除去淀粉定容至1L，然后添加75g葡萄糖，30g大豆蛋白粉，4.5g MgSO4，2.5g MnSO4，1.5g(NH4)2SO4。
实施例3：所述的一种刺孢小克银汉霉FAR3的制备方法，包括如下步骤：
广西松林红土壤用无菌水分别按10-2～10-6梯度稀释后涂布于固体培养基，35℃培养24～48小时，挑出单菌落溶于10mL的无菌水中，分别制成10-2～10-6梯度浓度的菌液，各吸取0.15mL于固体培养基，25℃培养72小时，分离得到的单个菌落进一步接种于液体种子培养基中25℃摇床培养72小时，然后利用显微镜油镜观察菌丝中的脂肪粒，选择菌丝中脂肪粒较多的菌株接种于发酵培养基中25℃摇床培养144小时，然后将发酵好的菌丝体烘干，利用乙醚索氏提取法提取菌丝体中的油脂，并用气相色谱仪测定各油脂中的γ-亚麻酸含量，选择油脂中γ-亚麻酸含量最高的菌株作为本发明的菌种刺孢小克银汉霉FAR3，用固体斜面培养基4℃保存。
所述的固体培养基(1L)：即为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，自然pH。
所述的液体种子培养基(1L)：即为马铃薯葡萄糖培养基。马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL，自然pH。
所述的发酵培养基(1L)：称取去皮的新鲜土豆250g，洗净切丁后加入500mL自来水利用搅拌机搅拌打碎成浆，然后4层纱布挤压过滤，将液体沉淀2h，除去淀粉定容至1L，然后添加100g葡萄糖，40g大豆蛋白粉，5g MgSO4，3g MnSO4，2g(NH4)2SO4。
实施例4：所述的刺孢小克银汉霉发酵制备γ-亚麻酸油脂的方法，其主要特点在于包括如下步骤：
(1)固体菌种培养：由冻干管或者沙土管保存菌株移接至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，于25℃培养7天，进行菌种活化，再将已活化的斜面菌种移接至三角瓶中进行扩大培养；
(2)液体菌种培养：将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子罐中进行培养，种子培养基为马铃薯葡萄糖培养基，pH为5.5～6.5，种子罐培养温度为25℃，培养时间为2d，通气量(体积分数v/v/h)为1：1～1:1.5；
(3)发酵培养： 
1)发酵培养基制备(1L)：按照200g马铃薯/1L发酵培养基的比例准确称取马铃薯，洗净之后加入450mL自来水利用土豆打浆机打浆，将打浆液，除去土豆渣，置于沉淀池沉淀2h，将上清液泵入发酵罐中并添加自来水至1L容积，然后添加5％葡萄糖，2％大豆蛋白粉，0.4％MgSO4，0.2％MnSO4，0.1％(NH4)2SO4；
2)发酵培养：按照5％的接种量将生长良好的种子液接入发酵罐中培养，pH为5.0，发酵培养温度为25℃，培养时间为6d，通气量(体积分数v/v/h)为1：1～1:1.5。
(4)产品收集
1)菌丝体：培养结束后，用板框压滤机对发酵菌液进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，使其含水量达到3.2％，粉碎过80目筛子，冷藏备用；
2)γ-亚麻酸油脂：将步骤1)的菌丝体，利用粉碎机对菌丝体进行破壁处理,将菌丝体粉碎为80目，最后利用丁烷亚临界萃取设备,萃取时间为8h，萃取温度为40℃)提取破壁后的菌丝体中的γ-亚麻酸油脂；
3)菌丝体蛋白粉：完成油脂提取的菌丝体即为菌丝体蛋白粉。将该菌丝体蛋白粉粉碎过80目筛子，冷藏备用。
实施例5：所述的刺孢小克银汉霉发酵制备γ-亚麻酸油脂的方法，包括如下步骤：
(1)固体菌种培养：由冻干管或者沙土管保存菌株移接至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，于25℃培养7天，进行菌种活化，再将已活化的斜面菌种移接至三角瓶中进行扩大培养；
(2)液体菌种培养：将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子罐中进行培养，种子培养基为马铃薯葡萄糖培养基，pH为6，种子罐培养温度为25℃，培养时间为2d，通气量(体积分数v/v/h)为1：1～1:1.5；
(3)发酵培养： 
1)发酵培养基制备(1L)：按照225g马铃薯/1L发酵培养基的比例准确称取马铃薯，洗净之后加入500mL自来水利用土豆打浆机打浆，将打浆液，除去土豆渣，置于沉淀池沉淀2h，将上清液泵入发酵罐中并添加自来水至1L容积，然后添 加8％葡萄糖，3％大豆蛋白粉，0.45％MgSO4，0.25％MnSO4，0.15％(NH4)2SO4；
2)发酵培养：按照8％的接种量将生长良好的种子液接入发酵罐中培养，pH为6，发酵培养温度为26℃，培养时间为6d，通气量(体积分数v/v/h)为1：1～1:1.5。
(4)产品收集
1)菌丝体：培养结束后，用板框压滤机对发酵菌液进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，使其含水量达到4％，粉碎过90目筛子，冷藏备用；
2)γ-亚麻酸油脂：将步骤1)的菌丝体，利用粉碎机对菌丝体进行破壁处理(将菌丝体粉碎为90目)，最后利用丁烷亚临界萃取设备(萃取时间为9h，萃取温度为42℃)提取破壁后的菌丝体中的γ-亚麻酸油脂；
3)菌丝体蛋白粉：完成油脂提取的菌丝体即为菌丝体蛋白粉。将该菌丝体蛋白粉粉碎过90目筛子，冷藏备用。
实施例6：所述的刺孢小克银汉霉发酵制备γ-亚麻酸油脂的方法，包括如下步骤：
(1)固体菌种培养：由冻干管或者沙土管保存菌株移接至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，于25℃培养7天，进行菌种活化，再将已活化的斜面菌种移接至三角瓶中进行扩大培养；
(2)液体菌种培养：将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子罐中进行培养，种子培养基为马铃薯葡萄糖培养基，pH为6.5，种子罐培养温度为25℃，培养时间为2d，通气量(体积分数v/v/h)为1：1～1:1.5；
(3)发酵培养： 
1)发酵培养基制备(1L)：按照250g马铃薯/1L发酵培养基的比例准确称取马铃薯，洗净之后加入500mL自来水利用土豆打浆机打浆，将打浆液，除去土豆渣，置于沉淀池沉淀2h，将上清液泵入发酵罐中并添加自来水至1L容积，然后添加10％葡萄糖，4％大豆蛋白粉，0.5％MgSO4，0.3％MnSO4，0.2％(NH4)2SO4；
2)发酵培养：按照10％的接种量将生长良好的种子液接入发酵罐中培养，pH为6.5，发酵培养温度为28℃，培养时间为7d，通气量(体积分数v/v/h)为1：1～1:1.5。
(4)产品收集
1)菌丝体：培养结束后，用板框压滤机对发酵菌液进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，使其含水量达到4.5％，粉碎过100目筛子，冷藏备用；
2)γ-亚麻酸油脂：将步骤1)的菌丝体，利用粉碎机对菌丝体进行破壁处理(将菌丝体粉碎为100目)，最后利用丁烷亚临界萃取设备(萃取时间为10h，萃取温度为45℃)提取破壁后的菌丝体中的γ-亚麻酸油脂；
3)菌丝体蛋白粉：完成油脂提取的菌丝体即为菌丝体蛋白粉。将该菌丝体蛋白粉粉碎过100目筛子，冷藏备用。
各项检测方法
1)γ-亚麻酸油脂产量测定：称取质量为M(g)粉状菌丝体，用滤纸包裹，进行索氏抽提。称出抽提前干燥抽提烧瓶的质量为M1(g)，称出抽提后干燥抽提烧瓶的重量为M2(g)，即可得出油脂质量为(M2-M1)。则菌丝体含油率B(％)＝(M2-M1)/M×100％。若生物量为A，菌丝体含油率为B，则油脂产量C(g/L)＝A×B。
2)γ-亚麻酸油脂检测：
①油脂甲酯化：在具塞试管中滴入3滴待测油脂样品，用移液管依次分别加入0.5mol/L KOH-CH3OH溶液和15％BF3-CH3OH溶液各2mL，每次加入溶液后均需在65℃水浴锅中加热皂化反应，对应的皂化反应的时间分别为15min和2min。皂化结束后用移液管依次加入正己烷分析纯和饱和NaCl溶液各2mL，最后用微量进样器取1uL上层清液注入气相色谱仪进行分析检测。
②气相色谱分析条件：控制进样器温度为240℃；控制检测器温度为240℃；升温程序：初始柱温控制为180℃，以5℃/min升至200℃，恒温7min，降至180℃。
实施例7(5t机械搅拌式发酵罐)
刺孢小克银汉霉FAR3(CGMCC NO.：9504)接种至PDA固体培养基中活化，25℃恒温培养7d。将活化好的菌种接种至三角瓶固体培养基中，25℃培养7d。用无菌的接种管吸取20mL的无菌水加入1瓶三角瓶固体菌种中，然后用接种管轻刮固体培养基表面的菌丝体，再用接种管将含有孢子和菌丝体的菌液全部接入1瓶摇瓶液体种子培养基中，置于摇床，25℃、150r/min转速下培养48h。50L种子罐装入30L发酵罐液体种子培养基(即为马铃薯葡萄糖培养基，1L发酵罐液体种子培养基成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL)，灭菌、降温后，按照10％的接种量接入15瓶摇瓶液体种子(3L摇瓶液体种子)，培养过程中控制培养温度为25℃，搅拌转速为100r/min，控制pH自然，培养2d结束。500L扩增罐装入300L发酵罐液体种子培养基(即为马铃薯葡萄糖培养基，1L发酵罐液体种子培养基成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL)，灭菌、降温后，将培养好的50L种子罐中的种子液移入500L扩增罐中，培养过程中控制培养温度为25℃，搅拌转速为80r/min，控制pH自然，培养2d结束。5t发酵罐装入3t发酵培养基(1L发酵培养基成分为：1L马铃薯打浆液，50g葡萄糖，25g大豆蛋白粉，4g MgSO4，2g MnSO4，1g(NH4)2SO4)。灭菌、降温后，将已经培养好的500L扩增罐中的种子液移入5t发酵罐中，发酵过程中控制搅拌转速为80r/min，温度为25℃，发酵pH为5.5，控制发酵通气量分别为180m3/h，培养7d结束。培养结束后，用板框压滤机对发酵菌液进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，烘干温度控制为65℃，最终使其含水量达到3.2％～4.5％，最终获得90.3kg干燥菌丝体，菌丝体经检验合格后，粉碎过80目筛子，冷藏备用。
实施例8(5t机械搅拌式发酵罐)
刺孢小克银汉霉FAR3(CGMCC NO.：9504)接种至PDA固体培养基中活化，25℃恒温培养7d。将活化好的菌种接种至三角瓶固体培养基中，25℃培养7d。用无菌的接种 管吸取20mL的无菌水加入1瓶三角瓶固体菌种中，然后用接种管轻刮固体培养基表面的菌丝体，再用接种管将含有孢子和菌丝体的菌液全部接入1瓶摇瓶液体种子培养基中，置于摇床，25℃、150r/min转速下培养48h。50L种子罐装入30L发酵罐液体种子培养基(即为马铃薯葡萄糖培养基，1L发酵罐液体种子培养基成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL)，灭菌、降温后，按照10％的接种量接入15瓶摇瓶液体种子(3L摇瓶液体种子)，培养过程中控制培养温度为25℃，搅拌转速为100r/min，控制pH自然，培养2d结束。500L扩增罐装入300L发酵罐液体种子培养基(即为马铃薯葡萄糖培养基，1L发酵罐液体种子培养基成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL)，灭菌、降温后，将培养好的50L种子罐中的种子液移入500L扩增罐中，培养过程中控制培养温度为25℃，搅拌转速为80r/min，控制pH自然，培养2d结束。5t发酵罐装入3t发酵培养基(1L发酵培养基成分为：1L马铃薯打浆液，50g葡萄糖，25g大豆蛋白粉，4g MgSO4，2g MnSO4，1g(NH4)2SO4)。灭菌、降温后，将已经培养好的500L扩增罐中的种子液移入5t发酵罐中，发酵过程中控制搅拌转速为80r/min，温度为25℃，发酵pH为5.5，控制发酵通气量分别为180m3/h，培养7d结束。培养结束后，用板框压滤机对发酵菌液进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，烘干温度控制为65℃，最终使其含水量达到3.2％～4.5％，最终获得90.3kg干燥菌丝体。利用粉碎机对菌丝体进行破壁处理，最后利用丁烷亚临界萃取设备提取破壁后的菌丝体中的γ-亚麻酸油脂，控制萃取温度为40℃，菌丝体萃取时间为8h，最终获得29.9kgγ-亚麻酸油脂，油脂中γ-亚麻酸含量为14.42％。
实施例9(5t气升式发酵罐)
刺孢小克银汉霉FAR3(CGMCC NO.：9504)接种至PDA固体培养基中活化，25℃恒温培养7d。将活化好的菌种接种至三角瓶固体培养基中，25℃培养7d。用无菌的接种管吸取20mL的无菌水加入1瓶三角瓶固体菌种中，然后用接种管轻刮固体培养基表面的菌丝体，再用接种管将含有孢子和菌丝体的菌液全部接入1瓶摇瓶液体种子培养基中，置于摇床，25℃、150r/min转速下培养48h。50L种子罐装入30L发酵罐液体种子培养基(即为马铃薯葡萄糖培养基，1L发酵罐液体种子培养基成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL)，灭菌、降温后，按照10％的接种量接入15瓶摇瓶液体种子(3L摇瓶液体种子)，培养过程中控制培养温度为25℃，搅拌转速为100r/min，控制pH自然，培养2d结束。500L扩增罐装入300L发酵罐液体种子培养基(即为马铃薯葡萄糖培养基，1L发酵罐液体种子培养基成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL)，灭菌、降温后，将培养好的50L种子罐中的种子液移入500L扩增罐中，培养过程中控制培养温度为25℃，搅拌转速为80r/min，控制pH自然，培养2d结束。5t发酵罐装入3t发酵培养基(1L发酵培养基成分为：1L马铃薯打浆液，50g葡萄糖，25g大豆蛋白粉，4g MgSO4，2g MnSO4，1g(NH4)2SO4)。灭菌、降温后，将已经培养好的500L扩增罐中的种子液移入5t发酵罐中，发酵过程中控制温度为25℃，发酵pH为5.5，控 制发酵通气量分别为180m3/h，培养7d结束。培养结束后，用板框压滤机对发酵菌液进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，烘干温度控制为65℃，最终使其含水量达到3.2％～4.5％，最终获得105kg干燥菌丝体。利用粉碎机对菌丝体进行破壁处理，最后利用丁烷亚临界萃取设备提取破壁后的菌丝体中的γ-亚麻酸油脂，控制萃取温度为40℃，菌丝体萃取时间为8h，最终获得31.5kgγ-亚麻酸油脂，油脂中γ-亚麻酸含量为18.6％。
验证例1：获得本发明菌种刺孢小克银汉霉FAR3的方法，按下述方法进行：
广西松林红土壤用无菌水分别按10-2～10-6梯度稀释后涂布于固体培养基，25℃培养48小时，挑出单菌落溶于10mL的无菌水中，分别制成10-2～10-6梯度浓度的菌液，各吸取0.15mL于固体培养基，25℃培养72小时，分离得到的单个菌落进一步接种于液体种子培养基中25℃摇床培养72小时，然后利用显微镜油镜观察菌丝中的脂肪粒，选择菌丝中脂肪粒较多的菌株接种于发酵培养基中25℃摇床培养144小时，然后将发酵好的菌丝体烘干，利用乙醚索氏提取法提取菌丝体中的油脂，并用气相色谱仪测定各油脂中的γ-亚麻酸含量，选择油脂中γ-亚麻酸含量最高的菌株作为本发明的菌种刺孢小克银汉霉FAR3，用固体斜面培养基4℃保存。
上述所用的各培养基组成如下：
固体培养基(1L)：即为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，自然pH。
液体种子培养基(1L)：即为马铃薯葡萄糖培养基。马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL，自然pH。
所述的发酵培养基(1L)：称取去皮的新鲜土豆200g，洗净切丁后加入450mL自来水利用搅拌机搅拌打碎成浆，然后4层纱布挤压过滤，将液体沉淀2h，除去淀粉定容至1L，然后添加50g葡萄糖，25g大豆蛋白粉，4g MgSO4，2g MnSO4，1g(NH4)2SO4。
所述刺孢小克银汉霉具有如下形态特征：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上25℃培养5天，菌落圆形，初白色，大量气生菌丝，4天后菌落转为浅灰色，背面灰色，直径4.0～4.5厘米。菌丝无色，平滑，分枝，无隔膜，宽4.4～7.4μm；孢囊球形或卵球形，光滑，成熟孢囊表面疣状突起，后在突起顶端形成孢囊孢子，25.0～30.0μm；孢囊孢子近球形至球形，单胞，浅褐色，短刺或有时平滑，7.0～10.0μm。将已经在马铃薯葡萄糖培养基上活化好的刺孢小克银汉霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中25℃培养2天，菌体为灰白色，菌液为淡黄色。
所述的一种刺孢小克银汉霉，所述的刺孢小克银汉霉具有如下分子生物学特征：提取菌株FAR3的基因组DNA，选用真菌18S rDNA的特异性引物NS1、NS8进行PCR扩增并纯化PCR产物，经北京六合华大基因科技有限公司测得该菌株18S rDNA的序列如下：
用DNeasy Plant Mini Kit提取了菌株FAR3总DNA，以通用引物ITS1与ITS4扩增ITS区段，经中国科学院微生物研究所测序后序列结果如下：
所述刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxter)thaxter FAR3]即刺孢小克银汉霉FAR3，所述的刺孢小克银汉霉属于毛霉目，小克银汉霉科，小克银汉霉属的菌种，该菌种在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏时间为2014年08月07日，保藏编号为CGMCC NO.9504。
验证例2(5t气升式发酵罐)：本发明所用菌种来源：以马铃薯葡萄糖培养基从广西松林红土壤中分离纯化得到的高产γ-亚麻酸的丝状真菌——刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxter)thaxter FAR3]。
生物量的测定：取一定体积V(L)的发酵菌液用滤布过滤，然后在烘箱将过滤得到的菌丝体烘至恒重，在干燥器中冷却至室温后称取其质量为G(g)。则生物量A(g/L)＝G/V。
所述的刺孢小克银汉霉发酵制备γ-亚麻酸油脂的方法，包括如下步骤：
(1)固体菌种培养：由冻干管或者沙土管保存菌株移接至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，于25℃培养7天，进行菌种活化，再将已活化的斜面菌种移接至三角瓶中进行扩大培养；
(2)液体菌种培养：将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子罐中进行培养，种子培养基为马铃薯葡萄糖培养基，pH为5.5，种子罐培养温度为25℃，培养时间为2d，通气量(体积分数v/v/h)为1:1.5；
(3)发酵培养： 
1)发酵培养基制备(1L)：按照200g马铃薯/1L发酵培养基的比例准确称取马铃薯，洗净之后加入450mL自来水利用土豆打浆机打浆，将打浆液，除去土豆渣，置于沉淀池沉淀2h，将上清液泵入发酵罐中并添加自来水至1L容积，然后添加5％葡萄糖，2％大豆蛋白粉，0.4％MgSO4，0.2％MnSO4，0.1％(NH4)2SO4；
2)发酵培养：按照10％的接种量将生长良好的种子液接入发酵罐中培养，pH为5.5，发酵培养温度为25℃，培养时间为7d，通气量(体积分数v/v/h)为1：1。
(4)产品收集； 
1)菌丝体：培养结束后，用板框压滤机对发酵菌液进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，使其含水量达到3.2％，粉碎过80目筛子，冷藏备用，获得干燥菌丝体质量为110kg；
2)γ-亚麻酸油脂：将步骤1)的菌丝体，利用粉碎机对菌丝体进行破壁处理将菌丝体粉碎为80目，最后利用丁烷亚临界萃取设备，萃取时间为8h，萃取温度为40℃，提取破壁后的菌丝体中的γ-亚麻酸油脂，获得γ-亚麻酸油脂质量为31.3kg，油脂中γ-亚麻酸含量为18.1％；
3)菌丝体蛋白粉：完成油脂提取的菌丝体即为菌丝体蛋白粉。将该菌丝体蛋白粉粉碎过80目筛子，冷藏备用，获得菌丝体蛋白粉77.5kg。
各项检测方法
1)γ-亚麻酸油脂产量测定：称取质量为M(g)粉状菌丝体，用滤纸包裹，进行索氏抽提。称出抽提前干燥抽提烧瓶的质量为M1(g)，称出抽提后干燥抽提烧瓶的重量为M2(g)，即可得出油脂质量为(M2-M1)。则菌丝体含油率B(％)＝(M2-M1)/M×100％。若生物量为A，菌丝体含油率为B，则油脂产量C(g/L)＝A×B。
2)γ-亚麻酸油脂检测：
①油脂甲酯化：在具塞试管中滴入3滴待测油脂样品，用移液管依次分别加入0.5mol/L KOH-CH3OH溶液和15％BF3-CH3OH溶液各2mL，每次加入溶液后均需在65℃水浴锅中加热皂化反应，对应的皂化反应的时间分别为15min和2min。皂化结束后用移液管依次加入正己烷分析纯和饱和NaCl溶液各2mL，最后用微量进样器取1uL上层清液注入气相色谱仪进行分析检测。
②气相色谱分析条件：控制进样器温度为240℃；控制检测器温度为240℃；升温程序：初始柱温控制为180℃，以5℃/min升至200℃，恒温7min，降至180℃。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种刺孢小克银汉霉FAR3，其特征在于：所述刺孢小克银汉霉[Cunninghamellaechinulata(Thaxter)thaxter FAR3]，属于毛霉目，小克银汉霉科，小克银汉霉属的菌种，该菌种在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏时间为2014年08月07日，保藏编号为CGMCC NO.9504。
所述刺孢小克银汉霉具有如下形态特征：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上25℃培养5天，菌落圆形，初白色，大量气生菌丝，4天后菌落转为浅灰色，背面灰色，直径4.0～4.5厘米。菌丝无色，平滑，分枝，无隔膜，宽4.4～7.4μm；孢囊球形或卵球形，光滑，成熟孢囊表面疣状突起，后在突起顶端形成孢囊孢子，25.0～30.0μm；孢囊孢子近球形至球形，单胞，浅褐色，短刺或有时平滑，7.0～10.0μm。将已经在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化好的刺孢小克银汉霉菌种接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中25℃培养2天，菌体为灰白色，菌液为淡黄色。
2.如权利要求1所述的一种刺孢小克银汉霉FAR3，其特征在于：所述的刺孢小克银汉霉具有如下分子生物学特征：提取菌株FAR3的基因组DNA，选用真菌18S rDNA的特异性引物NS1、NS8进行PCR扩增并纯化PCR产物，测得该菌株18S rDNA的序列如下：
gaattgacct tttctcggta ccatctaata atctagtttg ccatagttct cctcaaaagc 60
cggttgttgc caaccagcct tcaatgatcc cacatgctca ctatgaccat tcaatcggta 120
gtagcgacgg gcggtgtgta caaagggcag ggacgtaatc aacgcaacct gatgagttac 180
gcttactagg aattcctcgt tgaagagcaa taattgcaat gctctatccc cagcacgaca 240
aagtttcaaa agtttcccca gaccttccgg ccaaggtata aaataaactc gttgactttg 300
tcagtgtagc gcgcgtgcgg cccagaacat ctaagggcat cacagacctg ttattgccta 360
aaacttcccc tgaattgtat tcagtagtct ctctaagaag ctggctagcc cgaaggctag 420
aaaccaccaa ctaaaaagtt ggcccagcta attagcagaa taaggtctcg ttcgttatcg 480
gaattaacca gacaaatcac tccacgaact aagaacggcc atgcaccacc acccataaaa 540
tctagaaaga gctttcaatc tgtcaatcct tattatgtct ggacctggtg agtttccccg 600
tgttgagtca aattaagccg caggctccac tcctggtggt gcccttccgt caattccttt 660
aagtttcagc cttgcgtccc atactccccc cagaacccaa aaactttact ttcgctaagc 720
tgctgaatcc tgccagtggc gaggatccaa tcgctagtcg gcatagtttg tggttaagac 780
tacgacggta tctaatcgtc ttcgatccct caactttagt ccctgatcaa tggaaacgtc 840
ctaggtcaaa tgctttcgca gtagtttgtc ttcggtcaat ccaagaattt cacctctagc 900
gaccaaatac aaatgccccc aaccgttcct attcatcatt tcctaaggtc tagtatacca 960
acaaaacaag actaaggtcc tattttatta ttccatgcta acacattcag gcacgaaggc 1020
ctactttgag cattctgatt tgctcatggt aatacgcttg ggcagagaac cacaccgacc 1080
gaagccaaca tgatcatacc caaactttgt cacccggact gaggcaaatc tagccaaatg 1140
aatgaccagc tgcccagcca acaaggcgta agttcgacta cggacgtttt aactgcaaca 1200
actttaatat acgcttttgg agctggaatt accgcggctg ctggcaccag acttgccctc 1260
caattgatcc tcgttaaggg atttaaattg tactcattcc aattgcaaag accataaaga 1320
ccctgcattg ttatttattg tcactacctc accgtgtcgg tattgggtaa tttgcgcgcc 1380
tgctgccttc cttggatgtg gtagccgttt ctcaggctcc ctctccggaa tcgaacccta 1440
attccccgtt acccgtgata gccatggtaa gccactacct taccatcata agcctgatag 1500
ggcagaaaat cgaatgtacc gtcgccggct caaggccatg cgatcagctt aattattatg 1560
aatcaccata aaaccaccgg taaaggcggg atggttttta cctaataagt gcaccccttc 1620
cgaagttggg gctttttttg catgtattag ctctagaatt accacggtta tccagtagta 1680
aaaaatttgt catgtagatc ataactgatt taatgagcca ttcgcagttt cgctgtataa 1740
gattgcttat acctacgggg aaaggtcgcc g                                1771；
用DNeasy Plant Mini Kit提取了所述的刺孢小克银汉霉菌株FAR3总DNA，以通用引物ITS1与ITS4扩增ITS区段，测序后序列结果如下：
ctttttcgac cattaaaatc atccataatg tgggtcaaac cacatgcgca atgtttttac 60
aagatgttat ttagttagca tctttttatt tgtaatatgg ccttaaaaaa gccacattac 120
taattttttt atactaaatt aactgaaaaa acgattgacc ataattttat ggttgtttaa 180
acaatatatt aacttatata aaaacaactt tcagcaatgg atctctcggc tttcgtatcg 240
atgaagaacg cagcaaatcg cgatatttaa tgtgatctgc ctatagtgaa tcatcaaatc 300
tttgaacgca tcttgcaccc tatggtattc cgtagggtac atctgtttca gtaccattca 360
aacatctccc tcactcctat ttttttatta aaagagagaa tgagatcaga gataaattat 420
aaatggtcct gggtaagctg tgtactaagt cttttgactt tttacctgac ggaattttat 480
cactacccgc ccttatatct tagcgtataa gctcggtgct aggagttaaa agcatagtaa 540
agaacctaac ttgcctttgt cagcctcctt ccttttaggt tggaggacat gatgcgactg 600
tgggacgccc gattaccctc gacttaaata tctgttaagg taaattcttg acttatcttt 660
gcaaaaaggt atgatagaat tggctttaat gtttttacat ctagagttat aattctttta 720
gctcctgatg ggagaaaaaa gcattaggaa ttcttcggaa gtc                   763。
3.如权利要求1所述的一种刺孢小克银汉霉FAR3的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
广西松林红土壤用无菌水分别按10-2～10-6梯度稀释后涂布于固体培养基，25℃～35℃培养24～48小时，挑出单菌落溶于10mL的无菌水中，分别制成10-2～10-6梯度浓度的菌液，各吸取0.15mL于固体培养基，25℃培养24～72小时，分离得到的单个菌落进一步接种于液体种子培养基中25℃摇床培养72小时，然后利用显微镜油镜观察菌丝中的脂肪粒，选择菌丝中脂肪粒较多的菌株接种于发酵培养基中25℃摇床培养144小时，然后将发酵好的菌丝体烘干，利用乙醚索氏提取法提取菌丝体中的油脂，并用气相色谱仪测定各油脂中的γ-亚麻酸含量，选择油脂中γ-亚麻酸含量最高的菌株作为本发明的菌种刺孢小克银汉霉FAR3，用固体斜面培养基4℃保存。
4.如权利要求3所述的一种刺孢小克银汉霉FAR3的制备方法，其特征在于还包括有：
所述的固体培养基：即为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，自然pH；
所述的液体种子培养基：即为马铃薯葡萄糖液体培养基。马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL，自然pH；
所述的发酵培养基：称取去皮的新鲜土豆200～250g，洗净切丁后加入450mL～500mL自来水利用搅拌机搅拌打碎成浆，然后4层纱布挤压过滤，将液体沉淀2h，除去淀粉定容至1L，然后添加50～100g葡萄糖，20～40g大豆蛋白粉，4～5g MgSO4，2～3g MnSO4，1～2g(NH4)2SO4。
5.如权利要求1所述的刺孢小克银汉霉发酵FAR3制备γ-亚麻酸油脂的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)固体菌种培养：由冻干管或者沙土管保存菌株移接至马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，于25℃培养7天，进行菌种活化，再将已活化的斜面菌种移接至三角瓶中进行扩大培养；
(2)液体菌种培养：将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子罐中进行培养，种子培养基为马铃薯葡萄糖培养基，pH为5.5～6.5，种子罐培养温度为25℃，培养时间为2d，通气量，体积分数v/v/h为1：1～1:1.5；
(3)发酵培养：
1)发酵培养基制备：按照200g～250g马铃薯/1L发酵培养基的比例准确称取马铃薯，洗净之后加入450mL～500mL自来水利用土豆打浆机打浆，将打浆液，除去土豆渣，置于沉淀池沉淀2h，将上清液泵入发酵罐中并添加自来水至1L容积，然后添加5％～10％葡萄糖，2％～4％大豆蛋白粉，0.4～0.5％MgSO4，0.2～0.3％MnSO4，0.1～0.2％(NH4)2SO4；
2)发酵培养：按照5％～10％的接种量将生长良好的种子液接入发酵罐中培养，pH为5.0～6.5，发酵培养温度为25℃～28℃，培养时间为6d～7d，通气量，体积分数v/v/h为1：1～1:1.5；
(4)产品收集；
1)菌丝体：培养结束后，用板框压滤机对发酵菌液进行固液分离，然后用沸腾干燥机进行菌丝体烘干，使其含水量达到3.2％～4.5％，粉碎过80～100目筛子，冷藏备用；
2)γ-亚麻酸油脂：将步骤1)的菌丝体，利用粉碎机对菌丝体进行破壁处理，将菌丝体粉碎为80～100目，最后利用丁烷亚临界萃取设备，萃取时间为8h～10h，萃取温度为40℃～45℃，提取破壁后的菌丝体中的γ-亚麻酸油脂；
3)菌丝体蛋白粉：完成油脂提取的菌丝体即为菌丝体蛋白粉；将该菌丝体蛋白粉粉碎过80～100目筛子，冷藏备用。
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