CN104087632B

CN104087632B - 一种深层液态发酵生产桑黄胞外多糖的方法

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Publication number: CN104087632B
Application number: CN201410337721.1A
Authority: CN
Inventors: 王文风; 徐国华; 徐玲; 王英燕; 张芙蓉; 杨亚威; 高岩; 许正宏
Original assignee: JIANGSU SHENHUA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: JIANGSU SHENHUA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2014-07-15
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2034-07-15
Also published as: CN104087632A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种深层液态发酵生产桑黄胞外多糖的方法。具体的说是一种工业化规模的桑黄胞外多糖的生产方法，该方法是将活化好的桑黄菌种通过接入到种子罐进行扩配，再将扩配好的液体种子接入到特制的产多糖的液态培养基中进行发酵，然后将发酵液进行分离，提取胞外多糖。本发明针对上述现有技术的不足进行研究，在小试和中试继续优化发酵培养基(尤其是碳源)、提升生物量和胞外多糖的基础上，解决了由小试放大到工业化生产中遇到的发酵过程参数控制、提取设备选型、优化等难题，最终成功嫁接到10‐20t发酵罐进行产业化生产，并顺利生产出高品质的桑黄多糖，真正实现了连续、自动化、产业化的生产。

Description

一种深层液态发酵生产桑黄胞外多糖的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种深层液态发酵生产桑黄胞外多糖的方法。

背景技术

桑黄为担子菌亚门(Basidlomycotlna),层菌纲(Hymenomucetes),多孔菌目(PolyPorales),锈革孔茵科(Hymenoechaetacae),针层孔菌属(Phellinus)。针层孔菌属(Phellinus)是多孔菌科的一个大属,全球共记载251种左右,中国己知62种。桑黄是一种珍贵的药用真菌，有“森林黄金”之美称。《神农本草经》及以李时珍的《本草纲目》为代表的中国古代医药学典籍中已经有“桑耳”，“桑黄”，“桑臣”，“胡孙眼”等记述，但对桑黄的定义应该说是相当模糊的。

在日本，具有抗癌功效的桑黄(Phellinus Linteus)被称作“Mesimakobu”，写成汉字就是“女岛瘤”，这是因为在日本的长崎县男女群岛的女岛上曾发现过桑黄。由于日本对桑黄的研究开始的早，进行的也比较深入，所以桑黄的日文名称也在国际上被广泛采用，像韩国和美国的桑黄制品就有直接以“Mesima”或“Mesimakobu”来命名的。

近年来越来越多的学者开始研究桑黄的药效成分和药理作用,但是目前国内野生的桑黄资源稀少，子实体的人工栽培成功率低且重复性差，固体栽培周期长、污染率高，易受周围环境限制，无法满足日益增长的市场需求。而深层液态发酵技术具有发酵周期短、高产量、污染率低等优点、不受周围环境限制，资源设备利用率高等优点，因而受到越来越多的研究者们的青睐。国内桑黄菌丝体的培养起步较晚，从1998年才开始，李国俊等用韩国的菌种才成功的进行菌丝体的培养，但仅仅进行了最简单的菌丝体生长研究。目前国内外也有少量大专院校的研究者对桑黄的深层发酵进行过研究，但往往其主要侧重点是如何获取更高的生物量，只有少部分研究者关注桑黄的功效成分多糖的研究。

发明内容

本发明的目的是为了解决工业化规模生产桑黄多糖的技术瓶颈，采用液态发酵生产桑黄多糖克服了固态发酵周期长、投资大、受季节限制、难以产业化等弊端，采用此发明能够连续、自动化、产业化的生产出高品质的桑黄多糖。

为了实现上述目的，本发明主要按照下述步骤进行：

本发明的产业化深层液态发酵生产桑黄胞外多糖的方法包括下述步骤：

一种制备桑黄发酵液的方法，将桑黄种子培养液接入灭菌后的发酵培养基，接种量为10～20％(v/v)，通风比为1：0.5‐1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在22～30℃下发酵培养3‐5天，得到桑黄发酵液；其中所述的发酵培养基配方为：葡萄糖1-3％、淀粉1-3％、酵母粉0.2-1％、蛋白胨0.5-2％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、七水硫酸镁0.1-0.5％、硫酸铜0.1-0.5wt％、消泡剂0.01-0.05％、20000u/ml的耐高温α-淀粉酶0.001-0.007％(v/v)，调节pH值6.5-7.5。上述培养基组成中除淀粉酶以外的“％”，均表示g/100ml。

所述的消泡剂可以为植物油(豆油、菜籽油)类、有机醚类等物质。

其中，所述的桑黄种子培养液优选通过以下方法制备得到：

1)一级种子培养：将经活化摇瓶菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为0.1～2％，通风比为1：0.5‐1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在22～30℃下培养4～7天，得到桑黄一级种子培养液；

2)二级种子培养：将步骤1)所得的一级种子培养液接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为10～20％，通风比为1：0.5‐1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在22～30℃下培养3～4天，得到所述的桑黄种子培养液。

所述的液体种子培养基配方优选为：葡萄糖2-4％、蚕蛹粉0.1-0.5％、黄豆饼粉1-3％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、七水硫酸镁0.1-0.5％、硫酸铜0.1-0.5wt％、消泡剂0.01-0.05％，调节pH值6.5-7.5。上述培养基组成中的“％”均表示g/100ml。

所述的发酵培养终点为：菌球变碎、滤液浑浊，有特有的浓郁香味；还原糖降至最低并略有波动，还原糖控制0.3％(g/100g)以下；镜检菌丝细碎，无杂菌污染。

一种桑黄胞外多糖提取的方法，该方法包括下述步骤：

1)分离：将上述方法所得的桑黄发酵液经离心分离，得到桑黄上清液；

2)浓缩：将步骤1)所得的滤液进行采用二级低温浓缩，得到浓缩比重为1.25～1.40的浓缩浆；

3)醇沉、烘干：加入浓缩浆重量3-5倍量的95％酒精，用酒精计检测混合液酒精度约65-80％(v/v)，静置8-16h，将沉淀物进行真空烘干，温度50-75℃，真空度不低于0.085MPa；烘干至干燥物水分含量为3～8％(g/100g)，即得胞外糖。

其中，所述步骤1)中所述的离心分离采用卧螺离心机进行，转速控制在2500‐3500r/min。

所述步骤2)中所采用的二级浓缩为：一级采用1‐3t双效蒸发器浓缩，将发酵液浓缩到比重为1.15‐1.20(50℃热测)，二级采用1‐3t单效浓缩器浓缩，即将比重为1.1‐1.20(50℃热测)的浓缩液继续浓缩到比重为1.25～1.40(50℃热测)的浓缩浆；浓缩过程均要求控制温度不高于75℃，真空度不低于0.085MPa。

本发明中醇沉是采用1‐3t醇沉罐，醇沉次数越多，胞外糖的含量越高。真空烘干采用的真空干燥箱，本发明提取的胞外糖含量在20‐50％。

本发明具有以下几个突出的优点：

本发明针对上述现有技术的不足进行研究，在小试和中试继续优化发酵培养基(尤其是碳源)、提升生物量和胞外多糖的基础上，解决了由小试放大到工业化生产中遇到的发酵过程参数控制、提取设备选型、优化等难题，最终成功嫁接到10‐20t发酵罐进行产业化生产，并顺利生产出高品质的桑黄多糖，真正实现了连续、自动化、产业化的生产。

为了提高目的产物胞外多糖的产量，本发明在发酵培养基的碳源进行了优化和组合:采用短效葡萄糖和长效淀粉的复合组方。发酵前期以生长菌丝体，提高生物含量为主，因此培养基中添加了菌体优先选用的葡萄糖碳源，迅速增殖；发酵后期要提高目的产物的含量，因此碳源提供菌体相对利用较慢的淀粉，并在培养基中添加适量淀粉酶，控制菌体数量在合适规模，并不断产生代谢物胞外糖。

采用本发明可根据市场需求和产品标准，制得不同含量的高品质的多糖，多糖含量可在20‐50％。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。

以下实施例使用的桑黄购买于中国科学院微生物研究所普通微生物中心，菌种编码CGMCC NO.50095。以此株菌为例，详细说明本发明的具体方案。但是本发明方法通用于所有的桑黄，并不仅限于该菌株。

实施例1

本发明产业化深层液态发酵生产桑黄胞外多糖的方法按下述步骤进行：

1、桑黄发酵液的制备：将活化好的桑黄摇瓶菌株按接种量1％接种于种子培养基(300L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3％、蚕蛹粉0.4％、黄豆饼粉1.7％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.15％、硫酸铜0.2wt％、消泡剂0.02％，调节pH值6.5，通风比为1：0.8vvm，罐压0.03Mpa，26～28℃振荡培养5天即得桑黄一级种子液；将一级种子液按接种量15％接入二级种子培养基(3000L)，其中二级种子培养基组成为葡萄糖3％、蚕蛹粉0.3％、黄豆饼粉1.8％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.15％、硫酸铜0.25wt％、消泡剂0.02％，调节pH值6.5，通风比为1：1.0vvm，罐压0.03Mpa，26～28℃培养3天即得桑黄二级种子液；将二级种子液按接种量18％接入发酵培养基(7500L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2％、淀粉2％、酵母粉0.5％、蛋白胨1.5％、磷酸二氢钾0.2％、七水硫酸镁0.2％、硫酸铜0.3wt％、消泡剂豆油0.03％、耐高温α‐淀粉酶(枣庄杰诺酶生物有限公司，20000u/ml)0.002％(v/v)，调节pH值6.5；通风比为1：0.5vvm，罐压0.03Mpa，26～28℃培养4天，发酵至菌球变碎、滤液浑浊，有特有的浓郁香味；还原糖降至最低0.2％并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染。即得桑黄发酵液8500Kg。上述培养基组成中除淀粉酶以外的“％”，均表示g/100ml。

2、桑黄发酵液分离：将上述桑黄发酵液8500Kg通过卧螺离心机进行分离，转速控制在3000r/min，分离时间在2h，得到桑黄滤液7555Kg和786Kg的湿菌丝体(含水量为80％)，湿菌丝体可直接低温干燥粉碎制得发酵桑黄菌粉。

4、低温浓缩：将步骤2所得的桑黄滤液7555Kg真空转移至3t双效蒸发器，在真空度为0.085MPa，浓缩温度为65℃条件下浓缩至比重为1.20(50℃热测)浓缩液，再将浓缩液真空转移至1.5t单效球型浓缩器，在真空度为‐0.09MPa，浓缩温度为60℃条件下继续浓缩至比重为1.32(50℃热测)的浓缩浆545kg。

5、醇沉、烘干：向盛有545kg浓缩浆的醇沉罐中加入重量1800kg的95％酒精，用酒精计检测混合液酒精度72％(v/v)，静置12h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度60℃，真空度0.09MPa；烘干12h得胞外糖245.3kg。检测水分含量为5％，多糖含量为31％。

实施例2

1、桑黄发酵液的制备：将活化好的桑黄摇瓶菌株按接种量1.5％接种于种子培养基(300L)，其中种子培养基组成为葡萄糖3％、蚕蛹粉0.3％、黄豆饼粉1.8％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.15％、硫酸铜0.3wt％、消泡剂0.02％，调节pH值6.5，通风比为1：1.0vvm，罐压0.03Mpa，25～27℃振荡培养6天即得桑黄一级种子液；将一级种子液按接种量15％接入二级种子培养基(3000L)，其中二级种子培养基组成为葡萄糖3％、蚕蛹粉0.3％、黄豆饼粉2.0％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.15％、硫酸铜0.2wt％、消泡剂0.02％，调节pH值6.5，通风比为1：1.0vvm，罐压0.03Mpa，25～27℃培养3天即得桑黄二级种子液；将二级种子液按接种量18％接入发酵培养基(15000L)，其中发酵培养基组成为葡萄糖2％、淀粉2％、酵母粉0.7％、蛋白胨1.5％、磷酸二氢钾0.2％、七水硫酸镁0.2％、硫酸铜0.3wt％、消泡剂菜籽油0.03％、耐高温α‐淀粉酶(枣庄杰诺酶生物有限公司，20000u/ml)0.002％(v/v)，调节pH值7.0；通风比为1：0.5vvm，罐压0.04Mpa，25～27℃培养4天，发酵至菌球变碎、滤液浑浊；还原糖降至最低0.2％并略有波动；镜检菌丝细碎，无杂菌污染，既得桑黄发酵液17700Kg。上述培养基组成中除淀粉酶以外的“％”，均表示g/100ml。

2、桑黄发酵液的分离：将上述桑黄发酵液17700Kg通过卧螺离心机进行分离，得到桑黄滤液16155Kg和1288Kg的湿菌丝体(含水量为75％)，湿菌丝体可直接低温干燥粉碎制得发酵桑黄菌粉。具体工艺条件是：转速控制在3200r/min，分离时间在4.5h。

4、低温浓缩：将步骤2所得的桑黄滤液16155Kg真空转移至3t双效蒸发器，在真空度为0.09MPa，浓缩温度为63℃条件下浓缩至比重为1.18(50℃热测)浓缩液，再将浓缩液真空转移至1.5t单效球型浓缩器，在真空度为‐0.09MPa，浓缩温度为65℃条件下浓缩至比重为1.35(50℃热测)的浓缩浆1070kg。

5、醇沉、烘干：向盛有1070kg浓缩浆的醇沉罐中加入重量3500kg的95％酒精，用酒精计检测混合液酒精度71％(v/v)，静置10h，将底部沉淀物分离用真空干燥箱进行烘干，温度65℃，真空度0.09MPa；烘干20h得胞外糖488kg。检测水分含量为4.3％，多糖含量为33％。

实施例3

为更好验证本发明中短效葡萄糖和长效淀粉的复合组方在产业化生产桑黄多糖的优越性，又做了几个对比试验。试验中只调整了液体发酵培养基中碳源葡萄糖或(和)淀粉的用量，对比例1中不含有淀粉，葡萄糖浓度为1.5％；对比例2中不含有葡萄糖，淀粉浓度为2.5％，对比例3中葡萄糖含量为2.5％，淀粉含量为0.5％；其余条件均同实施例1，试验结果见表1：

表1

Claims

1.一种制备桑黄发酵液的方法，其特征在于将桑黄种子培养液接入灭菌后的发酵培养基，接种量为10~20%v/v，通风比为1：0.5-1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在22~30℃下发酵培养3~5天，得到桑黄发酵液；其中所述的发酵培养基配方为：葡萄糖1-3%、淀粉1-3%、酵母粉0.2-1%、蛋白胨0.5-2%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、七水硫酸镁0.1-0.5%、硫酸铜0.1-0.5%、消泡剂0.01-0.05%、20000u/ml的耐高温α-淀粉酶0.001-0.007%v/v，调节pH值6.5-7.5；

其中，所述的桑黄种子培养液通过以下方法制备得到：

1）一级种子培养：将经活化摇瓶菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为0.1~2%v/v，通风比为1：0.5-1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在22~30℃下培养4~7天，得到桑黄一级种子培养液；

2）二级种子培养：将步骤1）所得的一级种子培养液接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为10~20%v/v，通风比为1：0.5-1.5vvm，罐压0.02～0.05Mpa，在22~30℃下培养3~4天，得到所述的桑黄种子培养液；

所述的液体种子培养基配方为：葡萄糖2-4%、蚕蛹粉0.1-0.5%、黄豆饼粉1-3%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、七水硫酸镁0.1-0.5%、硫酸铜0.1-0.5%、消泡剂0.01-0.05%，调节pH值6.5-7.5。

2. 一种提取桑黄胞外多糖的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

1）制备桑黄发酵液：按照权利要求1所述的方法制备桑黄发酵液；

2）分离：将步骤1）所得的桑黄发酵液经离心分离，得到桑黄上清液；

3）浓缩：将步骤2）所得的桑黄上清液进行二级低温浓缩，得到浓缩比重为1.25～1.40的浓缩浆；

4）醇沉、烘干：加入浓缩浆重量3-5倍量的95%酒精，用酒精计检测混合液酒精度为65-80%v/v，静置8-16h，将沉淀物进行真空烘干，温度50-75℃，真空度不低于0.085MPa；烘干至干燥物水分含量为3～8%g/100g，即得胞外糖。

3. 根据权利要求2所述的提取桑黄胞外多糖的方法，其特征在于所述步骤2）中所述的离心分离采用卧螺离心机进行，转速控制在2500-3500r/min。

4. 根据权利要求2所述的提取桑黄胞外多糖的方法，其特征在于所述步骤3）中所采用的二级浓缩为：一级采用双效蒸发器浓缩，将发酵液浓缩到比重为1.15-1.20，二级采用单效浓缩器浓缩，即将比重为1.15-1.20的浓缩液继续浓缩到比重为1.25～1.40的浓缩浆；浓缩过程均要求控制温度不高于75℃，真空度不低于0.085MPa。