JP2006249007A - 腫瘍細胞に対するｄｎａ合成阻害材 - Google Patents

Abstract

【課題】 メシマコブの菌糸体培養物の抗腫瘍作用の作用メカニズムを解明し、更に、少量で高い薬理効果を示すメシマコブ菌糸体由来抗腫瘍材を提供する。
【解決手段】 玄米、白米、米ぬか、小麦粉、大麦粉、フスマ、ハトムギ、大豆粉、フィシュミール、チキンミール、酵母、酒粕等の蛋白、多糖類食品素材をメシマコブの培養基材として使用し、得られたメシマコブ菌糸体培養物を舞茸の液体培養物或いは舞茸の子実体に水を加え、破砕してスラリー状にしたものを酵素素材として酵素処理し乾燥して得られた粉末を有効成分とする腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害材である。
【選択図】 図１

Description

本発明はメシマコブの菌糸体培養物を、更に舞茸の培養物で酵素処理して得られる、腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害材に関する。

従来、メシマコブ、舞茸、ヒメマツタケ、冬虫夏草、椎茸等の茸類には特殊の薬理作用が存在することが知られていた。特に、メシマコブ、ヒメマツタケ、舞茸等は副作用のない抗腫瘍作用が強調されている。しかしながら、その有効成分、薬理効果、薬理効果のメカニズムは未だ解明されていない。実際の腫瘍患者は学術的な論拠を待つことができず、これらの茸類を最後の手段として半信半疑で服用している現状である。

メシマコブ、ヒメマツタケ等の茸類は、子実体を入手するのが困難で希少価値があるため、大量に供給することができない。菌糸体の培養ならば比較的容易である上、菌糸体にも薬理効果があることが知られ、菌糸体の培養方法が種々検討されている。例えば特許文献１にはグルコース、マンノース、ガラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース、マルトース、ラクトース、ラフィノースから選ばれた１種以上を、菌糸体培養の炭素源として使用する技術が開示されている。又、特許文献２には桑の木抽出物を入れて培養する技術が開示されている。
特開２００１−１７８４４８号公報 特開２００３−２５９８５７号公報

本発明者らはこれら茸類にはある程度の抗腫瘍作用があることを近親者で現実に体験している。したがって、市販されているこれらサプリメントは健常細胞には全く無害である上、ある程度は薬理効果があると信じている。しかしながら、顕著な薬理効果を得るためには大量服用が必要であり、より安価でより効果のある茸由来の抗腫瘍物質を提供する必要を感じていた。そのためには抗腫瘍作用のメカニズムを解明し、その根拠に基づいて確信をもって服用できる抗腫瘍物質を提供する必要があった。

本発明は上記課題を解決することを目的とし、その構成は、玄米、白米、米ぬか、小麦粉、大麦粉、フスマ、ハトムギ、大豆粉、フィシュミール、チキンミール、酵母、酒粕等の蛋白、多糖類食品素材をメシマコブの培養基材として使用し、得られたメシマコブ菌糸体培養物を舞茸の液体培養物或いは舞茸の子実体に水を加え、破砕してスラリー状にしたものを酵素素材として酵素処理し乾燥して得られた粉末を有効成分とする腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害材である。

すなわち、抗腫瘍作用のメカニズム解明手段として、チミジンにβ線を放射するトリチウムをラベルしたトリチウムチミジン（以下、３Ｈチミジンとする。）を使用した。チミジンは細胞が分裂した後の合成期に細胞内に取込まれる物質であり、細胞の合成或いは分裂が停止した場合には、ＤＮＡを構成する塩基の１種であるチミジンの取込みが減少する。したがって、一定量の３Ｈチミジンの存在下で腫瘍細胞を増殖させ、腫瘍細胞のみを取出してその放射活性を測定することにより３Ｈチミジンの取込み量の減少を目安として、ＤＮＡ合成阻害作用の強弱を比較することができる。
本発明者らの実験の結果、メシマコブの菌糸体の培養液には濃度依存的にＤＮＡ合成阻害効果があることが判明した。

更に、本発明者らはメシマコブ菌糸体培養物に酵素処理を施した結果、酵素処理物は腫瘍細胞の３Ｈチミジン取込みを顕著に阻害することが判明した。酵素処理にあたっては、作用メカニズムはメシマコブとは異なると思われるが、ある程度の抗腫瘍作用を有する舞茸の菌糸体培養液或いは子実体のスラリーを用いた。その結果、単なる市販のメシマコブと異なり、メシマコブ菌糸体培養物の舞茸酵素による分解物は、メシマコブ菌糸体と舞茸との相乗効果により、市販の酵素による分解物に比して一層の効果を有することが判明した。
確実な効果を得るためには、より有効な物質をより安価に提供することが必須の条件であり、本発明者らはメシマコブ菌糸体の培養基材として、安価に入手できる素材を開発した。

本発明により、抗腫瘍作用のメカニズムが解明され、確実に効果があると信じることのできるメシマコブ菌糸体由来の、腫瘍細胞に対する選択的ＤＮＡ合成阻害材を大量供給することが可能になった。

本発明においては、メシマコブ菌糸体培養用の培地は多糖類を主成分とする食品素材である。糖源として実験的にはグルコースが用いられるが、茸自体がセルローズを始め、澱粉質や蛋白質を分解する機能を有するのであるから多糖類であればよい。例えば、澱粉、セルロース及び他の多糖類が多く含有されている素材である。具体的には玄米、白米、米ぬか、小麦粉、フスマ、大麦粉、ハトムギ、大豆粉、フィシュミール、チキンミール、澱粉粉、酵母、酒粕、オカラ、昆布粉等特に限定しないが、経口服用するものであるから、食品として認知されているものが好ましい。玄米と白米との間には、３部搗きとか７部搗き等の銘柄が存在するがこれらも包含されることは論を待たない。更に、必要に応じてグルコース、シュークロース、トレハロース、ラクトース、マルトーズ等の単糖類や二糖類を補助的に配合することは差支えない。

培養は液体培地が好ましい。濃度は原料にって異なるが３〜１０％、好ましくは４〜７％である。各種原料を配合することによって、微量元素や微量有効化合物、配糖体のアグリコン等が含有され、純粋原料を使用するよりも有効な培養物が得られる。
培養物を酵素処理することにより、メシマコブ菌糸体の細胞膜が溶解してメシマコブ細胞内容物が溶出することにより効果が増大するものと思料する。舞茸の菌糸体培養物にはセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ等が含有され、舞茸固有の抗腫瘍性物質も溶出しているため好ましい複合分解酵素源である。

必要に応じてセルラーゼ系酵素、ヘミセルラーゼ系酵素、ペクチナーゼ系酵素アミラーゼ系酵素、プロテアーゼ系酵素等の他の酵素を補助的に配合しても差支えない。
舞茸酵素の配合量は特に限定しないが、例えば、培養基質６〜７％の液体培地の場合には、メシマコブ培養物３００Ｌに対し、舞茸菌糸体液体培養物５〜１２Ｌ、好ましくは７〜１０Ｌである。
タンク培養により大量に得られたメシマコブの菌糸体培養物或いはその酵素処理物は、スプレードライ法、凍結乾燥法その他公知の乾燥法により乾燥し、粉末、顆粒、錠剤その他の経口投与が容易な材型として市場に供することができる。

Ａ．メシマコブ菌糸体培養物及びその酵素処理物の製造
(1) 原料菌株
メシマコブ（Phellinus linteus)菌株は、中国、雲南省産の子実体より純粋培養して分離した菌株・ＨＰＬＯ−０３株を用いた。舞茸は食用に栽培供給されている保存菌株、ＳＦ−７３号菌株を使用した。
(2) メシマコブ培地組成
メシマコブ液体培養培地として下記Ａ及びＢの２種類を使用した。
Ａ培地組成（ｐＨ ５．３〜６） Ｂ培地組成（ｐＨ ５．３〜６）
玄米粉 ２％ 玄米粉 １％
グルコース １％ フスマ ０．５％
酒粕 ２％ 小麦粉 ０．５％
大豆粉 ０．５％ ハトムギ粉 ０．５％
ビール酵母 ０．３％ 酒粕 １％
チキンミール ０．３％ 大豆粉 ０．５％
ビール酵母 ０．３％
チキンミール ０．３％

(3) メシマコブの培養
メシマコブ菌糸体の培養はポテトデキストロース寒天培養種菌を、５００ｍｌ三角フラスコで２４℃で７日間培養した。この培養液を５Ｌ三角フラスコに移し２４℃で５日間培養した。この培養液をジャーファーメンターに移し２４℃で５日間培養した。更に、本タンクで２４℃で２１日間培養し大量の菌糸体培養物を得た。液体培地としては本実施例においては、Ａ培地組成を用いた。この菌糸体培養物を腫瘍細胞の３Ｈチミジン取込み阻害試験に供した。

(4) 舞茸培養物の製造
別に、グルコース ３％
米糠 １％
酒粕 ２％
チキンミール ０．５％ からなり、ｐＨ５．３〜６．０の液体培地を用いて舞茸の種菌を接種し、５００ｍｌ三角フラスコで２４℃で７日間培養した。この培養液を５Ｌ三角フラスコに移し２４℃で５日間培養した。この培養液をジャーファーメンターに移し２４℃で５日間培養した。更に、本タンクで２４℃で２１日間培養し大量の菌糸体培養物を得、冷蔵保存した。

(5) メシマコブ菌糸体の舞茸酵素処理物の製造
(3)の本タンク培養で得られた菌糸体培養液３００Ｌに対し、 (4)で得られた舞茸の菌糸体培養液８Ｌを添加して６０℃で１時間反応させた。その後、１００℃で１時間加熱して得られた酵素処理物を腫瘍細胞の３Ｈチミジン取込み阻害試験に供した。

Ｂ．ＤＮＡ合成阻害試験
(1) 腫瘍細胞
理化学研究所バイオリサーチセンターより入手したＳ−１８０細胞（マウス肉腫細胞）を使用した。Ｓ−１８０細胞は ddy マウス（雄、７週齢、SPF 、日本エスエルシー社より購入）の腹腔内で継代増殖された細胞で牛胎仔血清（JRT Biosciens. A CSL Company, U.S.A.より入手）を１０％添加したＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ，ＵＫ）培養液（以下単に培養液とする）で調整して試験に用いた。

(2) 腫瘍細胞と試料の調整
腫瘍細胞は培養液にて３０万個／ｍｌの濃度に調整し、その０．１ｍｌを９６ウェル平底プレートに入れ、腫瘍細胞３万個／ウェルとした。
Ａの(3) で製造した菌糸体培養物とＡの(5) で製造した酵素処理物は、それぞれ３０００ｒｐｍの遠心操作により上清を分離し、この上清を原液として培養液にて５〜１６０倍の２ｎ希釈を行い、その０．１ｍｌを腫瘍細胞の入った各ウェルに加えた。試料の最終濃度は１０〜３２０倍であった。

(3) 腫瘍細胞の培養及び３Ｈチミジンの取込み
腫瘍細胞と希釈された各メシマコブ試料は、先ず、３７℃、二酸化炭素５％の培養器で２０時間培養した。その後各ウェルに３Ｈチミジンを３．７ｋＢｑ（１μＣｉ）添加し、更に７時間の培養を継続した。
培養後の腫瘍細胞はハベスターを用いてフィルターに吸着させ、更に溶解シンチレーターシートを吸収させて、計測機で放射活性を測定した。活性値はｃｐｍ（counts per minutes）として表現し、図１に示した。
ハベスターは、HARVESTER 96 MACH 3,TOMTEC USA を使用し、
フィルターは、Printed Filtermat A Wallac Finland を使用し、
溶解シンチレーターシートは、MeltiLex, Wallac Finland を使用し、
計測機は、TRILUX 1450 MicroBeta, Wallac Finland を使用した。

計測機で測定した活性値ｃｐｍ値は、腫瘍細胞内に取込まれた３Ｈチミジンの量に対応する。チミジンはＤＮＡの合成に不可欠な物質であるから、細胞内に取込まれた３Ｈチミジンが少ないことは実質的に細胞の増殖が抑制されていることを意味する。図１は３万個の腫瘍細胞を含有し、培養液で希釈した各試料を含有する各ウェルの希釈倍率を横軸にとり、縦軸に細胞中に取込まれた３Ｈチミジンの放射活性を表したグラフであり、メシマコブ由来試料を全く添加しないコントロールと共に示した。
なお、試験は各希釈倍率に関し５ウェル行い、平均値と標準偏差を示した。

図１より、メシマコブ菌糸体は直接腫瘍細胞と接触するのみで、チミジンの細胞内取込みを阻害する効果があるが、高濃度であることを要件とし、４０倍希釈では既にコントロールと同程度になった。一方、酵素処理したメシマコブ菌糸体は、３２０倍に希釈してもなお有効であることが判明した。

実施例１で用いたＡ培地組成のメシマコブ培地に代えて、Ｂ培地組成の培地を使用した以外は、実施例１と同様の試験を行った。その結果、マウス腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害効果は実施例１とほぼ同様であった。

放射活性のｃｐｍ値と、メシマコブ菌糸体試料の希釈倍率との関係を示すグラフである。

Claims (7)

1. メシマコブ菌糸体培養物の酵素処理物を有効成分とする腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害材。
2. 酵素処理するにあたり、舞茸の液体培養物を酵素素材として使用することを特徴とする請求項１に記載する腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害材。
3. 酵素処理するにあたり、舞茸の子実体に水を加え、破砕してスラリー状にしたものを酵素素材として使用することを特徴とする請求項１又は２に記載する腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害材。
4. 酵素処理するにあたり、セルラーゼ系酵素、ヘミセルラーゼ系酵素、ペクチナーゼ系酵素及びアミラーゼ系酵素からなる群から選ばれた少なくとも１種を補助酵素として添加することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載する腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害材。
5. メシマコブ培養基材として、主として蛋白、多糖類食品素材を使用することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載する腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害材。
6. 蛋白、多糖類食品素材が、玄米、白米、米ぬか、小麦粉、大麦粉、フスマ、ハトムギ、大豆粉、フィシュミール、チキンミール、澱粉粉、酵母、酒粕、オカラ及び昆布粉からなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項５に記載する腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害材。
7. 蛋白、多糖類食品素材からなるメシマコブ培養主基材に加えるに、グルコース、シュークロース、トレハロース及びラクトースからなる群から選ばれた少なくとも１種を補助的に配合することを特徴とする請求項５又は請求項６に記載する腫瘍細胞に対するＤＮＡ合成阻害材。