KR100199920B1 - 동충하초속균의 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자낭균강에 속하는 동충하초속균의 균사체 배양 및 자실체 형성을 위한 배양방법에 관한 것이다. 좀더 상세히 설명하면 국내에서 자생하는 동충하초속균을 분리하여 인공적으로 동충하초속균의 균사체 및 자실체를 형성시키는 방법에 관한 것이다.

Description

동충하초속균의 배양방법

제1도는 본 발명의 액체배지에서 배양된 균사체 사진.

제2도는 본 발명의 고형배지에서 배양된 균사체 사진.

제3도는 본 발명의 고형배지에서 형성된 자실체 사진.

제4도는 본 발명에 따른 동충하초속균의 배양방법을 나타내는 도식이다.

본 발명은 자낭균강에 속하는 동충하초속균의 균사체 배양 및 자실체 형성을 위한 배양방법에 관한 것이다. 좀더 상세히 설명하면 자연계에서 자생하는 동충하초속균을 분리하여 액체배지 또는 고형배지에 접종하여 배양시켜 인공적으로 동충하초속균의 균사체 및 자실체를 형성시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 기술된 동충하초속균은 분류학적으로 볼 때 자낭균강 맥각균목에 속하며 일반적 의미로서의 동충하초란 말은 중국에서 유래된 것으로 겨울에는 곤충의 몸에 살면서 양분을 흡수하여 곤충을 죽게 한 후 여름이 되면 죽은 곤충의 몸에서 버섯을 만든다는 뜻에서 붙여졌다. 동충하초는 곤충기생성균의 일종으로 인삼, 녹용과 더불어 예로부터 중국의 진귀한 3대 보약 중의 하나로 다루어져 오고 있다. 자실체를 형성하는 대표적인 동충하초속균으로는 코디셉스(Cordyceps)속, 토루비엘라(Torrubiella)속, 페시로미세스(Paecilomyces)속 등이 알려져 있다.

자연계에서 채집되는 동충하초의 종류는 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sineensis) 및 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris), 코디셉스 스카라베콜라(Cordyceps scarabaecola), 코디셉스 누탄스(Cordyceps nutans), 코디셉스 스페코세팔라(Cordyceps sphecocephala), 코디셉스 트리센트리(Cordyceps tricentri), 페시로미세스 테뉘페스(Paecilomyses tenuipes), 파이토코디셉스 닌츄키오스포라(Phytocordyceps ninchukispora)등이 있다. 일부 종들의 균사체 및 자실체는 결핵, 황달 등의 치료와 강장제로서의 효과가 인정되어 이용되고 있으며 주로 병후의 신체 조절, 보약 등에 사용되는 고가의 한방 약재로 이용되어지고 있다. 또한, 동충하초의 약리성분에는 면역 기능을 강화하는 성질이 함유되어 있어, 감기, 폐결핵, 만성 기침, 천식, 발작, 빈형, 허약, 남성의 성적 기능 장애, 고혈압 등에 효과를 나타내고 있다. 특히 약제로 사용되어 온 균사체와 자실체의 성분 중 코디세핀(Cordycepin)과 같은 유용 약리성분이 밝혀지면서(Cunningham, K.G., Hutchinson. S.A., Manson, W., and Spring, F.S. 1951. Cordycepin, a metabolic product from cultures of Cordyceps militaris(Linn) Link. Pt. 1. Isolation and characteristics. J. Chem. Soc. 51:2290-2300) 동충하초에 대한 세계적인 관심은 더욱 커지고 있다.

또한, 일본에서는 동충하초가 건강유지 및 증진, 영양 보양, 미용 등에 효과가 있는 충초정, 동충하초립이란 제품 명으로 판매되고 있으며 중국에서는 사천충초 봉왕정, 신차와 같이 드링크나 차로 판매되기도 한다.

현재 자연계에서는 750 여종이 알려져 있고 그 중 20 여종의 유용한 동충하초가 발견되고 있으나, 자연 상태에서는 채집이 상당히 어렵고, 그 수량 또한 산업적으로 이용할 수 없을 정도로 미미한 양이어서 자연보호 문제 및 유용 약리성분의 자원 확보의 곤란 등으로 의약품, 식품 개발에 어려움을 겪고 있으며, 현재는 중국에서 자연산이 고가로 수입되어 약용으로 사용되고 있는 실정이다. 아울러 자연산 동충하초는 그 기주가 대부분 곤충이기 때문에 혐오성을 가질 수 있으므로 식용으로 사용하기에는 부적당한 면이 있다.

이에 본 발명자는 최초로 국내에서 동충하초속균을 인공적으로 배양하는 방법을 개발하여 대량의 동충하초균을 공급함으로서 의약품 및 식품 개발을 더욱 원활히 할 수 있으며, 특히 자연산 동충하초는 기주가 곤충이므로 이로 인해 발생하는 혐오성을 인공 배양방법을 통하여 해소함으로써 식용으로도 사용이 가능하게 하였다.

본 발명의 목적은 동충하초속균의 균사체 및 자실체를 인공적으로 배양하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 사용되는 동충하초속균으로는 코디셉스(Cordyceps)속, 토루비엘라(Torrubiells)속, 페시로미세스(Paecilomyces)속이 있다.

본 발명에 따라 배양된 동충하초속균의 균사체와 자실체는 그 자체로 별다른 가공 없이 자연에서 채집한 동충하초속균과 같은 방법으로 이용될 수도 있고 추출물로서 이용될 수도 있다.

균사체의 배양 배지로는 액체배지 또는 고형배지를 이용할 수 있다. 자실체는 고형배지에 배양이 가능하며 그 배지는 균사체 배양시 사용된 고형배지를 사용하며 배양 조건을 달리하여 일정 기간 배양하므로써 얻어진다. 따라서 본 발명은 동충하초속균의 조직 또는 포자를 한천에 이식하여 배양한 다음 액체배지 또는 고형배지에 접종하여 균사체를 얻거나, 고형배지에 얻어진 균사체를 배양 조건을 달리하여 일정 기간 배양하므로써 자실체를 얻는 동충하초속균의 배양방법에 관한 것이다(제4도). 다만, 고형배지에의 배양은 한천 배지에서 배양된 균사체를 접종원으로 사용하는 것외에 액체배지 균사체의 성장이 빠르므로 액체배지 배양된 균사체를 고형배지의 접종원으로 사용하여 배양할 수도 있다.

본 발명을 더욱 상세히 설명하면, 본 발명이 제공하는 균사체의 배양방법은 모균주(균사체)를 액체배지에 접종하여 배양 온도 5-35, 통기량 0.5-3.0vvm, pH 4-8에서 1-15일간, 바람직하게는 배양 온도 23-25, 통기량 0.5-1.5vvm, pH 5-6에서 7-8일간 배양하는 것이다.

접종원으로 사용되는 균사체는 채집된 동충하초의 조직 또는 포자를 분리하여 한천 배지에 이식하여 5-35에서 수주간 배양하여 형성된 균사체를 이용한다. 이는 균주배양에 있어서 잘 알려진 통상적인 방법으로, 채집된 자연산 동충하초는 여러 잡균들에 오염되어 있기 때문에 한천 배지에서 순수하게 동충하초속균만을 분리하기 위해서이다.

동충하초속균의 균사체의 배양을 위해 본 발명이 제공하는 액체배지(이하 액체배지라 함)는 탄소원, 질소원, 비타민 또는 무기염류 등을 사용하여 합성 배지를 조제한다. 또한 양조 효모와 같은 산업 부산물을 이용한 배지를 사용할 수도 있다.

배지내 영양소의 탄소원의 사용량은 0.5-5%이며 탄소원으로는 주로 당을 이용하며 그 예로는 글루코오스, 프락토오스, 만노오즈, 수크로오즈, 스타취, 크실로오스(xylose), 당밀등이 있으며, 질소원은 0.1-1% 내에서 조절하여 사용할 수 있고 질소원으로는 글루탐산, 아스파라긴, 아르기닌, 알라닌, 세린등이 이용될 수 있으며, 비타민원은 0.000001-0.00001%로 조절하여 첨가할 수 있으며 비타민원으로는 티아민-HCl, 바이오틴, 니코틴산등이 이용될 수 있다. 무기염류의 사용량은 0.01-3% 내에서 조절이 가능하다.

액체배지는 또한 맥아추출물 0.2-5%, 감자추출물 5-30%, 펩톤 0.1-1%, 덱스트로오스 1-5%, 양조 효모 0.5-15%, 효모추출액 0.1-3%, 에비오즈^TM(상표명,삼일제약제) 0.1-2%, 하이포넥스^TM(상표명, 일수화학사제) 0.1-2% 및 MgSO₄ 7H₂O 0.01-1%, KH₂PO₄0.01-1%, K₂HPO₄0.01-1%, CaCl₂0.01-3%, FeCl₃0.01-2%, NaCl 0.0002-0.0003%가 각각 또는 함께 이용되어 작제될 수도 있다.

상기에서 에비오즈는 건조 효모 60%, 질산치아민 3.3% 및 소화효소류 0.8%를 포함한 것으로 삼일제약사에서 제조판매되는 것이며, 하이포넥스는 질소 5.0%, 인산 10.0%, 칼륨 5.0%, 수용성 붕소 0.05% 이상 및 수용성 몰리브덴 0.0005% 이상을 포함한 것으로 일수화학에서 제조판매되는 원예용 액체비료이다.

본 발명이 제공하는 동충하초속균의 또 다른 균사체 배양방법은 균사체를 고형배지에 접종한 다음 배양 온도 3-35, 습도 20-90%, 5-100일, 바람직하게는 배양온도 22-26습도 75-85%로 25-35일간 배양하여 균사체를 얻는 것으로 기질을 포함한 백색-오렌지색의 균사체를 얻을 수 있다. 이때 접종원으로 사용되는 균사체는 액체 배양시 접종원으로 사용하는 균사체를 이용할 수도 있고, 배양기간의 단축을 위하여 액체배지에서 배양된 균사체를 이용할 수 있다.

고형배지는 백미, 안남미(학명; Oryza sativa indica), 현미, 밀, 호밀, 보리등과 같은 곡류 및 옥수수, 감자 등과 같은 서류와 이들의 배아로부터 선택된 1종 또는 이들의 혼합물로도 배양 가능하며, 상기 곡류 및 서류 각각에 액체배지를 첨가하여 작제 가능하며(성분비가 중량 비로 곡류 및 서류; 액체배지=1:1-15), 각각의 곡류 또는 서류에 번데기나 메뚜기든 곤충 또는 그의 유충과 같은 충체를 혼합하여 배양하거나(성분비가 중량 비로 곡류 또는 서류:충체=1:0.1-2), 액체배지에 번데기나 메뚜기등 곤충, 또는 그의 유충과 같은 충체를 혼합하여 배양하거나(성분비가 중량 비로 액체배지:충체=1-15:0.1-2), 곡류 또는 서류와 액체배지의 혼합물에 번데기나 메뚜기등 곤충 또는 그의 유충과 같은 충체를 첨가하여 작제하는 것도 가능하다(성분비가 중량 비로 곡류 또는 서류:액체배지:충체=1:1-15:0.1-2). 고형배지는 상기 배지를 혼합한 후 가압 증기 멸균한다. 또한 톱밥과 쌀겨, 번데기를 비롯한 유충 및 성충, 충체를 혼합하여 고형배지를 작제하는 것도 가능하며, 또 인삼(홍삼, 백삼을 비롯한 그 가공품), 고삼, 천궁, 당귀, 작약과 같은 각종 한약제 및 약용식물의 가용 부위나 종자 등을 그대로 혼합하거나 이들의 추출액을 혼합하여 고형배지를 작제하는 것도 가능하다.

본 발명이 제공하는 자실체의 배양방법은 고형배지에서 배양된 균사체를 고형배지 자체의 수분함량을 20-90%, 습도를 20-95%, 온도를 5-35%, 광도를 50 럭스이상 조사하여 15-200일간, 바람직하게는, 고형배지 자체 수분함량 55-65%, 습도 85-95%, 온도 18-22, 광도 800-1000럭스로 65-75일간 배양하여 주황색-홍색의 자실체를 형성시킬 수 있다(제3도).

액체배지나 고형배지에서 얻어진 균사체나, 고형배지에서 얻어진 자실체는 별다른 가공 없이 천연에서 채집한 동충하초와 같이 그 자체로서 이용하거나, 열풍건조, 진공건조, 동결진공건조등의 가공 방법에 따라 이용될 수도 있고, 추출방법에 따라 다양한 추출물로서 이용될 수도 있다. 예컨대 고형배지 즉, 백미 등에서 동충하초속균의 균사체나 자실체를 배양시킨 경우 이를 그대로 한약 분말의 죽이나 스프로 만들어 이용할 수도 있고 약용 식물부위를 배지로 이용한 경우에는 그대로 한약으로 사용하거나, 추출물로 이용 가능하다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하고자 하나, 다음의 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예1][액체배지에서의 균사체 배양]

코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)와 코디셉스 누탄스(Cordyceps nutans)균을 분리하여 각각 표 1에 기재된 7종의 액체배지 20ml에 접종하여 배양온도 24-25, 통기량 1.00.5vvm, pH 50.5, 7일 정도 배양후 배양액으로부터 균사를 여과하여 80에서 2시간 건조하여 표 2의 건조 균사체를 얻었다.

[실시예 2][고형배지 및 충체에서의 균사체 배양]

고형배지는 표 3과 같이 조제하여 멸균한 다음 실시예 1과 같은 방법으로 표 1의 액체배지 3에서 배양된 균사체를 고형배지 전반에 고루 접종하여 습도 805%, 온도 24-25에서 30일간 배양하여 균사체를 얻었다(제2도).

또한 충체에서 균사체를 형성시키기 위해서는 그 배지의 조성을 표 4와 같이 하였으며 접종원으로 쓰인 균사체 및 균사체 배양 조건은 고형배지에서와 같이 배양하여 균사체를 얻었다.

배양된 균사체는 고형배지와 완전히 분리하는 것이 불가능하여 육안적으로 관찰하여 배지면적당 균사체 생육면적비로 나타내어 그 결과를 표 5 및 표 6과 같이 나타내었다.

+ :균사가 약간 형성됨 (10-30%정도)

++ :균사가 약간 많이 형성됨 (60%정도)

+++:균사가 많이 형성됨 (70%이상)

균사체는 옥수수 5g에 액체배지 50을 넣은 고형배지에서 가장 양호하게 배양되었고, 쌀 5g + 옥수수 5g + 액체배지 50로 작제된 고형배지에서 양호한 생장을 보였다. 또한 충체배지에서의 균사체 성장은 누에고치 번데기 20g와 멸균수 100ml을 첨가한 경우에 가장 양호하였다.

[실시예 3][고형배지 및 충체배지에서의 자실체 형성]

실시예 2 에서 배양시킨 균사체를 고형배지 자체 수분함량 60%, 상대습도 90%, 202의 온도 조건과 광도 900럭스 조사하여 75일간 배양하여 자실체를 형성시켰다.(제3도)

배양된 자실체는 고형배지와 완전히 분리되는 것이 불가능하여 자실체를 육안적 관찰하여 배지면적당 자실체 형성면적비로 나타내어 그 결과를 표 7 및 표 8과 같이 나타내었다.

+ :균사가 약간 형성됨 (10-30%정도)

++ :균사가 약간 많이 형성됨 (60%정도)

+++:균사가 많이 형성됨 (70%이상)

자실체는 쌀 50g + 누에고치 번데기 5g + 액체배지 75을 혼합한 고형배지에서 가장 양호하였고, 쌀 5g + 옥수수 5g + 액체배지 50을 혼합한 고형배지, 쌀 5g + 액체배지 50을 첨가한 고형배지, 감자 5g에 액체배지 50을 첨가한 고형배지 순으로 배양이 양호하였다. 충체 배지를 이용하여 자실체를 형성시켰을 때에는 누에고치 번데기 20g와 한천수 20ml을 첨가한 고형배지에서 가장 양호하였다.

[실험예][균사체 및 자실체 성분 분석]

실시예 1의 액체배지에서 배양된 균사체를 여과한 후 동결건조하고, 실시예 3의 고형배지에서 75일간 배양한 자실체를 수거한 후 동결건조시켜 식품공전에 명시된 세미마이크로-킬달법(Semimicro-Kjeldahl)을 이용한 조단백 측정법과 속스렛(Soxhlet) 추출법에 의한 조지방의 측정법, 강열건조 감량법에 의한 조회분 측정법을 이용하여 균사체와 자실체의 성분을 분석하였다. 이를 자연산 동충하초와 그 성분을 비교한 것이 표 9에 나타나있다.

* 자연산의 동충하초는 균사체와 자실체의 실제적인 분리가 어려워 균사체와 자실체를 함께 성분 분석을 하였다.

상기 표 9의 성분 비교 결과에서 나타난 것처럼 자연산 동충하초와 본 발명에 따라 배양된 균사체와 자실체의 성분은 서로 유사한 것을 알수 있다. 따라서, 본 발명은 동충하초속균을 인공적으로 배양하는데에 성공한 것을 알수 있다. 본 발명에 따르면 인공적으로 배양된 동충하초속균의 균사체 및 자실체가 제공된다.

Claims (4)

1. 동충하초속균의 균사체를 액체배지에 접종한 후 통기량은 0.5~3.0vvm로 유지하면서 배양 온도 5~35, pH 4~8에서 1~15일간 배양하는 것을 특징으로 하는 액체배지에서의 동충하초속균의 균사체 배양방법.
2. 제1항에 있어서, 액체배지가 각종 탄소원 0.5~5%, 질소원 0.1~0.5%, 비타민 0.000001~0.00001% 및 무기염류 0.01~3%을 사용하여 조제된 것을 특징으로 하는 액체배지에서의 동충하초속균의 균사체 배양방법.
3. 제1항에 있어서, 액체배지가 맥아추출물 0.2-5%, 감자추출물 5~30%, 펩톤 0.1~1%, 덱스트로오스 1~5%, 양조 효모 0.5~15%, 효모추출액 0.1~3%, 에비오즈^TM(상표명, 삼일제약제) 0.1~2%, 하이포넥스^TM(상표명, 일수화학사제) 및 무기염류 0.01~3%가 각각 또는 함께 사용되어 조제되는 것을 특징으로 하는 액체 배지에서의 동충하초속균의 균사체 배양방법.
4. 제1항에 있어서, 통기량 0.5~1.5vvm, 배양 온도 23~25, pH 5~6에서 7~8일간 배양하는 것을 특징으로 하는 액체배지에서의 동충하초속균의 균사체 배양방법.