KR100465283B1

KR100465283B1 - 동충하초 균사체 및 그 배양 방법

Info

Publication number: KR100465283B1
Application number: KR10-2002-0007100A
Authority: KR
Inventors: 김삼덕
Original assignee: 김삼덕
Priority date: 2002-02-07
Filing date: 2002-02-07
Publication date: 2005-01-13
Also published as: KR20030067209A

Abstract

본 발명은 동충하초(Cordyceps sinensis)의 인공 배양 균사체 및 그 배양 방법에 관한 것으로, 본 발명은 인공 배양 동충하초 균사체(Cordyceps sinenseJEO-7, KFCC 11292)를 제공하며, 또한 천연 동충하초의 균사체를 밀겨 또는 콩가루 배지에 접종한 후, 7일 이상 23 내지 26℃의 온도로 배양하는 단계를 포함한 배양 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 인공 배양 동충하초는 천연 동충하초보다 그 성분 및 미량원소 함량이 우월하며, 빠른 기간내에 상기 동충하초를 대량으로 생산하는 것이 가능하다.

Description

동충하초 균사체 및 그 배양 방법{CORDYCEPS SINENSIS MYCELIUM AND METHOD OF CULTURE THEREOF}

본 발명은 동충하초(Cordyceps sinensis)의 인공배양 균사체 및 그 배양 방법에 관한 것이다.

현재 세계적으로 300여종의 동충하초 균이 있으나, 자연계에서 채집되는 동충하초의 종류는 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis), 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris), 코디셉스 스카라베콜라(Cordyceps scarabaecola), 코디셉스 뉴탄스(Cordyceps nutans), 페시로마이세스 테뉘페스(Paecilomyces tenuipes), 파이토코디셉스 닌츄키오스포라(Phytocordyceps ninchukispora)등의 10여종에 불과하다. 이것들은 각종 유충과 번데기에 접종하여 자실체를 얻는 실험을 걸쳐 일부 소량의 자실체를 얻었으나 완전한 실험에선 성공하지 못하였다. 이 중 몇몇 균종들은 가잠 혹은 야생잠의 유충이나 번데기에 감염시켜 자실체 생산엔 성공했지만 약용이나 식품의 원료로 쓰는데 제한을 받거나 그 효과가 미미할 뿐 아니라 가격 또한 고가로 유통되고 있다. 동충하초의 원료가 그리 풍족하지 못한 상태에서 많은 수요를 만족시키기 위해 현재 한국, 중국, 일본, 유럽 등 세계적으로 인공 생산에 관한 연구가 계속되고 있다.

동충하초의 효능은 일찍부터 널리 알려져 있는 사실이다. 일례로서, 1801년에서부터 일본의 본초서 기록에 전해지고 있는 것에 따르면 폐병, 늑막염, 신장병 치료제로 이용되었다고 한다. 또한 일본과 중국 과학자들이 동충하초 연구로 최근 발표한 자료에 의하면 동충하초는 면역 기능을 증강하는 성분이 함유되어 있으며, 동충하초 추출물을 인체에 투여한 결과 세포면역을 촉진시켜 면역력이 높아져 각종 종양, 바이러스 감염에 대한 저항력을 높이는 등 효과가 있는 것으로 나타났다. 현재 중국 의약계에선 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis)로 노약한 환자의 회복을 촉진시키고, 불치병 환자들의 임종을 늦추거나 노환에서 오는 만성기침, 천식 폐결핵, 남성의 성기능 장애, 고혈압, 당뇨병 등의 치료에 이용되고 있다.

코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis)의 주요 성분 중 하나인 만니톨(mannitol)은 뇌혈전, 뇌일혈, 신장쇠약의 예방과 치료에 사용되고, 코디세핀(Cordycepin)은 백혈병(미국 OXIGENE. 1991, Eiichi N. Kodma., 2000), 항암작용(Donald., 1960), HIV 바이러스 억제 효과(Werner., 1990)등 항세균, 항진균 작용을 하는 항생물질로 알려져 있다. 그 밖의 노화방지 물질로 알려진 SOD와 기타 유용한 물질들이 함유되어 검출된다고 학술논문을 통해 발표하고 있다.

스위스의 임상실험에서 마약중독자에게 2주일 투여하여 마약의 심각한 부작용을 제거하고 중독현상이 중지되어 정상인으로 복귀시키는 데 성공했다. 그 밖의 각종 노동 및 운동에 따른 질환으로 일어나는 피로를 빨리 풀어주고, 정신적 노동을 하는 사람들과 갱년기의 스트레스를 빨리 해소하는 효과가 있으므로 이용 분야가 널리 알려져 있는 것이 특징이다.

상기와 같은 많은 약리 효과를 가지는 동충하초는 천연 의약품의 원료로서 많은 기대를 모으고 있으나, 다른 버섯과 약용식물에 비해 크기가 작고 분포 밀도가 작아 야외산속에서 자연적으로 채취가 곤란하고, 많은 집중 채집으로 실험용 공급에도 천연 동충하초의 양이 충족되지 못하여 고가에 거래되고 있는 실정이며, 또한 점점 구입이 힘들어 지고 있다.

상기와 같은 문제점으로 수요를 만족시킬 수 있도록 하는 동충하초의 자실체 생산 및 균사체 생산에 관한 연구가 현재에도 계속 진행되고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 간단하면서도 대량 생산이 가능한 동충하초 균사체 및 그 인공 배양 방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명자는 천연 동충하초와 유사한 성분을 가진 혹은 더 우수한 동충하초를 인공 배양 방법으로 생산하려는 노력을 기울여, 밀겨 또는 콩가루 배지를 이용하여 대량의 동충하체를 얻을 수 있는 방법에 대한 실험을 거듭한 결과, 생산량도 높고 유효성분이 자연적인 동충하초보다 더 우수한 본 발명에 따른 동충하초를 얻을 수 있었다.

본 발명에 따른 동충하초 균사체를 JEO-7(Cordyceps sinenseJEO-7)로 명명하여 한국미생물보존센터에 2002년 1월 3일 기탁하였으며, 수탁번호 KFCC-11292를 부여 받았다.

본 발명은 상기 동충하초 균사체 JEO-7 (KFCC-11292)을 제공한다.

본 발명에 따른 동충하초의 배양 방법은 밀겨 또는 콩가루 배지에 동충하초 포자를 접종한 후, 접종된 동충하초를 7일 이상 배양하는 단계로 이루어져 있다. 이 때 배양 조건은 24 내지 26℃에서 진탕배양기에서 행하는 것이 바람직하며, 상기 진탕 배양기의 진동 횟수는 1분당 100 내지 120회로 하는 것이 바람직하다.

하기 실시예를 통하여 본 발명에 따른 동충하초를 배양하는 방법을 좀 더 상세히 설명한다.

(실시예 1) 동충하초 JEO-7의 인공 배양을 위한 배지의 제조

(1) 밀겨 25g에 물을 500ml 섞어 20분간 가열한 후 여과시켰다. 포도당 8g, 비프 추출물(Beef extract) 2g, KHPO₄0.4g, MgSO₄0.12g 을 섞은 후 상기 여과액과 혼합한 후, 400ml이 될 때 까지 증류수를 첨가하였다. 혼합 용액을 5분 동안 가열하고, 128℃, 15Lb, 15분 동안 멸균하여 "밀겨 배지"를 제조하였다.

(2) 밀겨 25g 대신 콩가루 10g을 사용한 것을 제외하고는 (1)과 동일한 방법에 의하여 "콩가루 배지"를 제조하였다.

이하 본 발명에서의 실시예 및 실험예에서는 "밀겨 배지"를 사용한 것만을 기재하였으나, 콩가루 배지를 사용한 경우도 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

또한 상기 배지의 제조방법에서, 아가 파우더(agar powder)를 더 포함시켜 고체 배지를 만들어 사용할 수도 있으며, 고체 배지에서 배양된 균사체를 액체 배지로 옮겨 배양하여 대량 생산에 사용할수도 있다.

(실시예 2) 동충하초 JEO-7의 배양

신선한 천연 동충하초의 핵에서 포자를 추출하여 상기 실시예 1에서 제조한 배지에 접종하여 23 내지 26℃의 온도를 유지하면서, 1분당 100 내지 120회의 진동 횟수로 진탕배양 하였다. 5일 내지 7일간 배양한 결과, 많은 수량의 균사체와 포자를 얻을 수 있었다.

또한 본 발명에 따른 동충하초의 제조방법의 온도범위, 배지의 조성 및 배양시간의 적절한 범위는 하기와 같은 실험예에 의하여 결정되었다.

하기 실험예의 표에서 배양종점에 이르기까지 군락의 형성하는 정도를 -, +, ++, +++, ++++ 와 같이 표시하였다. 본 발명에 따른 동충하체는 액체배양기 24℃ 내지 26℃에서 90 내지 140회/분의 진동으로 밀겨 배지에서 발효 배양하는 경우 구형군락을 형성하는 특징을 가지고 있다. 군락은 구형으로 백색이며 크고 작은 것은 변하지 않고 성숙되면 4 내지 6mm 직경이었으며, 배양 시작시로부터 배양종점에 이르기까지 군락의 형성하는 정도를 -, +, ++, +++, ++++ 와 같이 표시한 것이다.배양 종점에 이르렀다는 표시인 ++++ 는 군락간에 모두 서로 접촉되어 육안으로 그 정도를 판정하기 쉬우며 군락형성 또는 배양종점의 점조성과 정비례를 형성하고 있으므로 군락의 형성으로 발효 배양종점의 판정을 지표로 한다. 하지만 배양종점 이후 계속 배양한다면 군락은 더 이상 형성되지 않고 자연 소강하여 유효성분의 함량이 내려가게 된다. 그러므로 배양종점을 판단하여 제때에 수확이 이루어져야 한다. 본 연구에서 군락형성 정도를 관찰하여 배양 여부를 판정하고 수확의 시간을 결정하는 표준으로 선택하였다.

(실험예 1) 적절한 배지 재료 선정을 위한 실험

밀겨 3%, 5%, 7%, 콩가루 2%, 3%, 4%를 9일간 배양하여 균사체 형성과 점성도를 관찰하여 배양종점을 판정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

배양시간배양기	3일	5일	7일	9일
밀겨	3%	-	+	++	+++
	5%	+	+++	++++	++++
	7%	+	++	+++	+++
콩가루	2%	+	+++	++++	++++
	3%	+	+	++	+++
	4%	+	+	++	++

상기 실험 결과, 밀겨 5% 와 콩가루 2%가 7일만에 배양종점에 도달하였고, 밀겨 3%, 4%는 9일에야 군락이 [++] 나 [+++] 으로 되었다. 위 실험에서 두 가지 재료를 비교 실험한 결과 밀겨 5% 및 콩가루 2%가 가장 적절한 배양 배지 조성으로 결정되었다. 본 발명의 이하 실험예에서는 고체배지와 액체배지로서 모두 밀겨 5%를 선정하였다.

(실험 2) 배양온도 선정을 위한 실험

배양재료는 모두 밀겨로 선정하여, 적절한 온도를 찾기 위하여 18℃ 내지 32℃의 온도범위에서 3일 내지 9일동안 배양시켰다.

배양기간배양온도	3일	5일	7일	9일
18℃	-	-	+	++
20℃	-	+	++	+++
24℃	++	+++	++++	++++
26℃	+	++	++++	++++
28℃	-	+	++	+++
30℃	-	-	+	++
32℃	-	-	+	++

상기와 같은 실험 결과, 배양온도 24℃와 26℃일 때 7일만에 배양종점에 도달하였고, 균사체 형성에도 규칙적이었으나, 그 밖의 온도에서는 반응속도가 길어짐을 알 수 있다. 따라서, 적절한 배양온도는 24℃ 내지 26℃임을 알 수 있었다.

(실시예 3) 배양시 적절한 진동횟수의 선정을 위한 실험

가장 적절한 진동횟수를 찾기 위하여 분당 진동수를 60회부터 180회까지 달리하여 9일 동안 배양시키는 실험을 실시하였으며, 실험결과는 하기 표 3에 나타내었다.

배양기간진동회수	3일	5일	7일	9일
60회/분	-	+	++	++
80회/분	+	++	+++	++++
100회/분	+	++	++++	++++
120회/분	+	+++	++++	++++
140회/분	+	+++	+++	++++
160회/분	-	+	++	+++
180회/분	-	+	++	+++

상기 실험 결과, 분당 100회 및 120회의 진동 회수에서 7일만에 배양종점에 도달하였으나, 그 외 분당 60회, 80회, 140회, 160회 및 180회의 경우는 9일에야 배양종점에 이르게 되었다. 배양시 적정한 진동 회수는 1분당 100회 내지 120회임을 알게 되었다.

(실험예 4) 배양기에 적절한 균종의 접종량의 선정을 위한 실험

고체배지에서 배양된 균사체를 액체배지에 접종하여 액체배지에 대한 균사체의 적정한 접종량을 선정하는 실험을 행하였다. 접종량을 1/15 %부터 1/8 %까지 달리하면서 9일 동안 배양시켰다. 실험 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

배양시간접종량	3일	5일	7일	9일
1/15 %	-	-	+	++
1/12 %	-	+	++	+++
1/10 %	++	+++	++++	++++
1/8 %	+	++	+++	++++

상기 실험 결과, 액체 배지의 1/10 %의 고체 배지를 접종한 것은 7일에 배양종점에 되었으나, 그 외 1/15 %, 1/12 %, 1/8 %의 경우는 반응속도가 상대적으로 길어짐을 알 수 있었다. 고체 배지에서 균사체를 배양한 후, 액체 배지에 접종하는 경우 적절한 양은 0.1 %임을 알 수 있었다.

(건조 균사체의 생산량)

상기 실험 1 내지 실험 4에서 선정된 적절한 배양조건에서 배양된 건조 균사체의 생산량을 하기 표 5에 나타내었다.

실험차수	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
건조중량	0.8%	1.5%	1.0%	2.0%	1.6%	2.8%	0.9%	3.0%	2.2%	1.5%	1.1%	1.8%

상기 표에서 %는 (중량/체적 ×100) 값을 나타낸다.

모두 12차에 걸쳐 생산을 하였는데, 1차 실험과 7차 실험을 제외한 10번의 실험에서는 모두 1% 이상이 생산되었으며, 최고로는 3.0%까지 높은 생산량을 얻을 수 있었다. 상기 실험 조건이 아닌 실험을 행한 경우의 생산량은 1% 미만이었다.

(생물학적 특성)

본 발명에 따른 동충하초 JEO-7의 균종의 생물학적 특성을 관찰하기 위하여 신선한 천연 동충하초의 포자를 고체 배지에 접종 배양하여 균락 부분을 연속 5대 선종한 후 계대 배양하여 얻었다. 상기 고체 배지는 상기 실시예 1에서의 밀겨 배지에 아가 파우더 8g을 더 포함하도록 하여 제조하였으며, 배지에 균종을 접종한후 23 내지 26℃에서 5일 내지 7일간 배양시켰다. 이렇게 얻은 동충하초의 생물학적 활성은 온정하고 호기성이며, 분생 포자경은 균사로부터 생기고 곧고 무색이며 가지가 있다. 산포세포는 병 모양이며 무색이며 단일이다. 밑 부분은 커지고 경부는 가늘고 휘어졌으며 5.4~17.3㎛ ×2.6~3.7㎛이다. 분생 포자는 구형이고 휘어졌으며, 단생 무색이고 평활하며 크기는 1.2~3.2㎛이다. 균사상은 계란형으로 성질은 온정하다. 액체발효 배지에서 배양할 경우 다량의 균사체와 포자를 얻을 수 있다.

(동충하초 JEO-7 균사체의 함량)

상기 실시예 2에 의하여 배양된 본 발명에 따른 JEO-7 균사체의 건조물과, 자연 생산된 동충하초의 아미노산 함량을 비교하여 하기 표 6에 나타내었다. 표에서 인공 동충하초 균사체란 본 발명에 따른 동충하초 JEO-7를 말하며, 천연 동충하초란 자연 생산된 동충하초를 의미한다.

아미노산 종류	천연동충하초(%)	인공동충하초 균사체(%)
아스파르트 산	1.646	0.449
세린	1.080	1.424
글루타민산	2.360	4.172
글리신	0.954	1.886
히스티딘	0.791	0.680
트레오닌	0.911	1.715
아르기닌	1.426	0.479
프롤린	1.029	1.465
시스틴	0.280	5.529
티로신	0.853	0.384
발린	0.719	1.634
메티오닌	0.285	0.543
리신	0.913	2.114
류신	0.937	2.821
페닐알라닌	1.140	2.698
합계	15.324	27.993

인공동충하초 균사체와 천연동충하초 균사체의 미량원소 함량을 하기 표 7에 나타내었다. g당 미량원소의 함량을 ㎍으로 표시하였다.

원소종류	천연동충하초(㎍/g)	인공동충하초 균사체(㎍/g)
Na	3.14	18.25
K	2.82	5.20
Ca	3.20	0.82
Mg	13.52	90.88
Mn	0.20	0.32
Fe	4.61	1.20
Cu	0.18	0.40
Zn	0.82	4.72
Co	-1.03	0.05
V	-	0.02
Ni	0.05	0.08
Cr	0.02	0.03
Cd	-	-
Al	1.43	1.12
B	0.48	0.35
Pb	0.01	0.01
Si	0.02	0.09
Mo	0.01	0.05
Po	58.82	34.01
Se	0.02	0.05

JEO-7 인공 배양 균사체의 유용성분을 분석한 결과, 단백질 함량과 다당류의 함량은 다음과 같았다. 코디셉트 산(만니톨) 48.65%, 락토오즈 2.13%, 글루코오즈 5.4%, 자일로오즈 2.74%이고, 비율의 g분자량은 1 : 0.47 : 0.01 : 0.057 이었다.

생산된 건조 분말의 유효성분을 측정하여 천연동충하초 유효 성분과 비교한 결과, 함량이 떨어지지 않고 우월하다는 것을 알 수 있었다. 본 발명에 따른 배양 방법에 의해 재배된 시넨시스 동충하초(Cordyceps sinens)는 값싸고 구하기 쉬운 원료를 이용해 배지를 만들어 필수아미노산을 생성하는 기능성 식품을 만든 동시에 많은 함량의 코디세핀(Cordycepin), 폴리사카라이드(Polisaccaride), 만니톨(mannitol)등이 포함되어 있어 의약품의 원료를 단기간에 대량 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 동충하초 인공 균사체 JEO-7을 본 발명에 따른 배양 방법에 의하여 배양한 균사체 분말을 주사제로 정제하여 마우스 복강내에 주입하였다. 그 Ld 50은 27.1g/Rg 이다. 배타독성과 생육력엔 영향이 없었으며, 기타 실험에서도 영향이 없었다.

본 발명에 따른 제조방법에 의하면, 동충하초 균사체 JEO-7를 빠른 기간에 대량 생산이 가능하다. 또한 본 발명에 따른 동충하초 균사체 JEO-7은 본 발명에따른 배양 배지, 배양 온도, 진동횟수, 접종량으로 배양할 경우 대량 생산이 가능할 뿐 아니라, 본 발명에 따라 인공 배양하는 경우 아미노산, 미량원소 등의 성분 함량이 천연 동충하초 분말보다 더 우수하며, 또한 약효가 좋고 독성작용이 낮은 우수한 동충하초를 얻을 수 있다.

Claims

인공 배양 동충하초 균사체(Cordyceps sinensJEO-7, KFCC-11292).
제1항에 따른 인공 배양 동충하초 균사체(Cordyceps sinensJEO-7, KFCC-11292)의 배양 방법에 있어서,

천연 동충하초의 균사체를 밀겨 또는 콩가루 배지에 접종한 후,

24℃ 내지 26℃의 온도에서, 7일 이상, 1분당 100회 내지 120회의 진동이 유지되도록 진탕 배양하는 것을 특징으로 하는

동충하초 균사체(Cordyceps sinensJEO-7, KFCC-11292)의 배양 방법.
제2 항에 있어서,

상기 배지는, 밀겨 5% 또는 콩가루 2%의 액체배지인 것을 특징으로 하는

동충하초 균사체(Cordyceps sinensJEO-7, KFCC-11292)의 배양 방법.
제2 항에 있어서,

상기 배지는, 밀겨 5% 또는 콩가루 2%의 조성을 가지며, 아가 파우더를 포함하는 고체 배지인 것을 특징으로 하는

동충하초 균사체(Cordyceps sinensJEO-7, KFCC-11292)의 배양 방법.
제2 항에 있어서,

천연 동충하초의 균사체의 액체 배지 접종시 접종량은 1/10 %인 것을 특징으로 하는

동충하초 균사체(Cordyceps sinensJEO-7, KFCC-11292)의 배양 방법.