KR100852287B1

KR100852287B1 - 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의제조 방법

Info

Publication number: KR100852287B1
Application number: KR1020070039291A
Authority: KR
Inventors: 남승우; 전만기; 여익현
Original assignee: (주)풀무원홀딩스
Priority date: 2007-04-23
Filing date: 2007-04-23
Publication date: 2008-08-18

Abstract

본 발명은, β-glucosidase의 활성이 우수한 담자균류인 버섯을 이용하여 두부 순물 속에 포함된 배당체 형태의 이소플라본을 aglycone 형태로 변환하는 단계; 및 상기 두부 순물 속에서 배양된 버섯 배양 생성물이 첨가된 연두부를 생성하는 단계를 포함하는 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 두부제조 시 발생하는 폐기물 및 수질오염 부하물질로서의 두부 순물의 천연 생리활성물질인 이소플라본의 효과적인 응용 및 이의 기능성 소재화 연구의 일환으로, 두부 제품을 섭취하는 사람들의 이소플라본 섭취를 증가시키고, 이소플라본 흡수율을 높이기 위한 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법을 제공하는 효과가 있다.

동충화초, 순물, 연두부

Description

두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법{Making soybean curd method added a mushroom cultivate product using water strained off coagulating bean curd}

도 1은 본 발명의 각 버섯별 전 배양에 사용한 배지조성을 나타낸 도면.

도 2는 본 발명의 중심합성 계획법에 따른 독립변수 값과 처리 조건을 나타낸 도면.

도 3은 본 발명의 이소플라본 함량 분석을 위한 조건을 나타낸 도면.

도 4는 본 발명의 화상분석 결과 및 절차를 나타낸 도면.

도 5는 본 발명의 rheometer를 이용한 Texture 측정 조건을 나타낸 도면.

도 6은 본 발명의 연두부의 typical texture 프로파일 분석 커브를 나타낸 도면.

도 7 내지 도 13은 본 발명의 각 균주의 기본배지와 순물 분말시료를 1, 3 및 5% 농도로 배지를 조제하고, 6종의 버섯 균주를 6~14일간 배양한 결과를 나타낸 도면.

도 14는 본 발명의 각 버섯의 순물배지에서의 배양 종료 후 균사형태를 찍은 사진.

도 15는 본 발명의 순물배지의 농도를 1,3,5,7 및 9% 농도로 조제하여 동충 하초를 배양한 결과를 나타낸 도면.

도 16 내지 도 18은 본 발명의 1~5% 농도의 순물배지에서 생육한 동충하초의 균사형태를 촬영하고, 면적분포, 원형도, fractal 차원 및 pellet core의 러프니스를 분석, 산출한 결과를 나타낸 도면.

도 19는 본 발명의 동충하초를 기본배지, 순물배지 및 기본+순물배지에서 액체배양하고 균사생육과 용매 침전물의 정도를 비교 실험한 결과를 나타낸 도면.

도 20은 진탕속도가 균체 생육에 미치는 영향을 나타낸 도면.

도 21 내지 도 26은 본 발명의 균사생육의 최적조건을 검토하기 위하여 pH, 접종비 및 배지액량을 독립변수로 하고, 균사체 생육량을 종속변수로 하여 반응표면분석법으로 분석한 결과를 나타낸 도면.

도 27 및 도 28은 본 발명의 분말 및 액상시료로 배지를 조제하여 2L-jar fermentor에서 균사체를 비교 배양한 결과를 나타낸 도면.

도 29 내지 도 32는 본 발명의 5L-jar에서 교반속도를 200-600rpm으로 조절하여 균사체를 배양한 결과를 나타낸 도면.

도 33은 본 발명의 교반속도를 300rpm으로 고정한 후 통기속도의 변화에 따른 균사생육 및 용매침전물의 변화를 나타낸 도면.

도 34는 본 발명의 동결건조한 두부순물과 동충하초의 기본배지 및 순물배지 버섯 배양액의 일반성분 분석을 시행한 결과를 나타낸 도면.

도 35는 본 발명의 순물에서 배양된 동충하초에 내포된 cordycepin의 함량 분석 결과를 나타낸 도면.

도 36은 본 발명의 두부순물 및 순물배지에 배양한 버섯 배양액에 존재하는 이소플라본 중 daidzein과 genistein의 함량을 분석한 결과를 나타낸 도면.

도 37은 본 발명의 동충하초 버섯 배양액의 첨가량을 달리하여 제조한 연두부의 관능검사를 실시한 결과를 나타낸 도면.

도 38은 본 발명의 관능검사 항목간 상관관계분석 결과를 나타낸 도면.

도 39는 본 발명의 두부 제조 시 순물, 기본배지 및 순물배지 버섯 배양액을 0~5% 범위의 농도로 첨가하고 20℃에서 두부의 저장 중 발생되는 총균수의 변화를 측정한 결과를 나타낸 도면.

도 40은 본 발명의 두부 저장 중 pH의 변화를 측정한 결과를 나타낸 도면.

도 41 내지 도 45는 본 발명의 제조된 연두부의 저장 중 연두부의 견고성, 응집성, 탄력성, 점착성 및 부서짐성을 측정한 결과를 나타낸 도면.

도 46은 본 발명의 두부순물과 일반배지 동충하초 배양액 및 두부순물 동충하초 배양액을 농도별로 첨가하여 제조한 연두부의 색도의 변화를 나타낸 도면.

도 47은 본 발명의 두부순물 및 일반배지 동충하초 배양액과 두부순물을 농도별로 첨가하여 제조한 연두부를 20℃에 보관하면서 색도의 변화를 측정한 결과를 나타낸 도면.

본 발명은 두부제조 시 발생하는 폐기물 및 수질오염 부하물질로서의 두부 순물의 천연 생리활성물질인 이소플라본(isoflavone)의 효과적인 응용 및 이의 기능성 소재화 연구의 일환으로, 두부 제품을 섭취하는 사람들의 이소플라본 섭취를 증가시키고, 이소플라본 흡수율을 높이기 위하여 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법에 관한 것이다.

대두(Glycine max Merr)는 전형적인 콩과 식물의 종실로, 원산지인 중국 등 아시아 지역에서 기원전 2500년경부터 재배되었다. 현재는 미국을 비롯하여 브라질, 아르헨티나 등지에서 많이 재배되고 있으나, 세계 대두 총 생산량의 약 1/2이상은 미국에서 생산되고 있다. 이들 대두는 우수한 영양원으로서 한국을 비롯한 중국, 일본, 동남아시아 등 여러 나라에서 주로 섭취, 이용되었으며, 이들의 가공식품으로서 두유, 두부 및 간장, 된장, 납두, 템페 등, 비 발효 또는 발효식품의 각종 형태가 이용되어 왔다.

이 중, 대표적인 대두 가공식품인 두부는 80~85%의 높은 수분 함량과 단백질 8.5%, 지방질 5.5%, 당질 1.5%를 함유하는 고단백 식품이다. 지방질과 당질은 단백질과 결합되어 있거나, 응고된 단백질 조직내의 수분과 함께 존재하므로 소화율이 대두식품 중 가장 뛰어 날뿐 아니라 단백질도 풍부하여 오래전부터 우리나라, 중국, 중국, 일본 등지에서 매우 훌륭한 단백질의 급원이 되어 왔다. 특히, 최근 식품과 건강에 관심이 높아지면서 세계적인 건강식품으로 인정되었고, 이에 따라 그 소비는 날로 증가되고 있는 실정이다.

이러한 두부는 일반적으로 침지시킨 콩에 10배 내외의 물을 첨가하여 마쇄한 후 불용성 성분인 비지를 제거하고 응고제에 의해 단백질 응고시켜 제조하게 된다. 이 때, 응고되지 않은 수용성 물질이 함유된 물은 순물(soybean curd whey)이라 하는데, 이들 순물의 양은 첨가량의 약 50%나 된다. 특히, 대두 단백질의 대부분을 차지하는 glycinin(11S)과 β-conglycine(7S)은 두부 제조 시에 수화되어 3차원적 망상구조를 형성하고, 다른 대부분 단백질과 함께 두부로 이동하지만 저분자 단백질과 펩타이드, 아미노산은 두부 순물에 남게 된다. 따라서 두부 제조 시 부산물로 생산되는 이들 두부 순물에는 이소플라본, oligosaccharide, phytate, saponin, 펩타이드 등 각종 기능성 성분이 풍부하게 함유되어 있는 것이다.

순물에 녹아있는 가용성 물질 중, 대표적인 기능성을 보이는 물질로는 이소플라본과 대두 올리고당을 들 수 있다. 이소플라본은 식물체에 들어있는 색소(anthocyanin)의 한 종류인 페놀(phenol)계 화합물의 배당체로써 암, 골다공증, 만성질환의 예방 및 항산화 효과 등이 있는 것으로 밝혀져 주목받고 있다. 특히, daidzein과 genistein 등의 aglycone 형태는 estrogen hormone과 유사한 구조를 갖고 있으며, 유방 암,전립선암, 대장암등의 예방과 순환기 질환에 큰 효과가 있다고 보고되고 있다.

또, 순물 고형분의 30~40%나 함유되어 있는 올리고당인 stachyose와 raffinose는 대장내 Bifidobacteria의 생육을 촉진시키며, 장의 건강에 유익함이 밝혀진 바가 있다. 특히, 대두 올리고당은 "probiotic material"로서 bifidobacterium을 선택적으로 증식시키고 인체의 효소에 의해 분해되지 않는 난소화성 특성을 가지며 raffinose와 stachyose는 저 칼로리의 당류으로서 장내에 유익 한 균의 활성화, 변비 및 설사의 예방, 충치예방 효과 등을 갖는 것으로 알려져 있다.

현재 순물에서 회수된 이소플라본과 올리고당을 식품의 기능성 소재로 활용할 목적으로 한외여과나 나노여과 등 막분리하고, 이를 분무건조, 동결건조, 진공건조하여 소재로 일부 사용하고 있다. 그러나 건조방법에 따라 성분변화나 향미의 손실, 건조비용 등에서 차이가 발생하고 있어 아직 효과적인 이용방법으로는 매우 제한되어 있는 실정이다.

특히, 국내 대부분의 두부 공장에서 유출되는 순물은 처리과정 중 발생하는 높은 비용 부담 때문에 작은 공장일수록 별 처리 없이 폐수로 방출되고 있는 실정인데, 두부 순물의 BOD와 COD는 각각 20,821ppm 및 19,258ppm이나 된다. 이는 법적 규제치인 60~80 및 70~90ppm을 훨씬 넘는 수치이다. 또한 순물에는 콩에 함유된 수용성 물질이 일부 용해되어 있고 또한 첨가된 응고제의 상당량이 들어 있기 때문에 하천의 오염원으로 작용하고 있으며, 방출되는 순물의 양도 상당할 것으로 추정되어 진다. 따라서 순물의 효과적인 이용연구의 필요성은 유효성분의 기능성 소재화 등 고도 활용은 물론, 폐자원의 재활용과 환경보존 측면에서도 매우 중요하다고 할 수 있다.

한편, 이들 대두 이소플라본은 배당체인 genistin, daidzin, glycitin과 aglycone인 genistein, daidzein, glycitein으로 존재하며 품종 및 환경에 따라 다양하게 나타난다. 대두의 이소플라본은 주로 6”-O-malonyl-β-glucosidase 형태로 존재하며, aglycone은 약 2% 이하의 함량으로 존재한다고 보고되었는데, 음식물을 통해 섭취된 배당체 이소플라본은 체내 장관에 존재하는 미생물 유래 β-glucosidase에 의해 aglycone으로 전환되어 흡수된다. 반면에 aglycone은 장관에서 바로 흡수되므로 이소플라본의 흡수율은 배당체 형태보다는 aglycone 형태가 더 높은 것으로 보고되었다. 따라서 이소플라본은 소장 점막으로 흡수되지만 배당체보다는 aglycone 형태의 이소플라본이 더 많이 그리고 빠르게 흡수되는 것이다. 실제, 만성질환의 예방과 치료에는 전체 이소플라본 중 약 10% 정도의 비율로 존재하는 aglycone type인 genistein, daidzein이 주로 관여하는 것으로 보고되고 있다.

지금까지 daidzein은 골다공증 예방과 혈중 알콜 농도 상승을 억제하는 효과, 그리고 genistein은 여성의 성호르몬인 estrogen과 관련된 암 즉, 유방암, 자궁암, 전립선암 등의 암세포 증식을 억제하는데, 주로 암세포의 증식 신호전달에 중요한 역할을 하는 tyrosine protein kinase의 작용을 방해하고 estrogen 수용체에 약하게 결합한다고 보고되고 있다. 또한 갱년기 이후 여성에서는 genistein이 약한 estrogen 활성을 나타내므로 골다공증 예방의 한 방법으로도 제안되고 있다.

따라서 대두 이소플라본의 배당체와 aglycone은 생체 이용율이 서로 다름을 알 수 있는데, 대두 이용 식품의 제조공정 중 발효공정이 없는 경우는 배당체 형태의 이소플라본이 주를 이룬다. 반면, 장기간의 발효공정에 의해 제조된 두부 가공품의 경우, aglycone 형태가 상당히 증가하는 것으로 보고되고 있다. 이는 미생물 유래 β-glucosidase의 활성에 기인하는 것으로 알려져 있으나, 단기간의 발효기간에 의해 제조되는 청국장이나 나토(Natto)의 경우 aglycone의 증가가 크지 않는 것으로 보고되었다.

현재, 이러한 daidzin이나 genistin과 같은 배당체는 β-glucosidase 처리나 산처리 및 미생물 발효에 의해서도 당이 분해된 daidzein이나 genistein과 같은 aglycone 형태로 전환할 수 있음이 보고되고 있다.

이와 같이, 이소플라본은 배당체 보다 aglycone 형태가 흡수율이 높고, 생리활성도 강하므로 aglycone 형태로의 전환 및 이들의 배당체 함량 증가는 생체 내 이용성 측면에서 매우 중요하다. 이와 같이, 배당체가 aglycone 형태로 전환되었을 때 이소플라본의 생체 이용성이 증가되기 때문에, 이소플라본의 품질 비교는 총 이소플라본 보다는 이 중에 함유되어 있는 aglycone 형태의 이소플라본의 조성 농도로 나타내고 있다.

따라서 이소플라본의 함량을 낮추고 aglycone 형태의 함유비율을 높이는 연구는 검토의 필요성이 매우 높고 또 충분한 타당성을 갖는다고 볼 수 있는데, 최근에는 이러한 방법으로 미생물 발효나 가열, 효소반응 등 각종의 물리화학적 처리가 이용되고 있다.

하지만 아직도 보다 경제적이고 효율적인 방법은 매우 제한되어 있으며, 특히, 미생물 발효의 경우는 적정 균주의 선정이라는 문제점을 해결해야 한다. 담자균류인 버섯의 경우 β-glucosidase의 활성이 우수하여 이러한 배당체 분해에 효과적일 것으로 예측되며, 또 자체 균주의 각종 생리기능성을 기대할 수 있어 검토의 필요성이 매우 높다. 그러나, 아직 이들 연구는 거의 검토된 바 없었다.

버섯은 호기성 균류의 균사가 생장한 자실체로 주로 담자균류이며, 일부 자낭균류를 포함한다. 예로부터 식용이나 한방 및 민간 생약의 우수한 상품약으로 사 용되어 왔으며, 특히 최근에 와서는 각종 약효성분이 규명되고, 그 효과도 보고되어 버섯유래 생리활성 물질의 개발과 이용은 이제 산업적인 중요 과제로 등장하기 까지 이르렀고, 그 산업적 생산체도 확대되고 있는 실정이다.

지금까지 항암작용, 면역증강효과, 항산화효과, 혈중 콜레스테롤 저하효과 등의 각종 생물활성과 기능성이 있는 것으로 알려져 있다. 이들 버섯의 생리활성에 대한 연구는 Lucas 등이 그물버섯의 열수추출물이 sarcoma 180에 대하여 항암효과가 있는 물질인 것으로 밝혀지면서 비롯되어 Chihara 등이 일본 및 아시아의 종양에 유효한 민간약인 한약에 기초하여 Phelinus linteus, Corinus hirsutus 및 Ganoderma apalantum 등 열수 추출물의 항암활성을 보고한 이래 각종의 보고가 있었다.

이중 동충하초는 자낭균류에 속하는 버섯으로, 겨울철에 여러 종의 곤충에 기생하였다가 여름이 되어 곤충을 기주로 하여 자실체를 발생하거나 기주내에 포자를 형성하는 버섯이다. 전 세계적으로 300여종이 분포하는데, 국내에는 약 45여종이 자생하는 것으로 보고 되어있다.

최근 일본 히로시마 아시안게임에서 중국의 마군단(馬軍團) 육상선수들이 복용하여 기록을 갱신한 것과 등소평이 즐겨 애용한 것이 밝혀지면서 세계적으로 관심의 대상이 되었으며, 국내외의 활발한 연구에 의하여 동충하초의 여러 기능성이 광범위하게 보고되고 있다. 동충하초의 유용 성분은 cordycepin, cordycepic acid, 아미노산, 다당류, 비타민 등으로 알려져 있고, 면역증강 및 부신호르몬 분비 촉진, RNA와 DNA의 합성 억제작용, 항종양 효과, 근육수축작용, 항피로 등의 효과가 보고되었다. 또한, 중국에서는 동충하초 균사체를 배양하여 자실체와 그 효능을 비교한 결과 거의 차이가 없는 것으로 보고 되었고, 균사체를 배양하여 분말, 캡슐, 정/환제, 음료 등을 생산, 판매 하고 있다. 국내에서는 주로 누에 및 번데기를 기주로 하여 재배된 동충하초에 대한 연구가 비교적 활발히 진행되고 있는데, 이 중 번데기 동충하초(C. militaris)는 cordycepin을 다량 함유한 것으로 보고되었고, 항산화효과, 항 돌연변이원성효과, 항균작용 및 아질산염 소거능 등을 갖는 것으로 보고되고 있다.

본 발명은 두부제조 시 발생하는 폐기물 및 수질오염 부하물질로서의 두부 순물의 천연 생리활성물질인 이소플라본의 효과적인 응용 및 이의 기능성 소재화 연구의 일환으로, 두부 제품을 섭취하는 사람들의 이소플라본 섭취를 증가시키고, 이소플라본 흡수율을 높이기 위한 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

보다 상세히, 높은 β-glucosidase 활성도를 가지고 있는 버섯을 이용하여 두부순물을 배양하여 두부순물에 존재하는 이소플라본 배당체가 aglycones으로 전환되어 이소플라본의 장내 흡수율을 향상시키는 것을 목적으로 한다.

이를 위하여 본 발명은 두부 순물을 시료 기질로 하여 6종의 버섯균주에 대한 배양을 통하여 최적 균주를 선정하고, 선발된 동충하초(Cordyceps militaris) 균주에 대한 최적 배양조건을 반응표면분석법으로 최적화하는 한편, 두부순물의 동 충하초 배양특성을 2L 및 5L jar fermentor 수준에서 조사하는 것을 목적으로 한다.

또한, 배양경과에 따른 aglycone으로 전환된 이소플라본과 동충하초의 기능물질인 codycepin의 변화 등 몇몇 성분변화를 비교 분석하여 기능성을 조사하고, 아울러 순물의 버섯 배양액을 몇몇 농도별로 첨가한 연두부의 실온(20℃) 저장 중 물성과 관능변화 및 미생물의 영향 등 품질특성을 분석하여 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은, β-glucosidase의 활성이 우수한 담자균류인 버섯을 이용하여 두부 순물 속에 포함된 배당체 형태의 이소플라본을 aglycone 형태로 변환하는 단계; 및 상기 두부 순물 속에서 배양된 버섯 배양 생성물이 첨가된 연두부를 생성하는 단계를 포함하는 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법을 제공한다.

여기서, 상기 두부 순물은 순물 액상을 간헐살균 처리하여 균사체를 배양할 수 있다.

또한, 상기 두부 순물에 있어서, 순물 동결건조시료군의 genistein의 함량은 순물배지 버섯 배양액의 genistein의 함량에 비하여 약 3배가 크다.

또한, 상기 버섯은 기본 배지에서와 가장 유사한 균사 형태를 보이는 동시에 큰 건조 균사체량 증가 특성을 가지는 동충하초 균사체일 수 있다.

보다 바람직하게는, 연두부 제조 시 상기 순물에 상기 동충하초 균사체를 배양한 순물배양액을 0.5% 농도로 첨가하여 두부의 저장기간을 연장할 수 있다.

또한, 상기 동충하초 균사체는 0.0336% 함량의 cordycepin을 포함할 수 있다.

또한, 상기 동충하초 균사체를 순물 배지에서 액체배양하기 위한 균사생육의 최적 농도는 5%일 수 있다.

또한, 상기 동충하초 균사체를 순물 배지에서 액체배양하기 위한 균사생육의 최적의 진탕속도는 150rpm일 수 있다.

또한, 상기 동충하초 균사체를 순물 배지에서 액체배양 시 정상점은 pH 5.81, 접종비 4% 및 배지액량 45.95ml에서 형성될 수 있다.

또한, 액상의 순물을 배지로 상기 동충하초 균사체를 액체배양할 때 최적의 균사생육에 대한 교반속도는 150rpm에서 배양 6일일 수 있다.

또한, 생물반응기에서 상기 동충하초 균사체 생육의 최적조건은 교반속도 300rpm 및 통기속도 1vvm일 수 있다.

본 발명과 본 발명의 동작성의 이점 및 본 발명의 실시에 의하여 달성되는 목적을 충분히 이해하기 위해서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 첨부 도면 및 첨부 도면에 기재된 내용을 참조하여야만 한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명함으로써, 본 발명을 상세히 설명한다.

Ⅰ 재료 및 방법

1. 균주 및 보존

실험에 사용한 균주는 Garnoderma lucidum(영지), Hericium erinacium(노루궁뎅이버섯), Cordyceps militaris(동충하초), Phellinus linteus(상황 버섯), Inonocus oblicus(차가버섯), Grifora frondosa(잎새버섯)의 6종이며, 강원대학교 생물공학과 생물신소재 연구실의 보존 균주였다. 균주 보존은 P.D.A.(potato dextrose agar) 평판배지에서 25~30℃에서 6~30일간 각각 배양한 후 4℃에서 보존하였고, 3개월마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.

2. 두부 순물 시료의 조제

실험에 사용한 순물 시료는 두부 제조 시 발생하는 액상의 순물을 원심분리(3000×g)하여 고형분을 제거한 다음, 이를 동결건조하거나(whole sample, W), 배제분자량 MW 10kD의 한외여과막(재질: Polypropylene, 외경: 360um, 막두께: 40~50um, 막세공:0.1~0.2um, 강도: 120 MPa, 세공율:40~50%. Amicon사 제품)을 이용하여 순물을 막분리하고 얻어진 농축액(retentate, R)과 투과액(permeate, P)을 각각 동결 건조하여 건조시료로 사용하였다. 한편, 액상시료는 두부 제조 시 발생하는 액상의 순물을 그대로 시료로 하였다.

3. 배지살균

각 버섯 별 전 배양에 사용한 배지조성은 도 1과 같으며, 121℃, 15psi 의 조건에서 15분간 살균하였다. 이때, 순물시료는 액상 시료는 그대로, 그리고 조제된 분말시료는 1~9%(w/v) 농도로 증류수에 녹이고 121℃, 15psi의 조건에서 30분간 살균 후 24시간 동안 저온 방치한 다음, 무균성의 확보를 위해 다시 동일한 조건으로 30분간 살균하는 간헐살균(discontinuous sterilization)법을 사용 하였다. 한편, 액상시료는 그대로 간헐살균을 실시하여 배지로 사용하였다. pH는 필요 시 0.1N HCl 또는 0.1N NaOH로 조절하였다.

4. 배양 방법

접종균의 전배양은 P.D.A. 평판배지에서 생육한 균사체를 직경 5mm의 스테인레스 스틸 파이프(stainless steel pipe)로 mycelium disk를 만든 다음, 이 disk 6-7개를 도 1의 기본배지 50㎖를 넣은 250㎖ 삼각 플라스크에 접종하여 균주별로 25~30℃에서 6~14일간 배양하였다. 이 때, 전배양액은 균질기(Heidolph Co., DIAX 600)로 30초 동안 균질화시켜 본 배양의 접종용으로 사용하였고, 매 실험마다 새로이 배양하여 사용하였다. 본 배양은 순물 배지 50㎖를 함유한 250㎖의 삼각 플라스크에 균질화한 전배양액을 각각 3-5%(v/v)로 접종하였고, 25~30℃에서 100rpm으로 6~14일간 진탕배양 하였다.

5. 균사체 생육의 최적조건 검토

(1) 진탕 배양 조건

선정된 균주의 진탕 배양 속도에 따른 균사체 생육영향은 순물배지 100ml를 250㎖의 삼각 플라스크에 넣고, 접종비 5%로 하여 진탕속도를 50~300 rpm으로 변화시키면서 25℃에서 회전 진탕배양하여 조사하였다.

(2) 반응 표면 분석

최적 배양조건을 검토하기 위하여 pH, 접종비 및 배지액량을 독립변수로 하고, 균사체 생성량을 종속변수로 하여, 도 2와 같이 18개의 처리조합으로 이루어진 중심합성 계획법(central composite design)에 따라 실험하였고, 그 결과를 반응표면분석(Response surface analysis)하였다. 이 때, 반응표면모형은 다음 수학식 1의 2차 다항회귀 모형을 적용하였다.

여기서 k는 독립변수의 수, Xi는 독립변수, Y는 종속변수이며 βo, βi, βij는 각각 중심점에서의 회귀계수, 선형계수 및 2차 interaction 계수이다.

본 실험의 경우 3개의 독립변수를 사용하였으므로 k값은 3이며, X₁, X₂, X₃은 각각 pH, 접종비, 배지액량을 나타낸다.

또한 각 독립변수의 수준을 5로 하고 -2~+2 범위의 코드 밸류(code value)를 갖도록 하기 수학식 2 내지 4와 같이 선형화하였으며, 각 실험 자료에 대한 분산분 석(ANOVA: Analysis of Variance)과 잔차를 구하였다.

한편, 정상점(stationary point)은 2차 회귀에 의해 산출한 상수값(β)으로부터 반응식을 얻은 후, 이 식을 미분하여 얻었으며, 이 때 독립변수와 종속변수의 상호관계는 ANOVA로 검정하였다

(3) Jar fermentor에서의 배양

본 실험에는 생물반응기는 2L(Marubishi, japan) 및 5L(Kobiotech, korea)가 사용되었다. 교반속도의 영향은 배양온도 25℃, 통기속도 1vvm으로 고정하고, 교반속도 200~500rpm의 범위에서 100rpm 단위로 상승 조절하여 배양하였다. 통기속도의 영향은 배양온도 25℃, 교반속도 300rpm으로 고정하고, 통기속도 0.5~2vvm의 범위 에서 0.5vvm의 단위로 상승 조절하여 배양하였다.

6. 분석방법

(1) 균체 및 세포외 용매 침전물의 정량

건조 균체량은 배양액을 필터 페이퍼{filter paper(No. 2, Advantec)}로 여과한 다음, 증류수로 2~3회에 걸쳐 수세하였고 60℃에서 24시간 건조한 후, desiccator 에서 항량이 될 때까지 방치하면서 건조중량(mycelial dry weight, MDW)을 측정하여 정량하였다.

한편, 여과하여 얻은 배양 여액에 2배량의 아세톤(acetone)을 가하고 교반하여 침전물을 얻었으며, 이를 60℃에서 24시간 건조한 다음 중량을 측정하여 AP(Acetone precipitate)로 정량하였다.

(2) 일반성분 분석

두부순물 및 순물배지를 사용한 균체배양액의 일반성분은 수분함량은 105℃ 상압 건조법, 회분함량은 550℃ 직접 회화법, 단백질은 Lowry법을 이용하여 표준물질인 BSA(Bovine serum albumin)의 표준검량곡선을 작성하여 산출하였고, 전당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.

(3) Cordycepin 분석

순물 배지에서 생육한 균사체 배양액을 동결건조하고 95℃에서 물로 6시간 동안 열수추출을 한 후, 필터 페이퍼(Adventec No.2)를 사용하여 감압 여과하였다. 이 열수추출 여과액에 4배량의 에탄올(ethanol)을 가하여 4℃에서 24시간 방치한 후, 6000rpm에서 25min 동안 원심분리하여 상등액만을 취해 완전히 감압증발 시키고 0.45㎛의 멤브레인 필터(membrane filter)로 여과하여 Symmetry C18 Reverse phase column HPLC(4.6×150mm, Waters)로 분석하였다. 이때 이동상으로는 20% MeOH을 사용하였으며, flow rate는 0.6㎖/min으로 하였고, UV detector를 이용하여 260nm에서 검출하였다. 표준물질인 cordycepin(Sigma-aldrich Chemical Co., C3394)을 사용하여 표준검량곡선을 작성하여 시료의 cordycepin 함량을 산출 하였다.

(4) 이소플라본 분석

두부순물 및 순물배지를 사용한 균사체 배양액의 이소플라본 함량 측정은 다음과 같다. 두부순물 및 균체배양액의 동결건조물을 0.5~1g 취하여 추출용매(2N HCl in 50% EtOH with 0.05% Butylated Hydroxy Toluene) 10㎖와 Injection Solution 0.1㎖(20mg/㎖ EtOH, n-butyrophenone)를 넣고 80℃ 하의 진탕 항온수조에서 4시간 동안 가열하며 가수분해하였다. 냉각 후 5분간 sonication하였고 상층액을 취하여 syring filter(Millex LCR 13mm NS, MSCLRO, 0.5㎛, Millipore Co.)로 여과한 액 20㎕를 HPLC에 주입하여 분석하였다.

도 3에서 보는 바와 같이 daidzein과 genistein 함량은 Wang과 Kuan의 방법에 따라 ODS Hypersil column(4.6×200mm, 5㎛)을 사용하여 정량하였다. 이 때, 이 동상으로는 20% MeOH를 사용하였으며, flow rate는 0.6㎖/min으로 하였고, UV detector를 이용하여 254nm에서 검출하였다. 표준물질로는 daidzein(4',7-dihydroxyisoflavone)과 genistein(4'.5.7-tri- hydroxyisoflavone)을 Sigma사(Sigma-aldrich Chemical Co.)에서 구입하여 사용하였다. 시료의 daidzein과 genistein의 함량은 HPLC 분석의 자료를 토대로 표준물질의 peak 면적과 회수율을 고려하여 계산하였다.

7. 균사의 형태 분석

균사체 형태는 이미지 캡쳐링 보드(image capturing board)를 사용하여 PC(Samsung, Pentium 100)에 연결된 이미지 분석 시스템{image analysis system(Optimas Co., U.S.A)}으로 분석하였다.

(1) 시료의 조제 및 관찰

균사의 형태 관찰을 위하여 시료 1㎖를 무작위로 취한 다음, 동량의 고정화 용액(13㎖ 40% formaldehyde + 5㎖ glacial acetic acid + 200㎖ 50%(v/v), ethanol)으로 고정시켜 5~15배로 희석한 후 메틸렌 블루(methylene blue)로 염색하여 글래스 큐빅{glass cubic(가로 4cm×세로 3cm×높이 1.5cm)}에서 관찰하였다.

(2) 화상분석

화상분석의 절차는 도 4와 같고, CCD 카메라로 촬영한 화상은 640×480 pixels 및 256 grey level의 해상도로 촬영하였으며, 화상 가장자리의 굴절로 인한 오차를 최소화하기 위하여 400×400 pixels로 수정하였다. Image software(Optimas 6.5)를 이용하여 면적, fractal 차원, 원형도 및 균사체 펠렛의 roughness를 구하였다. Fractal 차원은 하기 수학식 5를 이용하여 면적 및 둘레길이 값으로부터 계산하였고, 원형도 및 러프니스(roughness)는 하기 수학식 6과 수학식 7을 이용하여 각각 구하였다.

Fractal 차원

S_n : 면적(mm2)

X_n : Perimeter(mm)

D : Fractal 차원(-)

Circularity = (Perimeter²/Area ×4π)

8. 연두부의 제조

연두부의 제조는 80g 용량의 용기(8.0cm×8.0cm×2.0cm)를 사용하였다. 제조 시 순물배지에 배양한 동충하초 배양액을 0%(대조구), 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3 및 5%(v/v) 농도로 첨가하였고, 응고제는 glucono-δ-lactone(GDL)을 0.3%(w/v) 농도로 첨가하였다.

9. 관능 검사

순물배지에서 배양한 동충하초를 비율별로 첨가하여 제조한 연두부의 관능검사는 실험실의 남녀 관능검사원 10명을 선정하여 실험의 취지를 충분히 숙지시킨 다음 5점 평점법(scoring test)으로 측정하였다. 즉, 연두부에 동충하초 배양액을 농도별(0~5%, v/v) 로 구분하여 냄새, 씹힘성, 색깔, 맛 및 전체적인 기호도에 대한 관능검사를 실시하여 나쁜 경우에는 1점, 좋은 경우에는 5점을을 기준으로 평가하여 얻어진 data에 대한 통계적 처리는 MINITAB Release 14 통계소프트웨어 한글버젼(Minitab Inc)을 이용하여 분산분석과 Duncan's multiple range test 5% 수준에서 유의성을 검증하였다.

10. 연두부의 저장성 시험

(1) 일반 미생물 검사

식품공전에 등재된 일반세균수 측정방법에 준하여 실험하였고 다음과 같다. 버섯 배양액을 0, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3 및 5%(v/v)로 첨가하여 제조한 연두부를 10%(w/v)의 농도로 취한 다음, 멸균 생리식염수(0.85% Sodium chloride)에 가해 균질기를 사용하여 균질화한 것을 검액으로 사용하였다. 검액을 멸균된 증류수에 1~1×104배로 단계 희석하고 희석액 1㎖씩을 petri film(3M, aerobic count plate, AC 2007-06 KL)에 분주한 다음, 35±1℃에서 48시간 배양하였다. 배양 종료 후 cell counter를 사용하여 생성된 집락수를 계수하고 시료 g당 CFU 단위로 표시하였다.

(2) 색도 측정

제조된 연두부의 색도는 색차계(Chroma Meter CR-400, Konica Minolta)를 이용하여 L값(명도, lightness), a값(적색도, redness) 및 b값(황색도, yellowness)을 측정하였다. 이 때, 표준 백색판의 L, a, b의 값은 각각 96.25, 0.09 및 1.91이었다.

(3) Texture 측정

Texture의 측정은 rheometer(COMPAC-100Ⅱ)를 사용하여 도 5와 같은 조건으로 2회 압착 실험하여 실시하였다. 연두부의 typical texture 프로파일 분석 커브(profile analysis curve)는 도 6과 같으며, 다음의 수학식 8 내지 12에 의하여 견고성(hardness), 응집성(cohesiveness), 탄력성(springiness), 점착성(gumminess) 및 부서짐성(brittleness)을 구하였다.

Strength = (Max weight(H1)×980.665)/Adaptor area

Distance = Max weight가 발생한 시료의 깊이 값

Cohesiveness(%) = (A₂/A₁) × 100

Springiness(%) = (B₂/B₁) × 100

Gumminess(g) = H1 × (A₂/A₁)

Brittleness(g) = H1 × (A₂/A₁) × (B₂/B₁)

Ⅱ. 결과 및 고찰

1. 우수 균주 선발

두부 제조 시 발생하는 부산물인 순물에 생육이 우수한 균주를 선발하기 위 하여 각 균주의 기본배지와 순물 분말시료를 1, 3 및 5% 농도로 배지를 조제하고, 6종의 버섯 균주를 6~14일간 배양하였다. 그 결과는 도 7 내지 13과 같다. 도 7에서 BM은 Basal medium for Hericium erinaceum을 W는 Freeze-dried soybean curd whey(FDW)를 의미하고, 도 8에서 BM은 Basal medium for Ganoderma lucidum을 W는 Freeze-dried soybean curd whey(FDW)를 의미한다. 또한, 도 9에서 BM은 Basal medium for Cordyceps militaris를 W는 Freeze-dried soybean curd whey(FDW)를 의미하고, 도 10에서 BM은 Basal medium for Phellinus linteus를 W는 Freeze-dried soybean curd whey(FDW)를 의미한다. 또한, 도 11에서 BM은 Basal medium for Inonotus oblicus를 W는 Freeze-dried soybean curd whey(FDW)를 의미하고, 도 12에서 BM은 Basal medium for Grifola frondosa를 W는 Freeze-dried soybean curd whey(FDW)를 의미한다. 한편, 도 13에서 BM은 Basal media for mushrooms를 W는 Freeze-dried soybean curd whey(FDW)를 의미한다.

기본배지와 비교하여 순물배지에서 최대 균사생육의 정도는 영지(1.34배)> 동충하초(1.2배)> 노루궁뎅이버섯(0.72배)> 상황버섯(0.5배)> 차가버섯(0.47배)> 잎새버섯(0.36배)의 순이었다.

또한, 도 14는 각 버섯의 순물배지에서의 배양 종료 후 균사형태를 살펴본 사진으로 동충하초, 상황버섯 및 잎새버섯의 경우 기본배지와 비교하여 순물배지에서 모두 비슷한 균사형태가 관찰되었으나, 상황버섯과 잎새버섯의 경우 건조 균사체량이 기본배지의 약 50%에 불과하였고 상대적으로 긴 배양시간을 필요로 하여 순물배지에는 적합하지 않은 것으로 판단되었다.

동충하초의 경우 기본 배지에서와 가장 유사한 균사 형태를 보였고, 또 건조 균사체량이 8.1g/L로 영지의 5.24g/L보다 약1.5배 더 많은 증가를 보였기에, 순물을 기능성 성분을 이용하는데 가장 적합한 균주로는 동충하초(C. militaris)로 판단하였으며, 이를 최적 균주로 선정하였다.

2. 순물배지 농도의 영향

선발한 동충하초균주의 순물배지의 농도에 따른 균사생육 정도를 탐색하였다. 순물배지(W)의 농도를 1,3,5,7 및 9% 농도로 조제하여 동충하초를 배양하였고, 그 결과는 도 15와 같다. 여기서 BM은 Basal medium for C. militaris를 W(1~9)는 Freeze-dried soybean curd whey concentration(%)을 의미한다.

순물농도 1~5%까지는 순물의 농도 증가에 비례하여 균사생육이 3.58~8.97 g/L로 증가하였으나, 그 이상의 농도(7~9%)에서는 다시 감소하는 경향을 나타냈으므로 최적 균사생육의 최적 농도는 5%로 결정하였다.

도 16 내지 18은 1~5% 농도의 순물배지에서 생육한 동충하초의 균사형태를 촬영하고, 면적분포, 원형도, fractal 차원 및 pellet core의 러프니스를 분석, 산출한 결과이다. 도 17에서 면적분포를 보면, 주로 0.6mm 이하의 면적을 갖는 균사체가 많았으며, 순물의 농도가 증가할수록 그 빈도수가 증가하여 건조 균체량의 측정 결과와 비교적 일치하였다.

한편, pellet 표면의 전단 생육이 활발한 rough pellet이 주로 관찰되는 기본배지와 순물배지농도 3 및 5%의 원형도(circularity)의 값은 3.19에서 최대의 분 포를 나타내었고, 각각 30.2, 35.14 및 38.51%의 최대 분포율을 보여 순물의 농도가 증가 할수록 최대 분포율도 증가하는 양상을 보였다. 반면에 순물농도 1%의 경우는 부족한 영양성분으로 인하여 pellet 외부의 전단생장이 적은 smooth pellet의 형태가 주로 관찰되며 원형도 값도 상대적으로 적은 1.59에서 45.31%의 최대의 분포를 나타내었다.

도 18은 면적과 둘레길이의 관계로부터 산출한 fractal 차원을 계산한 결과이다. 여기서 A는 basal medium for C. militaris.를 B, C, D는 1, 3, 5% of freeze-dried soybean curd whey를 의미한다. Smooth pellet의 형태가 주로 관찰된 순물농도 1% 배지의 fractal 차원 값은 1.2 이었고, rough pellet이 주로 관찰되는 순물농도 3 및 5% 배지의 경우는 fractal 차원의 값이 각각 1.57 및 1.49로 기본배지의 1.5와 비슷한 값을 보였다. 이상의 분석 결과로부터 배지 및 배양조건의 변화에 따라 발생하는 여러 가지 균사형태를 분석하고 조절하는 일련의 방법은 균사체 생육 및 기능성 대사산물의 생산 시 효과적인 판단의 한 지표로 사용할 수 있다.

3. 기본배지와 순물배지 혼합물의 영향

동충하초를 기본배지, 순물배지 및 기본+순물배지에서 액체배양하고 균사생육과 용매 침전물의 정도를 비교 실험하였다. 순물배지는 W(whole), R(retentate) 및 P(permeate) 3종의 시료를 사용하였으며, 그 결과는 도 19와 같다.

순물배지의 농도가 1~5%로 증가할수록 균사체 및 용매침전물 또한 증가하는 양상을 보였는데, W, R 및 P 시료의 5% 첨가 시 건조 균체량을 보면 각각 8.57, 8.04 및 5.46g/L로 분자량 10kD 이상의 retentate가 주로 동충하초 균주의 생육에 관여하는 것으로 판단되었다. 한편, 기본 배지에 순물을 첨가하였을 경우 순물만을 사용하였을 경우보다 최대 2.07~2.4배의 균사생육을 보였는데, 순물의 첨가 농도가 증가 할수록 균사의 생육 증진 효과는 감소하여 순물배지 5%의 경우와 비슷한 균사생육 정도를 보였다. 또한 순물 자체를 활용하고자 하는 본 연구의 목적과 배지의 사용 시 추가되는 비용 등을 고려하면, 순물 배지만을 사용하여 진행하는 것이 유리할 것으로 판단된다.

4. 플라스크 배양의 최적화

(1) 진탕 속도의 영향

진탕속도가 균체 생육에 미치는 영향을 플라스크에서 조사하였으며, 그 결과는 도 20과 같다. 그림에서 보는 바와 같이 균사체 생육은 진탕속도가 150rpm일 때 7.13g/L로 가장 좋았으며, 그 이상에서는 소폭으로 감소하였다. 반면, 100rpm이하에서는 균체 생육이 저조하였는데, 이는 낮은 교반속도로 인하여 균체내로의 산소전달 및 배지 영양성분의 흡수나 이용이 곤란하였기 때문으로 생각된다. 또한 용매침전물의 변화량도 50~150rpm 범위에서 교반속도가 증가할수록 감소하고, 그 이상의 rpm에서는 용매침전물의 변화량도 거의 일정하여 순물배지 내 영양성분이 균사 생육에 흡수 및 이용되는 것으로 판단되었다.

(2) 배양 최적화

동충하초 균을 순물 배지에서 액체배양하기 위한 최적조건을 탐색하기위해, 균체 생육에 중요인자인 pH, 접종비 및 배지액량을 독립변수로 하고, 균사체 생육량을 종속변수로 하여 반응표면분석법으로 균사생육의 최적조건을 검토하였으며, 그 결과를 도 21 내지 26에 나타내었다.

도 21은 pH, 접종비 및 배지액 량을 독립변수로 균사생육량을 종속변수로 하여 중심합성법으로 실험한 결과이고, 도 22는 독립변수의 입력 자료와 추정값을 이용하여 다중 회귀 분석한 결과이다. 도 22에서 보는 바와 같이, 정상점이 pH 5.81, 접종비 4% 및 배지액량 45.95ml에서 얻어졌으며, 이 때 정상점에서의 균사생육 추정값은 7.67g/L이었다.

종속변수 변량에 대한 독립변수의 영향을 분산분석(ANOVA)한 결과는 도 23과 같으며, 다중상관 계수(regression)의 제곱합은 27.68, 잔차(error)의 제곱합은 1.45이었고, 0.9749의 회귀계수를 얻었다. 또한 유의수준을 검정하는 F-값도 17.02로 5%이내(p>0.95)에서 유의성을 나타내었다. 따라서 도 21의 결과로부터 균사체의 생육은 다음 수학식 13과 같이 2차 회귀식으로 나타낼 수 있었다.

Y = 7.403 - 0.027X₁ - 0.168X₂ - 1.004X₃ - 0.151X₁ ² - 0.371X₁X₂ + 0.101X₁X₃ - 0.647X₂ ² + 0.260X₂X₃ - 0.272X₃ ² (p<0.05, R² = 0.9504)

한편, 균사 생육에 미치는 각 요인들 사이의 상호작용을 알아보기 위해 contour plot한 결과는 도 24 내지 도 26과 같다.

도 24는 pH(X₁)와 접종비(X₂) 간의 상호작용을 나타낸 것으로, 그림에서 pH(X₁)는 설정한 중앙값(pH 6) 주위에서 최고의 균사생육을 보였으나, 접종비의 경우는 설정한 중앙값 5%보다 다소 적은 값에서 정상점을 나타내었다.

도 25는 pH(X₁)와 배지액량(X₃)간의 상호영향을 분석한 등고선 그림으로, pH(X₁)는 역시 실험계획에서 설정한 중앙값 주위에서 최고의 생산량을 보였으나, 배지액량(X₃)의 경우는 중앙값인 100ml보다 절반정도인 50ml에서 최적의 생산량을 보였다.

한편, 도 26은 접종량(X₂)과 배지액량(X₃)간의 상호작용을 나타낸 그림으로, 접종량(X₂)는 중앙값 5%보다 다소 낮은 값에서, 배지액량(X₃)은 중앙값 100ml보다 절반정도인 50ml 주위에서 정상점을 나타내었다.

5. Jar fermentor 배양

(1) 2L jar fermentor 배양

순물은 그 속에 함유된 풍부한 영양성분으로 인하여 보관 시 쉽게 미생물이 증식한다. 이의 대안으로 건조하여 보관하는 방법이 있으나 건조한 분말시료 또한 배지로 조제 시에 물에 쉽게 용해되지 않아 배지조제에 많은 시간과 비용이 소비되는 문제점이 있다. 따라서 향후 순물배지를 이용한 버섯액체배양의 산업화를 위해 서는 액상 및 분말상태의 순물을 배지로 사용하여 액체배양을 시도하고, 그 경향을 비교 검토할 필요가 있다. 이에 분말 및 액상시료로 배지를 조제하여 2L-jar fermentor에서 비교 배양하였으며, 그 결과는 도 27 및 28과 같다. 이 때, 순물 액상시료의 pH는 6.0± 0.2로 동충하초의 생육 최적 pH와 유사한 범위에 있으므로 그대로 사용하였고 분말시료는 pH를 6.0± 0.2로 조절하여 사용하였다.

도 27에서 보는 바와 같이 액상시료의 경우 균사생육이 배양 4일에 9.96g/L로 급격히 증가하는 것을 볼 수 있다. 반면에 도 28에 나타난 고체 시료의 경우는 배양 6일까지 비교적 서서히 증가하여 최대 8.12g/L의 균사체 생산을 보였다. 상기의 결과로 액상의 순물을 그대로 사용하는 것이 배지 조제 시 소요되는 시간 및 비용 절감에 보다 유리할 것으로 판단되었으며, 이 후의 실험은 액상시료를 사용하여 실험을 진행하였다.

한편, 배양 경과에 따른 배양여액 중 용매 침전물의 변화를 측정한 결과, 두 시료군 모두 배양 개시 후 지속적으로 감소하고 배양 5-6일경부터 다시 증가하는 경향을 보였다. 이는 순물의 영양성분이 배양 중 균체에 흡수 및 이용되어 용매침전의 량이 감소하고, 배양 후기에 생성 및 축적된 버섯 배당체의 증가로 용매침전 량이 다시 증가한 것으로 판단된다. 본 발명에서는 순물배지를 이용한 동충하초 배양액의 이소플라본 함량이 기존 순물의 약 2.9배 이상 증가한 결과를 얻을 수 있었다.

(2) 5L-jar fermenter 배양

2L-jar의 배양 결과를 토대로 5L-jar에서 교반속도를 200-600rpm으로 조절하여 배양하였고, 그 결과는 도 29 내지 32와 같다.

교반속도의 증가에 따라 균사체 증식도 크게 증가하는 경향을 보였고, 특히 300rpm의 경우는 접종 후 균사체 생육이 lag phase 없이 바로 대수증식기(exponential phase)로 진행하고, 배양 3일에 10.7g/L의 균사생육을 보였으며 배양 4일에 11.6g/L의 최대 균사생육을 보인 다음, 배양 종료 시까지 서서히 감소하는 경향을 보였다. 또한 400rpm의 경우도 배양 1일간의 lag phase를 가진 후에 균사생육이 크게 증가하여 배양 3일에 10.23g/L의 균사생육을 보인 다음 서서히 증가하여 배양 종료 시 11.89g/L의 최대 균사생육을 보였다.

반면에 200rpm에서의 균사생육은 배양 종료 시 균사생육이 11.4g/L로 300 및 400 rpm의 경우와 비슷한 양의 균체생육을 보였으나 전반적인 균사 생육속도는 낮았다. 이 결과는 200rpm의 경우 비교적 낮은 교반속도로 배지 내 물질전달이 잘 이루이지지 않으므로 낮은 균사생육 속도를 가지며, 용존산소 또한 쉽게 제한되는 것으로 판단된다. 500rpm의 경우는 배양 종료 시에도 32.5%의 용존산소 잔존율을 보이나 오히려 과도한 교반속도로 배지 내 전단응력(share stress)이 증가하여 균사생육이 저해되는 것으로 볼 수 있다.

용매 침전량의 변화는 200-400rpm의 경우 배양개시(약 9.5-9.8g/L) 후 배양 4일까지 서서히 감소한 다음(5.5g/L), 300-400rpm에서는 배양종료 시 4.6- 4.9g/L로 다시 감소하는 반면에, 200rpm의 경우는 배양종료 시에도 5.5g/L를 유지하여 다당의 생성 및 축적은 비교적 낮은 교반속도에서 유리한 것으로 생각된다.

상기 실험의 결과로부터 균사체 생육의 최적 교반속도는 300-400rpm에서, 세포외 다당 생성 및 축적의 최적 교반속도는 200rpm에서 유리한 것으로 판단되었다.

교반속도를 300rpm으로 고정한 후 통기속도의 변화에 따른 균사생육 및 용매침전물의 변화를 조사하여 도 33에 나타내었다.통기속도 0.5vvm에서는 배양 4일째 최대 균사체량인 8.85g/L를 얻은 후 배양말기까지 유지하였고, 1vvm에서는 배양 3일에 10.7g/L의 최대 균사체량을 보인 후 배양말기까지 유지하여 최대 균체사량에 도달하는 기간을 1일 단축할 수 있었다. 한편, 통기속도 1vvm 이상의 조건에서는 과도한 form의 발생으로 over flow가 발생하여 더 이상 배양을 진행할 수 없었다.

6. 순물 및 순물버섯배양액의 이화학적 특성

(1) 일반성분 분석

동결건조한 두부순물과 동충하초의 기본배지 및 순물배지 버섯 배양액의 일반성분 분석을 시행하였고, 그 결과는 도 34와 같다. 여기서 A는 Soybean curd whey를 B는 Culture broth of C. militaris cultured by basal medium을 C는 Culture broth of C. militaris cultured by soybean curd whey medium을 나타낸다.

순물과 기본 및 순물배지 버섯 배양액의 동결건조 후 수분함량은 각각 3.68±2.8, 3.53±1.5 및 3.72±3.4%이었으며, 총 단백질은 0.45±0.03, 9.867±2.47 및 24.71±4.13%이었다. 총 당의 함량은 순물은 2.88±1.458%이고 버섯배양액은 각각 32.47±5.45 및 10.54±3.34 이었다. 또 회분함량은 각각 19.02±0.55 및 7.53 ±2.1% 이었다. 총 단백질 함량의 경우 순물보다 버섯배양액의 총 단백질 함량이 높은 결과를 보였다.

(2) 순물 및 버섯 배양액의 cordycepin 분석

순물을 배지로 6종의 버섯을 배양한 결과 가장 양호한 균주는 버섯의 일종인 동충하초(Cordycepes militaris)로 cordycepin, cordycepic acid, polysaccharide, amino acid 등과 같은 생리활성 성분을 함유하고 있어 면역증강 및 자양강장효과 등의 다양한 생리활성 효과를 나타내고 있는 것으로 알려져 있다. 대표적 지표물질인 cordycepin(3'-deoxyadenosin)은 nucleoside 유도체로서 DNA, RNA의 합성을 저해, 세포분화를 촉진, protein kinase 활성저해, 방광 및 대장암, 폐암과 fibrosarcoma에 대해 항암효과를 가지는 등의 다양한 생리활성을 가진다. 이러한 여러 가지 기능성을 가지는 cordycepin의 존재여부 확인과 존재 시 함량 분석을 시행하였고, 그 결과를 도 35에 나타내었다.

도면에서 보는 바와 같이 두부 순물에는 없으나 이를 배지로 한 동충하초 버섯배양액에서 cordycepin의 존재를 확인하였으며, 순물, 기본배지 및 순물배지 버섯 배양물의 함량은 각각 0, 0.0354% 및 0.0336% 로 순물배지에서 cordycpin의 함량 감소는 거의 없었다.

(3) 순물 및 버섯 배양액의 isofalvone 분석

이소플라본의 종류는 β-glucoside, aglycone, acetylglucoside 및 malonylglucoside 형태로 크게 4종으로 분류되며, 한 종류 당 3종의 다른 형태로 존재하여 총 12개의 isoflavone isomer가 존재한다. Genistin, daidzin 및 glycitin은 이소플라본의 β-glucoside 형태이고, genistein, daidzein 및 glycitein은 이소플라본의 aglycone 형태이다. 또한 acetylglucosides 형태는 각각 6”-Ο-acetylgenistin, 6”-Ο-acetyldaidzin 및 6”-Ο-acetylglycitin으로 지칭되며, malonylglucoside 형태는 6”-Ο-malonylgenistin, 6”-Ο-malonyldaidzin 및 6”-Ο-malonylglycitin으로 각각 지칭된다. 이 중 콩에 존재하는 isoflavone isomer는 daidzin과 genistin, 그리고 각각의 aglycone인 daidzein과 genistein이며, acetylglucosides 및 malonylglucoside류는 콩을 가열 및 가공하는 과정 중에 쉽게 분해되어 없어지는 것으로 알려져 있다.

콩의 이소플라본은 daidzin과 genistin으로 대부분 존재하지만, 대두 발효식품의 경우와 가열식품의 경우에는 미생물의 β-glucosidase와 가열처리에 의해 당이 분해된 aglycone의 함량이 높은 것으로 보고 되어있다. 또한 이들 aglycone 형태인 daidzein과 genistein은 그동안의 연구결과 항암, 항산화, 에스트로겐 유사효과 등 여러 생리활성 기능에 큰 기여를 하는 것으로 알려져 있다. 이에 두부순물 및 순물배지에 배양한 버섯 배양액에 존재하는 이소플라본 중 daidzein과 genistein의 함량을 분석하였으며, 그 결과는 도 36과 같다. 순물 동결건조시료군의 토탈(total) 이소플라본은 344±31.32㎎/100g이었고, 이중 daidzin, daidzein, genistin 및 genistein의 함량은 각각 110±2.1, 16.2±4.95, 153±22.31 및 14.3±3.61㎎/100g 이었다.

한편, 순물배지 버섯 배양액의 total isoflavon, daidzin, daidzein, genistin 및 genistein의 함량은 각각 334±82.02, 105±23.21, 21.7±8.28, 129±34.5 및 37.8±5.52㎎/100g으로 순물시료에 비하여 daidzein의 함량은 비슷한 수준이었으나 genistein의 함량이 약 2.94배 증가하였다. 이는 동충하초균은 순물에 존재하는 β-glucoside 형태인 genistin을 aglycone 형태인 genistein으로의 전환과 관계한다.

일반적으로 발효식품의 경우 발효 중에 미생물에 의해 상당한 양의 이소플라본이 분해되어 소실되는 것으로 알려져 있으나, 본 실험의 결과에서 순물 중 동충하초 균이 이소플라본의 glycoside 결합을 aglycone 형태로 전환하는 것임을 확인할 수 있다.

7. 관능 검사

동충하초 버섯 배양액의 첨가량을 달리하여 제조한 연두부의 색(color), 냄새(flavor), 맛(taste), 조직감(texture) 및 전체적인 기호도(overall acceptability) 등의 관능검사를 실시한 결과는 도 37과 같다.

관능분석 결과 버섯배양액의 투입농도가 증가 될수록 색, 냄새, 맛, 조직감 및 전체적인 기호도가 감소하는 결과를 보이고 있다.

관능검사 항목간 상관관계분석은 도 38에 나타난 결과와 같이 배양액의 투입농도와 색(r= -0.944), 냄새(r= -0.828), 맛(r= -0.886), 전체적인 기호도(r= -0.964)로 높은 음의 상관관계를 나타내었고(p<0.05), 조직감에 있어서는 (r= -0.248) 상관관계를 나타내지 않았다(p>0.05).

즉, 동충하초 버섯배양액의 농도와 관능검사 항목간 상관분석에는 음의 상관관계가 있는 것으로 분석되어, 상관분석결과 배양액의 농도가 증가할수록 색과 냄새, 맛, 조직감과 전체적인 기호도가 감소하는 경항을 보이고 있으나, 대조구와는 큰 차이를 보이지 않아 기능성 제품화를 위한 관능검사상 가능성을 보여 주었다.

8. 연두부 제조시 두부순물 및 버섯배양액의 첨가 영향

두부 응고물의 망상구조 속에는 상당량의 수분을 함유한 gel 상태이므로, 저장 중에 쉽게 부패되는 단점이 있다. 이에 anti-fungal, anti-tumor, anti-viral 등의 기능도 있는 것으로 알려지고 있는(95-97) 동충하초를 연두부 제조 시에 0.1~5% 농도로 첨가하여 연두부를 제조하고 저장하였으며, 저장 중 pH, 색도 및 일반 미생물의 생성 여부를 측정하였다. 한편 두부제조 시 이소플라본, 올리고(oligo) 당 등의 비교적 저분자의 기능성 물질은 그 대부분이 순물로 용출되는 것으로 알려져 있다. 따라서 순물 버섯배양액의 유용한 성분을 가능한 한 모두 이용하기 위하여 연두부로 제조하여 실험을 실시하였다.

(1) 미생물 변화

두부 제조 시 순물, 기본배지 및 순물배지 버섯 배양액을 0~5% 범위의 농도로 첨가하고 20℃에서 두부의 저장 중 발생되는 총균수의 변화를 측정한 결과는 도 39와 같다.

순물만을 첨가한 경우 0~0.5% 범위에서는 첨가 농도가 증가할수록 생균수의 감소효과가 나타났다. 그러나 0.5% 이상 첨가한 경우는 첨가 농도에 따라 생균수도 증가하였는데, 실험에 사용한 순물 첨가구는 이소플라본만을 추출 정제한 것이 아니라 순물을 그대로 첨가하여 영양성분이 더욱 추가되었으며, 첨가 농도가 증가함에 따라 두부의 망상 조직에 상대적으로 공극이 증가하여 미생물의 증식에 오히려 도움이 되었을 것으로 생각된다. 템페와 같은 대두 발효제품은 이소플라본의 aglycone의 증가로 항산화력이 증가되는 것으로 밝혀지고 있으며, 특히 genistein의 경우 유방암 및 전립선암에 항암작용이 알려져 있다. 항암효과를 나타내는 주요 mechanism의 하나로서 genistein의 항산화적 특성이 지적되고 있으며, growth factor receptor의 tyrosine protein kinase(TPK)의 강력한 억제제로 알려져 있고, 콩, 두부 및 두부순물의 항산화효과 및 이소플라본 함량을 조사한 결과 두부순물이 항산화효과 및 이소플라본의 함량이 가장 많은 것으로 보고된 바 있다. 따라서 순물첨가구의 미생물 생육에 대한 억제 효과는 주로 genitein이 관여하는 것으로 판단되며, 순물 중 genistein만을 분리 정제하여 연두부 제조시에 첨가하는 경우 미생물 증식억제에 더욱 효과적일 수 있다.

연두부 조제 시 기본배지에서 배양한 동충하초(이하 기본배양액 첨가구)의 첨가의 경우는, 순물첨가구와는 반대로 0~0.5% 첨가 시 첨가농도에 따라 오히려 미생물의 생육정도가 증가하다가 그 이상의 농도로 첨가하였을 경우에는 다시 미생물 생육을 억제하였다. 따라서 미생물 증식 억제를 위해서는 동충하초의 기능성 물질이 일정 농도 이상 필요한 것으로 생각된다.

연두부 조제 시 순물배지에서 배양한 동충하초 배양액(이하 순물배양액 첨가구) 첨가의 경우는, 그 경향은 순물 첨가구와 유사하게 0~0.5% 농도에서 첨가농도가 증가할수록 미생물 생육의 수도 감소한 다음 그이상의 첨가 농도에서는 다시 미생물 생육의 수도 증가하였다. 그러나 미생물의 그 생육 정도는 순물 첨가구의 경우보다 감소하였으며, 0.5%농도 이상의 첨가구에서도 미생물의 생육정도는 더욱 감소하는 효과를 보였다. 생균수를 보면 일정 농도 이상 존재하는 대조구 및 순물배양액 첨가구 모두 저장 4일까지는 미생물이 검출되지 않았고, 저장 5일 이후에 생균수는 급격히 증가하여 저장 7일에 대조구는 7.8× 105 CFU/g의 생균수를 나타내었고 버섯배양액 첨가구는 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3 및 5% 첨가농도에서 각각 1.7× 105, 1.1× 105, 0, 9.7× 105, 1.3× 105 및 1.79× 106 CFU/g의 생균수가 검출되었다. 따라서 연두부를 제조하고 순물에 동충하초를 배양한 순물배양액을 0.5% 농도로 첨가하면 두부의 저장기간의 연장효과를 기대 할 수 있을 것으로 판단되었다.

(2) pH의 변화

저장 중 pH의 변화를 측정하였고 그 결과는 도 40과 같다. 도 40에서 보는 바와 같이 모든 시료구의 pH는 두부 제조 시 5.71~5.74의 범위로 저장 2일에 감소하였다가 4일에는 경미한 pH의 증가를 보인다음, 저장 4일 이후에는 급격히 감소하였다. 특히 기본배양액 0.3, 0.5, 1% 및 순물배양액 3 및 5% 첨가구의 경우는 저장 7일에서의 pH가 각각 5.38, 5.22, 5.32 및 5.37, 5.4로 급격히 감소하였는데, 저장 중 총미생물의 증가폭이 가장 크게 나타났던 도 39의 결과와 잘 일치하였다. 이는 두부의 부패로 생성되는 저분자량의 peptide와 amino acid 및 amine 등 양성 전해질에 의한 완충작용과 저장 중 생육하는 미생물의 대사산물에 의한 pH의 감소로 판단되며, 도 39의 결과와 잘 일치한다.

(3) Texture의 변화

제조된 연두부의 저장 중 연두부의 견고성(hardness), 응집성(cohesiveness), 탄력성(springiness), 점착성(gumminess) 및 부서짐성(brittleness)을 측정하였고, 그 결과는 도 41 내지 45와 같다.

도 41 및 42는 일반배지 동충하초 배양액과 두부순물배지 배양액, 두부순물을 농도별로 첨가하여 제조한 연두부의 texture의 측정결과, 두부순물의 첨가농도가 증가할 수록 견고성과 점착성은 증가하였고, 탄력성과 응집성, 부서짐성은 유의적인 차이를 보이지 않았다. 버섯배양액의 농도를 증가할 경우, 견고성과 점착성, 부서짐성은 0.5%까지 증가하다가 그 이후는 감소하는 경향을 보이고 있으나, 응집성과 탄력성은 첨가농도에 따라 유의적인 차이를 보이지 않았다. 도 43은 두부순물과 버섯배양액을 농도별로 측정한 결과로서, 두부순물의 농도를 증가할 경우 0.3%까지는 감소하다가 증가하는 결과를 보이고 있고, 일반배지에 배양한 버섯배양액을 첨가한 경우에는 0.5%가 가장 높게 나타났으며, 3% 이상 첨가할 경우 감소하는 경향을 보이고 있다. 두부순물배양액은 0.3%까지 물성이 증가하다가 감소하는 경향을 보이고 있다.

도 45 및 46은 20℃에서 보관중에 물성의 변화를 측정한 결과이다. 버섯배양 액의 종류와 첨가농도, 보관기간과 견고성, 응집성, 점착성, 부서짐성과는 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 변질이 진행될 경우 감소하는 경향을 보였으며, 탄력성에 있어서는 농도와 저장기간에 관계없이 일정한 결과를 보였다.

(4) 색도의 변화

동충하초 배양액을 첨가한 기능성연두부의 제품화 가능성을 검토하기 위하여 외관적 관능에 영향을 미치는 색도의 변화를 분석하였다. 두부순물과 일반배지 동충하초 배양액 및 두부순물 동충하초 배양액을 농도별로 첨가하여 제조한 연두부의 색도(명도, 적색도, 황색도)의 변화는 도 46과 같다. 명도에 있어서는 두부순물과 일반배지 동충하초 배양액을 첨가한 농도가 증가할수록 증가하지만, 두부순물 동충하초 배양액은 첨가농도가 증가할수록 감소하여 전체적으로 회색이 증가하는 경향을 보였다. 적색도에 있어서는 일반배지 동충하초 배양액은 농도별로 명도의 큰 변화는 보이지 않고 있으나, 두부순물과 두부순물 동충하초 배양액의 첨가농도가 증가할수록 증가하였다. 황색도에 있어서는 전체적으로 큰 변화가 없었다.

따라서 동충하초배양액을 함유한 기능성연두부를 제조하기 위해서는 기존 연두부와 유사한 색도를 가진 0.3% 배양액 첨가가 가장 타당하다고 판단된다.

두부순물 및 일반배지 동충하초 배양액과 두부순물을 농도별로 첨가하여 제조한 연두부를 20℃에 보관하면서 색도의 변화를 측정한 결과는 도 47과 같다. 전체적으로 보관기간이 증가할 수록 명도는 감소하는 경향을 보였고, 적색도에 있어서는 특이한 증감현상을 발견할 수 없었다. 황색도에 있어서는 두부순물의 첨가를 제외하고는 대체적으로 감소하는 경향을 보였으며, 두부순물의 경우에는 1% 이상의 첨가농도와 0.3% 첨가농도간에 반대곡선을 보이고 있는 것으로 파악되어, 향후 제품화를 위한 관능색도중 황색도의 변화를 고려시 참고할 만한 기술적 정보를 획득하였다.

Ⅲ 결 론

두부제조 시 발생하는 오염 부하물로서 고비용으로 폐기 처분하고 있는 두부순물에서 6종의 버섯균주 배양을 통하여 최적 균주인 동충하초 균주를 선발하였다. 반응 표면분석법으로 최적 배양조건을 설정하였고, 2L 및 5L jar fermentor에서 순물을 기질로 한 동충하초 균주의 배양 특성을 조사하였다. 또 배양한 추출물의 성분분석 및 순물의 이소플라본과 동충하초의 기능물질인 codycepin의 성분변화를 분석, 비교하였다. 이의 기능성 제품화를 검토하기 위해 동충하초 배양액을 농도별로 첨가한 두부를 실온에서 저장하면서 물성, 관능 및 미생물의 변화를 분석하여 aglycones으로 전환된 이소플라본과 동충하초의 기능물질인 codycepin을 함유한 기능성 연두부의 제조공정을 확립하였다. 순물을 이용한 동충하초 배양액을 실용화 하기 위한 기술자료를 목적으로 조사한 결과는 다음과 같다.

1. 순물을 버섯 배양 배지원으로서의 가능성을 영지, 노루궁뎅이, 동충하초, 상황, 차가버섯 및 잎새버섯 등 6종의 버섯균주를 사용하여 액체배양하여 검토한 결과, 동충하초 균주가 8.1g/L/6day(5% total solid)로 가장 균사체 생육이 양호하 였다.

2. 선정한 동충하초의 최적 균사생육을 위해 순물배지 농도를 1~9% 범위로 하여 배양한 결과, 5%에서 최적의 균사생육을 보였다.

3. 순물의 영양성분 이용 정도를 탐색하기 위해 동결건조분말 및 액체 성상의 순물을 배지로 배양한 결과, 순물 액상을 간헐살균 처리하여 배양하는 것이 가장 적합하였다.

4. 액상의 순물을 배지로 액체배양 중 균사생육에 대한 교반속도의 영향을 검토한 결과, 150rpm에서 배양 6일에 최대 균사체량을 얻었으며 이때의 건조균사체량은 7.14g/L이었다.

5. 동충하초균의 최적의 균사생육 조건을 검토하기 위하여 pH, 접종량 및 배지액량을 독립변수로하고 건조균사체량을 종속변수로 하여 반응표면분석에 의한 최적 생육조건을 검토한 결과, 최적조건은 pH 5.8, 접종비 4% 및 배지액량 45.95ml에서 얻어졌고, 이때의 건조균사체 추정값은 7.67g/L 이었다.

6. 고체시료 및 액상시료를 액체배지로 조제, 사용하여 배양한 결과, 고체 시료구의 균사생육(8.12g/L/6day) 보다 액상 시료구 균사생육(9.96g/L/3day)의 productivity가 2.5배 증가하였다.

7. 생물반응기에서 배양 중 최적의 교반조건을 200~500rpm 범위에서 검토한 결과, 최대 균사체 생육은 300rpm에서 11g/L/4day이었다. 또한 통기속도를 0.5~2.0vvm으로 변화시키면서 검토한 결과, 통기속도 1vvm에서 11g/L/4day의 최대 균사생육을 얻었으며 1.5vvm 이상의 통기조건에서는 과도한 form의 발생으로 overflow가 발생하여, 균사체 생육의 최적조건은 교반속도 300rpm 및 통기속도 1vvm으로 결정하였다.

8. 동결건조한 두부순물과 동충하초의 기본배지 및 순물배지 버섯 배양액의 일반성분 분석을 시행하였고, 순물과 기본배지 및 순물배지 버섯배양액을 동결건조한 후 시료의 수분함량은 각각 3.68±2.8, 3.53±1.5 및 3.72±3.4%이었으며, 총단백질은 각각 0.45±0.030, 9.867±2.47 및 10.54±3.34%이었다. 총당의 함량은 각각 2.88±1.458%, 32.47±5.45 및 24.71±4.13%이었다. 회분은 각각 19.02±0.55, 5.44±1.37 및 7.53±2.1% 이었다.

9. 동충하초의 대표적 지표물질인 cordycepin을 분석하였고, 동충하초 버섯배양액에서 cordypepin의 존재를 확인하였으며, 그 함량은 0.0336% 이었다.

10. 순물 동결건조시료군의 토탈 이소플라본은 344±31.32㎎/100g이었고 이중 daidzin, daidzein, genistin 및 genistein의 함량은 각각 110±2.1, 16.2±4.95, 153±22.31 및 14.3±3.61㎎/100g 이었다. 한편 순물배지 버섯 배양액의 토탈 이소플라본, daidzin, daidzein, genistin 및 genistein의 함량은 각각 334±82.02, 105±23.21, 21.7±8.28, 129±34.5 및 37.8±5.52㎎/100g으로 순물시료에 비하여 daidzein의 함량은 비슷한 수준이었으나 genistein의 함량이 약2.94배 증가하였다.

11. 버섯배양액을 첨가하여 제조한 두부의 관능검사 결과를 상관분석한 결과, 95% 신뢰구간에서 역 상관관계를 보이고 있어 버섯배양액의 농도를 증가할 경우 color, flavor, taste, 전체적인 기호도가 감소하는 결과를 보였다.

12. 두부 제조 시 순물 버섯 배양액을 0~5% 범위의 농도로 첨가하여 제조한 두부를 20℃에서 저장 중 발생되는 총균수의 변화를 측정한 결과 저장 7일에 대조구는 7.8× 105 CFU/g의 생균수를 나타낸 반면, 버섯배양액 첨가구는 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3 및 5% 첨가농도에서 각각 1.7× 105, 1.1× 105, 0, 9.7× 105, 1.3× 105 및 1.79× 106 CFU/g의 생균수가 검출되었다. 따라서 연두부를 제조하고 순물에 동충하초를 배양한 순물배양액을 0.5% 농도로 첨가하면 두부의 저장기간의 연장효과를 기대 할 수 있을 것으로 판단되었다.

본 발명은 도면에 도시된 일 실시예를 참고로 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 등록청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims

β-glucosidase의 활성이 우수한 담자균류이자 큰 건조 균사체량 증가 특성을 가지는 동충하초 균사체를 이용하여 두부 순물 속에 포함된 배당체 형태의 이소플라본을 aglycone 형태로 변환하는 단계; 및

상기 동충하초 균사체를 배양하여 이소플라본이 aglycone 형태로 변환된 순물배양액을 0.5% 농도로 첨가하여 연두부를 생성하는 단계를 포함하는 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 두부 순물은 순물 액상을 간헐살균 처리하여 균사체를 배양하는 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 두부 순물에 있어서,

순물 동결건조시료군의 genistein의 함량은 순물배지 버섯 배양액의 genistein의 함량에 비하여 약 3배가 큰 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,

상기 동충하초 균사체는 0.0336% 함량의 cordycepin을 포함하는 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 동충하초 균사체를 순물 배지에서 액체배양하기 위한 균사생육의 최적 농도는 5%인 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 동충하초 균사체를 순물 배지에서 액체배양하기 위한 균사생육의 최적의 진탕속도는 150rpm인 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 동충하초 균사체를 순물 배지에서 액체배양 시 정상점은 pH 5.81, 접종비 4% 및 배지액량 45.95ml에서 형성되는 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법.
제 1항에 있어서,

액상의 순물을 배지로 상기 동충하초 균사체를 액체배양할 때 최적의 균사생육에 대한 교반속도는 150rpm에서 배양 6일인 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법.
제 1항에 있어서,

생물반응기에서 상기 동충하초 균사체 생육의 최적조건은 교반속도 300rpm 및 통기속도 1vvm인 두부 순물을 활용한 버섯 배양 생성물의 첨가 연두부의 제조 방법.