KR20020007553A - 미생물을 이용한 어글리콘 이소플라본의 생산 방법 - Google Patents

미생물을 이용한 어글리콘 이소플라본의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 β-글루코시다제를 분비하는 미생물을 이용하여 이소플라본 배당체로부터 간편하고 경제적이며 효과적으로 어글리콘 이소플라본을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 이소플라본 배당체로부터 어글리콘 이소플라본을 생산함에 있어서, (a) 이소플라본 배당체를 포함하는 용액을 흡착 수지가 충진된 칼럼에 가하고, (b) β-글루코시다제를 분비하는 미생물을 배양한 후 균체를 제거하여 얻은 배양상층액을 상기 칼럼에 연속적으로 순환시켜 상기 수지에 흡착된 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 전환시킨 후 상기 배양상층액을 제거하고, (c) 상기 칼럼으로부터 어글리콘 이소플라본을 회수하거나; 또는 (i) 이소플라본 배당체를 포함하는 용액에 β-글루코시다제를 분비하는 미생물을 접종하고 배양하여 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 전환시키고 (ii) 얻어진 배양액으로부터 균체를 제거한 배양상층액을 흡착 수지가 충진된 칼럼에 가하여 어글리콘 이소플라본을 흡착시킨 후, (iii) 상기 칼럼으로부터 어글리콘 이소플라본을 회수하는 것을 특징으로 한다.

Description

미생물을 이용한 어글리콘 이소플라본의 생산 방법{PROCESS FOR PRODUCING AGLYCONE ISOFLAVONES USING MICROORGANISM}
본 발명은 이소플라본(isoflavone)을 함유한 식물로부터 유래된 이소플라본 유도체 및 배당체 함유하는 용액을 칼럼에 충진된 흡착수지에 흡착시킨 후 여기에 β-글루코시다제를 분비하는 미생물을 배양한 후 균체를 제거하여 얻은 배양상층액을 순환시키거나, 상기 미생물을 상기 추출액 중에서 배양한 후 균체를 제거하여 얻은 배양상층액을 흡착수지가 충진된 칼럼에 통과시켜, 어글리콘 이소플라본을 생산하는 방법에 관한 것이다.
이소플라본은 콩과식물, 칡 등의 식물종에 존재하는 천연 화합물로서, 여성 호르몬의 일종인 에스트로겐과 유사한 구조를 가지며, 피토에스트로겐(phytoestrogen)과 같은 생리적 기능이 있음이 밝혀졌다. 이소플라본은 C15H10O2의 분자식을 지닌 화합물군으로 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein) 및 그 글루코스 배당체, 나아가서는 아세틸화체, 마로닐화체(malonyl) 등 총 12 종류가 천연의 상태로 존재하는 이성체로 알려져 있으며 주로 배당체의 형태로 존재하는 물질이다. 또한 이들은 예전에 단순한 색소로만 여겨져 왔으나 최근의 연구들을 통해서 항암효과(Barnes,J. Nutr.,125, 777s, (1995); Akiyama et al.,J. Biol. Chem.,262(2), 5592 (1987); Molteni et al.,J. Nurt.,125, 751s (1995), 골다공증 예방(Shino et al.,Life Sci.,42(11), 1123 (1988)), 만성질환 예방(Fotsis et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA.,90, 2690 (1993)), 항산화 효과(Naim et al.,J. Agric. Food Chem.,24(6), 1174 (1976)), 알데히드 탈수소효소 억제 작용(Keung and Vallee,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 1247 (1993)), 전립선 암의 예방(Peterson and Barnes,The Prostate,22, 335 (1993)) 등의 역할이 계속 밝혀지고 있다.
이소플라본은 자연 상태에서 대부분이 배당체의 형태로 존재하는데, 이러한 이소플라본 배당체는 체내에서 위산에 의해 분해되지 않아 그대로 흡수되지 못하며 대장내 미생물로부터 분비되는 효소에 의해 분해된 후 흡수되고 있어, 그 흡수율이 낮은 단점이 있다(미국 특허 제5,506,211호). 반면에 어글리콘 이소플라본은 체내에서 부가적인 변환이 없이 위와 소장에서 직접 흡수되는 장점을 가진다. 이에 따라 흡수율이 높은 어글리콘 이소플라본의 생산 방법이 절실히 요구되고 있다.
식물체로부터 이소플라본을 추출하는 종래의 방법으로서, 미국특허 제5,679,806호에서는 대두와 칡으로부터 에탄올 또는 메탄올을 이용하여 추출, 정제하는 일련의 공정을 거쳐 이소플라본 배당체만을 추출해내는 기술을 제시하였으며, 미국특허 제4,524,067호에서는 대두를 메탄올로 추출하여 사포닌을 얻는 기술을 제안하였고, 미국특허 제4,428,876호에서는 대두를 가성소다로 추출한 후 일련의 공정을 거쳐 단백질, 올리고당, 사포닌, 이소플라본 배당체 등을 분리하는 방법을 제시하였다. 그러나 이 방법들에 의하면 모두 이소플라본 배당체가 생산된다.
한편, 어글리콘 이소플라본은 이소플라본 배당체를 전환시켜 얻을 수 있는데, 이러한 전환 방법에는 크게 두가지가 있다. 첫 번째 방법은 산을 이용하여 이소플라본 배당체를 가수분해하는 것인데, 예를 들어 미국특허 제5,679,806호에서는 이소플라본 배당체를 4N HCl과 105℃에서 5 시간 반응시켜 산가수분해시킴으로써 이소플라본 어글리콘을 제조하였다. 그러나 이 방법은 반응이 가혹한 조건에서 이루어지고 공정 후 발생되는 폐수의 처리가 문제되며, 부가적인 정제 공정 등 번거로운 공정이 필요한 단점이 있다.
두 번째 방법은 β-글루코시다제를 이용하여 이소플라본 배당체를 가수분해하는 것인데, 예를 들어, 미국특허 제6,015,785호에서는 대두를 물에 넣고 여기에 일정량의 β-글루코시다제를 넣은 후 온도 40-60 ℃, pH 4-5에서 일정시간 반응시켜 어글리콘을 제조하는 방법을 기술하였다. 최연배 등(한국식품과학회지, vol 31, No.1, 189-195(1999))은 대두 요구르트 제조시 유산균에 의한 이소플라본 배당체의 가수분해에 관하여 기술하였다. 일본 공개특허공보 제11169127호에서는 콩추출물에 β-글루코시다제를 넣고 25-65 ℃에서 30 분 내지 3 시간 정도 반응시켜 어글리콘 이소플라본으로 전환시킨 후 일련의 공정을 거쳐 두유를 제조하는 방법을 기술하였다. 일본 공개특허공보 제11089589호에서는 미생물에서 유래된 β-글루코시다제를 사용하여 콩배아의 이소플라본을 추출하지 않고 어글리콘으로 전환하는 기술에 대하여 기술하였다.
특히, 현재까지 알려진 β-글루코시다제를 이용한 어글리콘 이소플라본의 생산 방법에서는, 이소플라본을 함유한 식물로부터 열수 또는 알콜을 이용하여 이소플라본 배당체를 추출한 후, 여기에 β-글루코시다제를 가하고 일정 조건에서 반응시킨 다음 반응물을 흡착수지가 충진된 칼럼 등에 통과시키는 일련의 정제공정을 거쳐 얻는다. 그러나, 이 방법에 따르면 매 추출물의 가수분해 반응시 매번 효소를 첨가하여 반응시킨 후 반응물을 흡착수지에 흘려보내 어글리콘 이소플라본을 흡착시키고 효소는 폐기하는 일련의 공정을 수회 내지 수십 회를 반복한 다음 흡착수지로부터 어글리콘 이소플라본을 회수하는 번거로움과 어려움이 있다. 또한 어글리콘 이소플라본은 배당체와는 달리 소수성이 강하여 상대적으로 물에 대한 용해도가 매우 낮기 때문에, 전환된 어글리콘 이소플라본을 정제하는 상기 방법은 그 정제 과정에서 어글리콘 이소플라본이 용해도의 저하로 인해 오히려 수지에 흡착되지 않고 손실되어 생산성이 저하될 뿐 아니라 오히려 생산비용이 증가하고 공정이 복잡해지는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 상기의 복잡한 제조공정을 단순화시키고 생산비용을 절감할 수 있으며 위험성이 없는 어글리콘 이소플라본의 효율적인 제조방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 열수 추출된 이소플라본 배당체 용액을 이소플라본 배당체가 충분히 흡착될 정도의 양으로 흡착수지 칼럼에 흘려보내 수지를 이소플라본 배당체로 포화시킨 후 여기에 β-글루코시다제를 분비하는 미생물을 발효시킨 후 균체를 제거하여 얻은 발효액을 가하고 일정온도 및 pH를 유지하면서 칼럼을 통해 순환시켜 이소플라본 배당체가 완전히 어글리콘 이소플라본으로 전환되도록 충분히 반응시킨 후 물로 세척하고 어글리콘 이소플라본을 회수하거나, 상기 추출액을 배지로 사용하여 일정온도 및 pH를 맞춘 후 일정시간 동안 배양하고 균체를 제거한 다음 흡착수지에 흡착시키고 이어서 물로 세척하고 에탄올이나 메탄올과 같은 알콜 용매를 이용하여 어글리콘 이소플라본을 회수하는 단계를 포함하는 방법을 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 β-글루코시다제를 분비하는 미생물을 이용하여 이소플라본 배당체로부터 간편하고 경제적이며 효과적으로 어글리콘 이소플라본을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 방법의 개요를 보여주는 모식도이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 이소플라본 배당체로부터 어글리콘 이소플라본을 생산하는 데 있어서, (a) 이소플라본 배당체를 포함하는 용액을 흡착 수지가 충진된 칼럼에 가하고, (b) β-글루코시다제를 분비하는 미생물을 배양한 후 균체를 제거하여 얻은 배양상층액을 상기 칼럼에 연속적으로 순환시켜 상기 수지에흡착된 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 전환시킨 후 상기 배양상층액을 제거하고, (c) 상기 칼럼으로부터 어글리콘 이소플라본을 회수하는 것을 특징으로 하는, 어글리콘 이소플라본의 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명에서는 이소플라본 배당체로부터 어글리콘 이소플라본을 생산하는 데 있어서, (i) 이소플라본 배당체를 포함하는 용액에 β-글루코시다제를 분비하는 미생물을 접종하고 배양하여 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 전환시키고 (ii) 얻어진 배양액을 여과하여 균체를 제거하고 배양상층액을 흡착 수지가 충진된 칼럼에 가하여 어글리콘 이소플라본을 흡착시킨 후, (iii) 상기 칼럼으로부터 어글리콘 이소플라본을 회수하는 것을 특징으로 하는, 어글리콘 이소플라본의 생산 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 이소플라본 배당체를 포함하는 용액으로는 이소플라본 배당체를 포함하는 식물, 예를 들어 대두(soybean), 콩배아, 칡, 토끼풀, 자주개자리 또는 검은 콩 등의 분말을 열수 추출하여 얻어진 추출액, 및 두부순물 등을 들 수 있다. 상기 추출물은 상기 식물 분말 40 내지 120 ㎏을 1.5 톤(t) 탱크(tank)에서 물 0.5 내지 1.2 t에 혼합한 뒤 열수 추출을 하기 위해 온도를 60 ℃ 내지 100 ℃에서 30 분 내지 3 시간 정도 스팀 가열한 후, 동일 온도에서 추출액에 4 N 염산을 가해 pH를 3.0 내지 8.0으로 조절한 다음 바로 데칸타(decantor, 연속원심분리기)로 통과시켜 추출액과 슬러지를 분리함으로써 얻을 수 있다. 다른 방법으로는 추출시에 알콜, 예를 들어 에탄올을 70% 이상의 조건으로 사용하여 식물체를추출한 후 pH를 조절하고, 원심분리하여 이소플라본 배당체를 함유하는 추출액을 얻을 수도 있다.
본 발명에서 이소플라본 배당체로부터 어글리콘 이소플라본으로의 전환에 사용되는 미생물로는, β-글루코시다제를 분비하는 특징을 갖는 한 어떠한 미생물이라도 사용할 수 있으며, 대표적인 예로는 아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주, 리스테리아(Listeria)속 균주, 박테로이드(Bacteroides)속 균주 등이 있고 특히 본 발명자들이 대두추출물이 충진된 후 외부에 노출된 칼럼으로부터 분리해낸 효모(Saccharomyces cerevisiae) SKEUGEN001(KCTC 0799BP)과 유산균(Lactobacillus pentosus) SKEUGEN002(KCTC 0798BP)이 바람직하다. 특히 효모 SKEUGEN001(KCTC 0799BP)과 유산균 SKEUGEN002(KCTC 0798BP)는 MRS 배지(1 ℓ 당 박토 프로테오스 펩톤 No. 3 10g, 박토 쇠고기 추출물 10g, 박토 효모 추출물, 박토 덱스트로스 20g, 트윈 80 1g, 암모니움 시트레이트 2g, 소디움 아세테이트 5g, 마그네슘 설페이트 0.1g, 망간 설페이트 0.05g 및 디포타슘 포스페이트 2g; Difco사), TPY 배지(1 ℓ 당 트립티카제(BBL) 10g, 피톤 펩톤(BBL) 5g, D-글루코즈 5g, 효모 추출물 2.5g, 시스테인-HCl 0.5g, K2HPO42g, MgCl2(6H2O) 0.5g, ZnSO4(7H2O) 0.25g, CaCl20.15g, FeCl3미량, 트윈 80 1㎖; Difco사) 또는 TSA 배지(1 ℓ 당 트립토판(카제인의 췌액 소화물) 17g, 소이톤(대두 가루의 파파인 소화물) 3g, 덱스트로즈, 2.5g, 소디움 클로라이드 5g 및 디포타슘 포스페이트 2.5g; Difco사)에서 25 내지 45의 온도, pH 3 내지 10의 범위하에 배양하는 것이 바람직한데, 그 이유는 상기온도와 pH하에서 균주들의 활성이 우수하기 때문이다. 또한 상기 효모는 비타민 또는 영양분이 풍부해서 식용으로도 사용되는 안전한 미생물이며 상기 유산균도 장내에서 유해균의 성장을 억제하는 유용한 미생물로서, 이 균주들이 본 발명의 방법에 따라 얻어진 어글리콘 이소플라본에 잔존하더라도 안전하다는 장점을 가진다.
본 발명에서 이소플라본의 정제에 사용되는 흡착 수지로는, 약간의 극성을 지니고 있거나 비극성인 수지가 바람직하며, 예를 들어 아크릴릭 에스터(acrylic ester), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate)와 같은 아크릴 계열의 수지나 폴리스티렌(polystyrene)과 같은 폴리아로마틱(polyaromatic) 계열의 수지 등을 사용할 수 있다. 상용품으로서는 HP20(DIAION사 제품) 또는 XAD-7(ROHM & HASS사 제품)을 예로 들 수 있다.
이하, 상기 이소플라본 배당체를 포함하는 용액, 미생물 및 흡착수지를 사용하여, 본 발명의 한 태양에 따라 이소플라본이 흡착된 칼럼에 미생물 발효액을 순환시키는 공정을 이용한 방법을 상세히 설명한다.
먼저, 상기 이소플라본 배당체를 포함하는 용액을 30 ℃ 내지 70 ℃에서 상기 흡착수지가 충진된 칼럼에 유속이 분당 1 내지 4 ℓ가 되도록 흘려보내 총 이소플라본 배당체가 수지에 흡착되도록 한다. 이 용액을 모두 통과시킨 칼럼에 증류수를 충분히 흘려보내 수지를 세척한다.
한편으로는 상기 미생물을 적절한 배지 중에서 pH 3.0 내지 10.0, 25 ℃ 내지 45 ℃에서 8 내지 50 시간 동안 배양한 후 필터로 여과하여 균체를 제거하여 배양상층액을 얻는다. 이 배양상층액의 pH를 4.0 내지 8.0으로 조절한 후 칼럼에 연결된 순환 장치, 예를 들어, 온도 조절이 가능한 순환펌프가 달린 탱크, 온도조절이 가능한 칼럼 또는 온도를 유지할 수 있는 칼럼에 가한 다음, 25 ℃ 내지 80 ℃에서 15 내지 200 ㎖/분의 유속으로 1 시간 내지 72 시간 동안 순환시켜, 이 배양상층액에 포함된 β-글루코시다제에 의해 수지에 흡착된 이소플라본 배당체가 어글리콘 이소플라본으로 전환되도록 반응시킨다. 이때 배양상층액은 칼럼의 수지가 배양상층액속에 잠길 정도로 넣는데, 수지보다 약 10 ㎝ 정도 더 높게 투입하는 것이 바람직하다. 특히, 순환 과정중의 상기 온도와 pH는 발효액중에 존재하는 β-글루코시다제의 활성을 최적화하는데 매우 중요하다.
반응이 끝난 후, 상기 배양상층액을 탱크에서 제거하고 수지를 증류수로 세척한 다음 적절한 용출액을 칼럼에 흘려보내 칼럼으로부터 어글리콘 이소플라본을 회수한다. 이때 용출액으로서는 에탄올, 메탄올 등을 사용할 수 있고, 70 % 이상의 에탄올이 바람직하며, 95 % 에탄올이 바람직하다. 회수의 종료는 260 ㎚에서 흡광도를 갖는 이소플라본을 기준물질로 하여 흡광도가 일정수준 이하로 내려갈 때, 예를 들어 흡광치가 0.01 이하로 내려갈 때를 기준으로 한다. 회수된 용출액을 온도 40 ℃ 내지 80 ℃에서 감압 농축한 후 농축물을 30 ℃ 내지 80 ℃에서 감압 건조하여 옅은 미황색의 어글리콘 이소플라본을 얻을 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하기 위한 장치는 도 1에 예시된 바와 같은 구조를 가질 수 있으며 밸브를 통해 어글리콘 이소플라본을 회수할 수 있다.
이하, 본 발명의 다른 태양에 따라 이소플라본 배당체를 포함하는 용액에서 미생물을 배양하는 공정을 이용한 방법을 설명한다.
이소플라본 배당체를 포함하는 용액을 통상적인 방법에 따라 살균한 후 pH를 3.0 내지 10.0, 바람직하게는 6.0 내지 7.0, 온도 25 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 33 ℃ 내지 38 ℃로 조절한 다음, 여기에 β-글루코시다제를 분비하는 미생물의 배양액을 약 0.5 내지 5 %(v/v)의 농도로 접종하고 8 내지 50 시간 동안 배양하여, 상기 용액 중에 포함된 이소플라본 배당체가 어글리콘 이소플라본으로 전환되도록 반응시킨다. 이 때, 이소플라본 배당체의 어글리콘 이소플라본에로의 전환은 260nm에서 흡광도를 갖는 이소플라본을 기준물질로 하여 확인할 수 있다. 특히 순환 과장에서 상기 온도와 pH는 균주의 성장을 최적화하는데 매우 중요하다.
반응이 끝난 후 얻어진 배양액을 여과하여 균체를 제거한 다음 상기와 동일한 방법으로 흡착수지가 충진된 칼럼에 흘려보내 어글리콘 이소플라본을 흡착시킨 다음, 동일한 방법으로 세척 및 용출하여 어글리콘 이소플라본을 회수한다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예: β-글루코시다제를 분비하는 미생물의 분리
대두 추출물이 충진된 칼럼에서 번식하던 미생물들로부터 평판희석배양 방법에 따라 β-글루코시다제를 분비하는 2종의 미생물을 분리하였다.
이어서 분류 프로그램이 포함된 API 키트(Biomeriux Inc., 프랑스)를 사용하여 분석 및 동정한 결과 이중 한 균주는 (Saccharomyces cerevisiae)로서 99% 이상의 상동성(homology)를 나타내어, 본 발명자들은 이 균주를 효모 SKEUGEN001로 명명하였다.
또한 나머지 한 종의 균주의 16S rDNA 부분 염기서열 분석을 (주)마이크로아이디에 의뢰하여 서열번호: 1의 염기서열을 확인하였으며 이로부터 이 균주가 유산균(Lactobacillus pentosus)인 것으로 확인하였고, 본 발명자들은 이 균주를 유산균 SKEUGEN002로 명명하였다.
상기 효모 SKEUGEN001과 유산균 SKEUGEN002 균주는 각각 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000년 6월 2일에 기탁번호 제 KCTC 0799BP 호와 제 KCTC 0798BP 호로 기탁되었다.
실시예 1
콩 분말 50 ㎏을 1.5 t 탱크에서 물 1.0 t과 혼합한 후 95 ℃에서 1 시간 정도 스팀 가열하여 열수 추출하였다. 80 ℃에서 열수 추출액에 4 N 염산을 가하여 pH를 4.0으로 조절한 후 바로 데칸타(decantor)로 통과시켜 추출액과 슬러지를 분리하였다. 55 ℃에서 바로 추출액을 수지인 HP20(DIAION사 제품) 400 ℓ 칼럼에 분당 2 ℓ의 유속으로 흘려보내 이소플라본 배당체가 수지에 흡착되도록 한 후 이 칼럼에 증류수를 충분히 흘려보내 수지를 세척하였다.
이어서, 효모 SKEUGEN001(기탁번호 제 KCTC 0799BP호)를 추출액 중에서 pH 6.5로 유지시키면서 37 ℃에서 10 rpm으로 20 시간 동안 배양한 후 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 균체를 제거하였다. 여액을 pH 6.0으로 조절한 후 얻어진 용액 180 ℓ를칼럼과 연결된 40 ℃로 조절된 열교환 순환 탱크에 넣고 60 시간 동안 순환시켜 칼럼에 흡착된 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 전환시켰다. 고압 액체 크로마토그래피(HPLC, 영린기기)를 수행하여 260 ㎚ 흡광도를 갖는 이소플라본을 기준물질로 하여 약 80 % 이상의 이소플라본 배당체가 이소플라본으로 전환됨을 확인하였으며, 약 80% 이상 전환되었을 때 순환을 종료하였다. 순환 종료 후 칼럼에 95 % 에탄올을 흘려보내 수지에 흡착된 이소플라본을 회수하였다. 회수의 종료 확인도 동일한 방법으로 HPLC를 수행하여 흡광치가 0.005 이하로 내려갈 때를 기준으로 하였다.
회수된 에탄올 용출액을 60 ℃에서 감압 농축한 후 65 ℃에서 감압 건조하여 건조물 0.8 ㎏을 얻었다. 이 중 총 이소플라본은 0.32 ㎏이었다.
실시예 2
유산균 SKEUGEN002(기탁번호 제KCTC 0798BP호)를 사용하고 여액의 pH를 1M NaOH를 사용하여 5.3 으로 조절한다는 점을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여, 건조물 0.9 ㎏을 얻었으며 이 중 총 이소플라본은 0.36 ㎏이었다.
실시예 3
콩 분말 50 ㎏을 1.5 t 탱크에서 물 1.0 t에 혼합한 후 95 ℃에서 1 시간 정도 스팀 가열하여 열수 추출하였다. 80 ℃에서 추출액에 4 N 염산을 가하여 pH를4.0으로 조절한 다음 바로 데칸타로 통과시켜 추출액과 슬러지를 분리하였다.
추출액을 온도 조절가능한 반응 탱크에 옮긴 후 100 ℃에서 30 분간 살균한 다음 1M NaOH로 pH를 6.5로 조절하였다. 이어서, 효모 SKEUGEN001(기탁번호 제KCTC 0799BP호)를 MRS 배지(1 ℓ 당 박토 프로테오스 펩톤 No. 3 10g, 박토 쇠고기 추출물 10g, 박토 효모 추출물, 박토 덱스트로스 20g, 트윈 80 1g, 암모니움 시트레이트 2g, 소디움 아세테이트 5g, 마그네슘 설페이트 0.1g, 망간 설페이트 0.05g 및 디포타슘 포스페이트 2g; Difco사)에서 종균(seed) 배양하여 얻은 발효액을 상기 반응 탱크에 들어있는 추출액에 추출액의 2 %(v/v)의 양으로 접종한 후, 37 ℃에서 10 rpm의 임펠러 속도로 24 시간 동안 배양하여 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 전환시켰다. 260 ㎚에서 흡광도를 갖는 이소플라본을 기준물질로 하여 배당체 이소플라본이 어글리콘 이소플라본으로 전환됨을 확인하였으며, 90% 이상 전환되었을 때 배양을 종료하였다.
배양 종료 후, 배양액을 1N HCl로 pH 4.0으로 조절한 다음 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 미생물을 제거하여 여액을 얻고, 이 여액을 수지인 XAD-7(ROHM & HASS사 제품) 400 ℓ칼럼에 분당 2 ℓ의 유속으로 흘려보내 이소플라본이 수지에 흡착되도록 하였다. 이소플라본이 흡착된 칼럼에 증류수를 충분히 흘려보내 수지를 세척한 후, 에탄올(95%)을 흘려보내 수지에 흡착된 이소플라본을 회수하였다. 회수의 종료 확인도 동일한 방법으로 HPLC를 수행하여 흡광치가 0.005 이하로 내려갈 때를 기준으로 하였다.
회수된 에탄올 용출액을 60 ℃에서 감압 농축한 후 65 ℃에서 감압 건조하여건조물 0.85 ㎏을 얻었다. 이 중 총 이소플라본은 0.3 ㎏이었다.
실시예 4
유산균 SKEUGEN002(기탁번호 제KCTC 0798BP호)를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 3에서와 동일한 방법으로 실시하여, 건조물 1.05 ㎏을 얻었으며 이 중 총 이소플라본은 0.4 ㎏이었다.
실시예 5
두부순물 5.0 t에 4 N 염산을 가하여 pH를 4.0으로 조절한 후 XAD-7(ROHM & HASS사 제품) 400 ℓ 칼럼에 분당 2 ℓ의 유속으로 흘려보내 총 이소플라본이 수지에 흡착되도록 한 후 이 칼럼에 증류수를 충분히 흘려보내 수지를 세척하였다.
이어서, 유산균 SKEUGEN002(기탁번호 제 KCTC 0798BP호)를 실시예 1에서와 동일하게 콩 추출액 중에서 1M NaOH를 사용하여 pH 6.5로 유지시키면서 37 ℃에서 10 rpm으로 16 시간 동안 배양한 후 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 균체를 제거하였다. 여액을 pH 6.0으로 조절한 후 얻어진 용액 180 ℓ를 칼럼과 연결된 50 ℃로 조절된 열교환 순환 탱크에 넣고 60 시간 동안 순환시켜 칼럼에 흡착된 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 전환시켰다. HPLC(영린기기)를 수행하여 260 ㎚ 흡광도를 갖는 이소플라본을 기준물질로 하여 이소플라본 배당체가 어글리콘 이소플라본으로 전환됨을 확인하였으며, 약 약 80 % 이상이 전환되었을 때 발효를 종료하였다.
종료 후 칼럼에 95 % 에탄올을 흘려보내 수지에 흡착된 이소플라본을 회수하였다. 회수의 종료 확인도 동일한 방법으로 HPLC를 수행하여 흡광치가 0.005 이하로 내려갈 때를 기준으로 하였다.
회수된 에탄올 용출액을 60 ℃에서 감압 농축한 후 65 ℃에서 감압 건조하여 건조물 0.9 ㎏을 얻었다. 이 중 총 이소플라본은 0.36 ㎏이었다.
본 발명의 방법은 기존의 어글리콘화 방법보다 간단하고 간편한 공정을 통해 경제적으로 고함량의 어글리콘 이소플라본을 생산한다. 특히 본 발명의 방법에 사용되는 효모 SKEUGEN001(KCTC 0799BP) 또는 유산균 SKEUGEN002(KCTC 0798BP)는 매우 안전하다는 장점이 있다. 또한 본 발명에서는 종래의 효소 대신 미생물을 사용함으로써 매우 저렴하다.

Claims (10)

  1. 이소플라본 배당체로부터 어글리콘 이소플라본을 생산하는 데 있어서, (a) 이소플라본 배당체를 포함하는 용액을 흡착 수지가 충진된 칼럼에 가하고, (b) β-글루코시다제를 분비하는 미생물을 배양한 후 균체를 제거하여 얻은 배양상층액을 상기 칼럼에 연속적으로 순환시켜 상기 수지에 흡착된 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 전환시킨 후 상기 배양상층액을 제거하고, (c) 상기 칼럼으로부터 어글리콘 이소플라본을 회수하는 것을 특징으로 하는, 어글리콘 이소플라본의 생산 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 이소플라본 배당체를 포함하는 용액이 이소플라본을 함유한 식물체를 물 또는 알콜로 추출하여 얻어진 추출액 또는 두부순물인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 흡착 수지가 아크릴 계열의 수지 또는 폴리아로마틱 계열의 수지인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 미생물이 효모(Saccharomyces cerevisiae) SKEUGEN001(KCTC0799BP) 또는 유산균(Lactobacillus pentosus)SKEUGEN002(KCTC 0798BP)인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 발효액을 25 내지 80 ℃의 온도 및 pH 3.5 내지 8.0인 범위에서 15 내지 200 ㎖/분의 유속으로 1 내지 72 시간 동안 순환시키는 방법.
  6. 이소플라본 배당체로부터 어글리콘 이소플라본을 생산하는 데 있어서, (i) 이소플라본 배당체를 포함하는 용액에 β-글루코시다제를 분비하는 미생물을 접종하고 배양하여 이소플라본 배당체를 어글리콘 이소플라본으로 전환시키고 (ii) 얻어진 배양액을 여과하여 균체를 제거하고 여액을 흡착 수지가 충진된 칼럼에 가하여 어글리콘 이소플라본을 흡착시킨 후, (iii) 상기 칼럼으로부터 어글리콘 이소플라본을 회수하는 것을 특징으로 하는, 어글리콘 이소플라본의 생산 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 (i) 단계에서 이소플라본 배당체를 포함하는 용액이 이소플라본을 함유한 식물체를 물 또는 알콜로 추출하여 얻어진 추출액 또는 두부순물인 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 (i) 단계에서 미생물이 효모(Saccharomyces cerevisiae) SKEUGEN001(KCTC 0799BP) 또는 유산균(Lactobacillus pentosus)SKEUGEN002(KCTC 0798BP)인 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 (i) 단계에서 배양 과정이 25 내지 45 ℃의 온도 및 pH 3.0 내지 10의 범위하에서 8 내지 50 시간 동안 수행되는 방법.
  10. 제 6 항에 있어서,
    상기 (ii) 단계에서 흡착 수지가 아크릴 계열의 수지 또는 폴리아로마틱 계열의 수지인 방법.
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