KR100302560B1 - 이소플라본의 아글리콘의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이소플라본의 아글리콘을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주 또는트리코더마(Trichoderma)속 균주를 이소플라본 분말 수용액에서 배양하여 이소플라본의 아글리콘을 배양액에 축적시키는 단계; 및 배양액으로부터 이소플라본의 아글리콘을 회수하는 단계를 포함하는 이소플라본의 아글리콘의 제조방법에 관한 것으로, 상기 이소플라본 분말 수용액은 대두를 침지한 후, 분쇄한 다음, 여과하여 여액을 얻는 단계; 여액에 응고제를 부가하여 단백질을 침전시킨 후, 여과하여 상등액을 얻는 단계; 상등액에 여과보조제를 넣고, 여과하여 여액을 얻는 단계; 여액을 다시 흡착수지 또는 한외여과막을 통과시켜 농축액을 얻은 다음, 분무 건조 또는 동결 건조하여 이소플라본의 분말을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻는 것임을 특징으로 하는 이소플라본의 아글리콘의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 한외여과에 의해 이소플라본을 분리하고, 이소플라본의 수용액에서 직접 아스퍼질러스속 균주 또는 트리코더마속 균주를 배양하여 이소플라본의 아글리콘을 제조하였으므로. 경제적인 방법이다. 또한, 직접 대두로부터 제조할 수도 있지만, 두부폐액으로부터 제조할 수 있으므로, 더욱 경제적이다.
Description
본 발명은 이소플라본의 아글리콘을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주 또는트리코더마(Trichoderma)속 균주를 이소플라본 분말 수용액에서 배양하여 이소플라본의 아글리콘을 제조하는 방법에 관한 것이다.
콩은 인류의 중요한 식량자원으로 활용되어 왔으며, 단백질, 필수지방산, 인지질, 비타민 E 및 칼슘 등이 풍부해 사람이 섭취할 경우 여러 가지 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 콩의 생리활성은 고혈압방지효과, 혈전용해능, 혈중콜레스테롤 저하효과 등의 각종 성인병 예방 효과가 있고, 뿐만 아니라 항암성, 항돌연변이성, 노화방지는 물론 두뇌활동과 피부미용에도 좋은 것으로 알려져 있다. 또한, 콩은 고추장, 된장, 간장, 콩요구르트를 비롯해 두유, 두부, 유부 등 여러 가지 모습으로 변신이 가능한 다재다능한 식품이다.
최근 이러한 '콩'의 또 한가지 성분과 기능에 대해 일반인들의 관심이 집중되고 있는데, 바로 콩 속에 함유된 기능성 성분인 이소플라본류가 그 주인공으로서, 이소플라본류는 암, 심장병, 골다공증, 신장병 등의 예방 및 치료 효과가 있다고 보고되어 있다. 콩에 들어 있는 주요 이소플라본류로는 제니스테인(genistein) 글리코시드, 다이드제인(daidzein) 글리코시드, 글리시테인(glycitein) 글리코시드 등이 있다. 이소플라본의 함량은 콩의 품종과 재배 조건 등에 따라 크게 다른데, 보통 0.6~3.1mg% 정도이며, 이중 두부나 대두단백 제조시 이소플라본의 30~50%정도의 손실이 따른다.
한편, 대두 중의 이소플라본 및 이소플라본 아글리콘의 종류 및 구조식은 다음과 같다.
대두로부터 이러한 이소플라본 아글리콘을 제조하는 방법으로는, 미국특허 제 5,679,806호에 개시된 방법이 있다. 즉, 대두를 마쇄한 후, 여기에 에틸 알코올 또는 메틸 알코올 용매를 대두:용매가 1:3~1:10이 되도록 부가하고, 40~70℃에서 가온하여 추출한 다음, 이를 수회 반복하여 추출용매를 합하고, 이를 물로 희석하여 조 엑기스(crude extract)를 얻은 다음, 다시 이를 여과하여 불용성 성분이 제거된 이소플라본의 조엑기스를 얻는 단계; 조 엑기스에 남아 있는 수용성 페놀, 단백질 또는 당류 등의 불순물을 제거하기 위해서 폴리스티렌이 기질로 만들어진 흡착수지 또는 폴리아크릴이 기질로 만들어진 흡착수지 등을 사용하여 이소플라본을 정제하는 단계; 및 이를 에틸알코올 또는 메틸알코올을 이용하여 용리하고, 이를 산으로 분해하여 이소플라본 아글리콘을 생성시킨 후, 여과, 건조, 결정화 등의 공정을 거쳐 이소플라본 아글리콘을 얻는 단계로 이루어진 방법이 있다.
그러나, 상기한 방법은 이소플라본 아글리콘인 제니스테인, 다이드제인, 글리시테인 등의 각 성분을 고순도로 얻을 수 있는 장점이 있으나, 상기 기술과 같이 추출시 용매가 다량 사용되고, 용리시 알코올의 농도를 조절함으로써, 에탄올 회수시 시간과 비용이 많이 발생할 수 있으며, 더구나, 이소플라본의 아글리콘을 얻기위해 산으로 처리함으로써 이소플라본의 구조 변화가 예상될 수 있고, 또한 순도를 높이기 위하여 중화하는 등의 별도 공정이 필요한 문제점이 있다.
또한, 한국 공개특허 제 90-13878호에 두부 폐액으로부터 식품소재 및 건강음료를 제조하는데 있어서, 두부폐액을 한외여과하여 이소플라보노이드 등의 배당체물질을 주제로하는 식품소재를 제조하는 방법에 공지되어 있으나, 이는 단순한 이소플라본 제조 방법으로 고순도의 이소플라본, 즉 이소플라본의 아글리콘을 생산하기 위해서는 추가 개선 공정이 필요한 문제점이 있다.
또한, 한국공개특허 제96-704927호 제96-704928호 제96-704929호 제 98-24361호 제98-32766호에 효소를 이용하여 이소플라본을 아글리콘으로 전환하는 방법이 언급되어 있으나, 상기한 방법들은 고가의 효소를 충분한 양 사용하여야 하므로 비경제적이라 할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위해서 연구를 거듭한 결과, 공지의 두부제조방법에 의해 생기는 두부폐액(순물)을 한외여과막 또는 흡착수지를 통과시킨 후, 농축정제하여 얻은 이소플라본의 분말 수용액에서아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주 또는트리코더마(Trichoderma)속 균주를 배양한다면, 고순도의 이소플라본 아글리콘을 경제적인 방법으로 얻을 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 고순도의 이소플라본 아글리콘을 경제적인 방법으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 참고예 1의 이소플라본의 HPLC 분석도이다.
도 2는 참고예 2의 이소플라본의 HPLC 분석도이다.
도 3은 실시예 1의 이소플라본의 아글리콘의 HPLC 분석도이다.
도 4는 실시예 2의 이소플라본의 아글리콘의 HPLC 분석도이다.
도 5는 표준물질인 다이드제인(Daidzein)의 HPLC 분석도이다.
도 6은 표준물질인 제니스테인(Genistein)의 HPLC 분석도이다.
상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 방법은아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주 또는트리코더마(Trichoderma)속 균주를 이소플라본 분말 수용액에서 배양하여 이소플라본의 아글리콘을 배양액에 축적시키는 단계; 및 배양액으로부터 이소플라본의 아글리콘을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 대두를 침지한 후, 분쇄한 다음, 여과하는 단계; 응고제를 사용하여 단백질을 침전시킨 후, 여과하여 상등액을 얻는 단계; 상등액에 여과보조제를 넣고, 여과하는 단계; 여액을 다시 흡착수지 또는 한외여과막을 통과시켜 농축액을 얻은 다음, 분무 건조 또는 동결 건조하여 이소플라본의 분말을 얻는 단계;아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주 또는트리코더마(Trichoderma)속 균주를 이소플라본 분말 수용액에서 배양하여 이소플라본의 아글리콘을 배양액에 축적시키는 단계; 및 배양액으로부터 이소플라본의 아글리콘을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 방법은 대두로부터 직접 제조할 수도 있지만, 대두를 침지한 후, 분쇄한 다음, 여과하는 단계 및 응고제를 사용하여 단백질을 침전시킨 후, 상등액과 침전물을 분리하는 단계가 두부를 제조하는 단계와 동일하므로, 두부의 제조시 발생하는 두부폐액을 사용하여 제조할 수도 있으므로, 경제적인 방법이다.
대두로부터 이소플라본 아글리콘을 제조하는데 있어서 가장 중요한 점은 이소플라본 이외에 단백질, 당류, 수용성 폐놀류와 같은 다른 불순물을 가장 경제적이 방법으로 제거하느냐인데, 본 발명에서는 한외여과막을 사용함으로써 경제적인 방법으로 이소플라본을 얻을 수 있고, 또한, 이소플라본 수용액에서아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주 또는트리코더마(Trichoderma)속 균주를 직접 배양하므로, 고가의 효소를 사용하지 않아도, 이소플라본의 당결합 부분이 절단된 아글리콘을 고순도를 얻을 수 있는 방법이다.
본 발명에서 사용된아스퍼질러스속 균주로는아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)KCCM 11885 또는아스퍼질러스 나이거KCCM 12723,아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae)KCCM 60241,아스퍼질러스 테르레우스(Aspergillus terreus)KCCM 60242 또는아스퍼질러스 테르레우스KCCM 60244가 있으며,트리코더마속 균주로는트리코더마 르에세이(Trichoderma reesi)KCCM 65516,트리코더마 르에세이KCCM 11767,트리코더마 르에세이KCCM 11770,트리코더마 르에세이KCCM 11772,트리코더마 르에세이KCCM 24449,트리코더마 르에세이KCCM 35502,트리코더마 르에세이KCCM 35504,트리코더마 비리드(Trichoderma viride)KCCM 11246,트리코더마 비리드KCCM 11763,트리코더마 비리드KCCM 11765 또는트리코더마 비리드KCCM 60108이 있다.
이하, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만 본 발명이 이들예로만 한정되는 것은 아니다.
[참고예 1]
대두 10kg에 상수 30ℓ를 가한 후, 20~30℃의 온도에서 4시간동안 침지시킨다음, 믹서로 분쇄하고, 200mesh 여과망으로 여과하여 Brix 약 10%의 대두유액 25ℓ을 얻었다. 이것을 93~95℃에서 30분간 가열한 다음, 85℃로 냉각하여 글루코노델타락톤, 염화마그네슘 및 황산칼슘을 첨가하여 단백질을 응고 침전시키고 상등액을 분리하였다. 상기 공정은 일반 두부 제조 공정과 동일하며, 이때 침전물과 분리된 상등액을 '순물'이라 칭하기로 한다. 이때 상등액의 pH는 6.8, 고형분 농도는 3%이었다.
상등액에 퍼라이트를 5% 첨가하여 여과하고, 이 여액을 RO Membrane(De Danske Sukkerfabrikker 회사의 CA865PP)을 이용하여 온도 5∼30℃의 조건으로 통과시켜 단백질 응고 침전에 사용된 염화마그네슘 등의 무기염류 및 단당류들을 제거하여 200㎖의 정제된 농축액을 얻었다. 상기 농축액을 진공동결 건조하여 미황색의 이소플라본 분말 10g을 얻었다. 이때 이소플라본의 구성 성분 비율을 보면 표 1과 같다.
| 이소플라본 | 농도 (%) |
| 다이드제인 글리코시드 | 15.3 |
| 제니스테인 글리코시드 | 6.4 |
| 글리시테인 글리코시드 | 3.5 |
[참고예 2]
상기 참고예 1과 동일한 과정을 통하여 얻은 여과액을 공지의 방법인 폴리아크릴이 기질로 만들어진 흡착 수지에 흡착시켰다.
이소플라본이 벤젠고리와 수산기 및 배당체로 이루어져 이소플라본과 흡착수지의 소수성 결합에 의한 흡착 정도를 높이기 위하여 상등액 25ℓ를 바로 흡착 수지가 채워진 칼럼(?? 5cm x 50cm)에 유속 SV=10로 통과시킨 후, 물로 세척하고, 50 ~95%의 에틸 알코올로 용리하여 용리액 1ℓ를 얻었다. 이때 에틸 알코올 대신 메틸 알코올도 가능하다. 이 용리액을 물로 에틸 알코올 농도 20%가 될 때까지 희석하여 참고예 1의 RO membrane을 통과하여(조건은 참고예 1과 동일) 200㎖의 정제된 농축액을 얻었다. 상기 농축액을 동결건조 또는 분무 건조하여 미황색의 이소플라본 분말 5g을 얻었다. 이때의 이소플라본의 구성 성분 비율을 보면 표 2와 같다.
| 이소플라본 | 농도 (%) |
| 다이드제인 글리코시드 | 16.6 |
| 제니스테인 글리코시드 | 10.8 |
| 글리시테인 글리코시드 | 6.3 |
[실시예 1]
참고예 1의 방법에 의하여 얻어진 이소플라본 또는 참고예 2의 방법에 의하여 얻어진 이소플라본을 5~30% 농도가 되도록 증류수를 넣어 120℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후,아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)KCCM 11885를 액체량 대비 5~10%로 접종하여 30℃에서 적게는 2일, 많게는 5일 동안 배양시킨 후, 배양액을 5,000~10,000rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 재 회수하였다. 원심 분리하여 얻은 침전물에 95% 메틸알코올을 가하여 80℃로 가온하고, 이것을 여과하여 침전물과 이소플라본의 아글리콘을 분리시킨 다음, 이것을 동결 건조하여 생물학적 활성이 높은 것으로 알려진 이소플라본의 아글리콘을 2.5g을 얻었다.
이때 얻어진 이소플라본의 아글리콘의 함량은 표 3과 같다.
| 아글리콘 | 농도 (%) |
| 다이드제인 | 25.7 |
| 제니스테인 | 15.6 |
| 글리시테인 | 12.9 |
[실시예 2]
참고예 1의 방법에 의하여 얻어진 이소플라본 또는 참고예 2의 방법에 의하여 얻어진 이소플라본을 5~30% 농도가 되도록 증류수를 넣어 120℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후,트리코더마 르에세이(Trichoderma reesei)KCCM 35516 을 액체량 대비 5~10% 접종하여 30~35℃에서 적게는 2일, 많게는 5일 동안 배양한 다음, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분리, 정제하여 이소플라본의 아글리콘 2.5g을 얻었다. 이때 얻어진 이소플라본의 아글리콘 함량은 표 4와 같다.
| 아글리콘 | 농도 (%) |
| 다이드제인 | 31.2 |
| 제니스테인 | 15.0 |
| 글리시테인 | 12.7 |
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 한외여과막을 사용하여 이소플라본의 제조공정를 단순화하였으며, 이소플라본의 수용액에서아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주 또는트리코더마(Trichoderma)속 균주를 직접 배양하여 이소플라본의 아글리콘을 제조하므로, 고가의 효소를 사용할 필요가 없는 경제적인 방법이다.
Claims (3)
- (1) 아스퍼질러스(Aspergillus)속 균주 또는 트리코더마(Trichoderma)속 균주를 이소플라본 분말 수용액에서 배양하여 이소플라본의 아글리콘을 배양액에 축적시키는 단계; 및 (2) 배양액으로부터 이소플라본의 아글리콘을 회수하는 단계를 포함하는 이소플라본의 아글리콘의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 사용되는 이소플라본 분말 수용액은1-1) 대두를 침지한 후, 분쇄한 다음, 여과하여 여액을 얻는 단계;1-2) 상기 1)의 여액에 응고제를 부가하여 단백질을 침전시킨 후, 여과하여 상등액을 얻는 단계;1-3) 상기 상등액에 여과보조제를 넣고, 여과하여 여액을 얻는 단계; 및1-4) 상기 3)의 여액을 다시 흡착수지 또는 한외여과막을 통과시켜 농축액을 얻은 다음, 분무 건조 또는 동결 건조하여 이소플라본의 분말을 얻는 단계;를 포함하는 방법에 의해 얻는 것임을 특징으로 하는 이소플라본의 아글리콘의 제조방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 1) 내지 3) 단계에 의해 얻은 여액이 두부 제조시 발생하는 두부폐액임을 특징으로 하는 방법.
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