KR101769112B1 - 이소플라본 생물전환능이 우수한 균주 및 이를 이용한 이소플라본 아글리콘 제조방법 - Google Patents

이소플라본 생물전환능이 우수한 균주 및 이를 이용한 이소플라본 아글리콘 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이소플라본 전환능이 우수한 균주 및 이를 이용한 이소플라본 아글리콘 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 대두 또는 발아대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 침전물을 회수하는 단계; (d) 상기 회수된 침전물을 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)를 이용하여 흡착하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 흡착된 물질을 주정 및 물의 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계를 포함하는 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 통상적으로 사용하여온 유해성 유기용매를 사용하지 않고 물과 에탄올을 이용하여, 기존의 이소플라본 아글리콘의 분리방법보다 상대적으로 제조공정이 간단하고, 경제적이며, 수율이 높은 것을 특징으로 한다.

Description

이소플라본 생물전환능이 우수한 균주 및 이를 이용한 이소플라본 아글리콘 제조방법{Isoflavone-biotransforming activity and processes for preparing isoflavone aglycone using the same}
본 발명은 이소플라본 전환능이 우수한 균주 및 이를 이용한 이소플라본 아글리콘 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 대두 또는 발아대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 침전물을 회수하는 단계; (d) 상기 회수된 침전물을 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)를 이용하여 흡착하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 흡착된 물질을 주정 및 물의 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계를 포함하는 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법에 관한 것이다.
콩은 인류의 중요한 식량자원으로 활용되어 왔으며, 단백질, 필수지방산, 인지질, 비타민 E 및 칼슘 등이 풍부해 사람이섭취할 경우 여러 가지 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 콩의 생리활성은 고혈압방지효과, 혈전용해능, 혈중콜레스테롤 저하효과 등의 각종 성인병 예방 효과가 있고, 뿐만 아니라 항암성, 항돌연변이성, 노화방지는 물론 두뇌활동과 피부미용에도 좋은 것으로 알려져 있다. 또한, 콩은 고추장, 된장, 간장, 콩요구르트를 비롯해 두유, 두부, 유부 등 여러 가지 모습으로 변신이 가능한 다재다능한 식품이다.
최근 이러한 '콩'의 기능성 성분 중 이소플라본에 대해 일반인들의 관심이 집중되고 있으며, 이소플라본은 암, 심장병, 골다공증, 신장병 등의 예방 및 치료 효과가 있다고 보고되어 있다. 또한 이소플라본의 함량은 콩의 품종과 재배 조건 등에 따라 크게 다른데, 보통 0.6~3.1mg% 정도이며, 두부나 대두단백 제조 시 이소플라본의 30~50%정도의 손실이 따른다.
이소플라본은 콩과식물, 칡 등의 식물종에 존재하는 천연 화합물로서, 여성 호르몬의 일종인 에스트로겐과 유사한 구조를 가지며, 피토에스트로겐(phytoestrogen)과 같은 생리적 기능이 있음이 밝혀졌다. 이소플라본은 의 분자식을 지닌 화합물군으로 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein) 및 그 글루코스 배당체, 나아가서는 아세틸화체, 마로닐화체(malonyl) 등 총 12 종류가 천연의 상태로 존재하는 이성체로 알려져 있으며, 주로 배당체의 형태로 존재하는 물질이다. 또한 이들은 예전에 단순한 색소로만 여겨져 왔으나 최근의 연구들을 통해서 항암효과(Barnes,J. Nutr.,125, 777s, (1995); Akiyama et al.,J. Biol. Chem.,262(2), 5592 (1987); Molteni et al.,J. Nurt.,125, 751s (1995), 골다공증 예방(Shino et al.,Life Sci.,42(11), 1123 (1988)), 만성질환 예방(Fotsis et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA.,90, 2690 (1993)), 항산화 효과(Naim et al.,J. Agric. Food Chem.,24(6), 1174 (1976)), 알데히드 탈수소효소 억제 작용(Keung and Vallee,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 1247 (1993)), 전립선 암의 예방(Peterson and Barnes,The Prostate,22, 335 (1993)) 등의 역할이 계속 밝혀지고 있다.
이소플라본은 자연 상태에서 대부분이 배당체의 형태로 존재하는데, 이러한 이소플라본 배당체는 체내에서 위산에 의해 분해되지 않아 그대로 흡수되지 못하며 대장내 미생물로부터 분비되는 효소에 의해 분해된 후 흡수되고 있어, 그 흡수율이 낮은 단점이 있다(미국 특허등록 제5,506,211호). 반면에 이소플라본 아글리콘은 체내에서 부가적인 변환이 없이 위와 소장에서 직접 흡수되는 장점을 가진다. 이에 따라 흡수율이 높은 이소플라본 아글리콘의 생산 방법이 절실히 요구되고 있다.
대두로부터 이러한 이소플라본 아글리콘을 제조하는 방법으로는, 미국특허 제5,679,806호에 개시된 방법이 있다. 즉, 대두를 마쇄한 후, 여기에 에틸 알코올 또는 메틸 알코올 용매를 대두:용매가 1:3~1:10이 되도록 부가하고, 40~70℃에서 가온하여 추출한 다음, 이를 수회 반복하여 추출용매를 합하고, 이를 물로 희석하여 조 엑기스(crude extract)를 얻은 다음, 다시 이를 여과하여 불용성 성분이 제거된 이소플라본의 조엑기스를 얻는 단계; 조 엑기스에 남아 있는 수용성 페놀, 단백질 또는 당류 등의 불순물을 제거하기 위해서 폴리스티렌이 기질로 만들어진 흡착수지 또는 폴리아크릴이 기질로 만들어진 흡착수지 등을 사용하여 이소플라본을 정제하는 단계; 및 이를 에틸알코올 또는 메틸알코올을 이용하여 용리하고, 이를 산으로 분해하여 이소플라본 아글리콘을 생성시킨 후, 여과, 건조, 결정화 등의 공정을 거쳐 이소플라본 아글리콘을 얻는 단계로 이루어진 방법이 있다.
그러나, 상기한 방법은 이소플라본 아글리콘인 제니스테인, 다이드제인, 글리시테인 등의 각 성분을 고순도로 얻을 수 있는 장점이 있으나, 상기 기술과 같이 추출 시 용매가 다량 사용되고, 용출 시 알코올의 농도를 조절함으로써, 에탄올 회수의 시간과 비용이 많이 발생할 수 있으며, 이소플라본의 아글리콘을 얻기 위해 산으로 처리함으로써 이소플라본의 구조 변화가 예상될 수 있고, 또한 순도를 높이기 위하여 중화하는 등의 별도 공정이 필요한 문제점이 있다.
또한, 한국공개특허 제 90-13878호에 두부폐액으로부터 식품소재 및 건강음료를 제조하는데 있어서, 두부폐액을 한외여과하여 이소플라보노이드 등의 배당체물질을 주제로하는 식품소재를 제조하는 방법에 공지되어 있으나, 이는 단순한 이소플라본 제조 방법으로 고순도의 이소플라본, 즉 이소플라본의 아글리콘을 생산하기 위해서는 추가 개선 공정이 필요한 문제점이 있다.
또한, 한국공개특허 제96-704927호, 제96-704928호, 제96-704929호, 제98-24261호, 제98-32766호에 효소를 이용하여 이소플라본을 아글리콘으로 전환하는 방법이 언급되어 있으나, 상기한 방법들은 고가의 효소를 충분한 양으로 사용하여야 하므로 비경제적이라 할 수 있다.
한편, 최근 이러한 문제점을 개선하는 새로운 제조방법이 개시되어 왔는데 대한민국 특허등록 제1,198,426호는 배당체 이소플라본을 흡착수지가 충진된 컬럼에 흡착시키는 단계, 상기 배당체 이소플라본이 흡착된 컬럼에 베타글루코시다제 효소액을 상향류 및 기포주입의 복합순환방식으로 순환시켜 흡착된 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 단계 및 상기 전환된 비배당체 이소플라본을 회수하는 단계를 포함하는 비배당체 이소플라본 제조방법을 개시하고 있다.
그러나, 상기 기술은 컬럼 크로마토그래피에 사용되는 수지(resin) 및 전개용매(에탄올 또는 발효알코올) 사용량이 다량 필요하며, 제조공정이 복잡하여 고비용이 소요되는 제조방법이다.
따라서 유기용매를 사용하지 않고, 간단하고 경제적이며 수율이 높은 이소플라본 아글리콘의 제조 방법의 개발이 필요하다.
특허문헌 1: 미국 특허등록 제5,506,211호 특허문헌 2: 미국 특허등록 제5,679,806호 특허문헌 3: 대한민국 공개특허 제 90-13878호 특허문헌 4: 대한한국 공개특허 제96-704927호 특허문헌 5: 대한민국 공개특허 제96-704928호 특허문헌 6: 대한민국 공개특허 제96-704929호 특허문헌 7: 대한민국 공개특허 제98-24261호 특허문헌 8: 대한민국 공개특허 제98-32766호 특허문헌 9: 대한민국 특허등록 제1,198,426호
비특허문헌 1: Barnes,J. Nutr.,125, 777s, 1995 비특허문헌 2: Akiyama et al.,J. Biol. Chem.,262(2), 5592, 1987 비특허문헌 3: Molteni et al.,J. Nurt.,125, 751s, 1995 비특허문헌 4: Shino et al.,Life Sci.,42(11), 1123, 1988 비특허문헌 5: Fotsis et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA.,90, 2690, 1993 비특허문헌 6: Naim et al.,J. Agric. Food Chem.,24(6), 1174, 1976 비특허문헌 7: Keung and Vallee,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 1247 , 1993 비특허문헌 8: Peterson and Barnes,The Prostate,22, 335, 1993
이에 본 발명의 발명자들은 통상적으로 사용하여온 유해성 유기용매를 사용하지 않고 물과 에탄올을 이용하여, 기존의 분리방법보다 상대적으로 제조공정이 간단하고, 경제적이며, 수율도 높은 이소플라본 아글리콘 제조 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은
(a) 대두 또는 발아대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 침전물을 회수하는 단계;
(d) 상기 회수된 침전물을 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)를 이용하여 흡착하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 흡착된 물질을 주정 및 물의 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계를 포함하는 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 고순도 이소플라본 아글리콘을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 대두 또는 발아대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 침전물을 회수하는 단계;
(d) 상기 회수된 침전물을 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)를 이용하여 흡착하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 흡착된 물질을 주정 및 물의 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계를 포함하는 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 고순도 이소플라본 아글리콘을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
(a) 대두 또는 발아대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 침전물을 회수하는 단계;
(d) 상기 회수된 침전물을 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)를 이용하여 흡착하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 흡착된 물질을 주정 및 물의 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계를 포함하는 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법을 제공한다.
상기 대두 또는 발아 대두는 콩과식물 중 하나로, 대두의 생리활성 물질로는 이소플라본, 식이섬유, 대두올리고당, 레시틴, 사포닌, 피트산 및 트립신 저해제 등이 있으며 본 발명에서는 이소플라본을 추출하여 사용하였다.
상기 이소플라본 아글리콘은 이소플라본의 비배당체 형태를 말하며, 본 발명에서는 배당체 형태의 이소플라본을 발효시켜 비배당체 형태로 전환하였다. 이소플라본의 아글리콘 형태는 이소플라본의 체내 흡수율을 높여주며, 상기 이소플라본 아글리콘은 제니스테인, 다이드제인 및 글리시테인을 모두 포함한다.
상기 유산균은 이소플라본 생물전환능이 우수한 미생물로서 발효를 하기위해 사용된 수단으로, 유산균이면 그 종류에 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼 PMO08(Lactobacillus plantarum PMO08), 비피도박테리움 롱검(Bifidobatacterium longum) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)가 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼 PMO08(Lactobacillus plantarum PMO08)이 사용될 수 있다. 상기 락토바실러스 플란타럼 PMO08(Lactobacillus plantarum PMO08)은 주식회사 풀무원홀딩스에서 개발한 균주로 이에 관하여는 대한민국 등록특허 제10-0264361호에 기재되어 있다. 아울러, 본 발명에 사용된 유산균은 일반적인 유산균에 비해 이소플라본 생물전환능이 우수한 신생균주이다.
상기 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)는 이소플라본을 흡착 분리하기 위한 크로마토그래피 수지 컬럼으로 사용된 수단으로, 메타아크릴레이트계 수지이면 그 종류에 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 하기 화학식 1의 구조를 가지는 수지(예를 들어, 미쓰비시 케미칼사의 Diaion HP2MG 및 Diaion HP1MG) 및 Rohm & Haas사의 Amberlite XAD 7HP일 수 있다.
<화학식 1>
Figure 112013121341921-pat00001

이하 본 발명의 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법을 단계별로 설명한다.
(a) 대두 또는 발아대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계
(a) 단계에서는 대두 또는 발아대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과하여 여과액을 수득한다.
상기 추출액의 회수는 특정 방법에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 대두 또는 발아대두에 50 내지 100℃의 물을 첨가하여 열수 추출하는 것일 수 있다. 또한 물의 온도가 50℃ 미만인 경우에는 이소플라본의 추출 효율이 낮고, 100℃를 초과하는 경우에는 물이 끓기 때문에 50 내지 100℃의 온도로 추출하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 80 내지 90℃일 수 있다. 물의 첨가량은 바람직하게는 식물 1 중량부에 대해 4 내지 10 중량부일 수 있으며, 반응시간은 30분 내지 90분 동안 교반하는 것이 바람직하다.
상기 여과는 특정 방법에 한정되는 것은 아니나, 추출액으로부터 여과박을 제거할 수 있는 방법이라면 어느 것을 사용하여도 무방하다. 바람직하게는 여과망 또는 원심분리를 이용하는 것일 수 있으며, 여과망 이용시 150 내지 200 mesh의 여과망을 사용하는 것이 바람직하다.
(b) 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양하는 단계
(b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양한다.
한편, 본 발명의 상기 (b) 단계의 유산균은 락토바실러스 플란타럼 PMO08(Lactobacillus plantarum PMO08), 비피도박테리움 롱검(Bifidobatacterium longum) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 유산균은 이소플라본 생물전환능이 우수한 미생물로서 발효를 하기위해 사용하는 균종을 말하며, 이에 관하여는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 배양 조건은 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액의 이소플라본의 농도가 5 내지 30% 농도가 되도록 정제를 넣어 85℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각하는 것이 바람직하며, 유산균의 양은 액체량 대비 5 내지 10%로 접종하여 30℃에서 2일 내지 5일 동안 교반하여 배양하는 것이 바람직하다.
(c) 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 침전물을 회수하는 단계
(c) 단계에서는 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 침전물을 회수한다.
상기 침전물을 회수하는 단계 이후에, 추가적으로 회수한 침전물을 원심분리하는 단계를 포함할 수 있다. 원심분리를 통해 불순물(잉여 상등액)을 더 제거하여 순도가 높은 이소플라본을 제조할 수 있다. 이때, 원심분리 방법은 회수한 침전물을 5000 내지 7000rpm으로 10 내지 20분 동안 원심분리하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 수득된 침전물을 중화하는 단계를 포함할 수 있다. 중화는 침전물의 pH를 중성에 가까이 조절함으로써 식품 첨가물로서 적정한 pH로 조절하기 위해 사용되는 방법을 말한다. 바람직하게는 알칼리 용액을 첨가하여 침전물의 pH가 6 내지 8이 되도록 하는 것일 수 있으며, 상기 알칼리 용액은 수산화나트륨 또는 수산화칼륨인 것이 바람직하다.
(d) 상기 회수된 침전물을 메타아크릴레이트계 수지( methacrylate type resin)를 이용하여 흡착하는 단계
(d) 단계에서는 상기 회수된 침전물을 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)를 이용하여 흡착한다.
한편, 본 발명의 상기 (d) 단계의 메타아크릴레이트계 수지는 하기 화학식 1의 구조를 가지는 수지일 수 있다.
<화학식 1>
Figure 112013121341921-pat00002

상기 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)는 이소플라본을 흡착 분리 하기위한 크로마토그래피 수지 컬럼으로 사용된 수단을 말하며, 이에 관하여는 앞서 설명한 바와 같다.
상기에서 사용하는 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)와 수용성 용액으로 용해시킨 침전물은 10 내지 30 : 1 의 중량비로 사용하는 것이 바람직하다.
(e) 상기 (d) 단계의 흡착된 물질을 주정 및 물의 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계
(e) 단계에서는 상기 (d) 단계의 흡착된 물질을 주정 및 물의 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리한다.
한편, 상기 (e) 단계는 ⅰ) 물로 용출시켜 수용성 물질을 제거하는 단계; 및
ⅱ) 주정 및 물의 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (e) 단계의 ⅰ)는 이소플라본 아글리콘을 용출시킬 때 1차적으로 수용성 물질을 제거하여 회수율을 높이기 위해 사용되는 방법을 말하며, 물을 사용하여 SV 0.5 내지 2의 속도로 BV 5 내지 10 만큼 통과시키는 것이 바람직하다.
상기 SV는 공간속도(space velocity)의 약자로 칼럼내 시간당 통액량을 흡착수지의 체적으로 나눈 수치이며, BV는 수지부피(Bed volume)의 약자로 칼럼안의 충진제가 차지하는 부피를 뜻한다.
또한 상기 (e) 단계의 ⅱ)에서 주정 및 물의 혼합비율은 1:1 내지 9 의 중량비일 수 있다.
상기 (e) 단계의 ⅱ)는 이소플라본 아글리콘을 용매를 사용하여 용출시키는 방법에 관한 것으로, 전개용매로 10 %(v/w) 에탄올용액 내지 50 %(v/w) 에탄올용액까지 에탄올 농도를 순차적으로 증가시키면서 전개 용출하는 것이 바람직하다. 이 때, 상층액과 전개용매의 속도는 바람직하게 SV 1 내지 3일 수 있으며, 부피는 바람직하게 BV 5 내지 10배일 수 있으며, 보다 바람직하게는 3 내지 5배일 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 고순도 이소플라본 아글리콘을 제공한다. 이 때, 상기 고순도는 순도가 50중량% 이상인 것을 특징으로 하는 고순도 이소플라본 아글리콘일 수 있다. 본 발명의 고순도 이소플라본 아글리콘은 종래의 제조방법에 의해서 제조된 것에 비해 매우 순도가 높다.
본 발명의 제조방법에 의하면 기존의 주정사용량 보다 적은 양으로 고순도의 이소플라본 아글리콘을 얻을 수 있다.
이와 같은 효과는 본 발명의 비교예에 잘 나타나있다.
본 발명의 비교예에서는 대한민국 특허등록 제1,198,426호에 개시된 바에 따라 흡착수지에 따른 이소플라본 흡착율과 주정사용량을 비교하였다(비교예 1, 비교예 2 및 표 1 참조). 그 결과 메타아크릴레이트계(methacrylate type resin) 합성수지를 사용했을 때 기존의 방법에 의하는 경우 표 1에서 보는 바와 같이, 일정량 이상의 대두 추출액(BV 40)이 통과하고 나면, 배당체 이소플라본의 흡착율이 급격히 떨어지지만, 본 발명의 방법에 따라 수세와 흡착을 반복하는 경우 표 1에서 보는 바와 같이, 칼럼의 100배 이상을 흘려보내도 배당체 이소플라본의 흡착율이 90% 이상 유지되는 것으로 확인하였다.
또한, 비교예와 본 발명의 합성수지에 흡착된 배당체 이소플라본의 회수에 필요한 주정의 사용량을 비교한 결과, 비교예의 경우 80% 주정 2,000ml가 사용되었으나, 본 발명에서 제시하고 있는 메타아크릴레이트계 합성수지는 50% 주정 1,500ml를 사용하고도 흡착된 배당체 이소플라본을 모두 회수 할 수 있는 것을 확인하였다.
이와 같은 본 발명의 방법의 효과는 메타아크릴레이트계 합성수지를 사용함으로써, 기존의 방법에 비해 인체에 무해하며, 고순도 이소플라본 아글리콘의 수율을 높이는 것이다.
본 발명의 이소플라본 전환능이 우수한 균주 및 이를 이용한 이소플라본 아글리콘 제조방법은 (a) 대두 또는 발아대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 침전물을 회수하는 단계; (d) 상기 회수된 침전물을 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)를 이용하여 흡착하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 흡착된 물질을 주정 및 물의 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계를 포함하며, 통상적으로 사용하여온 유해성 유기용매를 사용하지 않고 물과 에탄올을 이용하여, 기존의 이소플라본 아글리콘의 분리방법보다 상대적으로 제조공정이 간단하고, 경제적이며, 수율도 높일 수 있다.
도 1은 본 발명의 고순도 이소플라본 아글리콘의 제조 공정도이다.
도 2는 대두추출물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 3는 본 발명의 방법에 따라 제조된 이소플라본 아글리콘의 HPLC 크로마토그램이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
고순도 이소플라본 아글리콘의 제조
<1-1> 대두 추출액의 회수 및 여과액의 수득
대두 또는 발아 대두에 50 내지 100℃의 물을 첨가하여 열수 추출하였다. 물의 온도가 50℃ 미만인 경우에는 이소플라본의 추출 효율이 낮고, 100℃를 초과하는 경우에는 물이 끓기 때문에, 50 내지 100℃의 온도에서 식물 1 중량부에 대해 4 내지 10 중량부의 물을 첨가하여 30분 내지 90분 동안 교반하여 추출하였다.
상기 단계에서 추출한 대두 추출액을 회수한 후, 150 내지 200 mesh의 여과망을 이용하여 여과 후 여과액을 얻었다.
<1-2> 미생물의 접종 및 배양
상기 실시예 <1-1>의 여과액에 이소플라본의 농도가 5 내지 30% 농도가 되도록 정제를 넣어 85℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후, 이소플라본 생물전환능을 갖는 신규 미생물 락토바실러스 플란타럼 PMO08(Lactobacillus plantarum PMO08) KFCC 11028을 액체량 대비 5 내지 10 %로 접종하여 30℃에서 적게는 2일, 많게는 5일 동안 교반하면서 배양하였다.
<1-3> 침전 및 침전물의 회수
상기 실시예 <1-2>에서 배양한 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 상등액과 침전물로 분리 후, 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물을 5000 내지 7000rpm으로 10 내지 20분 동안 원심분리하여 불순물(잉여 상등액)을 제거한 침전물을 수득하였다.
수득한 침전물 1 중량부에 대해 증류수 1.0 내지 1.4 중량부를 첨가한 다음, 25 내지 35%(w/v)의 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 첨가하여 20 내지 40분 동안 교반하여 pH가 6 내지 8이 되도록 중화하였다.
<1-4> 침전물의 분리 및 정제
상기 실시예 <1-3>에서 수득한 침전물을 물에 용해시켜 수용성 용액으로 만든 다음, 이를 분리용 흡착 크로마토그래피 수지 컬럼인 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin) 컬럼을 이용하여 분리 정제하였다. 상기 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)와 수용성 용액으로 용해시킨 침전물은 10 내지 30 : 1 의 중량비로 사용하였다.
또한, 분리 정제 공정 수행 시, 1차 용출액은 물을 사용하여 SV 0.5 내지 2의 속도로 BV 5 내지 10 만큼 통과시켜 수용성 물질을 제거하고, 이후 전개용매로 10 %(v/w) 에탄올 용액부터 50 %(v/w) 에탄올 용액까지 에탄올 농도를 순차적으로 증가시키면서 전개 용출시켰다.
분획물 중 이소플라본 분획만을 농축하여 분획물을 제조하였다. 이 때 분획물 내 이소플라본 아글리콘의 함량이 10% 미만 일 경우, 모아서 감압농축한 후 분리정제과정을 반복하였다. 또한 이소플라본 아글리콘의 함량이 10% 이상인 분획도 수집하여 감압농축 및 분리정제과정을 반복하고, 다시 감압농축 후 건조시켜, 이소플라본 아글리콘의 함량이 10% 이상 유지되는 분획물에서 이소플라본 아글리콘을 수득하였다.
< 비교예 1>
흡착수지에 따른 이소플라본의 흡착율 비교
비교예로서 대한민국 특허등록 제1,198,426호에 개시된 바에 따라 이소플라본 흡착율을 비교하였다. 대두추출액에 함유된 배당체 이소플라본 함량은 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography; HPLC)로 분석하였다. 대두추출액을 100% 메탄올에 초음파처리를 통해 용해시킨 후, 여과하여 수득한 액상성분을 HPLC에 배당체 이소플라본 함량을 조사하였다.
기구 : Shimadzu Prominence LC-20AD
칼럼 : Symmetry C18 4.6(i, d) × 250mm
이동상 A: 아세토니트릴(1% 아세트산 함유):증류수=15:85
이동상 B: 아세토니트릴(1% 아세트산 함유):증류수=65:35
유속 : 1.0 ml/min
검출기 : UV 검출기 254㎚
시험 방법은 흡착수지의 종류만 차이가 있을 뿐 동일하게 비교예의 방법에 따라 시행하였으며, 흡착율 비교 시험에 사용된 대두 추출액에 함유된 배당체 이소플라본 함량을 분석한 결과 7mg/g으로 확인되었다.
비교예의 경우 대두 추출액을 준비한 다음 Diaion HP-20 합성수지가 1,000ml 충진되어 있는 칼럼에 대두 추출액을 12,000ml를 한번에 연속적으로 6시간 동안 컬럼에 흘려 흘려 보내고, 정제수 12,000ml(BV 12)를 다시 12시간 동안 천천히 통과시켜 컬럼을 수세시켰다. 이와 같이 조작을 3일 동안 3회 반복 실시하여 36,000ml(BV 36)의 대두추출액을 칼럼에 모두 흡착시켰으며, 매 두 시간마다 칼럼을 통과한 순물을 회수하여 흡착되지 않고 빠져 나온 배당체 이소플라본의 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
대조군으로 본 발명에서 사용된 메타아크릴레이트계(methacrylate type resin) 합성수지는 1,000ml를 칼럼에 충진한 다음 상기 비교예에서 실시한 것처럼 대두 추출액을 연속적으로 로딩하여 칼럼에 흡착을 진행하였다. 대두 추출액12,000ml을 칼럼에 흡착시킨 후 정제수 12,000ml(BV 12)를 다시 12시간 동안 천천히 통과시켜 컬럼을 수세시켰다. 이와 같이 조작을 3일 동안 3회 반복 실시하여 36,000ml(BV 36)의 대두추출액을 칼럼에 모두 흡착시켰으며, 매 두 시간마다 칼럼을 통과한 순물을 회수하여 흡착되지 않고 빠져 나온 배당체 이소플라본의 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
그 결과 기존의 방법에 의하는 경우 표 1에서 보는 바와 같이, 일정량 이상의 대두 추출액(BV 40)이 통과하고 나면, 배당체 이소플라본의 흡착율이 급격히 떨어지지만, 본 발명의 방법에 따라 수세와 흡착을 반복하는 경우 표 1에서 보는 바와 같이, 칼럼의 100배 이상을 흘려보내도 배당체 이소플라본의 흡착율이 90% 이상 유지되는 것으로 확인되었다.
Figure 112013121341921-pat00003

대두 추출액 로딩시 흡착수지의 최대 흡착량 측정 비교 결과
BV25 BV40 BV55 BV70 BV85 BV100 BV115 BV130
비교예 1 98.5 95.3 77.8 69.3 54.1 11.1 0 0
본 발명 99.4 98.6 97.7 96.4 95.7 95.1 88.4 76.4
< 비교예 2>
흡착수지에 따른 이소플라본 회수에 필요한 주정 사용량의 비교
비교예와 본 발명의 합성수지에 흡착된 배당체 이소플라본의 회수에 필요한 주정의 사용량을 비교하였다. 그 결과, 비교예의 경우 80% 주정 2,000ml가 사용되었으나, 본 발명에서 제시하고 있는 메타아크릴레이트계 합성수지는 50% 주정 1,500ml를 사용하고도 흡착된 배당체 이소플라본을 모두 회수 할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 이소플라본 전환능이 우수한 균주 및 이를 이용한 이소플라본 아글리콘 제조방법은 (a) 대두 또는 발아대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 침전물을 회수하는 단계; (d) 상기 회수된 침전물을 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)를 이용하여 흡착하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 흡착된 물질을 주정 및 물의 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계를 포함하며, 통상적으로 사용하여온 유해성 유기용매를 사용하지 않고 물과 에탄올을 이용하여, 기존의 이소플라본 아글리콘의 분리방법보다 상대적으로 제조공정이 간단하고, 경제적이며, 수율도 높일수 있기 때문에, 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (7)

  1. (a) 대두 또는 발아대두를 물로 추출하여 추출액을 회수한 후, 여과하여 여과액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 여과된 여과액에 유산균을 접종하여 배양하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 배양액을 20℃에서 6 내지 24시간 동안 침전을 유도하여 침전물을 회수하는 단계;
    (d) 상기 회수된 침전물을 메타아크릴레이트계 수지(methacrylate type resin)를 이용하여 흡착하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계의 흡착된 물질을 주정 및 물의 혼합비율 1:1 내지 9의 중량비인 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계를 포함하는 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유산균은 락토바실러스 플란타럼 PMO08(Lactobacillus plantarum PMO08), 비피도박테리움 롱검(Bifidobatacterium longum) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 메타아크릴레이트계 수지는 하기 화학식 1의 구조를 가지는 수지인 것을 특징으로 하는 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법.
    <화학식 1>
    Figure 112013121341921-pat00004

  4. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계는
    ⅰ) 물로 용출시켜 수용성 물질을 제거하는 단계; 및
    ⅱ) 주정 및 물의 혼합비율 1:1 내지 9의 중량비인 혼합용매로 용출시켜 고순도 이소플라본 아글리콘을 분리하는 단계를 포함하는 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법.
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