JP2023073794A - アドレノメデュリン遺伝子発現増強用組成物 - Google Patents

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Abstract

Figure 2023073794000001
【課題】本発明は、天然由来成分を有効成分として含み、アドレノメデュリンの遺伝子発現を増強する作用を有する組成物を提供する。
【解決手段】本発明の一以上の実施形態は、オキシリピンを有効成分として含有する、アドレノメデュリン遺伝子発現増強用組成物に関する。前記オキシリピンは好ましくは、(9Z,11E,15E)-13-ヒドロキシ-9,11,15-オクタデカトリエン酸、(7Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-7,13,15-オクタデカトリエン酸、(9Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-9,13,15-オクタデカトリエン酸、(9Z,12Z,14E)-16-ヒドロキシ-9,12,14-オクタデカトリエン酸、及び、(10E,12Z,15Z)-9-ヒドロキシ-10,12,15-オクタデカトリエン酸から選択される1以上を含有する。前記オキシリピンは好ましくはオキシリピンを含有するレモングラス抽出物の形態である。
【選択図】図1

Description

本発明は、アドレノメデュリン遺伝子発現増強用組成物に関する。
アドレノメデュリンは血管拡張作用を有する循環調節ペプチドである。アドレノメデュリンは、循環器系や消化器系などの様々な臓器から産生され、血管拡張、血管新生、抗菌作用、抗腸炎、胃粘膜保護、血栓形成抑制など重要な生理活性を有することが報告されている(特許文献1)。
非特許文献1では、漢方薬の一種である大建中湯(山椒、乾姜、高麗人参を含む)が腸上皮細胞からアドレノメデュリンの放出を促進し、それによって腸での血流を促進する作用を有すること、並びに、大建中湯及びその成分の1つである6-ショウガオールが、腸上皮細胞からアドレノメデュリンの放出を促進する作用を有し、この作用はTRP(transient receptor potential)チャネルの1つのTRPA1(TRP ankyrin 1)のアンタゴニストにより阻害されることが記載されている。
特許文献2では、炭素数が12~26であって、炭素-炭素二重結合を1以上有し、ヒドロキシル基又はヒドロペルオキシド基からなる群から選ばれる1以上の官能基を有する脂肪酸を有効成分として含有する、TRPA1刺激剤が記載されている。特許文献2では、このTRPA1刺激剤は、食品添加剤として食品に添加し、味覚を調整して改善することができると記載されている。特許文献2では、前記脂肪酸はオキシリピンとして植物から抽出することができることが記載されており、前記脂肪酸の具体例として、(10E,12Z)-9-ヒドロキシ-10,12-オクタデカジエン酸、(9Z,11E)-13-ヒドロキシ-9,11-オクタデカジエン酸、(9Z,11E,15Z)-13-ヒドロキシ-9,11,15-オクタデカトリエン酸、(10E,12Z)-9-ヒドロペルオキシ-10,12-オクタデカジエン酸、(9Z,11E)-13-ヒドロペルオキシ-9,11-オクタデカジエン酸、(9Z,11E,15Z)-13-ヒドロペルオキシ-9,11,15-オクタデカトリエン酸、(5Z,8Z,11Z,13E)-15-ヒドロペルオキシ-5,8,11,13-エイコサテトラエン酸、(4Z,7Z,10Z,13Z,15E,19Z)-17-ヒドロペルオキシ-4,7,10,13,15,19-ドコサヘキサエン酸、(9Z)-12-ヒドロキシ-9-オクタデセン酸及び(9E)-12-ヒドロキシ-9-オクタデセン酸からなる群より選ばれる少なくとも1種が記載されている。
国際公開WO2009/104248 特開2014-076979号公報
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304:G428-G436,2013
本発明は、天然由来成分を有効成分として含み、アドレノメデュリンの遺伝子発現を増強する作用を有する組成物を提供することを課題とする。
本発明者らは、レモングラスに由来するオキシリピンがアドレノメデュリン遺伝子の発現を増強する作用を有することを見出し、以下の本発明を完成するに至った。
(1)オキシリピンを有効成分として含有する、アドレノメデュリン遺伝子発現増強用組成物。
(2)前記オキシリピンが、(9Z,11E,15E)-13-ヒドロキシ-9,11,15-オクタデカトリエン酸、(7Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-7,13,15-オクタデカトリエン酸、(9Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-9,13,15-オクタデカトリエン酸、(9Z,12Z,14E)-16-ヒドロキシ-9,12,14-オクタデカトリエン酸、及び、(10E,12Z,15Z)-9-ヒドロキシ-10,12,15-オクタデカトリエン酸から選択される1以上を含有する、(1)に記載の組成物。
(3)前記オキシリピンを含有するレモングラス抽出物を含有する、(1)又は(2)に記載のアドレノメデュリン遺伝子発現増強用組成物。
本発明によれば、天然由来成分を有効成分とし、アドレノメデュリン遺伝子の発現を増強する作用を有する組成物が提供される。
図1はオキシリピンを添加した培地で培養したラット由来小腸細胞株での、アドレノメデュリンのβアクチンに対する相対的なmRNA発現量を示す。
<オキシリピン>
オキシリピンは、生体内において、シクロオキシゲナーゼ、リポオキシゲナーゼ及びシトクロームP450に属する酵素を含む複数の酵素の作用により、多価不飽和脂肪酸が酸化的に代謝されて生じる一群の化合物の総称である。
オキシリピンは1つの化合物のみからなっていてもよいし、2以上の化合物を含んでいてもよい。
オキシリピンは、典型的には、炭素数12~26であり、炭素-炭素二重結合を1以上有し、ヒドロキシ基、ヒドロペルオキシド基、ケト基及びエポキシ基から選択される1以上の酸素含有官能基を1以上有する脂肪酸である。前記脂肪酸の炭素鎖は直鎖又は分岐鎖であってもよいし、部分的に環化した直鎖又は分岐鎖であってもよいが、好ましくは直鎖である。前記脂肪酸の炭素数は、好ましくは16~22であり、より好ましくは18~22であり、より好ましくは18~20であり、最も好ましくは18である。前記酸素含有官能基は、好ましくはヒドロキシ基及びヒドロペルオキシド基から選択される1以上であり、より好ましくはヒドロキシ基である。前記酸素含有官能基の数は好ましくは1又は2であり、より好ましくは1である。炭素-炭素二重結合の数は好ましくは1~6であり、より好ましくは1~3であり、より好ましくは2又は3であり、最も好ましくは3である。前記脂肪酸は塩の形態であってもよい。
オキシリピンの具体例としては、(9Z,11E,15E)-13-ヒドロキシ-9,11,15-オクタデカトリエン酸、(7Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-7,13,15-オクタデカトリエン酸、(9Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-9,13,15-オクタデカトリエン酸、(9Z,12Z,14E)-16-ヒドロキシ-9,12,14-オクタデカトリエン酸、及び、(10E,12Z,15Z)-9-ヒドロキシ-10,12,15-オクタデカトリエン酸から選択される1以上が例示できる。これらのオキシリピンは塩の形態であってもよい。
また、オキシリピンの具体例としては、以下の物理化学的性状
(1) 外観:薄黄色透明の水あめ状固体
(2) HR MS [M+H]+:m/z 293.2116
(3) 分子式 C18H30O3
(4) 溶解性:エタノール、メタノール、アセトニトリル、クロロホルム、酢酸エチル、DMSO
(5) 紫外吸収スペクトル:λmax nm 230 (in 80% CH3CN)
(6) 1H NMRスペクトル 1H-NMR (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 0.99 (t, J = 7.7 Hz), 1.38-1.27 (m), 1.60-1.66 (m), 2.04 (m), 2.17-2.23 (m), 2.28-2.36 (m), 4.21 (q, J = 6.3 Hz, 1H), 5.35-5.40 (m), 5.42-5.47 (m), 5.53-5.58 (m), 5.68 (dd, J = 15.2, 6.6 Hz), 5.94 (t, J = 11.2 Hz), 6.52 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz)
(7) 13C NMRスペクトル 13C-NMR (126 MHz, CHLOROFORM-D) δ 178.5, 134.9, 134.7, 133.7, 127.2, 126.0, 124.5, 72.3, 35.4, 33.9, 29.5, 29.1, 29.0, 27.4, 24.7, 21.2, 14.3
を有する12位炭素にヒドロキシ基が1つ付加したオクタデカトリエン酸、並びに、(9Z,11E,15E)-13-ヒドロキシ-9,11,15-オクタデカトリエン酸、(9Z,12Z,14E)-16-ヒドロキシ-9,12,14-オクタデカトリエン酸、及び、(10E,12Z,15Z)-9-ヒドロキシ-10,12,15-オクタデカトリエン酸から選択される1以上であってもよい。前記12位炭素にヒドロキシ基が1つ付加したオクタデカトリエン酸は、具体的には、(7Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-7,13,15-オクタデカトリエン酸、及び/又は、(9Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-9,13,15-オクタデカトリエン酸であり得る。これらのオキシリピンは塩の形態であってもよい。
オキシリピンは、植物、微生物、動物等の天然原料に由来するものであってもよいし、化学的に合成されたものであってもよいが、好ましくは、天然原料、特に植物、に由来するものである。前記植物としては特にレモングラス(学名:Cymbopogon citratus)が好ましい。
オキシリピンは、オキシリピンを含有する、レモングラス等の植物自体又は植物の抽出物の形態であることが好ましく、植物の抽出物であること特に好ましい。植物自体を用いる場合、植物体の葉、茎、根等の部位を用いることができる。
オキシリピンまた、オキシリピンを含有する天然原料から精製又は濃縮された化合物であってもよい。天然原料から精製又は濃縮されたオキシリピンは、天然原料に含まれるオキシリピンのうち1以上の特定の化合物が精製又は濃縮されたものであってもよいし、植物原料に含まれるオキシリピンの全体が精製又は濃縮されたものであってもよい
オキシリピンを含有する植物抽出物は、植物原料を、抽出媒体を用いた抽出操作に付すことにより調製することができる。オキシリピンを含有する植物抽出物は、好ましくは、植物の疎水性抽出物である。抽出媒体としては、例えば、有機溶媒、水、熱水等の溶媒、超臨界二酸化炭素等の超臨界流体を利用することができ、溶媒が特に好ましい。溶媒としては、エタノール、ヘキサン、クロロホルム等の疎水性有機溶媒、あるいはそれらの混合溶媒を用いることが特に好ましく、特にエタノール及び/又はヘキサンが好ましい。溶媒抽出により抽出液を製造する場合には、植物原料を適量の溶媒(例えば植物原料に対して重量基準で0.5~100倍量)中に浸漬し、適宜撹拌又は静置して溶媒中に溶媒可溶性成分を溶出させる。抽出時間は特に限定されないが、5分間~24時間、例えば、15分間~15時間とすることができる。抽出温度は特に限定されないが、0℃~125℃、例えば15℃~50℃とすることができる。抽出後、溶媒可溶性成分を含む溶媒画分と細胞壁等の固体画分とを固液分離手段(例えば遠心分離、ろ過(珪藻土ろ過等))により分離し、溶媒画分を抽出液として取得する。得られた抽出液又は抽出液から溶媒を除去して得た濃縮物を、そのままオキシリピン含有抽出物として用いてもよいし、必要に応じて前記抽出液又は濃縮物を更に、濃縮、溶媒分画、クロマトグラフィー(カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、超臨界流体クロマトグラフィー等)及び/又は再結晶等のさらなる精製手段に付して、オキシリピンを精製又は濃縮した処理物を用いてもよい。抽出に用いる植物原料の部位は特に限定されず、葉、茎、根等の部位であることができ、乾燥した植物原料であることが好ましい。例えばオキシリピンを含有するレモングラス抽出物の調製に用いるレモングラスの原料は、レモングラスの葉及び/又は茎の乾燥物であることが好ましい。抽出のための植物原料の形状は、原形のまま、あるいは適当な寸法又は形状にカットした形態、あるいは破砕、粉砕、又は摩砕した形態、あるいは搾汁の形態とすることができる。
<アドレノメデュリン遺伝子発現増強用組成物>
本発明の1以上の実施形態は、オキシリピンを有効成分として含有する、アドレノメデュリン遺伝子発現増強用組成物に関する。
本実施形態に係る組成物の対象は典型的にはヒトであるが、ヒトには限定されず他の非ヒト動物、例えばヒト以外の哺乳類であってもよい。
アドレノメデュリンは、血管拡張、血管新生等の生理活性を有するペプチドである。アドレノメデュリンの遺伝子発現の増強により、血流増加を達成することができる。また、アドレノメデュリンの遺伝子発現の増強による血流増加により、抗菌作用、抗腸炎、胃粘膜保護、血栓形成抑制等の効果を達成することができる。
アドレノメデュリンの遺伝子発現が増強されていることは、本実施形態に係る組成物を摂取又は投与した対象から採取した細胞、或いは、本実施形態に係る組成物の存在下で培養した細胞中のmRNAからcDNAを調製し、該cDNAを鋳型とし、アドレノメデュリン(具体的には、アドレノメデュリン前駆体(プレプロアドレノメデュリン))のcDNA塩基配列(5’非翻訳領域、コーディング領域及び/又は3’非翻訳領域、好ましくはコーディング領域)の少なくとも一部を特異的に増幅し得るプライマーセットを用いた核酸増幅反応を行い、該反応による増幅産物量を検出することで確認することができる。アドレノメデュリンは、前駆体(プレプロアドレノメデュリン)から生じるペプチドである。このため、「アドレノメデュリンの遺伝子発現」は、「アドレノメデュリン前駆体の遺伝子発現」と言い換えることができる。
また、アドレノメデュリンの遺伝子発現が増強されていることは、本実施形態に係る組成物を摂取又は投与した対象から採取した細胞、或いは、本実施形態に係る組成物の存在下で培養した細胞において、アドレノメデュリンのペプチドの量、アドレノメデュリン前駆体の量、又は、アドレノメデュリン前駆体から生じるアドレノメデュリン以外のペプチドの量、好ましくはアドレノメデュリンのペプチドの量、を検出することで確認することができる。細胞中でアドレノメデュリンのペプチドの量、アドレノメデュリン前駆体の量、又は、アドレノメデュリン前駆体から生じるアドレノメデュリン以外のペプチドの量が増加している場合に、アドレノメデュリンの遺伝子発現が増強されていると評価することができる。
ヒト由来アドレノメデュリン前駆体(プレプロアドレノメデュリン)のアミノ酸配列を配列番号3に、ヒト由来アドレノメデュリン前駆体(プレプロアドレノメデュリン)のcDNA塩基配列を配列番号4に示す。配列番号4においてコーディング領域は第179位~第736位である。
本実施形態に係る組成物におけるオキシリピンの含有量は特に限定されず、例えば、組成物全量あたり合計で0.1~95質量%のオキシリピンを含有する、又は、オキシリピンを含むレモングラス抽出物等の植物抽出物を含有することができる。オキシリピンが、複数種の化合物を含む場合、オキシリピンの含有量は複数種の化合物の合計の含有量を指す。
本実施形態に係る組成物の対象は、好ましくは、アドレノメデュリンの遺伝子発現の増強を必要とする或いは望む対象である。また、本実施形態に係る組成物は、健常な対象に対しても有効である。
本実施形態に係る組成物は、医薬品、飲食品、化粧品等の各形態の組成物であってよい。飲食品は、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養補給のためのサプリメント等の形態のものも包含する。
本実施形態に係る組成物は、好ましくは、経口又は経鼻により摂取又は投与される組成物であり、より好ましくは、経口により摂取又は投与される組成物である。
本実施形態に係る組成物はまた、生体外の細胞と共存させることにより該細胞においてアドレノメデュリンの遺伝子発現を増強するために用いられる組成物であってもよい。この場合、本実施形態に係る組成物は、細胞を培養するための培地中に添加されて使用される。
本実施形態に係る組成物は、継続的に摂取、投与又は使用されてもよいし、必要時に摂取、投与又は使用されてもよい。
本実施形態に係る組成物の形状は、特に限定されず、例えば、液体状、流動状、ゲル状、半固形状、又は固形状などの何れの形状であってもよい。
本実施形態に係る組成物は、有効成分に加えて、少なくとも1種の他の成分を更に含んでいてもよい。本実施形態に係る組成物が含み得る、少なくとも1種の他の成分としては、特に限定されないが、好ましくは、医薬品、飲食品、化粧品等の最終的な形態において許容される成分である。
このような他の成分としては例えば、甘味料、酸味料、ビタミン類、ミネラル類、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、水等が挙げられる。また、必要により、色素、香料、保存料、防腐剤、防かび剤、更なる生理活性物質等を添加してもよい。
甘味料としては、ブドウ糖、果糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、パラチノース、トレハロース、キシロース等の単糖や二糖、異性化糖(ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、砂糖混合異性化糖等)、糖アルコール(エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、パラチニット、ソルビトール、還元水飴等)、はちみつ、高甘味度甘味料(スクラロース、アセスルファムカリウム、ソーマチン、ステビア、アスパルテーム等)等が挙げられる。
酸味料としては、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、酒石酸、乳酸、リン酸、又はこれらの塩等があり、これらのうちの1種又は2種以上を利用することができる。
ビタミン類としては、ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンE、ナイアシン、イノシトール等が挙げられる。
ミネラル類としては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄等が挙げられる。
増粘剤としては、カラギーナン、ジェランガム、キサンタンガム、アラビアガム、タマリンドガム、グアーガム、ローカストビーンガム、カラヤガム、寒天、ゼラチン、ペクチン、大豆多糖類、カルボキシメチルセルロース(CMC)等が挙げられる。
乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチン、植物性ステロール、サポニン等が挙げられる。
酸化防止剤としては、ビタミンC、トコフェロール(ビタミンE)、酵素処理ルチン等が挙げられる。
前記他の成分は、それぞれ当業者が飲食品、医薬品等の組成物に通常採用する範囲内の量で適宜配合することができる。
実験1:レモングラス抽出物に含まれるオキシリピンの分析
(1)レモングラスからオキシリピンの抽出
三角フラスコに入れた2Lのクロロホルムに対し、レモングラスの乾燥粉末を約100g加え、スターラーを用いて攪拌しながら、室温条件下で12時間以上抽出を行った。吸引ろ過により上清を回収し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固した。
(2)オキシリピンの粗精製
得られた濃縮乾固物2~5gを中圧液体クロマトグラフィー(LC)装置を用いて以下の条件で精製し、溶出液を15mlずつ1画分として分取した。
LC装置
シリカゲルインジェクトカラム:W830
中圧LC装置:EPCLC-W-Prep 2XY(山善株式会社)
精製カラム:Si-40D(シリカゲルカラム)
移動相条件
移動相:ヘキサン/酢酸エチル
0分(50%/50%)、16分(50%/50%)、32分(10%/90%)、48分(10%/90%)
流速:40ml/min
保持時間28分から40分の間の画分について、以下の条件で薄層クロマトグラフィー(TLC)分析を行い、Rf値が0.5となるスポットが検出される画分を回収してまとめ、オキシリピン粗精製画分とした。
TLC条件は以下の通り。
TLCプレート:シリカゲルTLCプレート、製品名:ガラスプレート シリカゲル60 F254、製品番号:105715(メルクミリポア社)
展開溶媒:クロロホルム:メタノール=9:1
発色試薬:りんモリブデン酸発色試薬(りんモリブデン酸ナトリウムn水和物を10%含むエタノール溶液)
(3)オキシリピンの精製
オキシリピン粗精製画分について、以下の条件で分取TLCに供し、UV波長254nmの吸収が検出されるRf値0.5のバンドを掻き取って回収し、体積比5倍以上の抽出溶媒(クロロホルム:メタノール=8:2)に浸漬し、スターラーで30分以上攪拌して成分を抽出した。抽出液をろ紙でろ過し、ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。こうして得られた濃縮乾固物を精製オキシリピンとした。
分取TLC条件は以下の通り。
TLCプレート:分取TLCプレート、製品名:PLCガラスプレート シリカゲル60 F254,1mm、型番:113895(メルクミリポア社)
展開溶媒:クロロホルム:メタノール=9:1
(4)各種オキシリピンの単離
精製オキシリピンについて、下記の条件でリサイクル分取HPLCに供し、3つに分かれて検出される化合物をそれぞれ分取した。分取した画分を、保持時間が短い順にR1、R2、R3と名付けた。
1回目のリサイクル分取HPLC条件
リサイクル分取装置:LC-9110(日本分析工業株式会社)
分取カラム:Diolカラム、製品名:Inertsil(登録商標)Diol、粒子径5μm、内径14mm、長さ250mm、型番:5020-79054(ジーエルサイエンス株式会社)
移動相:ヘキサン:エタノール=9:1
流速:9.999ml/min
検出波長:230nm、
リサイクル回数:8回以上
続いて、R1、R2、R3を別個に以下の条件でリサイクル分取HPLCに供し、検出された各画分から1又は2の化合物をそれぞれ分取した。
2回目のリサイクル分取HPLC条件
リサイクル分取装置:LC-9110(日本分析工業株式会社)
分取カラム:Diolカラム、製品名:Inertsil(登録商標)Diol、粒子径5μm、内径14mm、長さ250mm、型番:5020-79054(ジーエルサイエンス株式会社)
移動相:クロロホルム:メタノール=98:2、99:1又は97:3
流速:9.999ml/min
検出波長:230nm
リサイクル回数:8回以上
(5)構造決定
R1から分離された2つの化合物をR1-1、R1-2とした。R2から分離された2つの化合物をR2-1、R2-2とした。R3から分離された1つの化合物をR3とした。このうち極微量のR1-1以外の化合物について構造を解析した。
R1-2として単離された化合物を、エバポレーターを用いて乾固後、NMR及びHPLC-OrbitrapTMMSシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて解析した。その結果、R1-2は、下記式の平面構造を有する化合物((9Z,11E,15E)-13-ヒドロキシ-9,11,15-オクタデカトリエン酸)であると特定された。
Figure 2023073794000002
R1-2として単離された化合物は以下の物理化学的性状を有する。
(1) 外観:薄黄色透明の水あめ状固体
(2) HR MS [M+H]+:m/z 293.2118
(3) 分子式 C18H30O3
(4) 溶解性:エタノール、メタノール、アセトニトリル、クロロホルム
(5) 紫外吸収スペクトル:λmax nm 230 (in 80% CH3CN)
(6) 1H NMRスペクトル (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 0.96 (t, J = 7.7 Hz), 1.37 (q, J = 6.5 Hz), 1.60-1.66 (m), 2.04-2.09 (m), 2.15-2.19 (m), 2.28-2.38 (m), 4.23 (q, J = 6.3 Hz), 5.35 (q, J = 9.5 Hz), 5.41-5.46 (m), 5.54-5.59 (m), 5.68 (dd, J = 15.2, 6.6 Hz), 5.97 (t, J = 11.2 Hz), 6.52 (dd, J = 15.8, 11.7 Hz)
(7) 13C NMRスペクトル (126 MHz, CHLOROFORM-D) δ 14.3, 20.8, 24.7, 27.6, 28.9, 29.4, 33.8, 35.3, 72.2, 123.8, 126.0, 127.9, 133.0, 134.9, 135.4, 178.1
R2-1として単離された化合物を、エバポレーターを用いて乾固後、NMR及びHPLC-OrbitrapTMMSシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて解析した。その結果、R2-1は下記式の平面構造で表される(7Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-7,13,15-オクタデカトリエン酸又は(9Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-9,13,15-オクタデカトリエン酸の一方又は混合物であると推定された。
Figure 2023073794000003
R2-1として単離された化合物は以下の物理化学的性状を有する。
(1) 外観:薄黄色透明の水あめ状固体
(2) HR MS [M+H]+:m/z 293.2116
(3) 分子式 C18H30O3
(4) 溶解性:エタノール、メタノール、アセトニトリル、クロロホルム、酢酸エチル、DMSO
(5) 紫外吸収スペクトル:λmax nm 230 (in 80% CH3CN)
(6) 1H NMRスペクトル 1H-NMR (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 0.99 (t, J = 7.7 Hz), 1.38-1.27 (m), 1.60-1.66 (m), 2.04 (m), 2.17-2.23 (m), 2.28-2.36 (m), 4.21 (q, J = 6.3 Hz, 1H), 5.35-5.40 (m), 5.42-5.47 (m), 5.53-5.58 (m), 5.68 (dd, J = 15.2, 6.6 Hz), 5.94 (t, J = 11.2 Hz), 6.52 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz)
(7) 13C NMRスペクトル 13C-NMR (126 MHz, CHLOROFORM-D) δ 178.5, 134.9, 134.7, 133.7, 127.2, 126.0, 124.5, 72.3, 35.4, 33.9, 29.5, 29.1, 29.0, 27.4, 24.7, 21.2, 14.3
R2-2として単離された化合物を、エバポレーターを用いて乾固後、NMR及びHPLC-OrbitrapTMMSシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて解析した。その結果、R1-2は、下記式の平面構造を有する化合物((9Z,12Z,14E)-16-ヒドロキシ-9,12,14-オクタデカトリエン酸)と特定された。
Figure 2023073794000004
R2-2として単離された化合物は以下の物理化学的性状を有する。
(1) 外観:薄黄色透明の水あめ状固体
(2) HR MS [M+H]+:m/z 293.2116
(3) 分子式 C18H30O3
(4) 溶解性:エタノール、メタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム
(5) 紫外吸収スペクトル:λmax nm 230 (in 80% CH3CN)
(6) 1H NMRスペクトル (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 6.52 (dd, J = 14.9, 10.9 Hz), 5.99 (t, J = 10.9 Hz), 5.68 (dd, J = 15.2, 6.6 Hz), 5.40 (q, J = 8.0 Hz), 5.39-5.31 (m), 4.12 (q, J = 6.5 Hz), 2.92 (t, J = 7.2 Hz), 2.34 (t, J = 7.4 Hz), 2.05 (q, J = 6.9 Hz), 1.66-1.59 (m), 1.60-1.55 (m), 1.25-1.39 (m), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H)
(7) 13C NMRスペクトル (126 MHz, CHLOROFORM-D) δ 178.4, 135.9, 130.8, 127.9, 127.3, 125.8, 77.4, 77.1, 76.9, 74.3, 33.8, 30.3, 29.5, 29.1, 29.0, 27.2, 26.2, 24.7, 9.8
R3として単離された化合物を、エバポレーターを用いて乾固後、NMR及びHPLC-OrbitrapTMMSシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて解析した。その結果、R3は、下記式の平面構造を有する化合物((10E,12Z,15Z)-9-ヒドロキシ-10,12,15-オクタデカトリエン酸)と特定された。
Figure 2023073794000005
R3として単離された化合物は以下の物理化学的性状を有する。
(1) 外観:薄黄色透明の水あめ状固体
(2) HR MS [M+H]+:m/z 293.2117
(3) 分子式 C18H30O3
(4) 溶解性:エタノール、メタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム
(5) 紫外吸収スペクトル:λmax nm 230 (in 80% CH3CN)
(6) 1H NMRスペクトル (500 MHz, CHLOROFORM-D) δ 6.50 (dd, J = 14.9, 10.9 Hz), 5.98 (t, J = 10.9 Hz), 5.68 (dd, J = 14.9, 6.9 Hz), 5.46-5.38 (m), 5.31 (q, J = 8.8 Hz), 4.16 (q, J = 6.5 Hz), 2.92 (t, J = 7.4 Hz), 2.34 (t, J = 7.7 Hz), 2.10-2.04 (m), 1.64-1.61 (m), 1.57-1.50 (m), 0.97 (t, J = 7.4 Hz)
(7) 13C NMRスペクトル (126 MHz, CHLOROFORM-D) δ 178.7, 136.3, 132.5, 130.9, 127.9, 126.6, 125.6, 73.0, 37.3, 33.9, 29.4, 29.2, 29.0, 26.1, 25.4, 24.7, 20.7, 14.3
実験2:オキシリピンによるアドレノメデュリン発現増強活性
ラット由来小腸上皮細胞株IEC-6を、1ウェル(1mL)あたり1×10細胞になるようにDMEM(1g/L glucose、5% FBS、4μg/mL insulin)培地に懸濁し、懸濁液を24ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO条件下で培養した。
培養開始から24時間後に、50μM、83.3μM、250μMの実験1(3)で調製した精製オキシリピン(分子量294g/molとみなした)を含有するDMEM(1g/L glucose、5% FBS、4μg/mL insulin)培地に交換し、更に6時間培養した。
対照としてオキシリピンを含まないDMEM培地を用いた以外は同一の方法で小腸上皮細胞株の培養を行った。
培養後の細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した後、前記細胞をMaxwell(登録商標)RSC simplyRNA Cells(プロメガ)付属の1-Thioglycerol/Homogenization SolutionとLysis Bufferを用い指定の方法で処理して細胞溶解物を回収した。
前記細胞溶解物から、Maxwell(登録商標)RSC simplyRNA Cells(プロメガ)を用い指定の手順に従いtotal RNAを調製した。
得られたtotalRNAを使用し、リアルタイムPCRによってアドレノメデュリン及び内部標準βアクチンのmRNA発現量を測定した。One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II(タカラバイオ)を用い、付属のプロトコルに従って行った。プライマー配列は次表の通り。
Figure 2023073794000006
アドレノメデュリンのmRNA発現量を、βアクチンのmRNA発現量に対する相対値として算出した。更に、各条件でのアドレノメデュリンの算出したmRNA発現量を、対照条件でのアドレノメデュリンの算出したmRNA発現量に対する相対値として表した。
各条件についてn=3で測定を行った。結果を図1に示す。オキシリピンは、アドレノメデュリンの遺伝子発現を用量依存的に増強する作用を有することが確認された。

Claims (3)

  1. オキシリピンを有効成分として含有する、アドレノメデュリン遺伝子発現増強用組成物。
  2. 前記オキシリピンが、(9Z,11E,15E)-13-ヒドロキシ-9,11,15-オクタデカトリエン酸、(7Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-7,13,15-オクタデカトリエン酸、(9Z,13E,15Z)-12-ヒドロキシ-9,13,15-オクタデカトリエン酸、(9Z,12Z,14E)-16-ヒドロキシ-9,12,14-オクタデカトリエン酸、及び、(10E,12Z,15Z)-9-ヒドロキシ-10,12,15-オクタデカトリエン酸から選択される1以上を含有する、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記オキシリピンを含有するレモングラス抽出物を含有する、請求項1又は2に記載のアドレノメデュリン遺伝子発現増強用組成物。
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