KR20180088606A - 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료능이 있는 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물 - Google Patents
비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료능이 있는 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료능이 있는 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 유래의 이소람네틴(isorhamnetin)은 간세포내 염증 대표적 염증마커들인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 농도의존적으로 저해할 뿐 만 아니라 산화스트레스에 대항하는 대표적인 세포보호 전사인자인 Nrf2 활성화를 통한 글루타치온 합성 효소들(GR, GCL)을 증가시킴으로써, 간염증, 간섬유화, 간경화 등의 비알코올성 지방간 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 유래의 이소람네틴(isorhamnetin)은 간세포내 염증 대표적 염증마커들인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 농도의존적으로 저해할 뿐 만 아니라 산화스트레스에 대항하는 대표적인 세포보호 전사인자인 Nrf2 활성화를 통한 글루타치온 합성 효소들(GR, GCL)을 증가시킴으로써, 간염증, 간섬유화, 간경화 등의 비알코올성 지방간 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료능이 있는 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 관한 것이다.
2014년 통계청 사망원인통계 결과를 보면 한국인의 3대 사망원인인 암, 심장질환, 혈관질환은 전체 사망자의 47.4%로 거의 절반이며, 다음으로 폐렴, 당뇨병 및 간질환으로 사망에 이른다고 보고되어 있다. 특히 간질환으로 6,635명이 사망하였고, 이는 인구 10만명당 13.1%를 차지하는 것이다. 지방간은 간 내 과도한 지방(주로 중성지방)이 쌓여서 발생되는데 일반적으로 간 무게의 5% 이상 지방이 축적되면 지방간으로 진단한다 (국가건강정보포털 의학정보). 간 기능 이상으로 병원을 방문한 환자의 대부분(60~80%)이 지방간이며, 전체 인구의 20~30%가 지방간이라는 연구가 있을 정도로 지방간은 매우 흔한 질병이다.
또한, 국내성인 10명중 3명은 지방간 증상을 갖고 있는 것으로 나타났으며, 2014년 삼성서울병원 소화기 내과에서 지방간 내원 환자 비율을 조사한 결과, 전체 연령대 중 30대가 35.8%, 40대 34.3%, 50대 30.6%, 60대 24.6%, 20대 24.1% 순으로 나타나 30대 연령의 지방간 비율이 가장 높은 것으로 조사되었다. 대한간학회가 1988년부터 2014년까지 건강검진을 받은 성인 75만 명의 정보를 분석한 결과, 당뇨병 환자의 70%, 고혈압 환자의 52%, 대사증후군 환자의 38%가 지방간을 앓고 있는 것으로 나타나, 간 관련 치료제 시장뿐만 아니라 건강기능성 식품시장에도 간 기능성 개선 제품에 대한 관심과 소비자의 요구도가 높아지고 있는 실정이다.
지방간은 과음으로 인한 알코올성 지방간과 술과 관계없이 고지방식이로 인한 비만 등과 연관되어 발생되는 비알코올성 지방간 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)으로 나눌 수 있으며, 비알코올성 지방간의 15%는 지방간염 및 간섬유화로, 지방간염의 5%는 간경화 또는 간암으로 이행된다. 또한 약물과다복용과 혈관 내 총콜레스테롤 및 중성지방의 양이 정상치 이상으로 증가된 고지혈증의 경우에도 간의 해독기능과 지방분해 기능을 저하시켜 비알코올성 지방간(NAFLD)이 유발되는 것으로 알려져 있다.
비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료로 처방되는 약제들인 젬피브로질(gemfibrozil)이나 아토바스타틴(atorvastatin)과 같은 스타틴(statin) 계열 약물은 근육에서 미토콘드리아에 손상을 준다는 보고가 있어 단순 지방간 치료에 사용하기에는 적합하지 않는 것으로 알려졌다. 비알코올성 지방간의 대표적 질환들인 간염증 및 간섬유화의 발생기전 중 하나가 간세포 내 지방산 산화로 인한 활성산소가 염증관련 신호전달 경로의 중심 전사인자인 NFkB를 활성화시켜 관련 염증 유전자들인 COX-2 와 iNOS의 합성을 야기시킨다.
비타민 E(토코페롤)와 비타민 C(아스코르브산)가 지방간 예방과 지방간염 환자들의 간 기능 수치 및 조직검사에서도 어느 정도 효과가 있으며, 간세포 내에 자연적으로 존재하는 항산화물인 글루타치온(glutathione, GSH)의 전구물질들인 여러 가지 약제들 (N-acetylcysteine, S-adenosyl-methionine [SAM])이 간내 글루타치온을 증가시키는 항산화작용으로 지방간 치료에 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 간내 글로타치온(GSH)은 중심합성 효소인 감마 글루타밀시스테인 라이에이스(γ-glutamylcysteine lyase, GCL)로부터 합성되고 글루타치온리덕테이스(glutathione reductase, GR)의 작용으로 산화형인 GSSG로부터 환원되어 생성된다. 글루타치온리덕테이스(glutathione reductase, GR)와 감마 글루타밀시스테인 라이에이스(γ-glutamylcysteine lyase, GCL)와 같은 간세포내 글루타치온 합성효소의 증가는 세포 항상성 유지와 세포 보호기전의 대표적인 전사인자인 Nrf2의 활성화를 통하여 진행된다. 따라서, 염증인자인 NFkB를 활성화를 억제하고 세포보호 및 방어성 Nrf2 전사인자를 활성화시킬 수 있는 천연물 유래의 항산화성 성분들도 지방간염 질환의 예방과 치료에 효능을 보일 수 있음을 시사한다. 따라서, 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 비알콜성 지방간의 예방 및 치료를 위한 천연물 유래 약물개발이 필요한 실정이다.
한국공개특허 제2015-0103847호는 갈화추출물을 유효성분으로 함유하는 비알콜성 지방간 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 갈화추출물은 지방축적, 지질 축적으로 의한 간조직의 변형 등 비알콜성 지방간으로 인한 병리학적소견을 완화시키고, 혈중 지질 함량을 감소시킬 수 있으며, 지방세포 전사조절인자인 PPARγ 및 C/EBPα와 지방산 생합성을 조절하는 전사인자인 SREBP-1의 발현을 억제할 수 있다고 개시하였으나, 유효성분의 분리는 시도되지 않았다.
한국등록특허 제0867320호에서는 13종의 한약재의 수추출물을 이용한 간섬유화(간경화)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, Dimethylnitrosoamine(DMN) 첨가 식이를 통하여 간섬유화를 유발시키고, 간손상 지표로 혈중 빌리루빈, AST, ALT 조사 및 간조직내 지질과산화물질인 MDA 함량을 분석하였으나, 유효성분에 관한 연구는 시도되지 않았다.
한편, 퉁퉁마디(Salicornia europaea)는 우리나라 서해안 갯벌에서 대량 서식하고 있는 대표적인 염생식물로서, 염 저항성이 강하여 NaCl 200mM을 첨가한 사경재배에서도 성장감소 없이 생육이 가능하며, 생육을 위하여 염류를 절대적으로 필요로 하는 절대 염생식물(Obligatory halophyte or True halophyte)이다. 퉁퉁마디는 나트륨 외에도 마그네슘, 칼륨, 철 등의 미네랄과 풍부한 아미노산을 다량 함유하여 우리나라에서는 채소, 약초, 발효식품 등으로 이용하였고, 유럽에서는 샐러드, 식초의 재료 등으로 이용하고 있다.
절대 염생식물에서 삼투조절에 기여하는 용질들은 삼투저항 유기물질로 알려졌는데 세포내 축적되는 대표적인 삼투저항 물질들로는 아미노산 proline, glycin betaine과 같은 onium 화합물, 당알코올류들인 mannitol, sorbitol, ononitol 등과 단당류 trehalose 등으로 알려지고 있다.
퉁퉁마디는 오랫동안 민간약으로 시력저하, 소화불량, 위장병, 간염, 신장병 등에 사용되어 왔고, 항당뇨, 항암, 항고혈압, 항고지혈증, 피부미백 활성 등에 대한 연구만 이루어졌을 뿐 아직까지 그 생리활성 유효성분에 대한 연구가 많이 이루어지지 않았다.
한국 등록특허 제0468073호는 항당뇨 활성을 갖는 함초 추출물 또는 이로부터 분리된 이소람네틴-3-Ｏ-β-Ｄ-글루코시드를 포함하는 조성물을 개시하였고, 한국 등록특허 제1212612호는 퉁퉁마디로부터 분리된 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트 (isoquercitrin 6''-O-methyloxalate)가 항산화활성 및 과산화물 생성억제활성을 갖는다고 개시한 바 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 퉁퉁마디 추출물 및 이로부터 분리된 이소람네틴(isorhamnetin)이 비알코올성 지방간 질환 예방 및 치료능을 갖는다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 비알코올성 지방간 질환 예방능이 있는 천연 추출물의 분획물 및 이를 포함하는 식품 및 사료 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료능이 있는 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 비알코올성 지방간은 비알코올성 간염증, 비알코올성 간섬유화 및 비알코올성 간경화로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료능이 있는 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 포함하는 식품 및 사료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 유래의 이소람네틴(isorhamnetin)은 간세포내 대표적 염증마커들인 iNOS와 COX-2 단백질 발현을 농도의존적으로 저해할 뿐 만 아니라 산화스트레스에 대항하는 대표적인 세포보호 전사인자인 Nrf2 활성화를 통한 글루타치온 합성 효소들(GR, GCL)을 증가시킴으로써, 간염증, 간섬유화, 간경화 등의 비알코올성 지방간 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.
도 1은 퉁퉁마디 추출물로부터 분리된 분획물 및 화합물 1(이소람네틴)의 HPLC 크로마토그램이다 (A: 분획물(SEW-EA-B2), B: 분획물(SEW-EA-B2-F2), C: 분획물(SEW-L-17)에서 정제된 화합물 1).
도 2는 이소람네틴 화합물의 ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼이다 (A: 이소람네틴 화학식, B: ESI-MS, C: 1H-NMR, D: 13C-NMR).
도 3은 고지방식이를 통한 C57BL/6J 마우스 비만 유도를 나타낸 결과이다.
도 4는 고지방 및 정제염 식이군과 고지방 및 퉁퉁마디 추출물 식이군에서 적출된 마우스 간들의 무게와 간손상지표인 혈중 ALT 수준을 비교 측정한 결과이다(A: 마우스 간 성상 사진, B: 마우스 간 무게, C: 마우스 혈중 ALT).
도 5는 고지방 및 정제염 식이군과 고지방 및 퉁퉁마디 추출물 식이군에서의 간조직내 비알코올성 지방간 질환 지표인 염증 및 섬유화 수준을 비교 측정한 결과이다(A: 마우스 간 조직 H&E 염색 사진 및 Masson's trichrome 염색 사진, B: Steatosis, Inflammation, Ballooning 결과, C: NAFLD (비알콜성 지방간 질환) 척도 점수).
도 6은 고지방 및 정제염 식이군과 고지방 및 퉁퉁마디 추출물 식이군의 간조직내 염증 및 간섬유화 마커들(Il1b, Cxcl2, Ccl2, Cd68, Col1a1)의 mRNA 발현을 측정한 결과이다.
도 7은 퉁퉁마디 추출물에서 단리된 이소람네틴의 LPS로 자극된 인간 간세포주인 HepG2 세포에서 유도되는 아질산염(NO) 방출량 억제능(A) 및 iNOS 단백질 발현 저해능(B)을 확인한 결과이다.
도 8은 퉁퉁마디 추출물에서 단리된 이소람네틴의 LPS로 자극된 인간 간세포주인 HepG2 세포에서 유도되는 COX-2 단백질 발현 저해능(A)과 핵내에서의 NF-kB 단백질 발현 저해능(B)을 확인한 결과이다.
도 9는 퉁퉁마디 추출물에서 단리된 이소람네틴이 t-BHP가 처리된 HepG2 세포에서 생성되는 ROS의 생성과 세포사멸을 억제하고(A) 세포내 ROS 소거를 관찰한 형광현미경 사진(B)이다.
도 10은 퉁퉁마디 추출물에서 단리된 이소람네틴이 처리된 간세포 내에서의 글루타치온(GSH)의 함량(A) 및 글루타치온 합성효소(GR, GCL)의 발현능(B)을 확인한 결과이다.
도 2는 이소람네틴 화합물의 ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼이다 (A: 이소람네틴 화학식, B: ESI-MS, C: 1H-NMR, D: 13C-NMR).
도 3은 고지방식이를 통한 C57BL/6J 마우스 비만 유도를 나타낸 결과이다.
도 4는 고지방 및 정제염 식이군과 고지방 및 퉁퉁마디 추출물 식이군에서 적출된 마우스 간들의 무게와 간손상지표인 혈중 ALT 수준을 비교 측정한 결과이다(A: 마우스 간 성상 사진, B: 마우스 간 무게, C: 마우스 혈중 ALT).
도 5는 고지방 및 정제염 식이군과 고지방 및 퉁퉁마디 추출물 식이군에서의 간조직내 비알코올성 지방간 질환 지표인 염증 및 섬유화 수준을 비교 측정한 결과이다(A: 마우스 간 조직 H&E 염색 사진 및 Masson's trichrome 염색 사진, B: Steatosis, Inflammation, Ballooning 결과, C: NAFLD (비알콜성 지방간 질환) 척도 점수).
도 6은 고지방 및 정제염 식이군과 고지방 및 퉁퉁마디 추출물 식이군의 간조직내 염증 및 간섬유화 마커들(Il1b, Cxcl2, Ccl2, Cd68, Col1a1)의 mRNA 발현을 측정한 결과이다.
도 7은 퉁퉁마디 추출물에서 단리된 이소람네틴의 LPS로 자극된 인간 간세포주인 HepG2 세포에서 유도되는 아질산염(NO) 방출량 억제능(A) 및 iNOS 단백질 발현 저해능(B)을 확인한 결과이다.
도 8은 퉁퉁마디 추출물에서 단리된 이소람네틴의 LPS로 자극된 인간 간세포주인 HepG2 세포에서 유도되는 COX-2 단백질 발현 저해능(A)과 핵내에서의 NF-kB 단백질 발현 저해능(B)을 확인한 결과이다.
도 9는 퉁퉁마디 추출물에서 단리된 이소람네틴이 t-BHP가 처리된 HepG2 세포에서 생성되는 ROS의 생성과 세포사멸을 억제하고(A) 세포내 ROS 소거를 관찰한 형광현미경 사진(B)이다.
도 10은 퉁퉁마디 추출물에서 단리된 이소람네틴이 처리된 간세포 내에서의 글루타치온(GSH)의 함량(A) 및 글루타치온 합성효소(GR, GCL)의 발현능(B)을 확인한 결과이다.
본 발명에서는 아직까지 널리 연구가 이루어지지 않은 퉁퉁마디로부터 간세포내 염증반응 억제능 및 간세포 보호활성이 우수한 활성물질을 분리하고자 하였다.
본 발명에서는, 퉁퉁마디 추출물 및 이로부터 분리한 이소람네틴이 간세포내 염증반응 억제능 및 간세포 보호능을 가지고 있다는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 퉁퉁마디 열수 추출물이 고지방식이와 정제염 식이에서 촉발되는 비알코올성 지방간으로 인한 간손상, 간염 및 간섬유화 과정을 효과적으로 억제한다는 것을 확인할 수 있었으며, 퉁퉁마디 열수 추출물을 용매 분획, 크로마토그래피 분획 및 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 분리한 이소람네틴이 간세포내 염증 대표적 염증마커들인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 농도의존적으로 저해할 뿐 만 아니라 산화스트레스에 대항하는 대표적인 세포보호 전사인자인 Nrf2 활성화를 통한 글루타치온 합성 효소들(GR, GCL)을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료능이 있는 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 관한 것이다.
본 발명의 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 추출물은 염생식물인 퉁퉁마디에서 분리한 이소람네틴(isorhamnetin)을 포함하여 독성 및 부작용이 거의 없으며, 따라서 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료와 간기능 개선의 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 다른 관점에서, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료능이 있는 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 포함하는 식품 및 사료 조성물에 관한 것이다.
상기 식품 및 사료 조성물은 유효성분인 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 것 이외에 통상의 식품 조성물에 사용되는 여러 향미제, 천연 탄수화물 등이 추가로 포함될 수 있다.
상기 천연 탄수화물로는 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예를 들어, 말토스, 슈크로스 등), 폴리사카라이드(예를 들어, 덱스트린, 시클로덱스트린) 등과 같은 통상적인 당이나 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 사용될 수 있다. 상기 향미제로는 천연 향미제(예를 들어, 타우마틴 등), 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등), 합성 향미제(예를 들어, 사카린, 아스파르탐 등) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용할 수도 있으며, 각종 식품에 첨가제 형태로 첨가할 수도 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 이소람네틴(isorhamnetin) 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 첨가될 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다.
상기 식품 조성물의 형태 중 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 첨가물로는 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류; 등이 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다. 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 이소람네틴(isorhamnetin)을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품에는 필요에 따라 교미제 등이 첨가될 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 이소람네틴(isorhamnetin)을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 이소람네틴(isorhamnetin)을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제에는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등이 첨가될 수도 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 이소람네틴(isorhamnetin)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 이소람네틴(isorhamnetin)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등이 첨가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 비알코올성 지방간은 비알코올성 간염증, 비알코올성 간섬유화, 비알코올성 간경화 등을 예시할 수 있으며, 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 유래의 이소람네틴(isorhamnetin)은 비알코올성 지방간 질환 억제능 이외에 유리라디컬 및 활성산소 소거, 지질과산화 억제 등의 강한 항산화활성과 산화스트레스에 대한 세포보호능이 있으므로 식품, 화장품, 의약품 및 동물의약품과 기능성 사료 등의 원료로 널리 이용할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 퉁퉁마디 추출물로부터 유효성분 화합물 1의 분리
1-1. 퉁퉁마디 열수 추출물의 제조
세척하고, 세절된 퉁퉁마디 전초 10kg을 초고속 진공농축수 추출기(COSMOS660, ㈜경서 E & P, 한국)로 무염수 20ℓ를 첨가하여 100±5℃에서 5시간 동안 열수 추출하였다. 다음으로 추출액을 여과시킨 후, 잔사에 10ℓ의 물을 첨가하고 동일조건에서 2시간 재추출 후, 먼저 얻은 추출액과 혼합한 후 80~90℃에서 염도 20%, 고형분 40%로 농축하였다. 끝으로 농축물을 고형분 대비 1~5%의 활성탄으로 정제한 후 동결건조하여 열수 추출물을 제조하였다.
1-2. 용매 분획물 획득
실시예 1-1에서 얻은 퉁퉁마디 열수추출물 374g을 1ℓ의 물에 현탁시킨 후 3ℓ의 에탄올을 가하고 4℃에서 하룻밤 정치하여 생긴 고분자 침전물을 원심분리(4℃, 10000rpm, 30분) 및 감압필터 여과로 제거하고, 여과액을 감압건조하여 에탄올을 완전 제거한 액을 증류수 2ℓ에 재용해 시켰다.
다음으로 5ℓ 부피의 분액깔대기에 2ℓ의 n-헥산을 혼합하여 헥산층과 수층으로 2회 분획하였다. 상기 수층에 2ℓ의 클로로포름을 첨가하여 클로로포름층과 수층으로 2회 분획하고, 수층에 다시 에틸아세테이트를 첨가하고 에틸아세테이트층과 수층으로 2회 분획하고, 최종적으로 수층에 n-부탄올을 2ℓ 가하여 부탄올층과 수층으로 2회 분획하였다.
다음으로 각각의 분획층들을 감압건조하여 각 유기용매를 제거하고 동결건조시켜, 헥산 분획물(0.8g), 클로로포름 분획물(0.9g), 에틸아세테이트 분획물(3.4g), 부탄올 분획물(9.8g) 및 물 분획물(16.1g)을 제조하였다.
1-3. 컬럼크로마토그래피 정제
실시예 1-2에서 제조된 유기용매 분획물 중 항산화활성과 간세포보호 활성능이 우수한 에틸아세테이트 분획물(SEW-EA) (3.4g)을 50㎖ 알칼리수 (pH 10)에 용해시켜 흡착성 디아이온 HP-20 레진이 충진된 첫 번째 컬럼 (3.5 × 40㎝) 상단부위에 흡착시킨 후 증류수, 70% 메탄올 및 70% 아세톤으로 순차적으로 용출시켜 3개의 분획물들을 획득하였다. 그중 항산화활성과 간세포 보호 활성이 우수한 아세톤 용출획분(SEW-EA-B2) 1.5g을 극성 실리카겔이 충진된 두번째 컬럼 (2.8 × 40㎝)에서 메탄올을 농도구배로 증가시킨 클로로포름 용매, 보다 상세하게 클로로포름 : 메탄올의 비율이 100:0에서 70:30으로 순차적으로 변환시키면서, 유속 0.3㎖/분의 속도로 용출시켜 350㎖씩 5개의 분획물을 획득하였다. 그리고 그중 항산화활성과 간세포 보호 활성이 우수한 획분(SEW-EA-B2-F2, 432㎎)을 감압건조 후 2㎖의 메탄올에 용해하고, 저분자용 겔여과 세파덱스 (Sephadex) LH-20이 충진된 세 번째 컬럼 (2 × 33㎝)에 도입한 다음 95% 메탄올(유속 0.2㎖/분)을 흘러보내면서 30㎖씩 분획하여 총 20개의 분획물(SEW-L-1 ~ SEW-L-20)을 획득하였다. 최종적으로 상기 20개의 분획물 중 항산화활성과 간세포 보호활성이 가장 우수한 SEW-L-17 획분을 감압농축, 동결건조하여 68㎎을 수득하였다.
1-4. 고속액체크로마토그라피(HPLC) 정제
실시예 1-3에서 수득된 SEW-L-17 분획물 68㎎을 2㎖의 HPLC 용 메탄올에 용해한 후 0.22㎛ 필터로 여과한 다음 고속액체크로마토그라피를 이용하여 항산화성과 간세포보호활성이 강한 단일물질을 분리하였다. 분석용 HPLC는 졸박스 이클립스 C18 분석 컬럼 (Zorbax Eclips, 5㎛, 4.5 × 250㎜, Agilent)이 장착된 모델(1260 Infinity, Agilent, USA)을 사용하였고, 고속분취 액체크로마토그라피는 일본 YMC사의 프렙용 컬럼(Triart C18, 20㎜ × 150㎜, 5㎛, YMC, Japan)이 장착한 모델(Multiple Preparative HPLC(LC-forte/R, YMC, Japan)을 사용하였다. 이동상 용매 조건은 메탄올과 3차 증류수를 이용한 그래디언트 조건에서 1~3㎖/분의 유속으로 흐르게 하여 분석하였으며, Agilent, 1200 DAD 검출기(detector) 또는 YMC-YUV-3400 UV 검출기를 사용하였으며, 두 파장영역 (260 및 330 nm)의 흡수도를 이용하여 화합물들을 순수분획한 결과 머무름시간 13.5 분에서 화합물 1(32mg)을 수득할 수 있었다. 도 1은 퉁퉁마디 정제 분획물인 SEW-EA-B2, SEW-EA-B2-F2, 및 SEW-L-17의 분석용 HPLC 크로마토그램과 화합물 1의 자외선 흡수 파장 스펙트럼이다.
실시예 2: 퉁퉁마디 추출물로부터 분리된 화합물 1의 구조분석
실시예 1-4에서 분리된 화합물 1의 자외선 최대 흡수대 및 시약 첨가에 따른 흡수변이(adsorption shift)는 각 시료를 메탄올에 1㎎/㎖의 농도로 용해시킨 후 자외선 분광기(Genesys 10S UV-VIS spectrophotometer, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 190-500nm 영역내에서 측정하였다. 이때, 시약첨가에 따른 자외선 흡수대의 변화를 관찰하기 위하여 AlCl3 , NaOH, NaOAC 등을 사용하였다.
화합물의 분자량 결정을 위하여 전자포말이온화 (ESI) 질량분석기 (LC-ESI mass spectrometer, AGILENT 1100, USA Micromass Quattro II)로 포지티브 및 네거티브 스캔을 실시하고, 하이 레조루션(High resolution) MS를 측정하였다.
핵자기공명(NMR)분석은 화합물 1(10㎎)을 완전 건조하여 DMSO-d6(0.5㎖)에 용해한 후 5㎜ NMR 튜브에 주입하고 제올 모델 기종 (JNM-ECA 600, Jeol, Japan)으로 분석 하였으며, 1H-NMR은 600MHz로, 13C-NMR은 150MHz로 각각 측정하였다.
상기와 같이 측정한 결과, 화합물 1은 이소람네틴(isorhamnetin)으로 동정되었고 물리화학적 성질은 다음과 같다.
(1) 분자식 : C16H12O7
(2) 분자량 : 316, ESI-MS: m/z 315.2 [M-H], m/z 631.2 [M+M-H], m/z 317.0 [M+H] (도 2B)
(2) 녹는점 : 392℃
(3) 성상 : 황색분말
(4) 용해성 : 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름에 용해되고 물에 불용성
(5) TLC 발색 : FeCl3(양성), 브로모크레졸그린 (음성), UV light(양성, 황녹색), 아니린디페닐라민(음성), 앤티모니(음성), 드라겐돌프(음성)
(6) 자외선 최대 흡수파장 영역 (메탄올, nm) : 253, 267sh, 306sh, and 370, (+NaOH) : 273, 287sh, 326sh, 390, (+AlCl3) : 253, 267sh, 306sh, and 423 (+AlCl3 + HCl) : 253, 267sh, 306sh, and 370 ; (+NaOAc + H3BO3) 254, 306, 382
(7) 1H 및 13C-NMR : 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 2.49 (1H, d, 3-H), 3.83 (3H, s, OCH3), 6.18 (1H, d, 6-H), 6.47 (1H, d, 8-H), 6.93 (1H, d, 5′-H), 7.68 (1H, m, 6′-H), 7.74 (1H, d, 2′-H), 9.43 (1H, s, OH), 9.75 (1H, s, OH), 10.76 (1H, s, OH), 12.46 (1H, s, 5-OH) (도 2C), 13C-NMR (150MHz, DMSO-d6) δppm : 148.81(2-C), 135.86(3-C), 175.90(4-C), 156.17(5-C), 8.21(6-C), 163.94(7C), 93.60(8-C), 160.94(9-C), 103.05(10-C), 122.00(1′-C), 111.65(2′-C), 146.-63(3′-C), 147.37(4′-C), 115.55(5′-C), 121.72(6′-C), 55.73 (OCH3) (도 2D)
(8) 화학구조식
실시예 3: 퉁퉁마디 추출물의 고지방식이와 정제염 식이 유도 비알코올성 지방간의 억제효능 확인
3-1. C57BL/6J 마우스의 고지방식이 급여로 인한 비만 유도
C57BL/6J 수컷 7주령 마우스 36 마리를 무작위로 다음과 같이 두 그룹으로 나누고 24주 동안 각 사료를 급여하여 비만 및 인슐린 저항성을 유도하였다. 저지방식이 그룹(LFD, D12450B Rodent Diet with 10 kcal% fat; Research Diets, n=5) 및 고지방식이 그룹(HFD, D12492 Rodent Diet with 60 kcal% fat; Research Diets, n=31)에 24주 동안 각각 LFD와 HFD를 섭취시키고 평균체중을 비교하였을 때 LFD 섭취군(40.5 ± 1.8g)에 비해 HFD 섭취군(52.4 ± 0.5g)의 체중이 유의적으로 높게 나타났다 (P < 0.05)(도 3).
고지방식이 급여로 비만이 잘 유도되었음을 확인하였으므로, 고지방식이 유도 비만쥐를 대상으로 고지방식이와 정제염 식이를 통한 비알코올성 지방간 유도 실험을 진행하게 되었다.
3-2. 퉁퉁마디 추출물의 고지방식와 정제염 섭취로 유도된 간손상 개선 효능 평가
고지방식이는 미국 Research Diets 社에서 구입한 D12492 (Rodent Diet with 60 kcal% fat)이며, 정제염은 국내 ㈜한주소금에서 구입하였다. 소금 농도 설정은 WHO에서 권장하는 성인 하루 섭취량(나트륨 2g 또는 소금 5g)을 기준으로, 선행문헌에 따라 이를 쥐 체적률로 환산하여 계산하였으며, 소금 함량이 쥐 사료의 약 1%가 성인의 하루 권장 소금섭취량과 같게 하고, 이를 각각 NaCl 함량 기준으로 계산하였을 시, 1-1에서 제조된 퉁퉁마디 열수추출물(NaCl 함량: 약 56.41%)은 고지방식이의 약 1.77%, 한주소금(정제염, NaCl 함량:99.52%)은 고지방식이의 약 1.00%이며, 이를 바탕으로 사료를 조제하여 실험을 진행하였다.
또한, 고지방식이를 총 36주간 급여하였을 시, 지방간염증이 뚜렷하게 유발된다는 선행문헌에 따라 고지방식이를 24주간 투여한 후, 고지방과 소금을 섞은 식이를 13주간 추가 투여하여 총 37주간 실험을 진행하였다. 부검 후, 장기 무게를 분석한 결과 고지방식이와 정제염을 섭취한 군(HFD + purified salt PS)은 고지방식이만을 섭취한 군에 비해 간 무게가 유의적으로 증가하였고, 고지방식이와 퉁퉁마디 추출물을 섭취한 군(HFD + Salicornia salt, SS)에서는 간 무게가 고지방식이와 정제염을 섭취한 군보다 유의적으로 낮아(P < 0.05) 퉁퉁마디 추출물이 지방간 발생 억제효능이 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 4A 및 4B).
또한, 부검 후 얻은 혈장을 분석하여, 간세포가 손상을 받았을 때 혈중으로 방출되는 효소인 ALT (alanine aminotransferase)의 수치를 확인한 결과, 고지방식이와 정제염을 섭취한 군은 고지방식이만을 섭취한 군에 비해 ALT 수준이 유의적으로 증가되었고, 고지방식이와 퉁퉁마디 추출물을 섭취한 군에서는 ALT 수준이 고지방식이와 정제염을 섭취한 군보다 유의적으로 낮음 (P < 0.05)을 확인할 수 있었다(도 4C).
3-3. 퉁퉁마디 추출물의 비알콜성 지방간 질환(NAFLD)개선 효능의 조직학적 평가
퉁퉁마디 추출물의 비알콜성 지방간 질환 개선 효능을 조직학적으로 확인하기 위하여, 부검 후 얻은 간 조직을 대상으로 H&E 염색 및 Masson's trichrome 염색을 수행하고, 지방간증을 분석하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 고지방식이와 퉁퉁마디 추출물을 섭취한 군(HFD + Salicornia salt, SS)이 고지방식이와 정제염을 섭취한 군(HFD + purified salt PS)에 비해 지방간증이 억제되는 효능을 보였다. 즉, H&E 염색을 바탕으로 진행한 steatosis scoring 항목에서는 고지방식이와 퉁퉁마디 추출물을 섭취한 군(HFD + Salicornia salt, SS)이 고지방식이와 정제염을 섭취한 군(HFD + purified salt PS)보다 지방간증을 저해시킴을 확인하였으며 (P < 0.094), 간내 염증(inflammation)도 유의적으로 억제됨을 확인하였다.
또한, Steatosis, Inflammation 및 Ballooning을 종합하여 NAFLD (비알콜성 지방간 질환) 개선효능을 scoring을 하였을 때, 퉁퉁마디 추출물이 고지방식이와 정제염 식사로 촉발되는 비알코올성 지방간증을 억제하는 효능이 있다는 것을 확인할 수 있었다.
참고로 scoring 기준은 다음과 같다.
- 간섬유화 진행 점수: 0=섬유화가 10% 이하로 진행된 간, 1=10~33% 섬유화가 진행된 간, 2=33~66% 섬유화가 진행된 간, 3=66% 이상 섬유화가 진행된 간
- 간소엽내 염증 진행 점수: 0=200배 필드 현미경 하에서 관찰되는 병소가 없을 때, 1=200배 필드 현미경 하에서 관찰되는 병소가 2개 이하일 때, 2=200배 필드 현미경 하에서 관찰되는 병소가 2개에서 4개 사이일 때, 3=200배 필드 현미경 하에서 관찰되는 병소가 4개 이상일 때
3-4. 퉁퉁마디 추출물의 간조직 내 염증 및 섬유화 마커의 mRNA 발현에 미치는 영향 평가
조직내 염증 및 간섬유화 마커들(Il1b, Cxcl2, Ccl2, Cd68, Col1a1)의 mRNA 발현을 다음과 같이 측정하였다. 부검 후 얻은 간조직으로부터 RNA 분리 킷 (Ambion, RNA isolation kit, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)을 이용하여 RNA를 추출하고, 이를 NanoDrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 정량하고, 1st strand c-DNA 합성 킷(Takara Bio Inc., Otsu, Japan)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. mRNA 발현은 SYBR Green Master Mix(BioRad, Hercules, CA, USA) 프라이머들과 합성된 c-DNA 2㎕를 사용하여 qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)를 실시하여 확인 하였다.
PCR은 증폭반응 전 프라이머들은 95℃에서 3분간 변성시키고, 44 사이클로 95℃에서 10분간, 60℃에서 30분, 72℃ 30분간 반응조건으로 44회 연속반응시켰다. PCR 반응물내 mRNA 함량은 CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System (BioRad, Hercules, CA, USA)에서 측정하였다. 사용된 프라이머들은 다음과 같다.
서열번호 1: Ccl2 forward (5′-CCA CTC ACC TGC TGC TAC TCA T-3′)
서열번호 2: Ccl2 reverse (5′-TGG TGA TCC TCT TGT AGC TCT CC-3′)
서열번호 3: Il1b forward (5′-GGA GAA CCA AGC AAC GAC AAA ATA-3′)
서열번호 4: Il1b reverse (5′-TGG GGA ACT CTG CAG ACT CAA AC-3′)
서열번호 5: Cd68 forward (5′-ACC TGC TCA ACA TCA TGA AGG-3′)
서열번호 6: Cd68 reverse (5′-AGA TGG AGC TAT GCA GGT GG-3′)
서열번호 7: Cxcl2 forward (5′-CCA AGG GTT GAC TTC AAG AAC-3′)
서열번호 8: Cxcl2 reverse (5′-AGC GAG GCA CAT CAG GTA CG-3′)
서열번호 9: Col1a1 forward(5′-GCT CCT CTT AGG GGC CAC T-3′)
서열번호 10: Col1a1 reverse (5′-CCA CGT CTC ACC ATT GGG G-3′)
도 6에 나타난 바와 같이, 고지방식이와 정제염을 섭취한 군(HFD + purified salt PS)에 비하여 고지방식이와 퉁퉁마디 추출물을 섭취한 군(HFD + Salicornia salt, SS)은 염증관련 마커(cxcl2, il1b)의 발현과 섬유화관련 마커(col1a1)의 발현을 유의적으로 저해한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 이소람네틴의 효능 확인
4-1. 항산화 활성 조사
실시예 2의 퉁퉁마디 추출물로부터 유효성분으로 분리 동정된 이소람네틴의 항산화 활성을 확인하기 위하여 DPPH 유리 라디컬에 대한 소거능, 활성산소 소거능 및 지질과산화 저해능 평가를 수행하였다. 이때 대조군으로 비알코올성 지방간 예방과 치료에 사용되는 항산화 비타민인 알파-토코페롤(비타민 E)과 간세포 글루타치온의 전구물질인 N-acetylcystein(NAC)을 사용하였다.
4-1-1 : 유리라디컬 소거능 측정
항산화 활성은 불로이스의 방법(Chen, et. al., 1999. J. Agric. Food Chem. 47. 2226-2228)에 준하여 1,1-디페닐-2-피크릴 하이드라질(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, DPPH, Sigma Co., USA)을 이용하여 측정하였다. 즉, DPPH 5㎎을 에탄올 50㎖에 녹여 DPPH 용액을 만든 후 96-well microplate에 180㎕를 가하고 시료를 0~100㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 5초 동안 혼합한 후 30분 동안 실온에서 반응시키고, 517㎚에서 시료를 가하지 않은 대조군에 대한 흡광도 감소를 유리라디컬소거 활성(%)으로 나타내었다. 50%의 유리라디컬을 소거하는데 필요한 물질의 농도를 IC50 값으로 나타낼 수 있으며, 이 값이 낮을수록 항산화능이 강함을 의미한다.
| 화합물 | DPPH 소거활성(IC50값, μM) |
| 이소람네틴 | 10.6 |
| 알파-토코페롤 | 42.4 |
| N-아세틸시스테인 | 19.8 |
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 퉁퉁마디에서 분리한 이소람네틴은 알파-토코페롤보다 약 4배, N-아세틸시스테인보다 약 1.87배 강한 유리라디컬 소거능이 있음을 확인하였다.
4-1-2 : 활성산소 소거능 측정
활성산소(superoxide anion) 소거능 측정은 잔틴/잔틴옥시다제 (xanthin/xanthin oxidase) 효소반응에 의한 활성산소 발생계를 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루 테트라졸리움 (nitroblue tetrazolim, NBT)의 산화에 의한 광흡수도 (530㎚) 변화를 이용하여 측정하고, 50%의 활성산소를 소거하는데 필요한 물질의 농도를 표 2에 IC50 값으로 나타내었다.
| 화합물 | 활성산소 소거활성 (IC50값, μM) |
| 이소람네틴 | 5.3 |
| 알파-토코페롤 | >50 |
| N-아세틸시스테인 | 18.8 |
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 퉁퉁마디에서 분리한 이소람네틴은 알파-토코페롤보다 약 9배 이상, N-아세틸시스테인보다 약 3.5배 강한 활성산소 소거능이 있음을 확인하였다.
4-1-3 : 지질과산화 저해능 측정
지질과산화 저해능 측정은 적출된 흰쥐 간세포를 초원심분리 (77000g, 60분, Hitachi RP 30) 하여 얻어진 마이크로좀을 지질원으로 하여 Fe2+ 아스코르베이트계에 의한 지질과산화를 유도하고 생성된 말론디알데히드 (malonaldehyde, MDA)를 티오바비트린산 (thiobarbituric acid, TBA)과 반응시켜 시료에 의해 감소된 MDA양을 정량 환산하였다. 시험관에 시료가 함유된 간 마이크로좀 용액 200㎕와 소듐도데실슬폰염(sodium dodesyl sulfate, SDS)용액 225㎕를 가하고 5초간 진 탕 혼합한 후, 20%의 아세트산, 75㎕의 증류수, 1.2% TBA 용액 1㎖씩 가하여 30분간 가온 하였다. 실온에서 30분 냉각 후에 3000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 532㎚에서 흡광도를 측정하여 시료를 첨가하지 않은 대조군에 대한 지질 과산화 저해활성(%)을 구하고, 50%의 활성산소를 소거하는데 필요한 물질의 농도를 IC50 값으로 나타내었다.
| 화합물 | 지질과산화 저해활성 (IC50값, μM) |
| 이소람네틴 | 20.5 |
| 알파-토코페롤 | 45.1 |
| N-아세틸시스테인 | 32.7 |
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 퉁퉁마디에서 분리한 이소람네틴은 알파-토코페롤보다 약 2.2배, N-아세틸시스테인보다 약 1.65배 강한 지질과산화 저해능이 있음을 확인하였다.
4-2. LPS로 자극된 Human HepG2 세포에서 퉁퉁마디에서 분리된 이소람네틴 유효성분의 농도의존적인 NO 방출량 억제능 및 iNOS 단백질 발현 저해능 측정
퉁퉁마디에서 분리한 이소람네틴의 간세포내 항염증 효능을 분석하기 위하여 간세포 염증 유발 인자인 LPS(100ng/㎖)로 자극된 human HepG2 세포에서 생성되는 아질산염(NO)이 이소람네틴의 농도에 의존적으로 저해되는지 확인하였다. 아질산염(NO)의 측정은 Griess 시약을 이용한 NO assay를 사용하였다.
그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이, HepG2 세포에서 LPS에 의해서 유도되는 아질산염(NO)은 25.13 ± 0.75μM로 대조군으로 사용한 3.35 ± 0.52μM에 비하여 약 7.5배의 증가를 보였으나, 이소람네틴을 농도별(10, 25, 50μM)로 처리 한 결과 각각 20.59 ± 0.68μM, 12.08 ± 0.46μM, 5.01 ± 0.09μM로 아질산염(NO)의 양이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 이소람네틴이 농도 의존적으로 아질산염(NO)의 합성 유도 효소인 iNOS의 단백질 발현을 저해하는 것을 확인하고자 Immunoblotting 실험을 실시하였다. 즉 iNOS 단백질의 발현 양상을 분석하기 위하여 이소람네틴과 LPS를 동시에 HepG2 세포에 처리하고 18시간 동안 배양한 다음, 세포를 라이시스(lysis)시키고, 단백질을 정량(Bradford assay, BioRad Laborotories, Hercules, CA)하였다. 다음으로 동일한 양(20㎍)의 단백질을 12% SDS-PAGE 겔(Min Bio-Rad, Hets, UK)에 로딩하고, 전기영동을 실시하였다. 분리된 단백질은 셀룰로스 막(nitrocelluose membrane, Hybond-C Extra, Amersham)에 트랜스퍼하고, iNOS에 대한 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 결합시킨 후, 2차 항체(HRP-conjugated goat ant-rabbit immunoglobulin G antibody, Sigma)를 가하였다. iNOS 단백질 발현은 β-actin과 함께 chemiluminescence detection kit(Amersham Bioscience)을 이용하여 확인하였다.
도 7B에 나타난 바와 같이, LPS 처리로 세포내 증폭된 iNOS 단백질은 이소람네틴 처리에 의하여 농도의존적으로 감소됨을 확인할 수 있었고, 특히 50μM 이소람네틴은 LPS에 의해 증폭된 iNOS 단백질 발현을 LPS 처리 전과 같은 수준으로 억제시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
4-3. Human HepG2세포에서 퉁퉁마디에서 분리된 이소람네틴 성분의 NF-kB와 COX-2 단백질 발현 저해능 측정
비알코올성 지방간에서 촉발되는 간염증에 대한 이소람네틴의 억제 효능을 분석하기 위하여 간세포 염증 유발 인자인 LPS(100ng/㎖)로 자극된 human HepG2 세포에서 과발현되는 COX-2와 NF-kB 단백질의 발현이 이소람네틴에 의하여 저해되는지 확인하였다. 염증생성에 관여하는 효소인 COX-2(cyclooxygenase type 2)는 세포 내 염증을 유발하는 물질인 Prostaglandin E2가 생성되게 하는 효소로서 COX-2 단백질 발현은 대표적인 염증인자의 바이오마커로 활용된다.
세포내 산화스트레스를 주거나 염증유발 요인 즉 LPS와 같은 물질로 세포를 자극하면 COX-2 효소가 증가되므로, 이소람네틴의 간세포 내 함염증 효과를 확인하고자, HepG2 세포에 LPS(100ng/㎖) 및 이소람네틴을 농도별로 처리하고 18시간 배양하였다. 배양 후 각 세포의 단백질을 정량한 후 Western blot을 시행하여 COX-2 단백질의 발현양상을 확인하고 그 결과를 도 8A에 나타내었다.
COX-2 유전자 promoter 영역에 활성화로 인산화된 NFkB fragment인 p65가 결합하는 부위가 있어서, 산화스트레스나 염증성 자극으로 인한 COX-2 유전자의 합성이 NF-kB 활성화로 일어나는 것으로 알려진 바 있다. 따라서 LPS 처리로 활성화되는 NFkB를 핵내 phospho-p65 단백질 발현 양을 통하여 확인하고, 이소람네틴이 NFkB의 활성화 또한 억제하는지 확인하고자 HepG2 세포에 LPS(100ng/㎖) 및 이소람네틴을 농도별로 처리하고 18시간 배양한 후에 각 세포의 핵을 분리한 후, 핵내 phospho-p65의 발현 양을 Western blotting으로 확인하였다.
HepG2 세포에서 핵을 분리하기 위하여 4℃에서 Nuclear extraction kit(Active Motif Carlsbad, CA, USA)를 이용하였으며, 분리한 핵은 라이시스한 후, 고속원심분리(21,000g, 30분)하여 상등액을 취하고 단백질 정량 후 전기영동을 실시하고 그 결과를 도 8B에 나타내었다.
도 8B에 나타난 바와 같이, 이소람네틴은 농도의존적으로 NF-kB 활성화를 억제함을 확인할 수 있었다.
4-4. t-BHP로 처리된 Human HepG2세포에서 퉁퉁마디에서 분리된 이소람네틴 유효성분의 농도의존적인 ROS 생성 및 세포사멸 억제능 측정
비알코올성 지방간 질환의 대표적 기전 중의 하나로써, 고지방식이에 의한 간지방의 축적으로 유발되는 지방산화 중에 생성되는 활성산소들이 염증을 유발시키거나, 산화스트레스로 인한 직접적인 독성이 세포괴사를 야기하는 것으로 알려져 있다. 따라서 HepG2 세포에 직접적으로 ROS를 생성시켜는 강력한 과산화물인 t-BHP(tertiary butyl hydroperoxide)를 처리할 때 유발되는 세포괴사를 이소람네틴이 세포내 생성되는 ROS를 소거함과 동시에 억제할 수 있는지를 실험하였다.
이소람네틴을 농도별로 처리한 세포와 이소람네틴을 전처리하지 않은 세포에 동일하게 1mM의 t-BHP를 가하고 18시간 후에 세포내 생성된 ROS 함량과 세포의 괴사정도를 확인하였다. 6-well 플레이트에서 배양된 HepG2 세포에 t-BHP를 처리하였을 때 생성된 세포내 ROS 함량은 DCFH(2', 7'-chlorofluorescein) 형광 probe를 이용하여 ROS에 의하여 전환되는 DCFH-DA(2', 7'-chlorofluorescein diacetate)의 형광세기를 형광측정계(TECAN, San Jose, CA)로 485~530㎚ 사이의 파장에서 측정하였다.
세포괴사로 인한 세포 생존률(cell viability)은 MTT assay를 이용하였다. 즉, 6-well에 HepG2 세포를 배양한 후 이소람네틴을 농도별로 18시간동안 처리한 후 이소람네틴이 포함된 배지성분을 제거하고, 세포를 PBS로 세척한 다음 1mM의 t-BHP를 첨가하였다.
도 9A로부터, t-BHP만 처리된 HepG2 세포는 세포괴사로 인하여 세포생존률이 20.2% ± 0.88로 현저히 떨어졌으나, 전처리로 이소람네틴이 첨가된 배지의 세포들은 이소람네틴 처리농도의 비례하여 세포생존률이 점점 증가하여, 이소람네틴의 50μM 처리시에는 거의 100%에 가까운 세포 생존률을 나타내어, 이소람네틴에 의한 산화스트레스 유도 세포괴사 억제효능을 확인할 수 있었다.
또한, t-BHP만 처리된 HepG2 세포에서는 세포내 급격히 ROS가 증가되었으나, 이소람네틴이 처리된 세포에서는 세포내 ROS의 생성이 농도의존적으로 억제되어 50μM 처리시에는 t-BHP 처리 전까지의 수준으로 낮아진 것을 확인할 수 있었다. 도 9B의 사진은 세포내 ROS를 형광현미경 촬영한 것이다.
4-5. Human HepG2 세포에서 이소람네틴의 Nrf2 전사인자 활성화를 통한 글루타치온 합성 효소(GR, GCL) 단백질 유도 및 세포내 GSH 함량 향상능 측정
이소람네틴의 간세포 염증완화 및 세포보호 효과의 기전을 연구하고자 이소람네틴을 세포에 처리하였을 때 세포내 글루타치온(GSH)과 글루타치온 합성효소들(GR, GCL) 그리고 이들 효소 단백질의 합성을 일으키는 전사인자인 Nrf2 활성화 여부를 확인하고자 하였다. 간세포 보호인자로 알려진 글루타치온(GSH)의 함량은 글루타치온 합성효소인 글루타치온리덕테이스(GR)와 감마글루타밀시스테인 라이에이스(GCL)의 단백질 발현량 간의 밀접한 상관성이 있으며, 최근 글루타치온과 글루타치온의 전구물질인 N-acetylsystein은 지방간 치료에 활용되고 있다.
HepG2 세포에 이소람네틴을 농도별(0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100μM)로 18시간 처리하고 세포내 글루타치온(GSH) 함량을 측정하고, 그 결과를 도 10A에 나타내었다.
도 10A에 나타난 바와 같이, 이소람네틴은 농도의존적으로 세포내 글루타치온(GSH) 함량을 증가시키며, 특히 50μM 이상의 농도로 처리하였을 때 대조군 대비 2배 이상으로 글루타치온을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 이소람네틴에 의한 HepG2 세포에서의 글루타치온 증가가 이소람네틴에 의한 Nrf2 전사인자 활성과 Nrf2의 downstream gene들인 phase II 유전자 활성화에 따른 글루타치온 합성효소들인 GCL 과 GR의 단백질 발현에 의한 것인지를 확인하고자 이소람네틴을 농도별(0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100μM)로 18시간 처리한 후 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)을 수행하고 그 결과를 도 10B에 나타내었다. 웨스틴 블롯팅을 위하여 이소람네틴이 처리된 세포와 대조군 세포들을 라이시스(lysis)시키고, 단백질을 정량(Bradford assay, BioRad Laborotories, Hercules, CA)하였다. 다음으로 동일한 양(20㎍)의 단백질을 12% SDS-PAGE 겔(Min Bio-Rad, Hets, UK)에 로딩하고, 전기영동을 실시하였다. 분리된 단백질은 셀룰로스 막(nitrocelluose membrane, Hybond-C Extra, Amersham)에 트랜스퍼하고, GR과 GCL에 대한 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 결합시킨 후, 2차 항체(HRP-conjugated goat ant-rabbit immunoglobulin G antibody, Sigma)를 가하였다. GCL 및 GR 단백질 발현은 β-actin과 함께 chemiluminescence detection kit(Amersham Bioscience)을 이용하여 확인한 결과 이소람네틴은 농도의존적으로 글루타치온 합성효소들인 GCL 과 GR 발현을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
도 10B에 나타난 바와 같이, 이소람네틴에 의한 Nrf2 전사인자의 활성화는 핵내 존재하는 Nrf2 단백질 발현량으로 확인할 수 있었다. 이소람네틴은 10μM 이상의 농도부터 점차 Nrf2 전사인자의 핵내 이동을 통한 활성화를 시킴을 알 수 있었고, 이소람네틴의 농도의존적으로 일어나는 Nrf2활성화는 GCL과 GR의 발현과 유사한 경향을 나타내었다.
따라서 이소람네틴에 의한 HepG2세포내 글루타치온 증가는 Nrf2 전사인자 활성화에 따른 GCL 및 GR 효소단백질의 합성을 통하여 일어나며, 이는 간세포내 지방산산화에 의한 산화스트레스를 감소시켜 지방간세포내 염증완화와 치료에 효과적일 수 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Phyto Corporation
<120> Pharmaceutical Composition for Prevention or Treatment of
Non-alcoholic Fatty Liver Disease Containing Isorhamnetin derived
from Salicornia europaea
<130> P16117
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ccl2 forward primer
<400> 1
ccactcacct gctgctactc at 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ccl2 reverse primer
<400> 2
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 4
tggggaactc tgcagactca aac 23
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 8
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<220>
<223> Col1a1 forward primer
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gctcctctta ggggccac 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Col1a1 reverse primer
<400> 10
ccacgtctca ccattgggg 19
Claims (4)
- 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료능이 있는 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물.
- 제1항에 있어서, 상기 비알코올성 지방간은 비알코올성 간염증, 비알코올성 간섬유화 및 비알코올성 간경화로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물.
- 비알코올성 지방간 질환 예방능이 있는 이소람네틴을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 포함하는 식품 조성물.
- 비알코올성 지방간 질환 예방능이 있는 이소람네틴을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 포함하는 사료 조성물.
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| KR1020180082133A KR20180088606A (ko) | 2018-07-16 | 2018-07-16 | 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료능이 있는 이소람네틴(isorhamnetin)을 함유하는 퉁퉁마디(Salicornia SPP.) 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물 |
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|---|---|---|---|---|
| KR102099061B1 (ko) | 2019-11-27 | 2020-04-08 | 농업회사법인주식회사초정 | 오디 발사믹식초 제조방법 |
-
2018
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|---|---|---|---|---|
| KR102099061B1 (ko) | 2019-11-27 | 2020-04-08 | 농업회사법인주식회사초정 | 오디 발사믹식초 제조방법 |
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