KR20110005294A - 글루타티온 생산 촉진제, 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제, 음식품 및 사료 - Google Patents

글루타티온 생산 촉진제, 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제, 음식품 및 사료 Download PDF

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Abstract

안전성이 높은 천연물 중에서 글루타티온 생산 촉진 작용을 갖는 것을 알아내서, 그것을 유효성분으로 하는 글루타티온 생산 촉진제 및 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제를 제공하는 것을 목적으로 하며, 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제로, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 유효성분으로서 함유하게 한다.

Description

글루타티온 생산 촉진제, 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제, 음식품 및 사료{GLUTATHIONE PRODUCTION ENHANCER, PROPHYLACTIC/THERAPEUTIC AGENT FOR DISEASES ASSOCIATED WITH LACK OF GLUTACHIONE, AND FOOD, BEVERAGE AND FEED}
본 발명은 글루타티온 생산 촉진제, 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제, 음식품 및 사료에 관한 것이다.
글루타티온은 글루타민산, 시스테인, 글리신의 3개의 아미노산으로 이루어지는 트리 펩티드이고, 세포 내의 주요한 시스테인 잔기를 갖는 화합물이다. 이 글루타티온은 세포 내에서 래디칼의 포착, 산화 환원에 의한 세포 기능의 조절, 해독 기구에 관여 및 각종 효소의 SH 공여체 등으로서의 역할을 수행함이 알려져 있다.
이러한 역할을 수행하는 글루타티온의 세포 내 농도가 저하하면, 자외선 폭로에 의한 세포 상해, 염증, 흑색화, 기미 또는 주근깨의 생성, 급성 또는 만성 알코올 간 장해, 간장병, 만성 신부전, 흡연 등이 요인의 폐질환, 특발성 폐선유증, 백내장, 허혈성 심질환, 파킨슨병, 알츠하이머 병, 위궤양, 성인 호흡기장해 증후군, 면역 부전, 골수 형성 부전, 후천성 면역 부전 증후군, 잠복성 바이러스 감염증, 생리학적인 가령(加齡)에 수반하는 노화 현상, 및 암화(癌化) 등의 병상이 일어남이 알려져 있다. 이러한 글루타티온의 세포 내 농도의 저하에 의해 일어나는 병상의 치료로는, 종래, 세포 내 글루타티온 농도가 저하한 세포에 글루타티온을 집어 넣을 목적으로, 글루타티온을 함유하는 글루타티온 제재가 이용되고 있었다(특허 문헌 1 참조). 그렇지만, 글루타티온 제재의 경구 섭취에 의한 치료는 치료 대상 부위에 따라서는 생각하는 효과를 기대할 수 없었고, 또, 글루타티온 제재의 정맥주사에 의한 치료는 경구 섭취에 의한 치료보다 효과는 기대할 수 있지만, 통증을 수반하고, 통원이 필요한 등의 문제를 안고 있었다.
따라서, 생체 내의 세포에서의 글루타티온의 생산을 촉진함으로써 세포 내 글루타티온 농도를 상승시킬 수가 있다면, 나이가 들어감에 따라 쇠약해지는 산화 스트레스에 대한 방어 능력을 높일 수 있는 동시에, 자외선의 조사에 의한 산화 스트레스에 대한 상해를 억제할 수 있게 되어, 피부의 노화, 기미 등의 색소 침착증의 예방, 치료 또는 개선을 기대할 수 있는 동시에, 글루타티온의 결핍에 의해 일어나는 각종 장기의 기능 저하나 각종 질환의 예방 또는 치료를 기대할 수 있다고 생각된다. 이러한 생각에 의거하여, 글루타티온 생산 촉진 작용을 갖는 것으로서, 불루베리 추출물 및 호두 추출물(특허 문헌 2 참조), 치자나무속 식물의 추출물(특허 문헌 3 참조) 등이 알려져 있다.
또, 생체 내에서, 글루타티온은, 활성 산소종을 제거하는 작용을 갖는 환원형 글루타티온, 및 환원형 글루타티온과 활성 산소종과의 반응에 의해 생산되는 산화형 글루타티온으로서 존재한다. 최근에, 이 산화형 글루타티온이 신경세포의 흥분을 억제하여, 수면을 촉진하는 수면 촉진 물질인 것이 확인되고 있다. 그 때문에, 글루타티온의 생산을 촉진하여, 환원형 글루타티온뿐만 아니라, 산화형 글루타티온의 세포 내의 농도도 상승시킬 수가 있으면, 불면증 등의 수면장해의 예방, 치료 또는 개선에 유효하다고 생각되고 있다. 이러한 생각에 의거하여, 종래, 산화형 글루타티온을 유효성분으로 하는 최면제가 알려져 있다(특허 문헌 4 참조).
생체 세포에서는 γ-글루타밀시스테인 신테타제의 작용에 의해, 시스테인과 글루타민산이 반응하여 γ-글루타밀시스테인이 생합성 되고, 글루타티온 신테타제의 작용에 의해, γ-글루타밀시스테인과 글리신이 반응하여 글루타티온이 생합성 됨이 알려져 있다. 그 때문에, 글루타티온의 전구체인 γ-글루타밀시스테인을 생합성하기 위한 촉매적 역할을 수행하는 γ-글루타밀시스테인 신테타제의 발현을 촉진함으로써, 생체 세포 내의 글루타티온 농도를 상승시킬 수 있다고 생각된다.
특허문헌 1: 국제 공개 2003/032966호 팜플렛 특허문헌 2: 특개 2006－241062호 공보 특허문헌 3: 특개 2006－347934호 공보 특허문헌 4: 특개평 4－9336호 공보
본 발명은, 안전성이 높은 천연물 중에서 글루타티온 생산 촉진 작용 및 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용을 갖는 것을 알아내서, 그것을 유효성분으로 하는 글루타티온 생산 촉진제, 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제, 음식품 및 사료를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명의 글루타티온 생산 촉진제 및 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제는 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 음식품 및 사료는 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 배합한 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 사람 또는 동물의 생체 내 세포에서의 글루타티온의 생산을 촉진하는 방법은 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 함유하는 글루타티온 생산 촉진제를 사람 또는 동물의 소정 부위에 투여하는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 제조하는 방법은, 감초 엑기스로부터 글리틸리틴산을 실질적으로 제거하는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명에서 「글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는다」란, 감초 추출 조성물 중의 글리틸리틴산 함유율이 바람직하게는 1.0질량% 이하인 것을 의미하며, 더욱 바람직하게는 0.5질량% 이하인 것을 의미한다.
또, 본 발명에서 「감초 엑기스」란, 감초를 추출원료로서 사용하여 얻어진 추출액, 그 추출액의 희석액 혹은 농축액, 또는 그 추출액을 건조하여 얻어진 건조물로서, 글리틸리틴산이 실질적으로 제거되어 있지 않은 것을 의미하며, 「감초 추출 조성물」이란, 상기 감초 엑기스로부터 글리틸리틴산을 실질적으로 제거하고, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하는 것을 의미한다.
본 발명에 의하면, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 유효성분으로서 함유하고, 안전성이 우수한 글루타티온 생산 촉진제, 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제, 음식품 및 사료를 제공할 수가 있다.
이하, 본 실시 형태에 대해서 설명한다.
[글루타티온 생산 촉진제, 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제]
본 실시 형태의 글루타티온 생산 촉진제 및 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제는, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물(이하, 간단히 「감초 추출 조성물」이라고 하는 경우가 있다.)을 유효성분으로서 함유한다.
리퀴리틴(liquiritin), 리퀴리티게닌(liquiritigenin), 이소리퀴리틴(isoliquiritin) 및 이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin)을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은, 식물의 추출 처리로 일반적으로 이용되고 있는 방법에 의해 얻을 수 있는 감초 추출 조성물로부터 글리틸리틴산을 제거함으로써 얻을 수 있다.
추출원료로서의 감초로는 Glychyrrhiza glabra, Glychyrrhiza inflata, Glychyrrhiza uralensis, Glychyrrhiza aspera, Glychyrrhiza eurycarpa, Glychyrrhiza pallidiflora, Glychyrrhiza yunnanensis, Glychyrrhiza lepidota, Glychyrrhiza echinata, Glychyrrhiza acanthocarpa 등, 여러 종류의 것이 있고, 이들 중, 어느 종류의 감초를 추출원료로서 사용해도 좋지만, 특히 Glychyrrhiza glabra, Glychyrrhiza uralensis, Glychyrrhiza inflata를 추출원료로서 사용하는 것이 바람직하다.
추출원료로서 사용할 수 있는 감초의 구성 부위로서는, 예를 들면, 잎사귀부, 가지부, 수피부, 줄기(幹;stem)부, 줄기(莖;caulis)부, 과실부, 꽃부 등의 지상부, 뿌리부, 뿌리줄기부 또는 이들 부위의 혼합물 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 뿌리부 또는 뿌리줄기부이다.
감초 엑기스는 추출원료로서의 감초를 건조한 후, 그대로 또는 조 분쇄기를 이용하여 분쇄하고, 추출용매에 의해 추출하여 얻을 수 있다. 건조는 햇볕으로 행하여도 좋고, 통상 사용되는 건조기를 이용해 행하여도 좋다. 또, 헥산 등의 비극성 용매에 의해 탈지 등의 전처리를 행한 후 추출원료로서 사용해도 좋다. 탈지 등의 전처리를 행함으로써, 식물의 극성 용매에 의한 추출 처리를 효율적으로 행할 수 있다.
추출용매로는 극성 용매를 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 물, 친수성 유기용매 등을 들 수 있고, 이들을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여, 실온 또는 용매의 비점 이하의 온도에서 사용하는 것이 바람직하다.
추출용매로서 사용할 수 있는 물로는 순수, 수도수, 우물수, 광천수, 광수, 온천수, 용수, 담수 등 외, 이들에 각종 처리를 행한 것이 포함된다. 물에 실시하는 처리로는, 예를 들면, 정제, 가열, 살균, 여과, 이온교환, 삼투압 조정, 산성화, 알칼리화, 완충화 등이 포함된다. 따라서, 본 실시 형태에서 추출용매로 사용할 수 있는 물로는 정제수, 열수, 이온 교환수, 생리 식염수, 유기산 산성수, 암모니아 알칼리수, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수 등도 포함된다.
추출용매로서 사용할 수 있는 친수성 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로필 알코올, 이소프로필 알코올 등의 탄소수 1~5의 저급 지방족 알코올; 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 저급 지방족 케톤; 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세린 등의 탄소수 2~5의 다가 알코올 등을 들 수 있다.
2종 이상의 극성 용매의 혼합액을 추출용매로서 사용하는 경우, 그 혼합비는 적당히 조정할 수 있다. 예를 들면, 물과 저급 지방족 알코올과의 혼합액을 사용하는 경우에는, 물 10 용량부에 대해서 저급 지방족알코올 1~90 용량부를 혼합하는 것이 바람직하고, 물과 저급 지방족 케톤과의 혼합액을 사용하는 경우에는, 물 10 용량부에 대해서 저급 지방족 케톤 1~40 용량부를 혼합하는 것이 바람직하고, 물과 다가 알코올과의 혼합액을 사용하는 경우에는, 물 10 용량부에 대해서 다가 알코올 10~90 용량부를 혼합하는 것이 바람직하다.
추출 처리는, 추출원료에 포함되는 가용성 성분을 추출용매에 용출시켜 얻는 한 특별히 한정은 없고, 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 추출원료의 5~15 배량(질량비)의 추출용매에, 추출원료를 침지하고, 상온 또는 환류 가열하에서 가용성 성분을 추출시킨 후, 여과하여 추출 잔사를 제거함으로써 추출액을 얻을 수 있다. 얻어진 추출액으로부터 용매를 증류 제거하면 페이스트상의 농축물이 얻어지며, 이 농축물을 더욱 건조하면 건조물이 얻어진다.
이상과 같이 하여 얻어진 추출액, 그 추출액의 농축물 또는 그 추출액의 건조물에는 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌의 플라보노이드류 외, 글리틸리틴산도 포함되어 있기 때문에, 이들의 추출액, 그 추출액의 농축물 또는 그 추출액의 건조물(감초 추출 엑기스)로부터 글리틸리틴산을 제거한다.
감초 엑기스로부터 글리틸리틴산을 제거하기 위해서는, 감초 엑기스에 80~95용량%의 알코올 수용액을 첨가하여, 알코올 수용액 중에 감초로부터의 추출물을 분산시키고, 여과지로 침전물을 흡인 여과한다. 글리틸리틴산은 수용성이고, 알코올에 난용이기 때문에, 감초 엑기스에 포함되는 글리틸리틴산은 알코올 수용액에 거의 용해하지 않아, 침전물로서 제거된다. 한편, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌은 알코올에 가용이기 때문에, 알코올 수용액에 용이하게 용해한다.
분산매로서 사용하는 알코올은 특별히 한정되는 것은 아니고, 메탄올, 에탄올, 프로필 알코올, 이소프로필 알코올 등의 탄소수 1~5의 저급 지방족 알코올을 사용하면 좋다.
얻어진 여액으로부터 용매를 증류 제거한 잔사에 물을 첨가하고, 실리카겔이나 알루미나 등의 다공질 물질, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체나 폴리메타크릴레이트등의 다공성 수지 등을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의하여, 물, 알코올의 순서로 용출시킨다. 그리고, 알코올에 용출되는 획분으로서, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 얻을 수 있다.
컬럼 크로마토그래피에서 용출액으로 사용되는 알코올은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로필 알코올, 이소프로필 알코올 등의 탄소수 1~5의 저급 지방족 알코올 또는 그들의 수용액 등을 들 수 있다.
또한, 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻어진 알코올 획분을, ODS를 이용한 역상 실리카겔 크로마토그래피, 재결정, 액-액 향류 추출, 이온교환수지를 이용한 컬럼 크로마토그래피 등의 임의의 유기 화합물 정제수단을 이용해 정제해도 좋다.
감초 엑기스로부터 글리틸리틴산을 제거하여, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 얻는 방법으로는, 상술한 방법 이외에도, 아래와 같은 방법을 들 수 있다.
예를 들면, 감초 엑기스에 광산(예를 들면, 황산, 질산, 염산 등)을 첨가하여 pH를 1.0~3.0 정도로 조정하여, 산성 석출(산석) 처리를 행한다. 얻어진 산성 석출액을 여과하여 침전물을 회수하고, 30~90용량%, 바람직하게는 30~70용량%의 알코올 수용액(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로필 알코올, 이소프로필 알코올 등의 탄소수 1~5의 저급 지방족 알코올의 수용액)을 첨가하고, 그 후 여과한다.
이렇게 하여 얻어진 여액에 암모니아수를 첨가하여 여액의 pH를 3.0~5.0 정도, 바람직하게는 3.0~3.5 정도로 조정하여 글리틸리틴산을 석출시키고, 고액 분리한다. 얻어진 여액 획분에 탄산나트륨을 첨가해서 중화하고, 실리카겔이나 알루미나 등의 다공질 물질, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체나 폴리메타크릴레이트 등의 다공성 수지 등을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의하여, 물, 알코올의 순서로 용출시킨다. 그리고, 알코올에 용출되는 획분으로서, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 포함하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 얻을 수 있다. 또, 컬럼 크로마토그래피에서 용출액으로서 사용되는 알코올은, 상술한 것과 동일한 것을 들 수 있다.
또한 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻어진 알코올 획분을, ODS를 이용한 역상 실리카겔 크로마토그래피, 재결정, 액-액 향류 추출, 이온교환수지를 이용한 컬럼 크로마토그래피 등의 임의의 유기 화합물 정제수단을 이용해 정제해도 좋다.
이상과 같이 하여 감초 엑기스로부터 글리틸리틴산을 제거함으로써, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 얻을 수 있다. 이러한 감초 추출 조성물 중의 글리틸리틴산 함량은 1.0질량% 이하인 것이 바람직하고, 0.5질량% 이하인 것이 보다 바람직하다.
이상과 같이 하여 얻어지는 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은, 글루타티온 생산 촉진 작용을 가지기 때문에, 그 작용을 이용해 글루타티온 생산 촉진제의 유효성분으로서 사용할 수가 있다. 또, 감초 추출 조성물은 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용도 가지기 때문에, 그 작용을 이용하여 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진제의 유효성분으로도 사용할 수 있다.
또, 상기 감초 추출 조성물은, 그 글루타티온 생산 촉진 작용을 통해서, 글루타티온의 생산을 촉진할 수 있기 때문에, 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환(예를 들면, 활성 산소종 등의 산화 스트레스에 의해 일어나는 질환; 간염, 간기능장해 등의 간장질환; 만성 신부전; 특발성 폐선유증, 성인 호흡기장해 증후군 등의 호흡기계통 질환; 백내장; 허혈성 심질환; 파킨슨병; 알츠하이머병; 위궤양 등의 소화기계통 질환; 암; 골수형성 부전; 후천성 면역 부전 증후군; 잠복성 바이러스 감염증 등)의 예방·치료제의 유효성분으로도 사용할 수 있다.
또한, 상기 감초 추출 조성물은 글루타티온 생산 촉진 작용을 가지므로, 그 작용을 이용해 산화형 글루타티온의 세포 내의 농도를 상승시킬 수 있기 때문에, 불면증 등의 수면장해의 예방, 치료 또는 개선제의 유효성분으로도 사용할 수 있다.
본 실시 형태의 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제는, 상기 감초 추출 조성물만으로 이루어지는 것이라도 좋고, 상기 감초 추출 조성물을 제제화한 것이라도 좋다.
상기 감초 추출 조성물은 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 약학적으로 허용가능한 캐리어, 그 외 임의의 조제를 사용하여, 통상의 방법에 따라, 분말상, 과립상, 정제상, 액상 등의 임의의 제형으로 제제화 할 수 있다. 이때, 조제로는, 예를 들면, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 안정제, 교미·교취제 등을 사용할 수 있다. 또, 상기 감초 추출 조성물은, 다른 조성물(예를 들면, 음식품 등)에 배합해 사용할 수 있는 것 이외에, 연고제, 외용 액제, 첩부제 등으로 사용할 수 있다.
또, 본 실시 형태의 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제는, 필요에 따라서, 글루타티온 생산 촉진 작용을 갖는 다른 천연 추출물 등을 배합하여 유효성분으로서 사용할 수 있다.
본 실시 형태의 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제의 투여 방법으로는, 일반적으로 경피 투여, 경구 투여, 정맥 투여 등을 들 수 있지만, 질환의 종류에 따라, 그 예방·치료 등에 적합한 방법을 적당히 선택하면 좋고, 특히 경피 투여 또는 경구 투여에 의해 상기 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제를 유효량 투여하면 좋다.
또, 본 실시 형태의 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제의 투여량도 질환의 종류, 중증도, 환자의 개인차, 투여 방법, 투여 기간 등에 따라 적당히 증감하면 좋고, 질환의 종류나 중증도 등에 따라, 본 실시 형태의 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제를 유효량 투여하면 좋다.
본 실시 형태의 글루타티온 생산 촉진제는, 상기 감초 추출 조성물이 갖는 글루타티온 생산 촉진 작용을 통해서, 가령에 의해 쇠약해지는 산화 스트레스에 대한 방어 능력을 높이는 동시에, 자외선의 조사에 의한 산화 스트레스에 대한 상해를 억제할 수 있어, 피부의 노화, 기미 등의 색소 침착증이나, 글루타티온의 결핍에 의해 일어나는 각종 장기의 기능 저하 등에 의한 각종 질환을 예방, 치료 또는 개선할 수 있다. 단, 본 실시 형태의 글루타티온 생산 촉진제는, 이들 용도 이외에도 글루타티온 생산 촉진 작용을 발휘하는 것에 의의가 있는 모든 용도에 사용할 수 있다.
후술하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 특히 상기 감초 추출 조성물은, 표피 각화세포 및 피부 섬유아세포에서의 글루타티온의 생산을 효과적으로 촉진할 수 있기 때문에, 상기 감초 추출 조성물을 함유하는 글루타티온 생산 촉진제에 의하면, 표피 각화세포 또는 피부 섬유아세포 내에서 활성 산소종을 소거할 수 있고, 표피 각화세포 또는 피부 섬유아세포를 산화적 스트레스에 의한 상해 등으로부터 보호할 수 있어, 결과적으로, 피부의 노화 등을 효과적으로 방지할 수 있다.
또, 글루타티온이 티로시나제의 성숙화를 억제하는 작용을 가지므로, 글루타티온의 생산을 촉진함으로써 티로시나제의 성숙화를 보다 억제할 수 있어 멜라노사이트에서의 멜라닌의 생성을 억제할 수 있다. 그 때문에, 상기 감초 추출 조성물을 함유하는 글루타티온 생산 촉진제에 의하면, 멜라노사이트에서의 글루타티온의 생산을 효과적으로 촉진하여, 티로시나제의 성숙화를 보다 억제할 수 있기 때문에, 결과적으로, 피부 색소 침착증, 피부의 흑화, 기미, 주근깨 등을 예방할 수 있다.
또한, 상기 감초 추출 조성물은, 간세포에서의 글루타티온의 생산을 효과적으로 촉진할 수 있기 때문에, 상기 감초 추출 조성물을 함유하는 글루타티온 생산 촉진제는, 글루타티온의 결핍에 기인하는 간장 질환을 효과적으로 예방·치료할 수 있다.
또, 상기 감초 추출 조성물을 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진제로 함유하게 함유시킴으로써, 상기 감초 추출 조성물이 갖는 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용을 통해서, 글루타티온의 전구체인 γ-글루타밀시스테인의 생합성을 촉진할 수 있다.
본 실시 형태의 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제는, 상기 감초 추출 조성물이 갖는 글루타티온 생산 촉진 작용을 통해서, 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환(예를 들면, 활성 산소종 등의 산화 스트레스에 의해 일어나는 질환; 간염, 간기능 장해 등의 간장 질환; 만성 신부전; 특발성 폐선유증, 성인 호흡기장해 증후군 등의 호흡기 계통의 질환; 백내장; 허혈성 심질환; 파킨슨병; 알츠하이머병; 위궤양 등의 소화기 계통 질환; 암; 골수형성 부전; 후천성 면역부전 증후군; 잠복성 바이러스 감염증 등)을 예방·치료할 수 있는 동시에, 산화형 글루타티온의 세포 내 농도를 상승시킬 수 있기 때문에, 불면증 등의 수면장해를 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.
[음식품, 사료]
본 실시 형태의 음식품 또는 사료는 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 배합한 것이다.
상기 감초 추출 조성물은 글루타티온 생산 촉진 작용을 가지며, 사람, 동물, 어류 등의 소화관에서 소화되는 것이 아님이 확인되었고, 또 안전성이 우수하기 때문에, 일반식품, 건강식품, 보건기능식품 혹은 영양보조식품 등의 임의의 음식품, 또는 가금, 가축 등의 동물용 사료 혹은 양식어 등의 어류용 사료, 고양이 푸드, 개 푸드 등의 페트 푸드 등의 사료에 배합하기에 매우 적합하다. 이 경우, 상기 감초 추출 조성물을 그대로 음식품 또는 사료에 배합해도 좋고, 상기 감초 추출 조성물에 의해 제제화한 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제를 음식품 또는 사료에 배합해도 좋다.
상기 감초 추출 조성물, 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제를 음식품에 배합하는 경우, 그 경우의 유효성분의 배합량은, 사용 목적, 성별, 증상 등을 고려하여 적당히 조정할 수 있지만, 첨가 대상 음식품의 일반적인 섭취량을 고려하여 성인 하루당의 추출물 섭취량이 약 1~1000 mg가 되도록 하는 것이 바람직하다.
상기 감초 추출 조성물, 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제를 사료에 배합하는 경우의 배합 비율은, 대상 생물(가금, 가축, 양식어, 개, 고양이 등의 페트 동물 등)이나 그 체중, 사용 목적 등을 고려하여 적당히 조정할 수 있지만, 첨가 대상 사료의 일반적인 섭취량을 고려하여, 0.0001~20.0질량%인 것이 바람직하고, 0.01~2.0질량%인 것이 바람직하다.
상기 감초 추출 조성물, 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제를 배합하여 얻는 음식품은, 상기 감초 추출 조성물이 갖는 글루타티온 생산 촉진 작용을 방해하지 않는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다.
구체적인 예로서는, 청량음료, 탄산음료, 영양음료, 과실음료, 유산음료 등의 음료(이들의 음료의 농축 원액 및 조정용 분말을 포함한다); 아이스크림, 아이스샤벳, 깬 얼음 등의 빙과; 메밀 국수, 우동, 녹두 국수, 교자 피, 찐 만두 피, 중화면, 즉석면 등의 면류; 엿, 추잉 껌, 캔디, 껌, 초콜릿, 정과, 스넥 과자, 비스킷, 젤리, 잼, 크림, 구운 과자 등의 과자류; 어묵, 햄, 소세지 등의 수산·축산 가공 식품; 가공유, 발효유 등의 유제품; 사라다유, 튀김유, 마가린, 마요네즈, 쇼트닝, 휩(whip) 크림, 드레싱 등의 유지 및 유지 가공 식품; 소스, 국물 등의 조미료; 스프, 스튜, 사라다, 총채, 절임물; 그 외 여러 형태의 건강·영양 보조 식품; 정제, 캡슐제, 드링크제 등에 상기 감초 추출 조성물, 글루타티온 생산 촉진제 또는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제를 배합할 수 있고, 이때, 통상 이용되는 보조적인 원료나 첨가물을 병용할 수 있다.
[실시예]
이하, 제조예, 시험예 및 배합예를 나타내어, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 아래의 각각의 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[제조예 1]
감초(Glycyrrhiza glabra)의 뿌리와 줄기를 조 분쇄한 칩 상의 물질 10kg에 10L의 물을 첨가하고, 부드럽게 교반 하면서 추출하고, 데칸테이션으로 고액 분리하여 추출액을 얻었다. 얻어진 추출액을 페이스트 상이 될 때까지 감압 농축한 후, 70용량% 에탄올 수용액을 얻어진 농축물의 10배량 가하고, 교반기를 사용해 분산시켰다. 분산액을 5℃에서 하룻밤 보관하고, 생긴 침전을 여과지로 흡인 여과하여 제거하고, 여과액의 에탄올 수용액을 감압하에서 증류 제거하였다.
이렇게 얻어진 잔사에 물을 첨가하여 고형분을 5%로 하고, 다공성 합성 흡착 수지(다이아이온 HP－20, 미츠비시카가쿠 사제) 10L를 충전한 컬럼에 SV=1에서 액을 통과시켰다. 컬럼을 50L의 물로 세정한 후, 80용량% 에탄올 수용액 50L를 더욱 통과시켜서, 플라보노이드류를 용리(溶離)시켰다. 용리액을 모아 감압 증류하여 에탄올 수용액을 증류 제거한 후, 증류 잔사를 40℃에서 진공 건조하고, 분쇄함으로써, 345 g의 황갈색 분말을 얻었다(시료 1).
얻어진 분말을 아래의 조건에서 고속 액체 크로마토그래피법으로 분석한 결과, 글리틸리틴산 함량 0.5질량%, 리퀴리틴 함량 4.2질량%, 이소리퀴리틴 함량 3.6질량%, 리퀴리티게닌 함량 2.5질량%, 이소리퀴리티게닌 함량 1.5질량%였다.
＜액체 크로마토그래피 조건＞
고정상: JAIGEL GS－310 (니폰분세키코교 사제)
컬럼 직경: 20mm
컬럼 길이: 500mm
이동상 유량: 5mL/min
검출: RI
[제조예 2]
감초(Glycyrrhiza uralensis)의 뿌리와 줄기를 조 분쇄한 칩 상의 물질 10kg에 10L의 3% 암모니아수를 첨가한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 처리하여, 황갈색 분말 410g를 얻었다(시료 2). 얻어진 분말을 실시예 1과 동일하게 하여 고속 액체 크로마토그래피법으로 분석한 결과, 글리틸리틴산 함량 0.9질량%, 리퀴리틴 함량 5.5질량%, 이소리퀴리틴 함량 4.6질량%, 리퀴리티게닌 함량 3.9질량%, 이소리퀴리티게닌 함량 3.5질량%였다.
[제조예 3]
감초(Glycyrrhiza inflata)의 뿌리와 줄기를 조 분쇄한 칩 상의 물질 10kg에 10L의 물을 첨가하고 부드럽게 교반하면서 추출하고, 데칸테이션으로 고액 분리하여 추출액을 얻었다. 얻어진 추출액을 교반하면서, 50% 황산을 첨가하여 추출액의 pH를 2로 조정하여, 산성 석출 처리를 행하고, 여과에 의해 침전물을 모았다. 얻어진 침전물에 물을 첨가하고, 교반하여 분산시키고, 정치 후 상징액을 데칸테이션으로 제거했다. 이 조작을 반복하여 황산을 제거한 후, 여과를 행하여 침전물을 얻었다.
이렇게 해서 얻어진 침전물에 90용량% 에탄올 5L를 첨가하고, 상온에서 1시간 교반 분산시키고, 규조토를 이용해 흡인 여과했다. 얻어진 여과액에 암모니아수를 첨가하여 여과액의 pH를 5로 조정하고, 5℃에서 2일간 정치하여 글리틸리틴산을 석출시킨 후, 원심분리에 의해 고액 분리를 행하였다. 여과액 획분의 에탄올을 감압 증류하여 제거하고, 증류 잔사에 탄산나트륨을 첨가하여 중화시켰다.
이렇게 해서 얻어진 중화액을, 다공성 합성 흡착 수지(다이아이온 HP－20, 미츠비시카가쿠 사제) 5L를 충전한 컬럼에 SV=1에서 액을 통과시켰다. 컬럼을 25 L의 물로 세정한 후, 90용량% 에탄올 수용액 25 L를 더 통과시켜 플라보노이드류를 용리시켰다. 용리액을 모아 감압 증류하여 에탄올 수용액을 증류 제거한 후, 증류 잔사를 40℃에서 진공 건조하고 분쇄하여, 293 g의 황갈색 분말을 얻었다(시료 3).
얻어진 분말을 실시예 1과 동일하게 하여 고속 액체 크로마토그래피법으로 분석한 결과, 글리틸리틴산 함량 0.8질량%, 리퀴리틴 함량 3.5질량%, 이소리퀴리틴 함량 2.8질량%, 리퀴리티게닌 함량 2.5질량%, 이소리퀴리티게닌 함량 1.8질량%였다.
[시험예 1] 표피 각화세포에서의 글루타티온 생산 촉진 작용 시험
상기와 같이 하여 얻어진 감초 추출 조성물(시료 1~3)에 대해서, 이하와 같이 하여 표피 각화세포에서의 글루타티온 생산 촉진 작용을 시험했다.
정상 사람 신생아 포피 표피 각화세포(Normal Human Epidermal Keratinocyte: NHEK)를, 정상 사람 표피 각화세포 장기 배양용 증식 배지(EpiLife-KG2)를 이용해 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수했다. 회수한 세포를 1.0×105cells/mL의 세포 밀도가 되도록 EpiLife-KG2로 희석한 후, 48 웰 플레이트에 1 웰 당 200μL씩 파종하여, 하룻밤 배양했다.
배양 후, EpiLife-KG2에 용해한 시료 용액(시료 1~3, 시료 농도는 하기 표 1을 참조)을 각 웰에 200μL 첨가하고, 24시간 배양했다. 배양 종료 후, 각 웰로부터 배지를 빼내고, 400μL의 PBS(-)로 세정 후, 150μL의 M-PER(PIERCE 사제)를 사용하여 세포를 용해했다.
이 중 100μL를 사용하여 총 글루타티온의 정량을 행하였다. 즉, 96 웰 플레이트에 용해한 세포 추출액 100μL, 0.1M의 인산 완충액 50μL, 2mM의 NADPH 25μL 및 글루타티온 리덕타제 25μL(종농도(終濃度) 17.5 unit/mL)를 첨가하고 37℃에서 10분간 가온한 후, 10mM의 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) 25μL를 첨가하고, 5 분후까지의 파장 412nm에서의 흡광도를 측정하여 ΔOD/min를 구했다. 총 글루타티온 농도는, 산화형 글루타티온(와코쥰야크 사제)을 사용하여 작성한 검량선을 기초로 산출했다. 얻어진 값을 총 단백질량 당의 글루타티온량으로 보정 한 후, 하기식에 기초하여 글루타티온 생산 촉진율(%)을 산출했다.
글루타티온 생산 촉진율(%) = B/A × 100
식 중, A는 「시료 무첨가 시의 세포 중에서의 총 단백질량 양 당의 글루타티온량(대조)」를 표시하며, B는 「시료 첨가시의 세포 중에서의 총 단백질량 당의 글루타티온량」을 나타낸다.
결과를 표 1에 나타낸다.
시료 시료 농도(㎍/mL) 글루타티온 생산 촉진율(%)

1
 6.25 114.9
12.5 128.5
25 145.2

2
 6.25 118.1
12.5 151.6
25 188.4

3
 6.25 109.9
12.5 129.6
25 142.2
표 1에 나타낸 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은 표피 각화세포에서 글루타티온의 생산을 효과적으로 촉진할 수 있음이 확인되었다.
[시험예 2] 피부 섬유아세포에서의 글루타티온 생산 촉진 작용 시험
상기와 같이 하여 얻어진 감초 추출 조성물(시료 1~3)에 대해서, 이하와 같이 하여 피부 섬유아세포에서의 글루타티온 생산 촉진 작용을 시험했다.
사람 정상 피부 섬유아세포(NB1RGB)를, 10% FBS 함유 α-MEM를 이용해 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수했다. 회수한 세포를 2.0×105cells/mL의 세포 밀도가 되도록 10% FBS 함유 α-MEM으로 희석한 후, 48 웰 플레이트에 1 웰 당 200μL씩 파종하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, 1% FBS 함유 D-MEM로 용해한 시료 용액(시료 1~3, 시료 농도는 하기 표 2 참조)을 각 웰에 200μL 첨가하고, 24시간 배양했다. 배양 종료 후, 각 웰로부터 배지를 빼내고, 400μL의 PBS(-)로 세정 후, 150μL의 M-PER(PIERCE 사제)를 사용하여 세포를 용해했다.
이 중 100μL를 사용해 총 글루타티온의 정량을 행하였다. 즉, 96 웰 플레이트에 용해한 세포 추출액 100μL, 0.1M의 인산 완충액 50μL, 2mM의 NADPH 25μL 및 글루타티온 리덕타제 25μL(종농도 17.5 unit/mL)를 첨가하고 37℃에서 10분간 가온한 후, 10mM의 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) 25μL를 첨가하고, 5분후까지의 파장 412nm에서의 흡광도를 측정하여 ΔOD/min를 구했다. 총 글루타티온 농도는, 산화형 글루타티온(와코쥰야크 사제)을 사용하여 작성한 검량선을 기초로 산출했다. 얻어진 값을 총 단백질량 당의 글루타티온량으로 보정 한 후, 하기식에 의거하여 글루타티온 생산 촉진율(%)을 산출했다.
글루타티온 생산 촉진율(%) = B/A × 100
식 중, A는 「시료 무첨가 시의 세포 중에서의 총 단백질량 당의 글루타티온량(대조)」를 나타내며, B는 「시료 첨가시의 세포 중에서의 총 단백질량 당의 글루타티온량」을 나타낸다.
결과를 표 2에 나타낸다.
시료 시료 농도(㎍/mL) 글루타티온 생산 촉진율(%)

1
 6.25 104.3
25 109.4
50 159.9

2
 6.25 106.1
25 121.8
50 173.8

3
 6.25 102.9
25 114.3
50 147.2
표 2에 나타내는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은, 피부 섬유아세포에서 글루타티온의 생산을 효과적으로 촉진할 수 있음이 확인되었다.
[시험예 3] B16 멜라노마 세포에서의 글루타티온 생산 촉진 작용 시험
상기와 같이 하여 얻어진 감초 추출 조성물(시료 1~3)에 대해서, 이하와 같이 하여 B16 멜라노마 세포에서의 글루타티온 생산 촉진 작용을 시험했다.
B16 멜라노마 세포를, 10% FBS 함유 D-MEM 배지를 이용해 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수했다. 회수한 세포를 1.0×105cells/mL의 세포 밀도가 되도록 10% FBS 함유 D-MEM 배지로 희석한 후, 48 웰 플레이트에 1 웰 당 200μL씩 파종하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, 1% FBS 함유 D-MEM 배지에 용해한 시료 용액(시료 1~3, 시료 농도는 하기 표 3 참조)을 각 웰에 200μL 첨가하고, 24시간 배양했다. 배양 종료 후, 각 웰로부터 배지를 빼내고, 400μL의 PBS(-)로 세정 후, 150μL의 M-PER(PIERCE 사제)를 사용해 세포를 용해했다.
이 중 100μL를 사용해 총 글루타티온의 정량을 행하였다. 즉, 96 웰 플레이트에 용해한 세포 추출액 100μL, 0.1M의 인산 완충액 50μL, 2mM의 NADPH 25μL 및 글루타티온 리덕타제 25μL(종농도 17.5 unit/mL)를 첨가하고, 37℃에서 10분간 가온한 후, 10mM의 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) 25μL를 첨가하고, 5분후까지의 파장 412nm에서의 흡광도를 측정하여 ΔOD/min를 구했다. 총 글루타티온 농도는, 산화형 글루타티온(와코쥰야크 사제)을 사용하여 작성한 검량선을 기초로 산출했다. 얻어진 값을 총 단백질량 당의 글루타티온량으로 보정 한 후, 하기식에 의거하여 글루타티온 생산 촉진율(%)을 산출했다.
글루타티온 생산 촉진율(%) = B/A × 100
식 중, A는 「시료 무첨가 시의 세포 중에서의 총 단백질량 당의 글루타티온량(대조)」를 나타내며, B는 「시료 첨가시의 세포 중에서의 총 단백질량 당의 글루타티온량」을 나타낸다.
결과를 표 3에 나타낸다.
시료 시료 농도(㎍/mL) 글루타티온 생산 촉진율(%)

1
 6.25 108.2
25 167.2

2
 6.25 112.8
25 164.3

3		 6.25 108.4
25 143.7
표 3에 나타내는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은, B16 멜라노마 세포에서 글루타티온의 생산을 효과적으로 촉진할 수 있음이 확인되었다.
[시험예 4] 간세포에서의 글루타티온 생산 촉진 작용 시험
상기와 같이 하여 얻어진 감초 추출 조성물(시료 1~3)에 대해서, 이하와 같이 하여 간세포에서의 글루타티온 생산 촉진 작용을 시험했다.
정상 사람 간세포(Cell System-Hc Cells, 셀시스템즈 사제)를, CS-C 무혈청 배지(셀시스템즈 사제)를 이용해 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수했다. 회수한 세포를 1.0×105cells/mL의 세포 밀도가 되도록 CS-C 무혈청 배지로 희석한 후, 24 웰 플레이트에 1 웰 당 400μL씩 파종하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, CS-C 무혈청 배지에 용해한 시료 용액(시료 1~3, 시료 농도는 하기 표 4를 참조)을 각 웰에 400μL 첨가하고, 24시간 배양했다. 배양 종료 후, 각 웰로부터 배지를 빼내고, 400μL의 PBS(-)로 세정 후, 250μL의 M-PER (PIERCE 사제)를 이용해 세포를 용해했다.
이 중 100μL를 이용해 총 글루타티온의 정량을 실시했다. 즉, 96 웰 플레이트에 용해한 세포 추출액 100μL, 0.1M의 인산 완충액 50μL, 2mM의 NADPH 25μL 및 글루타티온 리덕타제 25μL(종농도 17.5 unit/mL)를 첨가하고 37℃에서 10분간 가온한 후, 10mM의 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) 25μL를 첨가하고 5분후까지의 파장 412nm에서의 흡광도를 측정하여 ΔOD/min를 구했다. 총 글루타티온 농도는, 산화형 글루타티온(와코쥰야크 사제)을 사용하여 작성한 검량선을 기초로 산출했다. 얻어진 값을 총 단백질량 당의 글루타티온량으로 보정 한 후, 하기식에 의거하여 글루타티온 생산 촉진율(%)을 산출했다.
글루타티온 생산 촉진율(%)=B/A × 100
식 중, A는 「시료 무첨가 시의 세포 중에서의 총 단백질량 당의 글루타티온량(대조)」를 나타내며, B는 「시료 첨가시의 세포 중에서의 총 단백질량 당의 글루타티온량」을 나타낸다.
결과를 표 4에 나타낸다.
시료 시료 농도(㎍/mL) 글루타티온 생산 촉진율(%)

1
 25 104.4
100 111.4
200 114.3

2
 25 105.3
100 103.2
200 121.9

3
 25 103.6
100 109.2
200 110.6
표 4에 나타내는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은 간세포에서 글루타티온의 생산을 촉진할 수 있음이 확인되었다.
[시험예 5] 표피 각화세포에서의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용 시험
상기와 같이 하여 얻어진 감초 추출 조성물(시료 1~3)에 대해서, 이하와 같이 하여 표피 각화세포에서의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용을 시험했다.
정상 사람 신생아 표피 각화세포(Normal Human Epidermal Keratinocyte:NHEK)를, 정상 사람 표피 각화세포 장기 배양 증식 배지(EpiLife-KG2)를 이용하여 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수했다. 회수한 세포를 1.0×105cells/mL의 세포 밀도가 되도록 EpiLife-KG2로 희석한 후, 35mm 샤레에 2.5 mL씩 파종하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, EpiLife-KG2에 용해한 시료 용액(시료 1~3, 시료 농도는 하기 표 5를 참조)을 2.5 mL 첨가하고, 16시간 더 배양했다. 배양 종료 후, 배양액을 버리고, ISOGEN(니폰진 사제, Cat.No. 311-02501)로 총RNA를 추출하고, 각각의 RNA량을 분광 광도계로 측정하여, 200μg/mL가 되도록 총RNA를 조정했다.
이 총RNA를 주형으로 하여, γ-글루타밀시스테인 신테타제 및 내부 표준인 GAPDH의 mRNA의 발현량을 측정했다. 검출은 리얼타임 PCR 장치 Smart Cycler(Cepheid 사제)를 이용하여, TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time, code No. RR063A)에 의한 리얼타임 2Step RT－PCR 반응에 의해 행하였다. γ-글루타밀시스테인 신테타제의 mRNA의 발현량은, 동일 샘플에서의 GAPDH의 mRNA의 발현량의 값으로 보정을 행한 후, 더욱 「시료 무첨가 시」의 보정 값을 100으로 했을 때의 「시료 첨가시」의 보정 값을 산출한 후에, 하기식에 의거하여 γ-글루타밀시스테인 신테타제의 mRNA의 발현 촉진율(%)을 산출했다.
mRNA 발현 촉진율(%) = B/A×100
식 중, A는 「시료 무첨가 시의 mRNA 발현량(대조)」를 나타내며, B는 「시료 첨가시의 mRNA 발현량」을 나타낸다.
결과를 표 5에 나타낸다.
시료 시료 농도(㎍/mL) mRNA 발현 촉진율(%)

1		 6.25 241.2
25 891.7

2		 6.25 205.6
25 638.2

3		 6.25 196.1
25 487.2
표 5에 나타내는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은, 표피 각화세포에서 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA의 발현을 효과적으로 촉진할 수 있음이 확인되었다.
[시험예 6] 피부 섬유아세포에서의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용 시험
상기와 같이 하여 얻어진 감초 추출 조성물(시료 1~3)에 대해서, 이하와 같이 하여 피부 섬유아세포에서의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용을 시험했다.
사람 정상 피부 섬유아세포(NB1RGB)를, 10% FBS 함유α-MEM를 이용하여 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수했다. 회수한 세포를 2.0×105cells/mL의 세포 밀도가 되도록 10% FBS 함유α-MEM로 희석한 후, 35mm 샤레에 2.5 mL씩 파종하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, 1% FBS 함유 D-MEM에 용해한 시료 용액(시료 1~3, 시료 농도는 하기 표 6을 참조)을 2.5mL 첨가하고, 16시간 더 배양했다. 배양 종료 후, 배양액을 버리고 ISOGEN(니폰진 사제, Cat.No. 311-02501)로 총RNA를 추출하고, 각각의 RNA량을 분광 광도계로 측정하여, 200μg/mL가 되도록 총RNA를 조정했다.
이 총RNA를 주형으로 하여, γ-글루타밀시스테인 신테타제 및 내부 표준인 GAPDH의 mRNA의 발현량을 측정했다. 검출은 리얼타임 PCR 장치 Smart Cycler(Cepheid 사제)를 이용하여, TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time, code No. RR063A)에 의한 리얼타임 2Step RT－PCR 반응에 의해 행하였다. γ-글루타밀시스테인 신테타제의 mRNA의 발현량은, 동일 샘플에서의 GAPDH의 mRNA의 발현량의 값으로 보정을 행한 후, 더욱 「시료 무첨가 시」의 보정 값을 100으로 했을 때의 「시료 첨가시」의 보정 값을 산출한 후에, 하기식에 의거하여 γ-글루타밀시스테인 신테타제의 mRNA의 발현 촉진율(%)을 산출했다.
mRNA 발현 촉진율(%) = B/A × 100
식 중, A는 「시료 무첨가 시의 mRNA 발현량(대조)」를 나타내며, B는 「시료 첨가시의 mRNA 발현량」을 나타낸다.
결과를 표 6에 나타낸다.
시료 시료농도(㎍/mL) mRNA 발현 촉진율(%)
1
25
 122.3
2 162.6
3 139.4
표 6에 나타내는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은, 피부 섬유아세포에서 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA의 발현을 효과적으로 촉진할 수 있음이 확인되었다.
[시험예 7] B16 멜라노마 세포에서의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용 시험
상기와 같이 하여 얻어진 감초 추출 조성물(시료 1~3)에 대해서, 이하와 같이 하여 B16 멜라노마 세포에서의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용을 시험했다.
B16 멜라노마 세포를 10% FBS 함유 D-MEM 배지를 이용하여 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수했다. 회수한 세포를 1.0×105cells/mL의 세포 밀도가 되도록 10% FBS 함유 D-MEM 배지로 희석한 후, 35mm 샤레에 2.5mL씩 파종하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, 1% FBS 함유 D-MEM 배지에 용해한 시료 용액(시료 1~3, 시료 농도는 하기 표 7을 참조)을 2.5mL 첨가하고, 16시간 더 배양했다. 배양 종료 후, 배양액을 버리고 ISOGEN(니폰진 사제, Cat.No. 311-02501)로 총RNA를 추출하고, 각각의 RNA량을 분광 광도계로 측정하여, 100μg/mL가 되도록 총RNA를 조정했다.
이 총RNA를 주형으로 하여, γ-글루타밀시스테인 신테타제 및 내부 표준인 GAPDH의 mRNA의 발현량을 측정했다. 검출은 리얼타임 PCR 장치 Smart Cycler(Cepheid 사제)를 이용하여, TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time, code No. RR063A)에 의한 리얼타임 2Step RT－PCR 반응에 의해 행하였다. γ-글루타밀시스테인 신테타제의 mRNA의 발현량은, 동일 샘플에서의 GAPDH의 mRNA의 발현량의 값으로 보정을 행한 후, 더욱 「시료 무첨가 시」의 보정 값을 100으로 했을 때의 「시료 첨가시」의 보정 값을 산출한 후에, 하기식에 의거하여 γ-글루타밀시스테인 신테타제의 mRNA의 발현 촉진율(%)을 산출했다.
mRNA 발현 촉진율(%) = B/A × 100
식 중, A는 「시료 무첨가 시의 mRNA 발현량(대조)」를 나타내며, B는 「시료 첨가시의 mRNA 발현량」을 나타낸다.
결과를 표 7에 나타낸다.
시료 시료농도(㎍/mL) mRNA 발현 촉진율(%)
1
25
 140.3
2 165.7
3 132.8
표 7에 나타내는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은 B16 멜라노마 세포에서 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA의 발현을 효과적으로 촉진할 수 있음이 확인되었다.
[시험예 8] 간세포에서의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용 시험
상기와 같이 하여 얻어진 감초 추출 조성물(시료 1~3)에 대해서, 이하와 같이 하여 간세포에서의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용을 시험했다.
정상 사람 간세포(Cell System-Hc Cells, 셀시스템즈 사제)를, CS-C 무혈청 배지(셀시스템즈 사제)를 이용하여 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수했다. 회수한 세포를 1.0×105cells/mL의 세포 밀도가 되도록 CS-C 무혈청 배지로 희석한 후, 35mm 샤레에 2.5mL씩 파종하고, 하룻밤 배양했다.
배양 후, CS-C 무혈청 배지에 용해한 시료 용액(시료 1~3, 시료 농도는 하기 표 8을 참조)을 2.5mL 첨가하고, 16시간 더 배양했다. 배양 종료 후, 배양액을 버리고 ISOGEN(니폰진 사제, Cat.No. 311-02501)로 총RNA를 추출하고, 각각의 RNA량을 분광 광도계로 측정하여, 200μg/mL가 되도록 총RNA를 조정했다.
이 총RNA를 주형으로 하여, γ-글루타밀시스테인 신테타제 및 내부 표준인 GAPDH의 mRNA의 발현량을 측정했다. 검출은 리얼타임 PCR 장치 Smart Cycler(Cepheid 사제)를 이용하여, TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time, code No. RR063A)에 의한 리얼타임 2Step RT－PCR 반응에 의해 행하였다. γ-글루타밀시스테인 신테타제의 mRNA의 발현량은, 동일 샘플에서의 GAPDH의 mRNA의 발현량의 값으로 보정을 행한 후, 더욱 「시료 무첨가 시」의 보정 값을 100으로 했을 때의 「시료 첨가시」의 보정 값을 산출한 후에, 하기식에 의거하여γ-글루타밀시스테인 신테타제의 mRNA의 발현 촉진율(%)을 산출했다.
mRNA 발현 촉진율(%) = B/A × 100
식 중, A는 「시료 무첨가 시의 mRNA 발현량(대조)」를 나타내며, B는 「시료 첨가시의 mRNA 발현량」을 나타낸다.
시료 시료농도(㎍/mL) mRNA 발현 촉진율(%)
1
50
 110.5
2 138.6
3 118.2
표 8에 나타내는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은, 간세포에서 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 의 발현을 효과적으로 촉진할 수 있음이 확인되었다.
상술한 시험예 1~4로부터 명확히 알 수 있는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은 우수한 글루타티온 생산 촉진 작용을 가지고 있다. 또, 시험예 5~8로부터 명확히 알 수 있는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은 우수한 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용을 가지고 있다. 이로부터, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은 γ-글루타밀시스테인 신테타제 mRNA 발현 촉진 작용을 통해서, 글루타티온의 전구체인γ-글루타밀시스테인의 생합성을 촉진하고, 그것에 의해 생체 내에서의 글루타티온의 생산을 촉진하고 있는 것으로 추측된다.
[시험예 9] 양식어의 글루타티온 함유량의 측정
제조예 1에서 얻어진 감초 추출 조성물(시료 1)을 양식용 사료로서 사용하여 하기의 조건으로 양식한 양식어의 근조직 중에 함유되는 글루타티온량을 측정했다.
(1) 제공시어: 평균 1kg의 양식 참돔
(2) 시험 시기: 9~10월
(3) 시험 미수(尾數): 10/6000(방미수)
(4) 투여량: 20mg-시료 1/kg-어체중
(5) 투여 방법: 4일 급식, 3일 비급식(1개월)
(6) 측정일: 시험 개시 1개월 후 배
양식어의 근조직 중에 함유되는 글루타티온량은 아래와 같이 하여 측정했다.
시료 1 투여군의 양식 참돔의 근육(背側)을 5% 5-설포살리틸산 중에 동질화하고, 4℃에서 원심분리 후, 상징을 시료 용액으로 했다. 96 웰 플레이트에 시료 용액 25μL 및 0.1M의 인산 완충액 125μL를 첨가한 후, 10mM의 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) 25μL를 첨가하고, 5분 후의 파장 412nm에서의 흡광도를 측정하여 ΔOD/min를 구했다. 환원형 글루타티온 농도는, 환원형 글루타티온 표준품을 이용해 작성한 검량선을 기초로 산출했다. 또, 대조군으로서, 시료 1을 투여하지 않은 것 이외는 동일한 조건으로 양식한 양식 참돔의 근육(背側) 중의 환원형 글루타티온 농도를 동일하게 하여 산출했다.
결과를 표 9에 나타낸다.
글루타티온양(mg/100g-근육)
시료 1 투여군 11.1
대조군 8.9
표 9에 나타내는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은, 양식 참돔의 근육 중의 글루타티온량을 효과적으로 증가시키는 작용을 갖는 것이 확인되었다.
[시험예 10] 마우스 피부 중의 글루타티온량의 측정
HR-1/Hos계의 5주령의 암컷 헤어레스 마우스(호시노시켄토우부츠시이쿠쇼로부터 구입)를 1주간 순화한 후, 제조예 1에서 얻어진 감초 추출 조성물(시료 1)을 분말 시료(라보MR스톡, 시미즈시켄자이료 사제)에 혼식하고, 감초 추출 조성물(시료 1)의 1일당 섭취량이 50(mg/kg－마우스 체중)이 되도록, 3주간 매일 급식했다. 급식 종료 후, 피부를 채취하여, 테프론호모지나이저를 이용하여, 채취한 피부 1mg 당 100μL의 1% Tritonx-100 함유 PBS 중에서 피부를 가용화하고, 4℃에서 원심분리(12000rpm, 15분간)한 후, 상징을 측정 시료로 했다.
얻어진 측정 시료 중의 25μL를 사용하여 총 글루타티온의 정량을 행하였다. 즉, 96 웰 플레이트에 측정 시료 25μL, 0.1M의 인산 완충액 125μL, 2mM의 NADPH 25μL 및 글루타티온 리덕타제 25μL(종농도: 17.5 unit/mL)를 첨가하고, 37℃에서 10분간 가온한 후, 10mM의 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) 25μL를 첨가하고, 5분후까지의 파장 412nm에서의 흡광도를 측정하여 ΔOD/min를 구했다. 총 글루타티온 농도는, 산화형 글루타티온(와코쥰야크 사제)을 이용해 작성한 검량선을 기초로 산출해 얻어진 값으로부터, 피부 중량당의 글루타티온량으로 산출했다. 또, 대조군으로서, 분말 사료에 감초 추출 조성물(시료 1)을 첨가하지 않은 것 이외는 동일하게 하여 마우스 피부 중의 총 글루타티온 농도를 산출했다.
결과를 표 10에 나타낸다.
글루타티온양(mg/100g-피부)
시료 1 투여군 38.0
대조군 23.6
표 10에 나타내는 바와 같이, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물은, 마우스 피부 중의 글루타티온량을 효과적으로 증가시키는 작용을 갖는 것이 확인되었다.
[배합예 1]
통상의 방법에 의해, 이하의 조성을 갖는 배합사료를 제조했다.
감초 추출 조성물 (제조예 1) 1질량%
어분 75질량%
소맥분 10질량%
전분 7질량%
어유 3질량%
미네랄류 2질량%
비타민류 2질량%
[배합예 2]
통상의 방법에 의해, 이하의 조성을 갖는 정제를 제조했다.
감초 추출 조성물 (제조예 1) 30.0mg
유청미네랄 (칼슘 25~30%함유) 100.0mg
비타민 K2 (1% 함유 분말) 1. 5mg
말티톨 156.0mg
글리세린 지방산 에스테르 12.5mg
[배합예 3]
통상의 방법에 의해, 이하의 조성을 갖는 정제를 제조했다.
감초 추출 조성물 (제조예 2) 15.0mg
드로마이트 (칼슘 20%, 마그네슘 10% 함유) 83.4mg
카제인포스포펩티드 16.7mg
비타민 C 33.4mg
말티톨 126.8mg
콜라겐 12.7mg
자당 지방산 에스테르 12.0mg
[배합예 4]
통상의 방법에 의해, 이하의 조성을 갖는 캡슐제를 제조했다. 또 캡슐로는, 1호 하드 젤라틴 캡슐을 사용했다.
＜1 캡슐(1정 200 mg) 중의 조성＞
감초 추출 조성물 (제조예 2) 20.0mg
옥수수 전분 60.0mg
유당 100.0mg
유산 칼슘 10.0mg
히드록시프로필 셀룰로오스(HPC－L) 10.0mg
[배합예 5]
통상의 방법에 의해, 이하의 조성을 갖는 경구 액상 제제를 제조했다.
＜1 앰플(1개 100 mL) 중의 조성＞
감초 추출 조성물(제조예 3) 0.4질량%
소르비트 12.0질량%
안식향산나트륨 0.1질량%
향료 1.0질량%
황산칼슘 0.5질량%
정제수 잔부
본 발명의 글루타티온 생산 촉진제는 피부 노화, 기미, 자외선의 조사에 의한 산화 스트레스에 대한 상해, 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환(예를 들면, 활성 산소종 등의 산화 스트레스에 의해 일어나는 질환; 간염, 간기능 장해 등의 간장 질환; 만성 신부전; 특발성 폐선유증, 성인 호흡기 장해 증후군 등의 호흡기계 질환; 백내장; 허혈성 심질환; 파킨슨병; 알츠하이머 병: 위궤양 등의 소화기계 질환; 암; 골수 형성 부전; 후천성 면역부전 증후군; 잠복성 바이러스 감염증 등), 산화형 글루타티온의 결핍에 기인하는 불면증 등의 수면장해 등의 예방, 치료 또는 개선에 크게 공헌할 수 있다.

Claims (6)

  1. 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 글루타티온 생산 촉진제.
  2. 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 글루타티온의 결핍에 기인하는 질환의 예방·치료제.
  3. 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 배합한 것을 특징으로 하는 음식품.
  4. 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 배합한 것을 특징으로 하는 사료.
  5. 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 함유하는 글루타티온 생산 촉진제를, 사람 또는 동물의 소정 부위에 투여하는 것을 특징으로 하는 사람 또는 동물의 생체 내 세포에서의 글루타티온의 생산을 촉진하는 방법.
  6. 리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 이소리퀴리틴 및 이소리퀴리티게닌을 함유하고, 글리틸리틴산을 실질적으로 함유하지 않는 감초 추출 조성물을 제조하는 방법으로서,
    감초 엑기스로부터 글리틸리틴산을 실질적으로 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
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