WO2009136611A1 - グルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤、飲食品及び飼料 - Google Patents

グルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤、飲食品及び飼料 Download PDF

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WO
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glutathione
licorice extract
extract composition
isoliquiritigenin
liquiritigenin
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信明 大戸
敏之 村上
大野　裕和
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丸善製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a glutathione production promoter, a preventive / therapeutic agent for diseases caused by glutathione deficiency, food and drink, and feed.
  • Glutathione is a tripeptide consisting of three amino acids, glutamic acid, cysteine and glycine, and is a compound having a major intracellular cysteine residue. This glutathione is known to play a role as a SH donor for various enzymes, such as radical scavenging, regulation of cell function by redox, involvement in detoxification mechanisms, and various enzymes.
  • the intracellular glutathione concentration can be increased by promoting the production of glutathione in cells in vivo, the ability to protect against oxidative stress that declines with aging will be enhanced and the damage to oxidative stress caused by ultraviolet irradiation will be suppressed. Therefore, it is expected that the prevention, treatment or improvement of pigmentation diseases such as aging of skin and spots, and the prevention or treatment of various organ functions and various diseases caused by deficiency of glutathione are expected.
  • bilberry extract and walnut extract see Patent Document 2
  • gardenia plant extract see Patent Document 3
  • glutathione exists as reduced glutathione having an action of removing reactive oxygen species, and oxidized glutathione produced by the reaction between reduced glutathione and reactive oxygen species.
  • this oxidized glutathione is a sleep promoting substance that suppresses excitation of nerve cells and promotes sleep. Therefore, if it is possible to promote the production of glutathione and increase the intracellular concentration of oxidized glutathione as well as reduced glutathione, it is considered effective for the prevention, treatment or improvement of sleep disorders such as insomnia. ing.
  • a hypnotic agent containing oxidized glutathione as an active ingredient has been known (see Patent Document 4).
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase reacts with cysteine and glutamic acid to biosynthesize ⁇ -glutamylcysteine
  • glutathione synthetase reacts with ⁇ -glutamylcysteine and glycine to produce glutathione. It is known to be biosynthesized. Therefore, it is considered that the concentration of glutathione in living cells can be increased by promoting the expression of ⁇ -glutamylcysteine synthetase that plays a catalytic role for biosynthesis of ⁇ -glutamylcysteine, which is a precursor of glutathione. .
  • the present invention has been found out of a highly safe natural product having glutathione production promoting action and ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA expression promoting action, and is caused by deficiency of glutathione production promoter and glutathione containing it as an active ingredient It aims at providing the preventive / therapeutic agent of disease, food and drink, and feed.
  • the glutathione production promoter and the preventive / therapeutic agent for diseases caused by glutathione deficiency contain liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin, and substantially contain glycyrrhizic acid. It contains licorice extract composition not contained in as an active ingredient.
  • the food and drink and the feed of the present invention are characterized by containing a licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid.
  • the method for promoting the production of glutathione in human or animal in vivo cells of the present invention comprises a licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid.
  • the glutathione production promoter contained is administered to a predetermined site of a human or animal.
  • the method for producing a licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin of the present invention and substantially free of glycyrrhizic acid substantially removes glycyrrhizic acid from licorice extract. It is characterized by that.
  • substantially free of glycyrrhizic acid means that the glycyrrhizic acid content in the licorice extract composition is preferably 1.0% by mass or less, more preferably 0.8%. It means 5 mass% or less.
  • the “licorice extract” is an extract obtained using licorice as an extraction raw material, a diluted or concentrated solution of the extract, or a dried product obtained by drying the extract.
  • the licorice extract composition means that glycyrrhizic acid is substantially removed from the licorice extract, and liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritigenin and isoliquiritigenin are removed. Means contained.
  • a glutathione production promoter that contains liquorice, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin, contains a licorice extract composition that is substantially free of glycyrrhizic acid as an active ingredient, and is excellent in safety, It is possible to provide a preventive / therapeutic agent for diseases caused by deficiency of glutathione, food and drink, and feed.
  • the glutathione production promoter of this embodiment and the prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by glutathione deficiency include liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin, and a licorice extract composition substantially free of glycyrrhizic acid. (Hereinafter sometimes referred to simply as “licorice extract composition”) as an active ingredient.
  • a licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid is commonly used in plant extraction treatments. It can be obtained by removing glycyrrhizic acid from the licorice extract that can be obtained by the above method.
  • the licorice used as the raw material for extraction is Glychyrrhiza glabra, Glychyrrhiza inflata, Glychyrrhiza uralensis, Glychyrrhiza aspera, Glychyrrhiza eurycarpa, Glychyrrhiza pallidiflora, Glychyrrhiza h
  • Any kind of licorice may be used as an extraction raw material, but it is particularly preferable to use Glychyrrhizachyglabra, Glychyrrhiza uralensis, Glychyrrhiza ⁇ ⁇ inflata as an extraction raw material.
  • constituent parts of licorice that can be used as an extraction raw material include, for example, leaf parts, branch parts, bark parts, trunk parts, stem parts, fruit parts, flower parts, etc., root parts, rhizome parts, or a mixture of these parts. Are preferred, but the root or rhizome is preferred.
  • the licorice extract can be obtained by drying licorice as an extraction raw material, pulverizing it as it is or using a crusher, and subjecting it to extraction with an extraction solvent. Drying may be performed in the sun or using a commonly used dryer. Moreover, after performing pretreatment, such as degreasing, with a nonpolar solvent such as hexane, it may be used as an extraction raw material. By performing pretreatment such as degreasing, extraction treatment with a polar solvent of a plant can be performed efficiently.
  • a polar solvent examples thereof include water and hydrophilic organic solvents. These are used alone or in combination of two or more at room temperature or a temperature below the boiling point of the solvent. It is preferable.
  • the water that can be used as the extraction solvent includes pure water, tap water, well water, mineral spring water, mineral water, hot spring water, spring water, fresh water, and the like, and those subjected to various treatments.
  • Examples of the treatment applied to water include purification, heating, sterilization, filtration, ion exchange, osmotic pressure adjustment, acidification, alkalization, buffering, and the like. Therefore, the water that can be used as the extraction solvent in the present embodiment includes purified water, hot water, ion-exchanged water, physiological saline, organic acid acidic water, ammonia alkaline water, phosphate buffer, phosphate buffered saline. Etc. are also included.
  • lower aliphatic alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and isopropyl alcohol
  • lower aliphatic ketones such as acetone and methyl ethyl ketone
  • 1,3-butylene examples include polyhydric alcohols having 2 to 5 carbon atoms such as glycol, propylene glycol and glycerin.
  • the mixing ratio can be adjusted as appropriate.
  • a mixed solution of water and a lower aliphatic alcohol it is preferable to mix 1 to 90 parts by volume of a lower aliphatic alcohol with 10 parts by volume of water.
  • a mixed solution it is preferable to mix 1 to 40 parts by volume of a lower aliphatic ketone with 10 parts by volume of water, and when using a mixed solution of water and a polyhydric alcohol, It is preferable to mix 10 to 90 parts by volume of polyhydric alcohol with respect to the part by volume.
  • the extraction treatment is not particularly limited as long as the soluble component contained in the extraction raw material can be eluted in the extraction solvent, and can be performed according to a conventional method.
  • the extraction raw material is immersed in an extraction solvent 5 to 15 times (mass ratio) of the extraction raw material, the soluble components are extracted at room temperature or under reflux, and then filtered to remove the extraction residue. A liquid can be obtained.
  • the solvent is distilled off from the obtained extract, a paste-like concentrate is obtained, and when this concentrate is further dried, a dried product is obtained.
  • the extract obtained as described above contains glycyrrhizic acid. Therefore, glycyrrhizic acid is removed from these extracts, the concentrate of the extract, or the dried product (licorice extract) of the extract.
  • glycyrrhizic acid is 80-95 vol% alcohol aqueous solution to licorice extract, disperse the extract from licorice in aqueous alcoholic solution, and suction filter the precipitate with filter paper. Since glycyrrhizic acid is water-soluble and hardly soluble in alcohol, glycyrrhizic acid contained in the licorice extract hardly dissolves in the alcohol aqueous solution and is removed as a precipitate. On the other hand, liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin, and isoliquiritigenin are soluble in alcohol and thus easily dissolved in an aqueous alcohol solution.
  • the alcohol used as the dispersion medium is not particularly limited, and a lower aliphatic alcohol having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and isopropyl alcohol may be used.
  • Water is added to the residue obtained by evaporating the solvent from the filtrate, and the residue is subjected to column chromatography using a porous material such as silica gel or alumina, a porous resin such as styrene-divinylbenzene copolymer or polymethacrylate, or the like. Elute in the order of water and alcohol. And the liquorice extract composition which contains liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin, and isoliquiritigenin as a fraction eluted with alcohol, and does not contain glycyrrhizic acid substantially can be obtained.
  • the alcohol used as an eluent in column chromatography is not particularly limited, and examples thereof include lower aliphatic alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and isopropyl alcohol, or aqueous solutions thereof. Can be mentioned.
  • the alcohol fraction obtained by column chromatography can be purified by any organic compound such as reverse phase silica gel chromatography using ODS, recrystallization, liquid-liquid countercurrent extraction, column chromatography using ion exchange resin, etc. It may be purified using means.
  • mineral acid for example, sulfuric acid, nitric acid, hydrochloric acid, etc.
  • mineral acid for example, sulfuric acid, nitric acid, hydrochloric acid, etc.
  • an acidic precipitation (acid precipitation) treatment is performed.
  • the resulting acid precipitation solution is filtered to collect a precipitate, and a 30 to 90% by volume, preferably 30 to 70% by volume aqueous alcohol solution (for example, methanol, ethanol, propyl alcohol, isopropyl alcohol, etc. 5) and then filtered.
  • aqueous alcohol solution for example, methanol, ethanol, propyl alcohol, isopropyl alcohol, etc. 5
  • Ammonia water is added to the filtrate thus obtained to adjust the pH of the filtrate to about 3.0 to 5.0, preferably about 3.0 to 3.5, so that glycyrrhizic acid is precipitated and solid-liquid separation is performed. To do.
  • the resulting filtrate fraction is neutralized by adding sodium carbonate and subjected to column chromatography using a porous material such as silica gel or alumina, a porous resin such as styrene-divinylbenzene copolymer or polymethacrylate, or the like. Elute in the order of water and alcohol.
  • liquorice extract composition which contains liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin, and isoliquiritigenin as a fraction eluted with alcohol, and does not contain glycyrrhizic acid substantially can be obtained.
  • alcohol used as an eluent in column chromatography are the same as those described above.
  • the alcohol fraction obtained by column chromatography can be purified by any organic compound such as reverse phase silica gel chromatography using ODS, recrystallization, liquid-liquid countercurrent extraction, column chromatography using ion exchange resin, etc. It may be purified using means.
  • a licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizin acid can be obtained.
  • the glycyrrhizic acid content in the licorice extract composition is preferably 1.0% by mass or less, and more preferably 0.5% by mass or less.
  • the licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin obtained as described above and substantially free of glycyrrhizic acid has a glutathione production promoting action, and therefore has its action. It can be used as an active ingredient of a glutathione production promoter. Since the licorice extract composition also has a ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA expression promoting action, it can be used as an active ingredient of a ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA expression promoting agent by utilizing this action.
  • the licorice extract composition can promote the production of glutathione through its glutathione production promoting action, diseases caused by deficiency of glutathione (for example, diseases caused by oxidative stress such as reactive oxygen species; hepatitis, Liver disorders such as liver dysfunction; chronic renal failure; idiopathic pulmonary fibrosis, respiratory disease such as adult respiratory syndrome; cataract; ischemic heart disease; Parkinson's disease; Alzheimer's disease: gastrointestinal diseases such as gastric ulcer Cancer; myelopoiesis; acquired immune deficiency syndrome; latent viral infection, etc.) and can also be used as an active ingredient of a prophylactic / therapeutic agent.
  • diseases caused by deficiency of glutathione for example, diseases caused by oxidative stress such as reactive oxygen species; hepatitis, Liver disorders such as liver dysfunction; chronic renal failure; idiopathic pulmonary fibrosis, respiratory disease such as adult respiratory syndrome; cataract; ischemic heart disease; Parkinson's disease; Alzheimer's disease: gastrointestinal diseases
  • the licorice extract composition has a glutathione production promoting action, and the intracellular concentration of oxidized glutathione can be increased using this action, prevention and treatment of sleep disorders such as insomnia Alternatively, it can be used as an active ingredient of an improving agent.
  • the glutathione production promoter of this embodiment or the prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by glutathione deficiency may consist of only the licorice extract composition, or may be a formulation of the licorice extract composition. There may be.
  • the licorice extract composition may be used in any dosage form such as powder, granule, tablet, liquid, etc. according to a conventional method using a pharmaceutically acceptable carrier such as dextrin or cyclodextrin and any other auxiliary agent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as dextrin or cyclodextrin and any other auxiliary agent.
  • an auxiliary agent for example, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a stabilizer, a flavoring / flavoring agent, and the like can be used.
  • the licorice extract composition can be used in combination with other compositions (for example, foods and beverages), and can also be used as an ointment, a liquid for external use, a patch, and the like.
  • the glutathione production promoter of this embodiment or the prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by glutathione deficiency is used as an active ingredient, if necessary, with other natural extracts having a glutathione production promoting action. can do.
  • the glutathione production promoter or the prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by glutathione deficiency may be administered to a predetermined site of a human or animal, and generally transdermal administration, oral administration, intravenous administration
  • a suitable method for its prevention or treatment may be selected as appropriate, and in particular, diseases caused by deficiency of the glutathione production promoter or glutathione by transdermal administration or oral administration. It is preferable to administer a prophylactic / therapeutic agent.
  • the dosage of the glutathione production promoter or the prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by glutathione deficiency according to the present embodiment may be appropriately increased or decreased depending on the type of disease, severity, individual differences among patients, administration method, administration period, etc. What is necessary is just to administer an effective amount of the glutathione production promoter of this embodiment or the prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by glutathione deficiency according to the type and severity of the disease.
  • the glutathione production promoter of this embodiment can enhance the ability to protect against oxidative stress that declines with aging, and can suppress damage to oxidative stress caused by ultraviolet irradiation through the glutathione production promoting action of the licorice extract composition. It is possible to prevent, treat or ameliorate various diseases caused by pigmentation such as aging of the skin, stains, etc., and reduced function of various organs caused by glutathione deficiency.
  • the glutathione production promoter of the present embodiment can be used for all purposes that are meaningful for exerting the glutathione production promoting action in addition to these uses.
  • the licorice extract composition particularly contains the licorice extract composition because it can effectively promote the production of glutathione in epidermal keratinocytes and skin fibroblasts.
  • glutathione production promoter reactive oxygen species can be eliminated in epidermal keratinocytes or dermal fibroblasts, and epidermal keratinocytes or dermal fibroblasts can be protected from damage caused by oxidative stress. As a result, it is possible to effectively prevent skin aging and the like.
  • glutathione since glutathione has an action of suppressing tyrosinase maturation, it is possible to further suppress tyrosinase maturation by promoting the production of glutathione and to suppress the production of melanin in melanocytes. it can. Therefore, according to the glutathione production promoter containing the licorice extract composition, it is possible to effectively promote the production of glutathione in melanocytes and further suppress the maturation of tyrosinase. , Skin darkening, spots, freckles and the like can be prevented.
  • the glutathione production promoter containing the licorice extract composition is effective for liver diseases caused by glutathione deficiency. Can be prevented or treated.
  • ⁇ -glutamyl which is a precursor of glutathione
  • ⁇ -glutamyl which is a precursor of glutathione
  • the preventive / therapeutic agent for diseases caused by glutathione deficiency is caused by glutathione deficiency (for example, oxidative stress such as reactive oxygen species) through the glutathione production promoting action of the licorice extract composition.
  • glutathione deficiency for example, oxidative stress such as reactive oxygen species
  • liver diseases such as hepatitis, liver dysfunction; chronic renal failure; idiopathic pulmonary fibrosis, respiratory disease such as adult respiratory disorder syndrome; cataract; ischemic heart disease; Parkinson's disease; Alzheimer's disease: gastric ulcer, etc.
  • Gastrointestinal diseases; cancer; bone marrow dysplasia; acquired immune deficiency syndrome; latent viral infections, etc. can prevent, treat or ameliorate sleep disorders such as illness.
  • the food / beverage products or feed of the present embodiment contains liquorice, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin, and contains a licorice extract composition substantially free of glycyrrhizic acid.
  • the licorice extract composition has a glutathione production promoting action, and it has been confirmed that it is not digestible in the digestive tract of humans, animals, fish, etc., and is excellent in safety.
  • Any food and drink such as general food, health food, health functional food or nutritional supplement, or animal feed such as poultry and livestock, fish feed such as farmed fish, feed such as pet food such as cat food and dog food Suitable for blending.
  • the licorice extract composition may be directly added to food or drink or feed, or a glutathione production promoter formulated with the licorice extract composition or a prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by glutathione deficiency is consumed. You may mix with goods or feed.
  • the amount of active ingredients in the mixture is determined in consideration of the purpose of use, sex, symptoms, etc. However, it is preferable that the extract intake per day for adults is about 1 to 1000 mg in consideration of the general intake of foods and drinks to be added.
  • the blending ratio is the target organism (pets such as poultry, livestock, farmed fish, dogs and cats) Animal) and the body weight, purpose of use, etc., can be adjusted as appropriate, but it is preferably 0.0001 to 20.0% by mass in consideration of the general intake of the feed to be added. 0.01 to 2.0% by mass is preferable.
  • beverages such as soft drinks, carbonated drinks, nutritional drinks, fruit drinks, and lactic acid drinks (including concentrated concentrates and powders for adjustment of these drinks); frozen desserts such as ice cream, ice sherbet and shaved ice; Noodles such as udon, harusame, gyoza skin, sweet husk, Chinese noodles, instant noodles; confectionery such as rice cake, chewing gum, candy, gum, chocolate, tablet confectionery, snack confectionery, biscuit, jelly, jam, cream, baked confectionery Fishery and livestock processed foods such as kamaboko, ham and sausage; dairy products such as processed milk and fermented milk; processed oils and fats such as salad oil, tempura oil, margarine, mayonnaise, shortening, whipped cream and dressing; sauces, sauce Seasonings such as soups, stews, salads, prepared dishes, pickles; various other forms of health and prosperity Supplementary foods: Tablets, capsules, drinks, etc. can contain the above-mentioned licorice extract composition, glutathioned
  • the obtained powder was analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions.
  • the glycyrrhizic acid content was 0.5% by mass
  • the liquiritin content was 4.2% by mass
  • the isoliquiritin content was 3.6% by mass
  • the liquiritigenin content was 2.5%.
  • the content was 1.5% by mass
  • the content of isoliquiritigenin was 1.5% by mass.
  • Example 2 Processing was carried out in the same manner as in Example 1 except that 10 L of 3% ammonia water was added to 10 kg of chips obtained by crushing rhizomes of licorice (Glycyrrhiza uralensis) to obtain 410 g of tan powder (Sample 2). The obtained powder was analyzed by high performance liquid chromatography in the same manner as in Example 1. As a result, the glycyrrhizic acid content was 0.9% by mass, the liquiritin content was 5.5% by mass, the isoliquiritin content was 4.6% by mass, and the liquiritigenin content was 3 It was 0.9% by mass and the content of isoliquiritigenin was 3.5% by mass.
  • a porous synthetic adsorption resin Diaion HP-20, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation
  • the obtained powder was analyzed by high performance liquid chromatography in the same manner as in Example 1.
  • the glycyrrhizic acid content was 0.8% by mass
  • the liquiritin content was 3.5% by mass
  • the isoliquiritin content was 2.8% by mass
  • the liquiritigenin content was 2. It was 0.5% by mass
  • the content of isoliquiritigenin was 1.8% by mass.
  • NHEK normal human epidermal keratinocytes
  • EpiLife-KG2 normal human epidermal keratinocyte long-term culture growth medium
  • the collected cells were diluted with EpiLife-KG2 to a cell density of 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL, seeded in a 48-well plate at 200 ⁇ L per well, and cultured overnight.
  • Quantification of total glutathione was performed using 100 ⁇ L of these. That is, after adding 100 ⁇ L of cell extract dissolved in 96-well plate, 50 ⁇ L of 0.1 M phosphate buffer, 25 ⁇ L of 2 mM NADPH and 25 ⁇ L of glutathione reductase (final concentration 17.5 units / mL), the mixture was heated at 37 ° C. for 10 minutes. 25 ⁇ L of 10 mM 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) was added, and the absorbance at a wavelength of 412 nm until 5 minutes was measured to obtain ⁇ OD / min.
  • the total glutathione concentration was calculated based on a calibration curve prepared using oxidized glutathione (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After correcting the obtained value to the amount of glutathione per total protein amount, the glutathione production promotion rate (%) was calculated based on the following formula.
  • Glutathione production promotion rate (%) B / A ⁇ 100
  • A represents “the amount of glutathione per total protein in the cell when no sample is added (control)”
  • B represents “the amount of glutathione per total amount of protein in the cell when added to the sample”.
  • the licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid effectively promotes glutathione production in epidermal keratinocytes. Confirmed to get.
  • N1RGB Human normal skin fibroblasts
  • ⁇ -MEM containing 10% FBS
  • the collected cells were diluted with ⁇ -MEM containing 10% FBS to a cell density of 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL, and then seeded at 200 ⁇ L per well in a 48-well plate and cultured overnight.
  • samples 1 to 3 refer to Table 2 below for the sample concentration
  • the medium was removed from each well, washed with 400 ⁇ L PBS ( ⁇ ), and the cells were lysed using 150 ⁇ L M-PER (PIERCE).
  • Quantification of total glutathione was performed using 100 ⁇ L of these. That is, after adding 100 ⁇ L of cell extract dissolved in 96-well plate, 50 ⁇ L of 0.1 M phosphate buffer, 25 ⁇ L of 2 mM NADPH and 25 ⁇ L of glutathione reductase (final concentration 17.5 units / mL), the mixture was heated at 37 ° C. for 10 minutes. 25 ⁇ L of 10 mM 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) was added, and the absorbance at a wavelength of 412 nm until 5 minutes was measured to obtain ⁇ OD / min.
  • the total glutathione concentration was calculated based on a calibration curve prepared using oxidized glutathione (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After correcting the obtained value to the amount of glutathione per total protein amount, the glutathione production promotion rate (%) was calculated based on the following formula.
  • Glutathione production promotion rate (%) B / A ⁇ 100
  • A represents “the amount of glutathione per total protein in the cell when no sample is added (control)”
  • B represents “the amount of glutathione per total amount of protein in the cell when added to the sample”.
  • the licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid effectively promotes the production of glutathione in dermal fibroblasts. Confirmed to get.
  • B16 melanoma cells were cultured using D-MEM medium containing 10% FBS, and then cells were collected by trypsin treatment. The collected cells were diluted with 10% FBS-containing D-MEM medium to a cell density of 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL, then seeded at 200 ⁇ L per well in a 48-well plate and cultured overnight.
  • sample solution dissolved in 1% FBS-containing D-MEM medium (samples 1 to 3, see the following Table 3 for sample concentration) was added to each well and cultured for 24 hours. After completion of the culture, the medium was removed from each well, washed with 400 ⁇ L PBS ( ⁇ ), and cells were lysed using 150 ⁇ L M-PER (PIERCE).
  • Quantification of total glutathione was performed using 100 ⁇ L of these. That is, after adding 100 ⁇ L of cell extract dissolved in 96-well plate, 50 ⁇ L of 0.1 M phosphate buffer, 25 ⁇ L of 2 mM NADPH and 25 ⁇ L of glutathione reductase (final concentration 17.5 units / mL), the mixture was heated at 37 ° C. for 10 minutes. 25 ⁇ L of 10 mM 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) was added, and the absorbance at a wavelength of 412 nm until 5 minutes was measured to obtain ⁇ OD / min.
  • the total glutathione concentration was calculated based on a calibration curve prepared using oxidized glutathione (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After correcting the obtained value to the amount of glutathione per total protein amount, the glutathione production promotion rate (%) was calculated based on the following formula.
  • Glutathione production promotion rate (%) B / A ⁇ 100
  • A represents “the amount of glutathione per total protein in the cell when no sample is added (control)”
  • B represents “the amount of glutathione per total amount of protein in the cell when added to the sample”.
  • a licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid can effectively promote glutathione production in B16 melanoma cells. It was confirmed.
  • sample solution dissolved in CS-C serum-free medium (samples 1 to 3, refer to Table 4 below for the sample concentration) was added to each well and cultured for 24 hours. After completion of the culture, the medium was removed from each well, washed with 400 ⁇ L of PBS ( ⁇ ), and the cells were lysed using 250 ⁇ L of M-PER (manufactured by PIERCE).
  • Quantification of total glutathione was performed using 100 ⁇ L of these. That is, after adding 100 ⁇ L of cell extract dissolved in 96-well plate, 50 ⁇ L of 0.1 M phosphate buffer, 25 ⁇ L of 2 mM NADPH and 25 ⁇ L of glutathione reductase (final concentration 17.5 units / mL), the mixture was heated at 37 ° C. for 10 minutes. 25 ⁇ L of 10 mM 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) was added, and the absorbance at a wavelength of 412 nm until 5 minutes was measured to obtain ⁇ OD / min.
  • the total glutathione concentration was calculated based on a calibration curve prepared using oxidized glutathione (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After correcting the obtained value to the amount of glutathione per total protein amount, the glutathione production promotion rate (%) was calculated based on the following formula.
  • Glutathione production promotion rate (%) B / A ⁇ 100
  • A represents “the amount of glutathione per total protein in the cell when no sample is added (control)”
  • B represents “the amount of glutathione per total amount of protein in the cell when added to the sample”.
  • the licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid can promote the production of glutathione in hepatocytes. It was.
  • Test for promoting expression of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA in epidermal keratinocytes The licorice extract composition (samples 1 to 3) obtained as described above was used in epidermal keratinocytes as follows. ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA expression promoting effect was tested.
  • NHEK normal human epidermal keratinocytes
  • EpiLife-KG2 normal human epidermal keratinocyte long-term culture growth medium
  • the collected cells were diluted with EpiLife-KG2 so as to have a cell density of 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL, then seeded at 2.5 mL in a 35 mm petri dish, and cultured overnight.
  • RNA was prepared.
  • RNA was analyzed for the expression levels of ⁇ -glutamylcysteine synthetase and the internal standard GAPDH mRNA. Detection was performed by real-time 2 Step RT-PCR reaction using TaKaRa SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit (Perfect Real Time, code No. RR063A) using a real-time PCR device Smart Cycler (Cepheid). The expression level of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA was corrected with the value of the expression level of GAPDH mRNA in the same sample, and then the correction value of “when no sample was added” was set to 100. After calculating the correction value, the expression promotion rate (%) of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA was calculated based on the following formula.
  • mRNA expression promotion rate (%) B / A ⁇ 100
  • A represents “mRNA expression level when no sample is added (control)”
  • B represents “mRNA expression level when sample is added”. The results are shown in Table 5.
  • the licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid has the expression of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA in epidermal keratinocytes. It was confirmed that it can be effectively promoted.
  • Test for promoting ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA expression in skin fibroblasts The licorice extract composition (samples 1 to 3) obtained as described above was used in skin fibroblasts as follows. ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA expression promoting effect was tested.
  • N1RGB Human normal skin fibroblasts
  • ⁇ -MEM containing 10% FBS
  • the collected cells were diluted with ⁇ -MEM containing 10% FBS so as to have a cell density of 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL, then seeded at 2.5 mL in a 35 mm petri dish, and cultured overnight.
  • RNA was prepared.
  • RNA was analyzed for the expression levels of ⁇ -glutamylcysteine synthetase and the internal standard GAPDH mRNA. Detection was performed by real-time 2 Step RT-PCR reaction using TaKaRa SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit (Perfect Real Time, code No. RR063A) using a real-time PCR device Smart Cycler (Cepheid). The expression level of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA was corrected with the value of the expression level of GAPDH mRNA in the same sample, and then the correction value of “when no sample was added” was set to 100. After calculating the correction value, the expression promotion rate (%) of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA was calculated based on the following formula.
  • mRNA expression promotion rate (%) B / A ⁇ 100
  • A represents “mRNA expression level when no sample is added (control)”
  • B represents “mRNA expression level when sample is added”.
  • Test for promoting expression of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA in B16 melanoma cells The licorice extract composition (samples 1 to 3) obtained as described above was subjected to ⁇ - in B16 melanoma cells as follows. Glutamylcysteine synthetase mRNA expression promoting action was tested.
  • B16 melanoma cells were cultured using D-MEM medium containing 10% FBS, and then cells were collected by trypsin treatment. The collected cells were diluted with 10% FBS-containing D-MEM medium to a cell density of 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL, then seeded at a rate of 2.5 mL in a 35 mm dish and cultured overnight.
  • RNA was prepared.
  • RNA was analyzed for the expression levels of ⁇ -glutamylcysteine synthetase and the internal standard GAPDH mRNA. Detection was performed by real-time 2 Step RT-PCR reaction using TaKaRa SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit (Perfect Real Time, code No. RR063A) using a real-time PCR device Smart Cycler (Cepheid). The expression level of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA was corrected with the value of the expression level of GAPDH mRNA in the same sample, and then the correction value of “when no sample was added” was set to 100. After calculating the correction value, the expression promotion rate (%) of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA was calculated based on the following formula.
  • mRNA expression promotion rate (%) B / A ⁇ 100
  • A represents “mRNA expression level when no sample is added (control)”
  • B represents “mRNA expression level when sample is added”.
  • the licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid has an effect on the expression of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA in B16 melanoma cells. It was confirmed that it could be promoted automatically.
  • Test for promoting the expression of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA in hepatocytes The licorice extract composition (samples 1 to 3) obtained as described above was subjected to ⁇ -glutamylcysteine in hepatocytes as follows. The synthetase mRNA expression promoting effect was tested.
  • RNA was prepared.
  • RNA was analyzed for the expression levels of ⁇ -glutamylcysteine synthetase and the internal standard GAPDH mRNA. Detection was performed by real-time 2 Step RT-PCR reaction using TaKaRaPCRSYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time, code No. RR063A) using a real-time PCR device Smart Cycler (Cepheid). The expression level of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA was corrected with the value of the expression level of GAPDH mRNA in the same sample, and then the correction value of “when no sample was added” was set to 100. After calculating the correction value, the expression promotion rate (%) of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA was calculated based on the following formula.
  • mRNA expression promotion rate (%) B / A ⁇ 100
  • A represents “mRNA expression level when no sample is added (control)”
  • B represents “mRNA expression level when sample is added”.
  • the licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid effectively expressed ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA in hepatocytes. It was confirmed that it could be promoted.
  • the licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid has an excellent glutathione production promoting action. is doing. Further, as is apparent from Test Examples 5 to 8, the licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid is an excellent ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA. Has an expression promoting effect.
  • the licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid is a precursor of glutathione through the action of promoting expression of ⁇ -glutamylcysteine synthetase mRNA. It is presumed that the biosynthesis of ⁇ -glutamylcysteine is promoted, thereby promoting the production of glutathione in vivo.
  • Test fish average 1 kg cultured red sea bream (2) Test period: September to October (3) Number of test birds: 10/6000 (4) Dose: 20 mg-sample 1 / kg-fish weight (5) Administration method: 4 days feeding, 3 days resting (1 month) (6) Measurement date: 1 month after the start of the test
  • the amount of glutathione contained in the muscle tissue of the cultured fish was measured as follows.
  • the cultured red sea bream muscle (dorsal side) of the sample 1 administration group was homogenized in 5% 5-sulfosalicylic acid, centrifuged at 4 ° C., and the supernatant was used as a sample solution.
  • the reduced glutathione concentration was calculated based on a calibration curve prepared using a reduced glutathione standard. Further, as a control group, the reduced glutathione concentration in muscle (dorsal side) of cultured red sea bream cultured under the same conditions except that no sample 1 was given was calculated in the same manner. The results are shown in Table 9.
  • a licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid effectively increases the amount of glutathione in cultured red sea bream muscle. It was confirmed to have an action.
  • Test Example 10 Measurement of glutathione content in mouse skin Obtained in Production Example 1 after acclimating a 5-week-old female hairless mouse (purchased from Hoshino Test Animal Breeding) of the HR-1 / Hos system for 1 week
  • the licorice extract composition (sample 1) was mixed with a powder sample (Lab MR Stock, manufactured by Shimizu Experimental Materials Co., Ltd.), and the daily intake of licorice extract composition (sample 1) was 50 (mg / kg-mouse body weight). ) So that every day for three weeks.
  • the skin was collected, and the skin was solubilized in 100 ⁇ L of 1% Tritonx-100-containing PBS per 1 mg of collected skin using a Teflon homogenizer, and centrifuged at 4 ° C. (12000 rpm, 15 minutes) The supernatant was used as a measurement sample.
  • Total glutathione was quantified using 25 ⁇ L of the obtained measurement sample. Specifically, 25 ⁇ L of a measurement sample, 125 ⁇ L of 0.1 M phosphate buffer, 25 ⁇ L of 2 mM NADPH and 25 ⁇ L of glutathione reductase (final concentration: 17.5 units / mL) were added to a 96-well plate and heated at 37 ° C. for 10 minutes. 25 ⁇ L of 10 mM 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) was added, and the absorbance at a wavelength of 412 nm until 5 minutes was measured to obtain ⁇ OD / min.
  • the total glutathione concentration was calculated as a glutathione amount per skin weight from a value obtained by calculation based on a calibration curve prepared using oxidized glutathione (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Further, as a control group, the total glutathione concentration in the mouse skin was calculated in the same manner except that the licorice extract composition (sample 1) was not added to the powdered feed. The results are shown in Table 10.
  • a licorice extract composition containing liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritin and isoliquiritigenin and substantially free of glycyrrhizic acid effectively increases the amount of glutathione in mouse skin. It was confirmed to have
  • Licorice extract composition (Production Example 1) 1% by mass 75% by weight of fish meal 10% by weight of flour Starch 7% by mass 3% fish oil Minerals 2% by mass Vitamins 2% by mass
  • Licorice extract composition (Production Example 1) 30.0mg Whey mineral (containing 25-30% calcium) 100.0mg Vitamin K 2 (1% powder) 1.5mg Maltitol 156.0mg Glycerin fatty acid ester 12.5mg
  • composition Example 3 A tablet having the following composition was produced by a conventional method.
  • Licorice extract composition (Production Example 2) 15.0mg Dolomite (containing 20% calcium and 10% magnesium) 83.4mg Casein phosphopeptide 16.7mg Vitamin C 33.4mg Maltitol 126.8mg Collagen 12.7mg Sucrose fatty acid ester 12.0mg
  • the glutathione production promoter of the present invention is used for skin aging, spots, damage to oxidative stress caused by ultraviolet irradiation, diseases caused by deficiency of glutathione (for example, diseases caused by oxidative stress such as reactive oxygen species; hepatitis, liver dysfunction Liver diseases such as: chronic renal failure; idiopathic pulmonary fibrosis, respiratory diseases such as adult respiratory syndrome; cataract; ischemic heart disease; Parkinson's disease; Alzheimer's disease: gastrointestinal diseases such as gastric ulcer; Bone marrow dysplasia; acquired immune deficiency syndrome; latent viral infection, etc.), and sleep disorders such as insomnia due to lack of oxidized glutathione.
  • diseases caused by oxidative stress such as reactive oxygen species
  • hepatitis liver dysfunction
  • Liver diseases such as: chronic renal failure; idiopathic pulmonary fibrosis, respiratory diseases such as adult respiratory syndrome; cataract; ischemic heart disease; Parkinson's disease; Alzheimer's disease: gastrointestinal diseases such as gastric

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Abstract

　安全性の高い天然物の中からグルタチオン産生促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするグルタチオン産生促進剤及びグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を提供することを目的とし、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤に、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を有効成分として含有せしめる。

Description

グルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤、飲食品及び飼料
　本発明は、グルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤、飲食品及び飼料に関するものである。
　グルタチオンは、グルタミン酸、システイン、グリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。このグルタチオンは、細胞内においてラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、解毒機構への関与及び各種酵素のＳＨ供与体等としての役割を果たすことが知られている。
　このような役割を果たすグルタチオンの細胞内濃度が低下すると、紫外線曝露による細胞傷害、炎症、黒色化、シミ又はソバカスの生成、急性又は慢性アルコール肝障害、肝臓病、慢性腎不全、喫煙等が要因の肺疾患、特発性肺線維症、白内障、虚血性心疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、胃潰瘍、成人呼吸器障害症候群、免疫不全、骨髄形成不全、後天性免疫不全症候群、潜伏性ウイルス感染症、生理学的な加齢に伴う老化現象、及び癌化等の病状が引き起こされることが知られている。このようなグルタチオンの細胞内濃度の低下によって引き起こされる病状の治療には、従来、細胞内グルタチオン濃度の低下した細胞にグルタチオンを取り込ませることを目的として、グルタチオンを含有するグルタチオン製剤が用いられていた（特許文献１参照）。しかしながら、グルタチオン製剤の経口摂取による治療は、治療対象部位によっては思うような効果が期待できず、また、グルタチオン製剤の静脈注射による治療は、経口摂取による治療より効果は期待できるものの、痛みを伴うこと、通院が必要なこと等の問題を抱えていた。
　したがって、生体内細胞におけるグルタチオンの産生を促進することにより細胞内グルタチオン濃度を上昇させることができれば、加齢により衰える酸化ストレスに対する防御能を高めるとともに、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害を抑制することにつながり、皮膚の老化、シミ等の色素沈着症の予防、治療又は改善が期待できるとともに、グルタチオンの欠乏によって起こる各種臓器の機能低下や種々の疾患の予防又は治療が期待できると考えられる。このような考えに基づき、グルタチオン産生促進作用を有するものとして、ビルベリー抽出物及びウォルナット抽出物（特許文献２参照）、クチナシ属植物の抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
　また、生体内において、グルタチオンは、活性酸素種を除去する作用を有する還元型グルタチオン、及び還元型グルタチオンと活性酸素種との反応により生産される酸化型グルタチオンとして存在する。近年、この酸化型グルタチオンが、神経細胞の興奮を抑制し、睡眠を促進する睡眠促進物質であることが確認されている。そのため、グルタチオンの産生を促進し、還元型グルタチオンのみならず、酸化型グルタチオンの細胞内濃度をも上昇させることができれば、不眠症等の睡眠障害の予防、治療又は改善に有効であると考えられている。このような考えに基づき、従来、酸化型グルタチオンを有効成分とする催眠剤が知られている（特許文献４参照）。
　生体細胞においては、γ－グルタミルシステインシンテターゼの作用により、システインとグルタミン酸とが反応してγ－グルタミルシステインが生合成され、グルタチオンシンテターゼの作用により、γ－グルタミルシステインとグリシンとが反応してグルタチオンが生合成されることが知られている。そのため、グルタチオンの前駆体であるγ－グルタミルシステインを生合成するための触媒的役割を果たすγ－グルタミルシステインシンテターゼの発現を促進することで、生体細胞内グルタチオン濃度を上昇させることができると考えられる。
国際公開２００３／０３２９６６号パンフレット 特開２００６－２４１０６２号公報 特開２００６－３４７９３４号公報 特開平４－９３３６号公報
　本発明は、安全性の高い天然物の中からグルタチオン産生促進作用及びγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするグルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤、飲食品及び飼料を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明のグルタチオン産生促進剤及びグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を有効成分として含有することを特徴とする。
　また、本発明の飲食品及び飼料は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を配合したことを特徴とする。
　さらに、本発明のヒト又は動物の生体内細胞におけるグルタチオンの産生を促進する方法は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を含有するグルタチオン産生促進剤を、ヒト又は動物の所定部位に投与することを特徴とする。
　さらにまた、本発明のリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を製造する方法は、甘草エキスからグリチルリチン酸を実質的に除去することを特徴とする。
　なお、本発明において「グリチルリチン酸を実質的に含有しない」とは、甘草抽出組成物中のグリチルリチン酸含有率が、好ましくは１．０質量％以下であることを意味し、より好ましくは０．５質量％以下であることを意味する。
　また、本発明において「甘草エキス」とは、甘草を抽出原料として用いて得られた抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、又は当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物であって、グリチルリチン酸が実質的に除去されていないものを意味し、「甘草抽出組成物」とは、上記甘草エキスからグリチルリチン酸を実質的に除去し、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有するものを意味する。
　本発明によれば、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を有効成分として含有し、安全性に優れたグルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤、飲食品及び飼料を提供することができる。
　以下、本発明の実施形態について説明する。
〔グルタチオン産生促進剤，グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤〕
　本実施形態のグルタチオン産生促進剤及びグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物（以下、単に「甘草抽出組成物」という場合がある。）を有効成分として含有する。
　リクイリチン（liquiritin）、リクイリチゲニン（liquiritigenin）、イソリクイリチン（isoliquiritin）及びイソリクイリチゲニン（isoliquiritigenin）、を含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、植物の抽出処理に一般に用いられている方法によって得ることのできる甘草エキスからグリチルリチン酸を除去することで、得ることができる。
　抽出原料としての甘草には、Glychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza inflata、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza aspera、Glychyrrhiza eurycarpa、Glychyrrhiza pallidiflora、Glychyrrhiza yunnanensis、Glychyrrhiza lepidota、Glychyrrhiza echinata、Glychyrrhiza acanthocarpa等、様々な種類のものがあり、これらのうち、いずれの種類の甘草を抽出原料として使用してもよいが、特にGlychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza inflataを抽出原料として使用することが好ましい。
　抽出原料として使用し得る甘草の構成部位としては、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、花部等の地上部、根部、根茎部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは根部又は根茎部である。
　甘草エキスは、抽出原料としての甘草を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、植物の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
　抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
　抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、酸性化、アルカリ化、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、有機酸酸性水、アンモニアアルカリ水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
　抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１～５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２～５の多価アルコール等が挙げられる。
　２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１～９０容量部を混合するのが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１～４０容量部を混合するのが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０～９０容量部を混合するのが好ましい。
　抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５～１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
　以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物には、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンのフラボノイド類の他、グリチルリチン酸も含まれているため、これらの抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物（甘草エキス）からグリチルリチン酸を除去する。
　甘草エキスからグリチルリチン酸を除去するには、甘草エキスに８０～９５容量％のアルコール水溶液を加え、アルコール水溶液中に甘草からの抽出物を分散させ、濾紙で沈殿物を吸引濾過する。グリチルリチン酸は、水溶性であり、アルコールに難溶であるため、甘草エキスに含まれるグリチルリチン酸は、アルコール水溶液にほとんど溶解せず、沈殿物として除去される。一方、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンは、アルコールに可溶であるため、アルコール水溶液に容易に溶解する。
　分散媒として用いられるアルコールは、特に限定されるものではなく、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１～５の低級脂肪族アルコールを使用すればよい。
　得られた濾液から溶媒を留去した残渣に水を加え、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン－ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコールの順で溶出させる。そして、アルコールで溶出される画分として、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を得ることができる。
　カラムクロマトグラフィーにて溶出液として用いられるアルコールは、特に限定されるものではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１～５の低級脂肪族アルコール又はそれらの水溶液等が挙げられる。
　さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られたアルコール画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液－液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
　甘草エキスからグリチルリチン酸を除去し、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を得る方法としては、上述した方法以外にも、下記の方法が挙げられる。
　例えば、甘草エキスに鉱酸（例えば、硫酸、硝酸、塩酸等）を加えてｐＨを１．０～３．０程度に調整し、酸性析出（酸析）処理を行う。得られた酸析液を濾過して沈殿物を回収し、３０～９０容量％、好ましくは３０～７０容量％のアルコール水溶液（例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１～５の低級脂肪族アルコールの水溶液）を加えて、その後濾過する。
　このようにして得られた濾液にアンモニア水を加えて濾液のｐＨを３．０～５．０程度、好ましくは３．０～３．５程度に調整し、グリチルリチン酸を析出させ、固液分離する。得られた濾液画分に炭酸ナトリウムを加えて中和し、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン－ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコールの順で溶出させる。そして、アルコールで溶出される画分として、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含み、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を得ることができる。なお、カラムクロマトグラフィーにて溶出液として用いられるアルコールは、上述したものと同様のものが挙げられる。
　さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られたアルコール画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液－液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
　以上のようにして甘草エキスからグリチルリチン酸を除去することで、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を得ることができる。かかる甘草抽出組成物中のグリチルリチン酸含量は、１．０質量％以下であるのが好ましく、０．５質量％以下であるのがより好ましい。
　以上のようにして得られるリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、グルタチオン産生促進作用を有しているため、その作用を利用してグルタチオン産生促進剤の有効成分として使用することができる。なお、甘草抽出組成物は、γ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用も有しているため、その作用を利用してγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分としても使用することができる。
　また、上記甘草抽出組成物は、そのグルタチオン産生促進作用を通じて、グルタチオンの産生を促進することができるため、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）の予防・治療剤の有効成分としても使用することができる。
　さらに、上記甘草抽出組成物は、グルタチオン産生促進作用を有しており、その作用を利用して酸化型グルタチオンの細胞内濃度を上昇させることができるため、不眠症等の睡眠障害の予防、治療又は改善剤の有効成分としても使用することができる。
　本実施形態のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、上記甘草抽出組成物のみからなるものであってもよいし、上記甘草抽出組成物を製剤化したものであってもよい。
　上記甘草抽出組成物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を使用して、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を使用することができる。また、上記甘草抽出組成物は、他の組成物（例えば、飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
　なお、本実施形態のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、必要に応じて、グルタチオン産生促進作用を有する他の天然抽出物等を配合して有効成分として使用することができる。
　本実施形態のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤の投与方法としては、ヒト又は動物の所定の部位に投与すればよく、一般に経皮投与、経口投与、静脈投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよく、特に経皮投与又は経口投与により上記グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を投与するのが好ましい。
　また、本実施形態のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよく、疾患の種類や重症度等に応じて、本実施形態のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を有効量投与すればよい。
　本実施形態のグルタチオン産生促進剤は、上記甘草抽出組成物が有するグルタチオン産生促進作用を通じて、加齢により衰える酸化ストレスに対する防御能を高めるとともに、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害を抑制することができ、皮膚の老化、シミ等の色素沈着症や、グルタチオンの欠乏によって起こる各種臓器の機能低下等による種々の疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本実施形態のグルタチオン産生促進剤は、これらの用途以外にもグルタチオン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
　後述する実施例において示されるように、特に上記甘草抽出組成物は、表皮角化細胞及び皮膚線維芽細胞におけるグルタチオンの産生を効果的に促進することができるため、上記甘草抽出組成物を含有するグルタチオン産生促進剤によれば、表皮角化細胞又は皮膚線維芽細胞内で活性酸素種を消去することができ、表皮角化細胞又は皮膚線維芽細胞を酸化的ストレスによる傷害等から保護することができ、結果として、皮膚の老化等を効果的に防止することができる。
　また、グルタチオンがチロシナーゼの成熟化を抑制する作用を有していることから、グルタチオンの産生を促進することによってチロシナーゼの成熟化をより抑制することができ、メラノサイトにおけるメラニンの生成を抑制することができる。そのため、上記甘草抽出組成物を含有するグルタチオン産生促進剤によれば、メラノサイトにおけるグルタチオンの産生を効果的に促進し、チロシナーゼの成熟化をより抑制することができるため、結果として、皮膚色素沈着症、皮膚の黒化、シミ、ソバカス等を予防することができる。
　さらに、上記甘草抽出組成物は、肝細胞におけるグルタチオンの産生を効果的に促進することができるため、上記甘草抽出組成物を含有するグルタチオン産生促進剤は、グルタチオンの欠乏に起因する肝臓疾患を効果的に予防・治療することができる。
　なお、上記甘草抽出組成物をγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進剤に含有せしめることで、上記甘草抽出組成物が有するγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、グルタチオンの前駆体であるγ－グルタミルシステインの生合成を促進することができる。
　本実施形態のグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、上記甘草抽出組成物が有するグルタチオン産生促進作用を通じて、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）を予防・治療することができるとともに、酸化型グルタチオンの細胞内濃度を上昇させることができるため、不眠症等の睡眠障害を予防、治療又は改善することができる。
〔飲食品，飼料〕
　本実施形態の飲食品又は飼料は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を配合したものである。
　上記甘草抽出組成物は、グルタチオン産生促進作用を有しており、ヒト、動物、魚類等の消化管で消化されるようなものではないことが確認されており、また安全性に優れているため、一般食品、健康食品、保健機能食品若しくは栄養補助食品等の任意の飲食品、又は家禽、家畜等の動物用飼料若しくは養殖魚等の魚類用飼料、キャットフード、ドッグフード等のペットフード等の飼料に配合するのに好適である。この場合、上記甘草抽出組成物をそのまま飲食品又は飼料に配合してもよいし、上記甘草抽出組成物により製剤化したグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を飲食品又は飼料に配合してもよい。
　上記甘草抽出組成物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を飲食品に配合する場合、それにおける有効成分の配合量は、使用目的、性別、症状等を考慮して適宜調整することができるが、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して成人１日あたりの抽出物摂取量が約１～１０００ｍｇになるようにするのが好ましい。
　上記甘草抽出組成物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を飼料に配合する場合の配合割合は、対象生物（家禽、家畜、養殖魚、犬・猫等のペット動物等）やその体重、使用目的等を考慮して適宜調整することができるが、添加対象飼料の一般的な摂取量を考慮して、０．０００１～２０．０質量％であるのが好ましく、０．０１～２．０質量％であるのが好ましい。
　上記甘草抽出組成物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を配合し得る飲食品は、上記甘草抽出組成物の有するグルタチオン産生促進作用を妨げない限り、特に限定されるものではない。
　具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などに上記甘草抽出組成物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を配合することができ、このとき、通常用いられる補助的な原料や添加物を併用することができる。
　以下、製造例、試験例及び配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
〔製造例１〕
　甘草（Glycyrrhiza glabra）の根茎を粗砕したチップ状物１０ｋｇに１０Ｌの水を加え、ゆるく攪拌しながら抽出し、デカンテーションで固液分離して抽出液を得た。得られた抽出液をペースト状になるまで減圧濃縮した後、７０容量％エタノール水溶液を得られた濃縮物の１０倍量加え、攪拌機を用いて分散させた。分散液を５℃にて一夜保管し、生じた沈殿を濾紙で吸引濾過して除去し、濾液のエタノール水溶液を減圧下で留去した。
　このようにして得られた残渣に水を加えて固形分を５％とし、多孔性合成吸着樹脂（ダイアイオンＨＰ－２０，三菱化学社製）１０Ｌを充填したカラムにＳＶ＝１で通液した。カラムを５０Ｌの水で洗浄した後、８０容量％エタノール水溶液５０Ｌをさらに通液し、フラボノイド類を溶離させた。溶離液を集めて減圧蒸留してエタノール水溶液を留去したのち、蒸留残渣を４０℃で真空乾燥し、粉砕することで、３４５ｇの黄褐色粉末を得た（試料１）。
　得られた粉末を下記の条件にて高速液体クロマトグラフ法で分析した結果、グリチルリチン酸含量０．５質量％、リクイリチン含量４．２質量％、イソリクイリチン含量３．６質量％、リクイリチゲニン含量２．５質量％、イソリクイリチゲニン含量１．５質量％であった。
＜液体クロマトグラフィー条件＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ　ＧＳ－３１０（日本分析工業社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：５００ｍｍ
移動相流量：５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
〔製造例２〕
　甘草（Glycyrrhiza uralensis）の根茎を粗砕したチップ状物１０ｋｇに１０Ｌの３％アンモニア水を加える以外は実施例１と同様にして処理し、黄褐色粉末４１０ｇを得た（試料２）。得られた粉末を実施例１と同様にして高速液体クロマトグラフ法で分析した結果、グリチルリチン酸含量０．９質量％、リクイリチン含量５．５質量％、イソリクイリチン含量４．６質量％、リクイリチゲニン含量３．９質量％、イソリクイリチゲニン含量３．５質量％であった。
〔製造例３〕
　甘草(Glycyrrhiza inflata)の根茎を粗砕したチップ状物１０ｋｇに１０Ｌの水を加え、ゆるく攪拌しながら抽出し、デカンテーションで固液分離して抽出液を得た。得られた抽出液を攪拌しながら、５０％硫酸を加えて抽出液のｐＨを２に調整し、酸性析出処理を行い、ろ過により沈殿物を集めた。得られた沈殿物に水を加え、攪拌して分散させ、静置後上澄みをデカンテーションで除去した。この操作を繰り返して硫酸を除去した後、濾過を行って沈殿物を得た。
　このようにして得られた沈殿物に９０容量％エタノール５Ｌを加え、常温で１時間攪拌分散させ、珪藻土を用いて吸引濾過した。得られた濾液にアンモニア水を加えて濾液のｐＨを５に調整し、５℃で２日間静置してグリチルリチン酸を析出させた後、遠心分離により固液分離を行った。濾液画分のエタノールを減圧蒸留して除去し、蒸留残渣に炭酸ナトリウムを加えて中和した。
　このようにして得られた中和液を、多孔性合成吸着樹脂（ダイアイオンＨＰ－２０，三菱化学社製）５Ｌを充填したカラムにＳＶ＝１で通液した。カラムを２５Ｌの水で洗浄したのち、９０容量％エタノール水溶液２５Ｌをさらに通液しフラボノイド類を溶離させた。溶離液を集めて減圧蒸留にかけてエタノール水溶液を留去したのち、蒸留残渣を４０℃で真空乾燥して粉砕し、２９３ｇの黄褐色粉末を得た（試料３）。
　得られた粉末を実施例１と同様にして高速液体クロマトグラフ法で分析した結果、グリチルリチン酸含量０．８質量％、リクイリチン含量３．５質量％、イソリクイリチン含量２．８質量％、リクイリチゲニン含量２．５質量％、イソリクイリチゲニン含量１．８質量％であった。
〔試験例１〕表皮角化細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
　上記のようにして得られた甘草抽出組成物（試料１～３）について、以下のようにして表皮角化細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
　正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte：ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにEpiLife-KG2で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
　培養後、EpiLife-KG2で溶解した試料溶液（試料１～３，試料濃度は下記表１を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(－)にて洗浄後、１５０μＬのＭ－ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用して細胞を溶解した。
　このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
　グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
　式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、表皮角化細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
〔試験例２〕皮膚線維芽細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
　上記のようにして得られた甘草抽出組成物（試料１～３）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
　ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭで希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
　培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１～３，試料濃度は下記表２を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(－)にて洗浄後、１５０μＬのＭ－ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。
　このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
　グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
　式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
　結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、皮膚線維芽細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
〔試験例３〕Ｂ１６メラノーマ細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
　上記のようにして得られた甘草抽出組成物（試料１～３）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
　Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
　培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地で溶解した試料溶液（試料１～３，試料濃度は下記表３を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(－)にて洗浄後、１５０μＬのＭ－ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用して細胞を溶解した。
　このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
　グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
　式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
　結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、Ｂ１６メラノーマ細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
〔試験例４〕肝細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
　上記のようにして得られた甘草抽出組成物（試料１～３）について、以下のようにして肝細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
　正常ヒト肝細胞（Cell System-Hc Cells，セルシステムズ社）を、ＣＳ－Ｃ無血清培地（セルシステムズ社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＣＳ－Ｃ無血清培地で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェルあたり４００μＬずつ播種し、一晩培養した。
　培養後、ＣＳ－Ｃ無血清培地で溶解した試料溶液（試料１～３，試料濃度は下記表４を参照）を各ウェルに４００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(－)にて洗浄後、２５０μＬのＭ－ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。
　このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
　グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
　式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
　結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、肝細胞においてグルタチオンの産生を促進し得ることが確認された。
〔試験例５〕表皮角化細胞におけるγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
　上記のようにして得られた甘草抽出組成物（試料１～３）について、以下のようにして表皮角化細胞におけるγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
　正常ヒト新生児表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte：ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養増殖培地（EpiLife-KG2）を用いた培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにEpiLife-KG2で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
　培養後、EpiLife-KG2で溶解した試料溶液（試料１～３，試料濃度は下記表５を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
　この総ＲＮＡを鋳型とし、γ－グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。γ－グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ－グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
　ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
　式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
　結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、表皮角化細胞においてγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
〔試験例６〕皮膚線維芽細胞におけるγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
　上記のようにして得られた甘草抽出組成物（試料１～３）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞におけるγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
　ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭで希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
　培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１～３，試料濃度は下記表６を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
　この総ＲＮＡを鋳型とし、γ－グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。γ－グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ－グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
　ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
　式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
　結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、皮膚線維芽細胞においてγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
〔試験例７〕Ｂ１６メラノーマ細胞におけるγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
　上記のようにして得られた甘草抽出組成物（試料１～３）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞におけるγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
　Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
　培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地で溶解した試料溶液（試料１～３，試料濃度は下記表７を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、１００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
　この総ＲＮＡを鋳型とし、γ－グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。γ－グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ－グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
　ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
　式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
　結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、Ｂ１６メラノーマ細胞においてγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
〔試験例８〕肝細胞におけるγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
　上記のようにして得られた甘草抽出組成物（試料１～３）について、以下のようにして肝細胞におけるγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
　正常ヒト肝細胞（Cell System-Hc Cells，セルシステムズ社）を、ＣＳ－Ｃ無血清培地（セルシステムズ社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＣＳ－Ｃ無血清培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
　培養後、ＣＳ－Ｃ無血清培地で溶解した試料溶液（試料１～３，試料濃度は下記表８を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
　この総ＲＮＡを鋳型とし、γ－グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。γ－グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ－グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
　ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
　式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
　結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、肝細胞においてγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
　上述した試験例１～４から明らかなように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、優れたグルタチオン産生促進作用を有している。また、試験例５～８から明らかなように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、優れたγ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を有している。このことから、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、γ－グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、グルタチオンの前駆体であるγ－グルタミルシステインの生合成を促進し、それにより生体内でのグルタチオンの産生を促進しているものと推察される。
〔試験例９〕養殖魚の含有グルタチオン量の測定
　製造例１で得られた甘草抽出組成物（試料１）を養殖用飼料として用いて、下記条件で養殖した養殖魚の筋組織中に含まれるグルタチオン量を測定した。
（１）供試魚：平均１ｋｇの養殖マダイ
（２）試験時期：９～１０月
（３）試験尾数：１０／６０００(放尾数)
（４）投与量：２０ｍｇ－試料１／ｋｇ－魚体重
（５）投与方法：４日給餌，３日休餌（１ヶ月）
（６）測定日：試験開始１ヶ月後
　養殖魚の筋組織中に含まれるグルタチオン量は、下記のようにして測定した。
　試料１投与群の養殖マダイの筋肉（背側）を５％５－スルホサリチル酸中でホモジナイズし、４℃にて遠心分離後、上清を試料溶液とした。９６ｗｅｌｌプレートに試料溶液２５μＬ及び０．１Ｍのリン酸緩衝液１２５μＬを加えた後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後の波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。還元型グルタチオン濃度は、還元型グルタチオン標準品を用いて作成した検量線をもとに算出した。また、コントロール群として、試料１を与えない以外は同様の条件で養殖した養殖マダイの筋肉（背側）中の還元型グルタチオン濃度を同様にして算出した。
　結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、養殖マダイの筋肉中のグルタチオン量を効果的に増加させる作用を有することが確認された。
〔試験例１０〕マウス皮膚中のグルタチオン量の測定
　ＨＲ－１／Ｈｏｓ系の５週齢の雌性ヘアレスマウス（星野試験動物飼育所より購入）を１週間馴化した後、製造例１で得られた甘草抽出組成物（試料１）を粉末試料（ラボＭＲストック，清水実験材料社製）に混餌し、甘草抽出組成物（試料１）の１日あたりの摂取量が５０（ｍｇ／ｋｇ－マウス体重）となるように、３週間毎日給餌した。給餌終了後、皮膚を採取し、テフロンホモジェナイザーを用いて、採取した皮膚１ｍｇあたり１００μＬの１％Ｔｒｉｔｏｎｘ－１００含有ＰＢＳ中で皮膚を可溶化し、４℃にて遠心分離（１２０００ｒｐｍ，１５分間）した後、上清を測定試料とした。
　得られた測定試料のうちの２５μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに測定試料２５μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液１２５μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度：１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を用いて作成した検量線をもとに算出して得られた値から、皮膚重量あたりのグルタチオン量として算出した。また、コントロール群として、粉末飼料に甘草抽出組成物（試料１）を添加しない以外は同様にしてマウスの皮膚中の総グルタチオン濃度を算出した。
　結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物は、マウスの皮膚中のグルタチオン量を効果的に増加させる作用を有することが確認された。
〔配合例１〕
　常法により、以下の組成を有する配合飼料を製造した。
　甘草抽出組成物（製造例１）　　　　　　　　　　　　　　　　　１質量％
　魚粉　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５質量％
　小麦粉　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０質量％
　でん粉　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７質量％
　魚油　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３質量％
　ミネラル類　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２質量％
　ビタミン類　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２質量％
〔配合例２〕
　常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
　甘草抽出組成物（製造例１）　　　　　　　　　　　　　　　　３０．０ｍｇ
　乳清ミネラル（カルシウム２５～３０％含有）　　　　　　　１００．０ｍｇ
　ビタミンＫ２（１％含有粉末）　　　　　　　　　　　　　　　　１．５ｍｇ
　マルチトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５６．０ｍｇ
　グリセリン脂肪酸エステル　　　　　　　　　　　　　　　　　１２．５ｍｇ
〔配合例３〕
　常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
　甘草抽出組成物（製造例２）　　　　　　　　　　　　　　　　１５．０ｍｇ
　ドロマイト（カルシウム２０％、マグネシウム１０％含有）　　８３．４ｍｇ
　カゼインホスホペプチド　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６．７ｍｇ
　ビタミンＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３３．４ｍｇ
　マルチトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２６．８ｍｇ
　コラーゲン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２．７ｍｇ
　ショ糖脂肪酸エステル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２．０ｍｇ
〔配合例４〕
　常法により、以下の組成を有するカプセル剤を製造した。なお、カプセルとしては、１号ハードゼラチンカプセルを使用した。
＜１カプセル（１錠２００ｍｇ）中の組成＞
　甘草抽出組成物（製造例２）　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０ｍｇ
　コーンスターチ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０．０ｍｇ
　乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０ｍｇ
　乳酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０ｍｇ
　ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ－Ｌ）　　　　　　　　１０．０ｍｇ
〔配合例５〕
　常法により、以下の組成を有する経口液状製剤を製造した。
＜１アンプル（１本１００ｍＬ）中の組成＞
　甘草抽出組成物（製造例３）　　　　　　　　　　　　　　　　０．４質量％
　ソルビット　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２．０質量％
　安息香酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１質量％
　香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０質量％
　硫酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５質量％
　精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部
　本発明のグルタチオン産生促進剤は、皮膚の老化、シミ、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）、酸化型グルタチオンの欠乏に起因する不眠症等の睡眠障害等の予防、治療又は改善に大きく貢献できる。

Claims (6)

  1. 　リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を有効成分として含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤。
  2. 　リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を有効成分として含有することを特徴とするグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤。
  3. 　リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を配合したことを特徴とする飲食品。
  4. 　リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を配合したことを特徴とする飼料。
  5. 　リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を含有するグルタチオン産生促進剤を、ヒト又は動物の所定部位に投与することを特徴とするヒト又は動物の生体内細胞におけるグルタチオンの産生を促進する方法。
  6. 　リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン及びイソリクイリチゲニンを含有し、グリチルリチン酸を実質的に含有しない甘草抽出組成物を製造する方法であって、
    　甘草エキスからグリチルリチン酸を実質的に除去することを特徴とする製造方法。
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