JP6993315B2 - ピラノベンゾピランを基本骨格とする化合物 - Google Patents
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キンミズヒキの抽出物は、アレルゲン不活化剤としての利用(特許文献1)、抗男性ホルモン剤および乳頭細胞増殖促進剤(特許文献2)、美白及び抗老化剤、並びに皮膚化粧料(特許文献3)、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤(特許文献4)、β-グルクロニダーゼ阻害剤(特許文献5)、中性エンドペプチダーゼ阻害剤(特許文献6)など、様々な医薬用途が提案されている。
しかし、上記に例示した先行技術にあっては、いずれも、その活性物質が何であるか特定していない。
本発明は、新規化合物を提供することを課題とする。
(1)化学式1で表される化合物。
したがって、本発明の化合物は、記憶に関わる神経系の活性化に有用であり、さらに神経系活性研究の試薬として利用できる。また記憶や神経活性化剤を得るための化学合成医薬品の出発物質、あるいは研究用試薬として利用できる。さらには、本発明の化合物を含有する飲食品や医薬品として利用することができる。
上記の操作で得られた粗抽出液から、不溶性残渣を濾過若しくは遠心分離により取り除いた抽出液、あるいは植物の搾汁液からの各化合物の精製は、公知の生薬の分離精製方法であればどのようなものでも良い。通常は、二相溶媒分配法、向流分配法、カラムクロマトグラフィー法、分取用高速液体クロマトグラフィー法等を単独又は組み合わせて用いることが好ましい。
例えば二相溶媒分配法としては、前記の抽出液からn-ヘキサン、クロロホルム、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸メチル等の溶媒と水との分配により、溶媒相へ目的化合物を回収する方法等があげられる。カラムクロマトグラフィー法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィー法、担体として順相系、又は逆相系シリカゲルを用いる方法、ダイヤイオンHP-20等を用いる吸着カラムクロマトグラフィー法、担体としてセファデックスLH-20等の修飾デキストランゲルを用いるゲルろ過法等があげられる。これらを単独若しくは組み合わせて、また、反復して実施する。分取用高速液体クロマトグラフィー法としては、オクタデシルシリカ等を用いる逆相系のカラムを用いる方法、シリカゲル等を用いる順相系のカラムを用いる方法等があげられる。
賦形剤としては、単糖類、二糖類、多糖類、無機塩、油脂、蒸留水などの製剤として一般に使用可能なものであればいずれも用いることができる。製剤化する際には、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤等の添加剤を用いることもできる。
(1)抽出・濃縮操作
株式会社栃本天海堂が販売する乾燥キンミズヒキ(Agrimonia pilosa var. japonica、商品名:センカクソウ)をブレンダ―を用いて粉砕した。粉砕物500gを99.5%エタノール-溶液5,000mLに常温で72時間、浸漬して抽出操作を行った。
得られた抽出液を吸引濾過後、濾液を減圧濃縮し、粗抽出物を15g得た。
この粗抽出物の全量を90%メタノール-水混合溶液に溶解し、ついで等量のヘキサンを用いて分液ロート中で3回振盪して脱脂した。
脱脂終了後、90%メタノール-水層を減圧濃縮し、濃縮物を7.5g得た。そのうち1.5gをあらかじめ、水、メタノールにてコンディショニングした固相抽出カートリッヂ(phenomenex社製, StrataC18-E, 55mm, 70A, 50g/150mL)に吸着させ、次いで40%メタノール-水溶液500mLでカラムを洗浄した。洗浄後、60~70%メタノール-水溶液にて溶出した。溶出液を回収し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、390mgの溶出物を得た。
回収した濃縮液全量を用いて、分取用高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により化合物の単離精製を行った。
移動相 A液0.1%ギ酸水溶液(20): B液アセトニトリル(80)
流速 20mL/min
カラム YMC-Triart C18 20×250mm 粒子径5μm(株式会社ワイエムシイ)
カラム温度 室温
検出 UV280nm
溶出時間10分以降に出現した5つのピークを分取し、溶出順にそれぞれをピーク1、ピーク2、ピーク3、ピーク4、ピーク5とした。この分取液を減圧濃縮し、乾固させて回収した。
[分取HPLCの条件2]
移動相 A液0.1%ギ酸水溶液(30): B液アセトニトリル(70)
流速 5mL/min
カラム CapcellpakC18 UG-120 10×150mm 粒子径5μm(大阪ソーダ株式会社)
カラム温度 40℃
検出 UV280nm
回収した最終乾固物の質量は次のとおりである。
ピーク1 8.52 mg
ピーク2 10.63 mg
ピーク3 15.27 mg
ピーク4 10.72 mg
ピーク5 15.50 mg
回収した最終乾固物を高分解能ESI-TOFMS(飛行時間型質量分析装置)、1H-NMR、13C-NMRおよびCOSYスペクトル、HMQCスペクトル、HMBCスペクトルを測定して各ピークの化合物構造を決定した。
ピーク1(KM1)
TOF-MSデータ
m/z 475.1961[M+H]+, C25H30O9(474.1890)
1H-NMR
4”:0.99ppm(d、J=7.4Hz) 2’Me:1.14ppm(d、J=6.8Hz) 3’:1.16ppm(d、J=6.8Hz) 15:1.27ppm(s) 3”:1.68ppm(tq、J=7.4Hz、J=7.4Hz) 14:2.16ppm(s) 11:2.24ppm(s) 3:2.48ppm(s) 5:2.86ppm(s) 2”:2.93ppm(t、J=7.4Hz) 12:3.75ppm(s) 2’:3.78ppm(m)
13C-NMR
11:9.3ppm 4”:14.6ppm 3’:20.1ppm 15:20.3ppm 2’Me:20.3ppm 3”:20.9ppm 14:24.0ppm 5:27.8ppm 2”:39.4ppm 2’:41.0ppm 4a:43.1ppm 3:62.3ppm 12:63.7ppm 1a:103.0ppm 5a:106.5ppm 7:112.0ppm 9:112.5ppm 9a:154.8ppm 8:161.0ppm 6:161.9ppm 2:162.5ppm 1”:201.5ppm 4:202.6ppm 13:203.6ppm 1’:213.2ppm
TOF-MSデータ
m/z 475.1985[M+H]+, C25H30O9(474.1890)
1H-NMR
4’:0.97ppm(t、J=7.2Hz) 4”:0.98ppm(t、J=7.2Hz) 15:1.26ppm(s) 3”:1.68ppm 3’:1.71ppm(m) 14:2.15ppm(s) 11:2.24ppm(s) 5:2.86pm(s) 2”:2.92(m) 2’:3.09ppm(dt、J=1.9Hz、J=7.2Hz) 12:3.77ppm(s)
13C-NMR
11:9.4ppm 4’:14.6ppm 4”14.6ppm 3’:19.5ppm 15:20.8ppm 3”:21.0ppm 14:24.0ppm 5:27.7ppm 2”39.8ppm 4a:43.1ppm 2’:46.5ppm 3:62.3ppm 12:63.1ppm 1a:103.0ppm 5a:106.4ppm 7:112.3ppm 9:112.4ppm 9a:155.2ppm 8:161.7ppm 2:162.5ppm 6:162.6ppm 1”:201.8ppm 4:203.1ppm 1’:208.7ppm
TOF-MSデータ
m/z 489.2128[M+H]+, C26H32O9(488.2046)
1H-NMR
3”Me:0.96ppm(t、J=7.3Hz) 4”:0.97ppm(t、J=7.3Hz) 2’Me:1.14ppm(d、J=6.6Hz) 3’:1.15ppm(d、J=6.8Hz) 15:1.27ppm(s) 3”:1.70ppm(m) 14:2.16ppm(s) 11:2.24ppm(s) 5:2.87ppm(s) 2”:3.08ppm(m) 12:3.75ppm(m) 2’:3.78ppm(m)
13C-NMR
11:9.3ppm 4”:14.7ppm 3”Me:14.7ppm 3’:20.1ppm 2’Me:20.3ppm 15:20.9ppm 14:24.1ppm 5:27.8ppm 3”:28.8ppm 2’:41.0ppm 4a:43.4ppm 3:62.3ppm 12:63.7ppm 1a:102.9ppm 5a:105.9ppm 9:112.5ppm 7:112.0ppm 9:112.5ppm 9a:155.0ppm 8:161.7ppm 2:162.5ppm 6:162.6ppm 4:202.5ppm 13:203.7ppm 1”:208.7ppm 1’:213.1ppm
TOF-MSデータ
m/z 475.2133[M+H]+, C26H32O9(488.2046)
1H-NMR
4”:0.84ppm(t、J=7.2Hz) 4’:0.97ppm(t、J=7.2Hz) 5”:1.11ppm(d、J=7.1Hz) 15:1.28ppm(s) 3”:1.69ppm(m) 3’:1.71(tq、J=7.2Hz、J=7.2Hz) 14:2.17ppm(s) 11:2.23ppm(s) 3:2.48ppm(s) 5:2.87ppm(s) 2’:3.09ppm(d、J=1.9Hz、J=7.2Hz) 12:3.76ppm(s) 2”:3.77ppm(m)
13C-NMR
11:9.4ppm 4”:12.5ppm 4’:14.6ppm 5”: 17.2ppm 3’:19.5ppm 15:20.8ppm 14:24.0ppm 5:27.7ppm 3”:28.7ppm 2”:41.9ppm 4a:43.1ppm 2’:46.5ppm 3:62.3ppm 12:63.1ppm 1a:102.9ppm 5a:106.2ppm 7:112.3ppm 9:112.4ppm 9a:155.2ppm 8:161.7ppm 2:162.5ppm 6:162.6ppm 4:202.9ppm 13:203.5ppm 1”:205.7ppm 1’:208.7ppm
TOF-MSデータ
m/z 503.22723[M+H]+, C27H34O9(502.2203)
1H-NMR
4”:0.83ppm(t、J=7.3Hz) 4’:0.90ppm(t、J=7.4Hz) 2’Me:1.15ppm(d、J=6.9Hz) 2”Me:1.20ppm(d、J=6.7Hz) 15:1.27ppm(s) 3”:1.69ppm(m) 3’:1.78ppm(m) 14:2.16ppm(s) 11:2.24ppm(s) 3:2.48ppm(s) 5:2.87ppm(s) 2’:3.68ppm(m) 2”:3.75ppm(m) 12:3.76ppm(s)
13C-NMR
11:9.4ppm 4’:12.7ppm 4”12.7ppm 2”Me:17.6ppm 2’Me:17.8ppm 15:20.8ppm 14:24.1ppm 5:27.8ppm 3’:28.8ppm 3”:28.9ppm 2”:41.8ppm 4a:43.1ppm 2’:47.7ppm 3:62.3ppm 12:63.7ppm 1a:102.9ppm 5a:106.2ppm 7:112.5ppm 9:112.6ppm 9a:155.0ppm 8:161.2ppm 6:162.0ppm 2:162.5ppm 4:202.9ppm 13:203.6ppm 1”:205.0ppm 1’:213.1ppm
上記の新規化合物のうち、ピーク1~4の化合物を用いて神経細胞活性化試験を実施した。
なお、以下の試験において、ピーク1~4は、それぞれKM1~4の試験試料名称で実施した。
したがって以下の試験結果はピーク1~4と読みかえることができる。
(1)リン酸化ERK(pERK)の増加作用確認試験(ウエスタンブロット試験)
KM1~4の化合物による、神経活性化の基点となる分裂促進因子(ERK)のリン酸化増強作用を試験した。
妊娠17日目のSDラット(日本エスエルシー)から胎仔を取り出し、大脳皮質と海馬を単離した。この大脳皮質と海馬から、神経細胞分散液キット(住友ベークライト)を用いて添付の説明書に従い、初代神経細胞を調製した。調製したラット初代神経細胞を2% B27(Gibco)、0.5mM L-グルタミン(Gibco)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma Aldrich)を含むニューロベイサル培地(Gibco)で4×105 cells/mLの細胞密度になるように分散させて懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、ポリ-L-リジンコートした48ウエルプレート(住友ベークライト)に350μLずつ播種し、37℃、5% CO2雰囲気下で培養した。
培養7日目に、予めジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解したKM 1~4 、およびキンミズヒキエタノール抽出物を、それぞれ終濃度が1~10μg/mL, 50μg/mLとなるように添加し、さらに20分培養後に上清を除去した。
次いでPBS(Gibco)で細胞を洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤、フォスファターゼ阻害剤(Roche Diagnostics)を加えたRIPA溶液(50mM Tris-HCl (pH8.0)、150mM NaCl、0.1% SDS、0.5%デオキシコルチコステロン(DOC)、1% NP-40)150μLを加え細胞抽出液を調製した。そしてBCA assay kit(Pierce Chemical)で細胞抽出液のタンパク質定量を行った。
調製した細胞抽出液に4倍希釈 Laemmli sample溶液(Bio-rad)と終濃度50mMになるようジチオトレイトール(DTT:和光純薬工業)を加え、95℃、5分加熱し、電気泳動用のサンプルを調製した。
電気泳動は、1レーンあたり1.2μgのタンパク質量に相当するサンプル量をCriterion(商標) TGX(商標) プレキャストゲル(4-20%:26レーン、Bio-rad)にロードし、電気泳動を行い、終了後、トランスブロットTurboミディPVDF転写パック(Bio-rad)を用いて1A、25 V、30分の条件で転写反応を行った。
転写させたメンブレンをBlocking One(ナカライテスク)に浸し、室温で1時間振盪させながらブロッキングした。次いで、Canget Signal Solution 1(東洋紡)で1/1000倍に希釈した抗p44/42 MAPK (Erk1/2) (L34F12) 抗体(Cell Signaling Technology)に浸し、4℃で振盪させながら一晩反応させた。反応終了後TBS-T溶液で3回洗浄し、10% Blocking One -TBS溶液で1/10000倍に希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(Invitrogen)で浸し、室温で振盪させながら1時間反応させた。反応終了後TBS-T溶液で3回洗浄し、次いでECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare)で5分反応させ発光量をChemiDoc(Bio-rad)にて測定した。
測定したメンブレンはTBS-Tで洗浄後、リプロービングバッファー(2% SDS, 100mM 3-Mercapto-1,2-propanediol, 62.5mM Tris-HCl, pH6.7)に浸し、60℃で30分浸透させた。TBS-Tで再度洗浄後、Blocking One(ナカライテスク)に浸し、室温で1時間振盪させながらブロッキングした。ブロッキング終了後、Canget Signal Solution 1(東洋紡)で1/3000倍に希釈した抗phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) (197G2)抗体(Cell Signaling Technology)に浸し、4℃で振盪させながら一晩反応させた。
次いでメンブレンをTBS-T溶液で3回洗浄した後、10% Blocking One -TBS溶液で1/10000倍に希釈したHRP標識抗ラビットIgG抗体(Invitrogen)で浸し、室温で振盪させながら1時間反応させた。次いでメンブレンをTBS-T溶液で3回洗浄した後、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare)で5分反応させ、ウエスタンブロッティングバンドの発光量をChemiDoc(Bio-rad)にて測定した。
得られたウエスタンブロッティングのバンドの発光量(強度)をImage lab software(biorad)ソフトを使用して測定し、発光強度を元に相対的リン酸化度を算出した。
試験結果を図2に示す。図上段はウエスタンブロッティングのバンドの発光像、下段はERKに対するリン酸化ERKの発光強度比(%)のグラフである。KM1~4はいずれも濃度依存的に、ラット初代神経系培養細胞におけるリン酸化ERKが増加していた。
1)試験方法
上記「pERKの増加作用確認試験」に記載の方法と同様に、ラット初代神経細胞を調製し、7日間培養した。
KM 1~4 、およびキンミズヒキエタノール抽出物を、それぞれ終濃度が1~10μg/mL、50μg/mLとなるように培養液に添加し1時間培養した後、RNeasy Mini kit(QIAGEN)を用い、添付の説明書に従ってRNAを調製した。
調製した100ngのRNAを用いて、PrimeScript RT reagent kit(タカラバイオ)を使用し、添付の説明書に従いcDNAを作製した。
特許文献7の結果から最初期遺伝子としてc-fos,及びArcを選定した。
c-fos及びArcの発現量は、1μL cDNA、ラットc-fos, Arc taq man probe(TaqMan Gene expression assays: Applied Biosystems)とPremix Ex Taq Perfect Real Time(タカラバイオ)を混合し、Quanti Studio (Applied Biosystems)を用いて、95℃、10秒、(95℃、15秒→60℃、30秒)×45サイクル、50℃、30秒のPCR反応条件で測定を行った。内部標準としてGAPDHの発現量をRodent GAPDH control Reagents(サーモフィッシャーサイエンティフィック)を使用し、上記と同様な反応で測定した。
測定により得られたCt値からGAPDHを内部標準としてΔΔCt法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を算出した。
図3にArc、図4にc-fosの相対的発現量の測定結果を示す。KM1~4はいずれも濃度依存的にラット初代神経系培養細胞において最初期遺伝子の発現量が増加していた。なかでもKM1は高活性を示した。
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