JP2022167403A

JP2022167403A - 筋萎縮抑制

Info

Publication number: JP2022167403A
Application number: JP2021073176A
Authority: JP
Inventors: 健史澤野; Takeshi Sawano; 知倫渡邉; Tomomichi Watanabe; 真行野口; Masayuki Noguchi; 実保井野; Miho Ino; 剛史櫻田; Takashi Sakurada
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2022-11-04

Abstract

【課題】筋委縮抑制用組成物を提供すること。【解決手段】ＡｇｒｉｍｏｌＢ及び／又はＡｇｒｉｍｏｌＢを０．３％以上含有する濃縮キンミズヒキ抽出物を有効成分とする筋委縮抑制用組成物。【選択図】図２

Description

本発明は、筋萎縮抑制に関する。

高齢者は、加齢による筋萎縮や筋力の低下が認められ、筋肉損傷や易骨折性などの傷害が発生しやすい。この治療・療養のために、安静状態やギプス固定等の活動制限下におかれると、さらに筋力が低下する。
また一般的に、高齢者に発生する筋肉の筋質量や筋力が減少する筋萎縮には、廃用性筋萎縮やサルコペニア等が挙げられる。筋萎縮が起こると、それに伴ってさらに筋機能の低下がみられるようになる。
高齢者は、運動不足による筋力の低下から筋萎縮となり、筋萎縮からさらに上記のような悪循環に陥りやすく、最悪の場合、寝たきりになる。一方、生活機能、クオリティオブライフ（ＱＯＬ）を維持するためには、ある程度の強制的な運動により、廃用性筋萎縮や筋機能の低下を抑制できることが知られている。

これまでの、筋萎縮や筋機能の低下を防ぐ試みとしては、健常時に適度な運動を継続すること、或いはリハビリテーションの理学療法に限られており、より効果的な筋萎縮の抑制方法が望まれている。
近年では、すでに運動や理学療法のみならず、筋萎縮及びそれに伴う筋機能の低下、ひいては寝たきりを予防しうる成分の探索が行われている。さらに、遺伝子的な研究も行われている。
非特許文献１には、筋萎縮原因遺伝子がアトロジン（ａｔｒｏｇｉｎｓ）であると特定され、廃用性筋萎縮の分子メカニズムが明らかにされている。特にＡｔｒｏｇｉｎ－１と呼ばれる遺伝子の発現を抑制することで、廃用性筋萎縮を抑制できることが記載されている。
したがって、Ａｔｒｏｇｉｎ－１遺伝子の発現を抑制できれば、サルコペニアなどＡｔｒｏｇｉｎ－１遺伝子の発現活性化に伴って発生する筋萎縮を予防改善できるといわれている。
特許文献１には、ε－ヴィニフェリンを有効成分とするＡｔｒｏｇｉｎ－１遺伝子発現抑制剤が記載されている。
特許文献２には、グネチンＣを有効成分とするＡｔｒｏｇｉｎ－１遺伝子発現抑制剤が記載されている。

特開２０１５－７１５４９号公報特開２０１５－１４０３１４号公報

二川健，「廃用性筋萎縮の治療ターゲットとしてのユビキチンリガーゼ」，生化学，第８１巻第７号，日本生化学会，２００９年，６１４～６１８ページ

本発明が解決しようとする課題は、筋委縮抑制用組成物を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、キンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物中の含有成分であるＡｇｒｉｍｏｌＢ（アグリモールＢ）が、ＴＮＦα誘導性Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現増加を抑制することを見出し、これにより、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
（１）ＡｇｒｉｍｏｌＢを有効成分とする筋委縮抑制用組成物。
（２）ＡｇｒｉｍｏｌＢを０．３％以上含有する濃縮キンミズヒキを有効成分とする筋委縮抑制用組成物。

本発明により、ＴＮＦα誘導性Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現増加を抑制する筋委縮抑制用組成物が提供される。本発明のＴＮＦα誘導性Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現増加を抑制する筋委縮抑制用組成物は、ＡｇｒｉｍｏｌＢ及び／又は濃縮キンミズヒキ抽出物を有効成分としており、ＴＮＦα誘導性Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現増加を抑制することで最終的に廃用性筋萎縮あるいはサルコペニアの進行を抑制する。その結果筋肉筋機能の低下を抑える。したがって、寝たきりを予防するための医薬または健康食品として利用できる。

キンミズヒキ抽出物のＴＮＦ－α誘導性Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現抑制作用を示す図濃縮キンミズヒキ抽出物のＴＮＦ－α誘導性Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現抑制作用を示す図ＡｇｒｉｍｏｌＢのＴＮＦ－α誘導性Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現抑制作用を示す図

本発明において、「筋萎縮」とは、筋細胞の減少や縮小により筋量が低下することをいい、長期間の安静臥床や骨折などによるギプス固定、あるいは微小重力暴露によるもの（廃用性筋萎縮という）、加齢に伴うもの（サルコペニアという。）が挙げられる。したがって筋萎縮の抑制とは、不活動や加齢に伴う筋量の低下を抑制することを意味する。
本発明の筋委縮抑制用組成物は、ＡｇｒｉｍｏｌＢ及び／又は濃縮キンミズヒキ抽出物を有効成分とする、ＴＮＦα誘導性Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現増加を抑制する筋委縮抑制用組成物である。ＴＮＦα誘導性Ａｔｒｏｇｉｎ－１遺伝子が活性化すると骨格筋肉蛋白質の分解が促進され筋萎縮が進む。一方、ＡｇｒｉｍｏｌＢ及び／又は濃縮キンミズヒキ抽出物によって、ＴＮＦα誘導性Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現増加が抑制され、筋肉が増強される。したがってＡｇｒｉｍｏｌＢ及び／又は濃縮キンミズヒキ抽出物は、筋萎縮やサルコペニアの予防・改善剤として利用できる。

ＡｇｒｉｍｏｌＢは、下記式（１）：

で表される化合物である。本発明においては、植物等から抽出、化学合成等の手段により入手することができる。また、市販品を用いてもよい。好ましくは、植物からの抽出による入手であり、特にキンミズヒキ抽出物から入手することが特に好ましい。

キンミズヒキ（学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａｐｉｌｏｓａ）は、バラ科キンミズヒキ属の多年草であり、本州、四国、九州などの林の縁、原野、路傍に生息しており、容易に入手可能である。別名、龍牙草、仙鶴草ともいう。本発明において、キンミズヒキは、漢方生薬、民間療法薬、健康食品（ハーブティー）原料として市販されている乾燥物を使用することができる。また自生あるいは栽培されたもの、全草を採取し、これを自然乾燥又は加熱乾燥させたもので良い。これを細切し、約１０倍量の水または、含水濃度０～８０％（ｖ／ｖ）エタノールに３～５日間浸漬して室温で抽出するか、あるいは還流冷却器を付して５０～８０℃で５～２４時間抽出し、濾過してキンミズヒキ抽出液を回収する。この抽出液は、ロータリーエバポレーターなどの減圧真空乾燥装置、又は凍結乾燥装置によって、水及びエタノールを除去してキンミズヒキ抽出物とする。

濃縮キンミズヒキ抽出物を有効成分とする筋委縮抑制用組成物において、濃縮キンミズヒキ抽出物中のＡｇｒｉｍｏｌＢの濃度は、例えば０．３０質量％以上が好ましい。

ＡｇｒｉｍｏｌＢ及び／又は濃縮キンミズヒキ抽出物を有効成分とする筋委縮抑制用組成物は、ＡｇｒｉｍｏｌＢ及び／又は濃縮キンミズヒキ抽出物をそのまま用いてもよく、慣用の医薬用製剤担体とともに医薬用組成物として動物及びヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜選択すればよい。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤などの経口剤や、注射剤、坐薬などの非経口剤が挙げられる。投与量は、通常成人で抽出物の重量で１０～１０００ｍｇを１日数回に分けて服用するのが適当である。

本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤などの経口剤は、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などの賦形剤を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中のＡｇｒｉｍｏｌＢ及び／又は濃縮キンミズヒキ抽出物の配合量は特に限定されるものでなく、適宜設計できる。この種の製剤には本発明組成物の他に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを適宜使用できる。

これら有効成分以外の配合成分において、結合剤としてはデンプン、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなどが例示できる。崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどが例示できる。界面活性剤としてはラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどが例示できる。滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコールなどが例示できる。流動性促進剤としては軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなどが例示できる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

［マウス骨格筋由来筋菅細胞（Ｃ２Ｃ１２）に対するキンミズヒキのＡｔｒｏｇｉｎ－１発現抑制試験］
＜キンミズヒキ抽出物及び濃縮キンミズヒキ抽出物の調製＞
キンミズヒキ（仙鶴草、福田龍株式会社）１００ｇに、９０％エチルアルコール１０倍量（１ｋｇ）を加え、還流抽出を２回繰り返した。終了後、固液分離して抽出液を得た。得られた抽出液を、常法により活性炭処理、珪藻土ろ過した後、濃縮・凍結乾燥し粗抽出物（固形量９．２８ｇ、収率９．２８％（対原料））を得た。この粗抽出物を「キンミズヒキ抽出物」として本試験に用いた。
このキンミズヒキ抽出物乾燥物８．５１ｇを６０℃に加温した２０％エチルアルコール溶液に溶解・懸濁（固形量１０％）させた後、常法により珪藻土ろ過して残渣を回収した。残渣を再び９０％エチルアルコールに溶解させ、常法により珪藻土ろ過した後、再度濃縮・凍結乾燥して濃縮物を得た（固形量０．５９ｇ、収率６．９３％（対キンミズヒキ抽出物））。これを濃縮キンミズヒキ抽出物とした。この濃縮キンミズヒキ抽出物は、キンミズヒキ抽出物から２０％エチルアルコール可溶性成分を除去することで、ＡｇｒｉｍｏｌＢを含む脂溶性成分が濃縮されていた。

＜キンミズヒキ抽出物及び濃縮キンミズヒキ抽出物中のＡｇｒｉｍｏｌＢの含有量の測定＞
本実施例において用いる試験品について、常法によりＡｇｒｉｍｏｌＢの含有量を測定した。キンミズヒキ抽出物中に０．０３６質量％、濃縮キンミズヒキ抽出物中に０．４４７質量％含有されていた。
キンミズヒキ抽出物及び濃縮キンミズヒキ抽出物におけるＡｇｒｉｍｏｌＢの含有量は、下記条件にてＨＰＬＣで測定した。
（ＨＰＬＣでの測定条件）
・カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ－ｌｌ５Ｃ１８ＡＲ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ
・移動相：蒸留水:アセトニトリル：リン酸＝１００：９００：１
・流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
・検出：ＵＶ２８８ｎｍ
・注入量：１０μＬ

＜Ｃ２Ｃ１２細胞の培養及び分化誘導＞
Ｃ２Ｃ１２は１０％ウシ胎児血清（FBS, Hyclone laboratories）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Sigma Aldrich）を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Thermo Fisher Scientific）で培養した。前培養したＣ２Ｃ１２を２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように懸濁し、Collagen Coated ４８ well Plate（CORNING）に４００μｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。
翌日、２％ウマ血清（HS, Gibco）、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２（分化誘導培地）に全量培地交換し、分化誘導を開始した。分化２日目及び４日目に半量培地交換した。

＜筋菅細胞に対するサンプルおよびＴＮＦ－α処理＞
分化５日目、培養上清を除去した後、サンプルを溶解した新しい培地を４００μＬ添加した。キンミズヒキ抽出物は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、濃縮キンミズヒキ抽出物は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬになるように、それぞれ溶解濃度を調製した。２４時間培養後、培養上清を除去し、ＴＮＦ－α（終濃度１２ｎｇ／ｍＬ）を溶解した新しい培地に交換し、さらに培養した。３時間後、培養上清を除去し、RLT Lysis buffer (QUIAGEN)を用いてＲＮＡ用サンプルを回収した。

＜Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現解析＞
RNeasy Mini kit（QIAGEN）を用い、添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。調製した１００ｎｇのＲＮＡを用いて、PrimeScript RT reagent kit（Takara）を使用し、添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現量は、ｃＤＮＡ、マウス Atrogin-1 taq man probe（TaqMan Gene expression assays：Applied Biosystems）とPremix Ex Taq Perfect Real Time（TaKaRa）を混合し、Quanti Studio (Applied Biosystems)を用いて、９５℃、２０秒、（９５℃、1秒→６０℃、２０秒）×４５サイクルの反応条件で測定を行った。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現量をマウス GAPDH taq man probe（TaqMan Gene expression assays：Applied Biosystems）を使用し、上記と同様な反応で測定した。測定により得られたＣｔ値からＧＡＰＤＨを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を算出した。
使用したプライマーは下記の通りである。
Ａｔｒｏｇｉｎ－１（別名：Fbxo32 F-box protein 32）：Assay ID: Mm00499523_m1
Ｇａｐｄｈ（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）：Assay ID: Mm99999915_g1

結果を図１及び図２に示す。図１に示すキンミズヒキ抽出物は、ＴＮＦ－α誘導性Ａｓｔｒｏｇｉｎ－１発現増加を抑制しなかった。しかし、図２に示す濃縮キンミズヒキ抽出物は、ＴＮＦ－α誘導性Ａｓｔｒｏｇｉｎ－１発現増加を抑制することがわかった。

［マウス骨格筋由来筋菅細胞（Ｃ２Ｃ１２）に対するＡｇｒｉｍｏｌＢのＡｔｒｏｇｉｎ－１発現抑制試験］
＜Ｃ２Ｃ１２細胞の培養及び分化誘導＞
Ｃ２Ｃ１２は１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（High glucose）で培養した。前培養したＣ２Ｃ１２を４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように懸濁し、96 well Plate（CORNING）に１００μｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。
翌日、２％ＨＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２に全量培地交換（２００μｌ）し、分化誘導を開始した。分化２日目及び４日目に半量培地交換した。

＜筋菅細胞に対するサンプルおよびＴＮＦ－α処理＞
分化誘導６日後、培養上清を除去し、新たに分化誘導培地１００μｌを添加した。ここにＡｇｒｉｍｏｌＢ（Chem Faces）を終濃度２．５μＭ、５μＭ又は１０μＭになるように処理し、２４時間培養した。ＡｇｒｉｍｏｌＢ存在下培養後、培養上清を除去し、新たに分化誘導培地１００μｌを添加した。ここにＴＮＦ－αを終濃度１２ｎｇ／ｍＬになるように添加し、３時間後、培養上清を除去し、RLT Lysis buffer (QUIAGEN)を用いてＲＮＡ用サンプルを回収した。

＜Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現解析＞
RNeasy mini plus kit (QIAGEN)を用い、添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。調製した２００ｎｇのＲＮＡを用いて、PrimeScript RT reagent kit（Takara）を使用し、添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。Ａｔｒｏｇｉｎ－１発現量は、ｃＤＮＡ、マウス Atrogin-1 taq man probe（TaqMan Gene expression assays: Applied Biosystems）とPremix Ex Taq Perfect Real Time（TaKaRa）を混合し、Quanti Studio (Applied Biosystems)を用いて、９５℃、２０秒、（９５℃、1秒→６０℃、２０秒）×４０サイクルの反応条件で測定を行った。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現量をマウス GAPDH taq man probe（TaqMan Gene expression assays: Applied Biosystems）を使用し、上記と同様な反応で測定した。測定により得られたＣｔ値からＧＡＰＤＨを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を算出した。

結果を図３に示す。図３に示すようにＡｇｒｉｍｏｌＢは、ＴＮＦ－α誘導性Ａｓｔｒｏｇｉｎ－１発現増加を抑制することがわかった。

Claims

ＡｇｒｉｍｏｌＢを有効成分とする筋委縮抑制用組成物。
ＡｇｒｉｍｏｌＢを０．３％以上含有する濃縮キンミズヒキを有効成分とする筋委縮抑制用組成物。