JP7010506B2 - 低分子有効サポニン含有量を増大させかつベンゾピレン含有量を低減させるアマチャヅル葉抽出物の製造方法及びそれによって得られたアマチャヅル葉抽出物 - Google Patents
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Description
予備実験1.焙煎方法によるベンゾピレン及び有効物質の含有量の比較
焙煎方法による有効物質の含有量及びベンゾピレン生成量を調査するために、アマチャヅル生葉100gをそれぞれの焙煎方法で2時間焙煎及び乾燥した。
焙煎温度による有効物質の含有量及びベンゾピレン生成量を調査するために、アマチャヅル生葉100gをそれぞれの温度に調節し、2時間電気ヒーターで焙煎及び乾燥させた後、予備実験1のスチーム処理及び抽出方法で抽出した後、減圧濃縮して凍結乾燥した抽出物でのベンゾピレン及び有効物質の含有量を分析して下記表3に示した。
焙煎は一定温度以上でアマチャヅル葉を入れ、開放した容器で炒めて熱処理することであって、蒸熱は焙煎と類似した温度で遂行するが、密閉した容器で熱い蒸気で熱処理することである。前記焙煎と蒸熱による有効物質の含有量及びベンゾピレン生成量を比較するために、焙煎はアマチャヅル生葉100gを135℃の温度に調節し、2時間の間に電気ヒーターで焙煎してから乾燥させ、蒸熱は温度を121℃に調節し、2時間の間に蒸熱及び乾燥させた後、予備実験1のスチーム処理及び抽出方法で抽出した後、ベンゾピレン及び有効物質の含有量を分析して下記表4に示した。
電気ヒーターで焙煎処理されたアマチャヅル葉をスチーム処理した場合と処理しなかった場合にアマチャヅル葉に含まれているベンゾピレン含有量を調査した。電気ヒーターを用いて135℃で2時間焙煎してから乾燥させたアマチャヅル葉100gを121℃で60分間スチーム発生器によってスチーム処理した場合と処理しなかった場合、及び135℃で2時間蒸熱してから乾燥させたアマチャヅル葉100gを前記のような方法でスチーム処理した場合と処理しなかった場合に対し、アマチャヅル葉に残っているベンゾピレンの含有量を調べた。アマチャヅル葉に含有されたベンゾピレン含有量は前記予備実験1と同様な方法で測定し、その測定結果を下記表5に示した。
抽出時に使われる溶媒pHによる有効物質の含有量及びベンゾピレン生成量を調査するために、アマチャヅル生葉100gを135℃で2時間の間に電気ヒーターで焙煎及び乾燥した後、121℃で1時間スチーム処理したアマチャヅル葉に塩酸及び/又は重炭酸ナトリウムで様々なpHに調整された1Lの水を加え、1時間浸漬させた。その後、121℃、1.2気圧で4時間熱水抽出してから中和して上澄み液を回収した。そして、前記上澄み液を回収して残った残渣に50%(v/v)エタノール1Lを加えてアルコールを抽出した後、収得した上澄み液を前記熱水抽出物と混合して濾過し、固形分含有量が20~25%になるように減圧濃縮し、凍結乾燥してアマチャヅル葉抽出物を製造した。前記アマチャヅル葉抽出物を予備実験1の分析方法と同様な方法で測定し、その結果を分析して下記表6に示した。
実施例1
(1)電気ヒーターを用いて135℃で2時間焙煎処理してから乾燥させたアマチャヅル葉を121℃で60分間スチーム処理した。前記スチーム処理したアマチャヅル葉100gに1Lの水を加え、1時間浸漬させた後、121℃、1.2気圧で4時間抽出した後、上澄み液を回収して熱水抽出物を製造した。
前記実施例1と同様に実施したが、(1)段階での水は塩酸及び重炭酸ナトリウムを用いてpH4に調整した後、前記スチーム処理したアマチャヅル葉に加えてアマチャヅル葉抽出物を製造した。
比較例1
前記実施例1と同様に実施したが、135℃の代わりに350℃で焙煎処理してアマチャヅル葉抽出物を製造した。
前記実施例1と同様に実施したが、焙煎処理せずにアマチャヅル葉抽出物を製造した。
実験例1.成分分析
下記表7の方法でRg3及びジペノシドL、ジペノシドLIなどの有効成分とベンゾピレンの含有量を測定して表8に表示した。標準品に対しては、Rg3はシグマアルドリッチから、ジペノシドLとジペノシドLIは株式会社エンボから購入して使った。
前記実施例又は比較例で得られたアマチャヅル葉抽出物が脂肪細胞の生存に毒性を示すかを確認するために、MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)アッセイを用いて実験を遂行した。これは、脱水所酵素作用によって黄色の水溶性基質であるMTTテトラゾリウム(tetrazolium)を青紫色の非水溶性MTTホルマザン(formazan)に還元させるミトコンドリアの能力を用いた試験法である。
細胞生存率(%)=(試料処理群の吸光度/対照群の吸光度)×100・・・(1)
実験例3.1.脂肪細胞分化
脂肪前駆細胞と脂肪細胞の増殖抑制能を確認するために、3T3-L1脂肪前駆細胞をアメリカ培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA、USA))から分譲されて使った。3T3-L1脂肪前駆細胞は脂肪細胞の代謝過程の研究に広く用いられる細胞株であり、前記細胞の分化が活発になるほど脂肪細胞内の脂肪蓄積も活発になる。アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から受けた細胞株は、10%小牛血清(BCS、Gibco、GrandIsland、NY、USA)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S、Gibco、GrandIsland、NY、USA)が含有されたダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco’s medified Eagle’s medium、DMEM)(Lonza、Allendale、NJ、USA)であり、5%CO2、37℃に維持される条件で培養した。
実施例及び比較例で得られたアマチャヅル葉抽出物の3T3-L1脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化及び脂肪生成抑制を確認するために、中性脂肪を特異的に染色させるOil Red O染色を進行した。
脂肪蓄積率(%)=(試料処理群の吸光度/対照群の吸光度)×100・・・(2)
ACCは肝臓と筋肉組職で脂質代謝を調節する重要な酵素である。この酵素はアセチル-CoA(acetyl-CoA)をカルボキシル化させてマロニル-CoA(malonyl-CoA)を生成するようにする。マロニル-CoAはミトコンドリア内で脂肪酸のベータ酸化を調節する最も重要な因子であり、マロニル-CoAの濃度が増加すればミトコンドリア膜のCPT-1(carnitine palmitoyl-CoA transferase)の活性が低下して脂肪酸のベータ酸化が抑制され、反対にマロニル-CoA濃度が減少すればベータ酸化は増加して体脂肪減少が促進される。ACCはAMPK活性の下位ターゲットタンパク質であり、AMPKの活性化はACCをリン酸化してACC酵素の不活性化を促進してマロニル-CoAの濃度が減少し、その結果、ミトコンドリア膜のCPT-1の活性が上昇するので、脂肪酸のベータ酸化が増加するようになる。
本発明によるアマチャヅル葉抽出物のAMPK活性化効能を3T3-L1細胞を用いて測定した。
培養されたL6筋肉細胞に実施例及び比較例によるアマチャヅル葉抽出物をHwangらの方法(Hwangら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 1253-1258)で処理して脂肪酸のベータ酸化増進効果を調査した。
実施例及び比較例によるアマチャヅル葉抽出物をL6筋肉細胞に処理して細胞内ブドウ糖吸収能力に対する影響を調査した。培養されたL6筋肉細胞をHwangらの方法(Hwangら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 1253-1258)で高濃度のブドウ糖とともに、細胞内では分解しない放射線同位元素である2-DG(2-deoxy-[3H]D-glucose)を添加した後、アマチャヅル葉抽出物の添加による細胞内2-DG吸収促進程度を調査した。
mTORタンパク質は、リン酸化したとき、筋細胞内のPI3K/Akt信号伝達経路で筋タンパク質合成及び筋肉量増加に関与するタンパク質の活性化を誘導することができることが知られている。よって、アマチャヅル葉抽出物の筋肉生成誘導活性を確認するために、培養されたL6筋肉細胞に実施例及び比較例によるアマチャヅル葉抽出物をHwangらの方法(Hwangら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 1253-1258)で処理し、分化が完了する時点である8日目にimage Jプログラムを用いて筋肉細胞分化程度を測定した。
前記体重30gのICR系の雄マウス(コアテク、韓国)を分譲され、22~24℃の温度条件及び40~60%の湿度条件で明暗周期を12時間(light/dark cycle)にして1週間適応させた後、実験群をそれぞれ8匹ずつで構成して次のように分類した。実験群1(運動対照群、以下、NCで表示)、実験群2(実施例2)、実験群3(比較例2)に設定し、試験物質は1回/1日で合計4週間投与した。実験動物を実験開始16時間前から安定した状態で条件を維持した後、アクリルプラスチック水槽(70cm、70cm、60cm)内に水を約70%程度入れ、水槽内で遊泳するようにした。遊泳時間は実験動物が力尽きてそれ以上動けない状態を終了点に設定し、開始時間から終了時間までの時間を遊泳時間として測定した。その結果、図14に示すように、運動遂行能力を測定するために力尽きたときまでの遊泳時間を測定した。実験の結果、同じ濃度条件での対照群に比べ、実施例2の摂取が運動遂行能力を増進させることを確認し、特に比較例と比較したとき、遊泳時間が長くて運動遂行能力が優れることを確認することができた。
製剤例1.錠剤の製造
実施例1又は2のアマチャヅル葉抽出物8mg、ビタミンE9mg、ビタミンC9mg、ガラクトオリゴ糖200mg、乳糖60mg及び麦芽糖140mgを混合し、流動層乾燥器を用いて顆粒化した後、糖エステル(sugar ester)6mgを添加した。これらの組成物500mgを通常の方法で打錠して錠剤を製造した。
通常の軟質カプセル剤の製造方法によって実施例1又は2のアマチャヅル葉抽出物8mg、ビタミンC9mg、パーム油2mg、植物性硬化油8mg、黄鉛4mg及びレシチン9mgを混合し、ゼラチンカプセルに充填して軟質カプセル剤を製造した。
実施例1又は2のアマチャヅル葉抽出物8mg、ビタミンE9mg、ビタミンC9mg、ブドウ糖10g、クエン酸0.6g、液状オリゴ糖25gを混合した後、精製水300mlを加え、各瓶に200mlずつ充填後、130℃で4~5秒間殺菌してドリンク剤を製造した。
実施例1又は2のアマチャヅル葉抽出物8mg、ビタミンE9mg、ビタミンC9mg、無水結晶ブドウ糖250mg及び澱粉550mgを混合し、流動層料粒器を使って顆粒に成形した後、布に充填して顆粒剤を製造した。
下記表9に記載した組成によって通常の方法で注射剤を製造した。
下記表10に記載した組成によって通常の方法で健康飲料を製造した。
下記表11に記載した組成によって通常の方法で健康機能食品を製造した。
Claims (8)
- 低分子有効サポニンの含有量を増大かつベンゾピレンの含有量を低減させるアマチャヅル葉抽出物の製造方法であって、
前記方法は、
(1)アマチャヅル生葉を90~300℃で5分~120時間焙煎処理してから乾燥する段階と、
(2)乾燥されたアマチャヅル葉をスチーム処理する段階と、
(3)前記スチーム処理されたアマチャヅル葉に1~100倍体積の水を添加した後、100~150℃、1~10気圧で5分~120時間熱水抽出してアマチャヅル葉の熱水抽出物を製造する段階と、
(4)前記アマチャヅル葉を熱水抽出して残った残渣に1~100倍体積のC1~C4の低級アルコールを添加した後、50~100℃で5分~120時間アルコール抽出してアマチャヅル葉熱水抽出物残渣のアルコール抽出物を製造する段階と、
(5)前記(3)段階の熱水抽出物及び(4)段階のアルコール抽出物を混合してから濾過及び濃縮する段階とを含む、アマチャヅル葉抽出物の製造方法。 - 前記(2)段階のスチーム処理は、5分~10時間行うことを特徴とする、請求項1に記載のアマチャヅル葉抽出物の製造方法。
- 前記スチーム処理は、開放した容器で行うことを特徴とする、請求項1に記載のアマチャヅル葉抽出物の製造方法。
- 前記(4)段階のC1~C4の低級アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール及びブタノールの中でそれぞれ選択される1種以上であることを特徴とする、請求項1に記載のアマチャヅル葉抽出物の製造方法。
- 前記(4)段階の低級アルコールは、それぞれ5~95体積%のアルコール水溶液であることを特徴とする、請求項1に記載のアマチャヅル葉抽出物の製造方法。
- 前記(3)段階の水及び(4)段階の低級アルコールはpH1~7に調整されたことを特徴とする、請求項1に記載のアマチャヅル葉抽出物の製造方法。
- 前記アマチャヅル葉抽出物は、ジンセノサイドRg3を0.01~7mg/g、ジペノシドLを1.5~70mg/g、ジペノシドLIを1.5~70mg/g含むことを特徴とする、請求項1に記載のアマチャヅル葉抽出物の製造方法。
- 前記アマチャヅル葉抽出物は、ベンゾピレンを10ppb以下含むことを特徴とする、請求項1に記載のアマチャヅル葉抽出物の製造方法。
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