KR102567179B1 - 지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용, 또는 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함하여 운동수행능력을 향상시키고 체력을 증진시키는데 우수한 효과를 나타내므로, 의약 분야 또는 기능성 식품 분야 등에서 매우 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

Description

지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물{Composition for enhancement of exercise performance comprising gypenoside compounds as an active ingredient}

본 발명은 지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 조성물에 관한 것이다.

복잡한 현대사회에서 환경오염에 의한 생활환경 악화, 정신적 스트레스 가중, 활동량 부족 등에 노출되어 있는 현대인들은 건강증진에 대한 관심이 나날이 증가하고 있다. 성인병 또는 노화의 예방책으로 운동이 가장 효과적이고 경제적이지만, 바쁜 일상생활과 피로 등으로 건강관리를 못하는 현대인들은 운동의 대안으로 다양한 기능성 식품 복용에 관심을 가지고 있다. 또한, 운동선수는 운동 종목에 따른 과학적인 훈련과 식이요법 이외에 운동능력 향상 보조제(ergogenic aids)를 사용하여 운동수행능력의 효율을 높인다. 운동능력 향상 보조제는 운동수행능력의 향상뿐만 아니라, 신체활동 시 체내에 축적되어 피로를 발생시키는 피로요소의 제거에도 효과가 있기 때문에 운동선수들뿐만 아니라 일반인들도 흔히 사용하고 있다.

운동능력 향상을 위한 기능성 보조제와 관련된 연구는 동서양을 막론하고 활발하게 수행되고 있다. 스테로이드, 카페인, 탄산수소나트륨, 또는 구연산나트륨 등과 같은 화합물을 포함하는 보조제는 운동 수행능력을 증가시키고 일상생활에도 활기를 주지만, 이는 일시적인 현상에 불과하고 건강에 치명적인 부작용을 수반할 위험이 있다.

이에 따라, 최근에는 식물 추출물과 같이 안전성이 보장된 천연물 또는 천연물 유래의 화합물을 이용한 기능성 보조제 개발에 대한 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자들은 천연물 유래의 화합물의 운동수행능력 향상 효과 및 근육 질환 개선 또는 치료 효과에 대하여 연구하는 과정에서, 지페노사이드 화합물의 운동수행능력 향상 효과가 현저히 높은 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2064387 B CN 102579471 B

본 발명의 목적은 지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 운동수행능력 향상용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유효성분은, 지페노사이드 L 또는 지페노사이드 LI일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유효성분은, 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유효성분은, 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI은 100 : 20 내지 80의 중량비일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유효성분은, 상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI은 100 : 30 내지 70의 중량비일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유효성분의 투여 용량은 0.01 내지 200 mg/kg/day일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 향상용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함하여 운동수행능력을 향상시키고 체력을 증진시키는데 우수한 효과를 나타내므로, 의약 분야 또는 기능성 식품 분야 등에서 매우 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

또한, 본 발명의 조성물은 지페노사이드 화합물을 유효성분으로 포함함으로써, ROS 생성을 감소시키고, 근육 내 미토콘드리아 기능에 관여하는 PGC-1α와 AMPK를 활성화하는데 우수한 효과가 있다. 또한, 산화적 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하고 근육 손상을 억제시킬 수 있는 항산화 유전자의 발현을 조절하는 Nrf2를 활성화한다. 또한, 근육 내 미토콘드리아의 복제에 관여하는 TFAM, CPT-1β, mtDNA의 발현을 증가시키고 근육 타입의 변화와 에너지 생성에 관여하는 GSY, SIRT1, PPARγ의 발현을 향상시킬 수 있으므로 운동 수행능력 향상시키는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한 근피로 개선 효과와 탈진 시까지의 운동시간과 운동량 증가 및 근육 내 글리코겐 함량 증대를 통해 운동수행능력을 현저히 향상시킬 수 있다.

본 발명은 천연물 유래의 화합물을 유효성분으로 하므로 부작용이 없이 안전하게 사용될 수 있어, 의약품 또는 식품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 명세서의 용어, “운동수행능력” 또는 “운동능력”은 일상생활이나 스포츠에서 볼 수 있는 신체동작을 외형적으로 달리기, 뛰기, 던지기, 헤엄치기 등으로 구분할 때, 상기 동작을 빠르게, 강하게, 정확하게, 오래, 능숙하게 할 수 있는 정도를 나타내는 것으로, 운동수행능력은 근력, 균형감각, 운동 협응, 민첩성 및 지구력 등의 인자로 규정된다. 용어 '운동수행능력 향상'은 운동수행능력을 개선하거나 향상시키는 것을 말하고, 구체적으로는, 지구력, 균형감각, 또는 근력을 개선하거나 향상시키는 것을 의미한다.

본 명세서의 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 형태를 의미한다.

상기 “약학적으로 허용 가능한 염”은 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 또는 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 유기산의 부가에 의해 형성된 산부가염을 포함한다. 상기 화학식 1의 화합물에 카르복실산기가 존재하는 경우 약학적으로 허용 가능한 카르복실산의 염의 예로는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 통상적인 방법에 의해 그것의 염으로 전환시킬 수 있다.

본 명세서의 용어, “입체 이성질체”는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 분자내 원자의 공간 배열이 달라짐에 따라 생기는 이성질체로, "거울상 이성질체" 또는 "부분입체 이성질체"로 구분된다. 상기 "거울상 이성질체"는 오른손과 왼손의 관계처럼 그 거울상과 서로 겹쳐지지 않는 이성질체를 의미하고, 상기 "부분입체 이성질체"는 입체 이성질체 중에서 광학 반전이 일어나지 않는 이성질체를 의미한다. 부분입체 이성질체에는 이중 결합 등의 회전 불가능한 결합이 있는 기하 이성질체, 단일 결합의 회전에 의해서 일시적인 배열이 달라져 있는 형태 이성질체, 혹은 입체 중심이 여러 개 존재하지만 거울상을 이루지 못하는 일반적인 부분입체 이성질체 등이 포함된다. 이들의 모든 이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본 명세서의 용어, “유효성분”이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명은 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 운동수행능력 향상용 식품 조성물을 제공한다.

상기 지페노사이드 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 L 화합물(지페노사이드 50)일 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 “지페노사이드 L”은 “Gypenoside L”, “Gyp L”, “Gyp 50”, “G50”, “지페노사이드 50”, “gypenoside 50”과 상호교환적으로 사용되며, 지페노사이드(gypenoside; Gyp)의 일종을 의미한다.

상기 지페노사이드 L은 화학적으로 합성하거나 천연 물질로부터 분리할 수 있으며, 본 발명의 지페노사이드 L을 천연 물질로부터 분리하는 경우에는 상기 지페노사이드 L을 포함하는 한, 천연물의 추출물 또는 이의 분획물을 모두 포함하는 개념일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화합물은 비대칭 탄소중심을 가질 수 있으므로, R 또는 S 이성질체, 라세미체, 부분입체 이성질체 혼합물 및 개개 부분입체 이성질체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 이성질체 및 혼합물은 본 발명의 범위에 포함된다.

본 명세서의 용어, “지페노사이드(Gypenoside; Gyp)”란 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin)을 의미한다. 상기 지페노사이드의 종류로는 Gyp L 및 Gyp LI를 포함하여, Gyp LXXV, Gyp XⅦ, Gyp XLIX, Gyp XXIV, Gyp XLV 등이 알려져 있다.

본 발명의 지페노사이드 L은 공지된 방법에 따라 진세노사이드 Rg3로부터 히드록실화(hydroxylation)하여 수득하거나, 식물 추출물로부터 분리하여 이용하거나, 또는 시판되고 있는 화합물을 이용할 수 있다.

본 명세서의 용어, “히드록실화”는 유기 화합물에 히드록실기(OH)를 도입하는 반응으로서, 직접 히드록시기를 도입하든지, 혹은 기존 치환기를 히드록시기로 바꿔놓음으로써 히드록실화가 이루어진다.

또한, 상기 지페노사이드 화합물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 입체 이성질체일 수 있고, 바람직하게는 부분입체 이성질체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하기 화학식 2로 표시되는 지페노사이드 LI 화합물(지페노사이드 51)일 수 있다.

[화학식 2]

본 발명의 “지페노사이드 LI”은 “Gypenoside LI”, “Gyp LI”, “Gyp 51”, “G51”, “지페노사이드 51”, “gypenoside 51”과 상호교환적으로 사용되며, 지페노사이드(gypenoside; Gyp)의 일종으로서 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 L 화합물의 부분입체 이성질체이다.

일 구체예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 화학식 2로 표시되는 화합물은 돌외잎 추출물로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 돌외잎 추출물은 돌외잎의 에탄올 추출물, 열수 추출물, 헥산 추출물, 에틸아세테이트 추출물 또는 초고압 추출물일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 돌외잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 돌외잎을 추출하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 돌외잎을 100 MPa 이상의 초고압 조건 하에서 추출하여 수득할 수도 있다. 필요한 경우에는 당업계에 공지된 방법에 따라 여과 및 농축 단계를 추가적으로 포함하여 제조할 수 있다. 일 구체예에서, 탄소수 1 내지 6의 유기용매는 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether) 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물에 함유되는 유효성분은 상기 지페노사이드 L, 지페노사이드 LI, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI은 100 : 20 내지 80의 중량비, 바람직하게는 100 : 30 내지 70의 중량비, 더욱 바람직하게는 100 : 50 내지 70의 중량비일 수 있다.

상기 지페노사이드 L에 대한 지페노사이드 LI의 중량비가 상기 범위일 때 운동수행능력 향상 효과가 극대화될 수 있다. 상기 지페노사이드 L에 대한 지페노사이드 LI의 중량비가 상기 하한치 미만인 경우에는 상기 조성물의 운동수행능력 향상 효과가 미미해지고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 상기 조성물의 운동수행능력 향상 효과가 오히려 감소하게 된다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효용량으로 포함할 때 바람직한 운동수행능력 향상 효과를 제공할 수 있다. 본 명세서에서, “유효용량”이라 함은 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며, 바람직하게는 운동수행능력을 향상하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 건강기능식품 조성물에 상기 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 0.001 내지 99.99 중량%로 함유될 수 있고, 바람직하게는 0.05 내지 50 중량%로 함유될 수 있으며, 잔량은 식품학적으로 허용 가능한 담체가 차지할 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물에 포함되는 유효성분의 유효용량은 조성물이 제품화되는 형태 등에 따라 달라질 것이다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염의 투여 용량은 0.001 ~ 400 mg/kg이고, 바람직하게는 0.01 ~ 200 mg/kg이며, 더욱 바람직하게는 0.01 ~ 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 20 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 mg/kg이고, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다. 상기 투여 용량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 용어, “건강기능식품”은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

상기 건강기능식품 조성물은 담체, 희석제, 부형제, 및 첨가제 중 하나 이상을 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액체 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형화될 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 운동수행능력 향상 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 지페노사이드 화합물 이외에 미량의 미네랄, 비타민, 당류 및 공지의 운동수행능력 향상 효과를 가진 성분 등을 추가로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 운동수행능력 향상용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 운동수행능력 향상용 약학 조성물은 운동능력의 퇴화로 인한 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 이와 관련된 질환의 예로는 퇴행성 질환, 미토콘드리아 이상 질환, 지구력 저하증, 순발력 저하증, 무기력증, 근육 폐기 및 우울증 등을 들 수 있다. 본 발명의 조성물은 운동수행능력 향상 효과가 있으며, 운동의 형태 및 종류를 제한하지 않는다. 본 발명의 조성물은 운동수행능력 향상 효과가 있으며, 운동의 형태 및 종류를 제한하지 않는다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토텍스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유체 및 제제화에 관해서는 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 경구투여, 피부외용제 등으로 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

또한 상기 조성물로부터 선택되는 투여 수준은 화합물의 활성, 투여 경로, 치료되는 병태의 중증도 및 치료되는 환자의 병태 및 이전 병력에 따를 것이다. 그러나 원하는 치료 효과의 달성을 위해 요구되는 것보다 낮은 수준의 화합물의 용량에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시키는 것은 당업계의 지식 내에 있으며, 바람직한 투여량은 나이, 성별, 체형, 체중에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 약제학상 허용 가능한 제약 제제로 제제화 되기 전에 추가로 가공될 수 있으며, 바람직하게는 더 작은 입자들로 분쇄 또는 연마될 수 있다. 또한 상기 조성물은 병태 및 치료되는 환자에 따라 달라질 것이지만, 이는 비-독창적으로 결정할 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 투여 용량은 0.001 ~ 400 mg/kg이고, 바람직하게는 0.01 ~ 200 mg/kg이며, 더욱 바람직하게는 0.01 ~ 100 mg/kg이고, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 지페노사이드 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물에 대해 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다.

<실시예>

재료의 준비

지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI은 주식회사 엠보에서 구매하였고, 진세노사이드 Rg3는 시그마알드리치에서 구매하였다.

실시예

하기 표 1의 조성에 따라 실시예 1 내지 실시예 4의 조성물을 준비하였다.

구분	지페노사이드 화합물
실시예 1	지페노사이드 L
실시예 2	지페노사이드 L + 지페노사이드 LI (100 : 60)
실시예 3	지페노사이드 L + 지페노사이드 LI (100 : 10)
실시예 4	지페노사이드 L + 지페노사이드 LI (100 : 100)

< 인비트로 시험 >

<재료 및 방법>

1. 시험물질

양성대조물질로는 Creatine monohydrate (Cr)를 사용하였고, 모든 시험물질은 ㈜비티씨에서 제공하였다.

2. 세포배양 및 분화 유도

생쥐의 골격근육에서 유래한 근원세포 (myoblast)인 C2C12 세포는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하여 사용하였다. C2C12 세포는 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 세포배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO₂ 배양기 (5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 trypsin-2.65 mM EDTA를 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.

C2C12 세포가 배양접시의 90% 정도 찼을 때 근세포로 분화를 유도하기 위해 DMEM 배지에 2% horse serum (Gibco-Thermo Fisher Scientific)를 첨가한 근세포 분화배양액으로 교환하여 세포를 배양하였고, 근세포분화배양액은 2일마다 교환하였다.

3. 근세포 분화 유도 및 시험물질 처리

C2C12 세포를 2 × 10⁵ cells/well로 6-well plate에 분주하고, 24시간 동안 안정화시켰다. 각각의 시험물질이 근세포 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 근세포 분화배양액에 각 시험물질을 첨가하여 세포에 처리하였다. 하기 표 2와 같이 시험물질을 처리한 근세포분화배양액으로 세포배양액을 교환하여 4일 (mRNA 분석) 또는 7일간 (단백질 분석) 세포를 배양하였다.

시험군		시험물질
G1	-	-
G2	실시예 1	0.36 ㎍/mL
G3	실시예 2	0.36 ㎍/mL
G4	실시예 3	0.36 ㎍/mL
G5	실시예 4	0.36 ㎍/mL
G6	Cr	5 ㎍/mL Cr

4. Reactive oxygen species (ROS) 측정

C2C12 세포를 1 × 10⁴ cells/well이 되도록 96-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 이후 각각의 시험물질을 함유한 근세포분화배양액으로 교환하여 세포를 1시간 배양하였다. 1시간 후 세포를 PBS로 씻어주고 50 μM tert-butyl hydrogen peroxide (TBHP)를 함유한 배양액으로 3시간 동안 추가배양한 후 DCF-DA Assay Kit (Abcam)을 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 세포 내 ROS 수준을 측정하였다.

5. Total cell lysate 준비 및 단백질 발현 조사 (Western blot analysis)

C2C12 세포를 2 × 10⁵ cells/well로 6-well plate에 분주하고, 24시간 동안 안정화시켰다. 시험물질을 함유한 근세포분화배양액으로 세포배양액을 교환하여 7일간 배양하였다. 7일간 분화 유도된 세포에 lysis buffer (20 mmol/L HEPES, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 100 mmol/L NaF, 10 mmol/L sodium pyrophosphate, 1 mmol/L Na3VO4, 20 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL antipain, 10 μg/mL leupeptin, 80 μg/mL benzamidine HCl, 0.2 mmol/L PMSF)를 첨가한 후 균질화하고, 원심 분리하여 total cell lysate를 얻었다. Total cell lysate의 단백질 양은 BCA protein assay Kit (Thermo Scientific)을 사용하여 측정하였다. Total cell lysate (50 μg)를 10 % sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리한 후, polyvinylidene difluoride membrane (Milipore)에 이동시켰다. Membrane을 5% skim milk-TBST (20 mmol/L Tris·HCl, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 0.1% Tween 20)에서 1시간 동안 blocking한 후, 측정하고자 하는 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 동안 또는 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 사용한 항체 정보는 하기 표 3에 나타내었다. 그 후 horseradish peroxidase (HRP)-linked anti-rabbit IgG 또는 HRP-linked anti-mouse IgG를 첨가하여 1시간 교반하였으며, 검출된 단백질 밴드는 Luminata^TM Forte Western HRP Substrate (Millipore)를 사용하여 enhanced chemiluminscence 방법으로 가시화하였다. 단백질 발현 수준은 ImageQuant^TM LAS 500 imaging ystems (GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 사용하여 정량하였다.

항체명	세부정보		제조회사
p-AMPK	Phospho-AMPKα (Thr172)	Cat No. #2535	Cell Signaling Technology
AMPK	AMPKα	Cat No. #2532	Cell Signaling Technology
p-p38	Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)	Cat No. #9211	Cell Signaling Technology
p38	p38 MAPK	Cat No. #9212	Cell Signaling Technology
p-Sirt1	Phospho-Sirt1 (Ser47)	Cat No. #2314	Cell Signaling Technology
Sirt1	Sirt1	Cat No. #9475	Cell Signaling Technology
p-NRF2	Phospho-NRF2 (Ser40)	Cat No. ab76026	Abcam
NRF2	NRF2	Cat No. ab31163	Abcam
β-actin	Beta-actin	Cat No. #3700	Cell Signaling Technology

6. mRNA 발현 조사 (Real-time RT-PCR)

C2C12 세포를 2 × 10⁵ cells/well로 6-well plate에 분주하고, 24시간 동안 안정화시켰다. 시험물질을 함유한 근세포분화배양액으로 세포배양액을 교환하여 2일 또는 4일간 배양하였다. 세포를 수거 후 RNeasyO Plus Mini kit (QIAGEN)을 사용하여 total RNA를 분리하였고, micro-volume spectrophotometer (BioSpec-nano, SHIMADZU)을 사용하여 정량하였고, OD260/280 값이 1.8 이상인 RNA를 실험에 사용하였다.

Total RNA (2 μg)로부터 HyperScriptTM RT master mix kit (GeneAll Biotechnology)을 이용하여 cDNA를 얻은 후, Rotor-Gene 300 PCR (Corbett Research)와 Rotor-GeneTM SYBR Green kit (QIAGEN)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 실험에 사용한 primer 정보는 하기 표 4에 나타내었다. 유전자의 발현의 정량 분석은 Rotor-Gene 6000 Series System Software program (Corbett Research)을 이용하여 수행하였다.

mRNA		Primer sequences	Genebank No.
SOD2	Forward	5’-ATCAGGACCCATTGCAAGGA-3’	NM_013671.3
	Reverse	5’-AGGTTTCACTTCTTGCAAGCT-3’
GPx1	Forward	5′-CAGGTCGGACGTACTTGAG-3′	NM_001329528.1
	Reverse	5′-CAGGTCGGACGTACTTGAG-3′
UCP2	Forward	5’-CTCGTCTTGCCGATTGAAGGT-3’	NM_011671.5
	Reverse	5'-TCTGCAATGCAGGCAGCTGTC-3'
UCP3	Forward	5'-GCCTACAGAACCATCGCCAG-3'	NM_009464.3
	Reverse	5'-GCCACCATCTTCAGCATACA-3'
ERRα	Forward	5’-TTCGGCGACTGCAAGCTC-3’	NM_007953.2
	Reverse	5’-CACAGCCTCAGCATCTTCAATG-3’
LDH B	Forward	5′-CCTCAGATCGTCAAGTACAGCC-3′	NM_001316322.1
	Reverse	5′-ATCCGCTTCCAATCACACGGTG-3′
MCT1	Forward	5’-GCTGGGCAGTGGTAATTGGA-3’	XM_021196222.2
	Reverse	5'-CAGTAATTGATTTGGGAAATGCAT-3'
TFam	Forward	5’-ATAGGCACCGTATTGCGTGA-3’	NM_009360.4
	Reverse	5’-CTGATAGACGAGGGGATGCG-3’
CPT-1β	Forward	5′-CCTGGAAGAAACGCCTGATT-3′	NM_009948.2
	Reverse	5′-CAGGGTTTGGCGAAAGAAGA-3′
mtDNA	Forward	5’-CACGATCAACTGAAGCAGCAA-3’	NM_001362199.2
	Reverse	5’-ACGATGGCCAGGAGGATAATT-3’
MHC1	Forward	5′-CGCTCCACGCACCCTCACTT-3′	XM_017315841.2
	Reverse	5′-GTCCATCACCCCTGGAGAC-3′
MHC7	Forward	5’-GCTGGAAGATGAGTGCTCAGAG-3’	XM_017315841.2
	Reverse	5’-TCCAAACCAGCCATCTCCTCTG-3’
MHC2A	Forward	5’-CCATTCAGAGCAAAGATGCAGGG-3’	XM_021176019.2
	Reverse	5'-GCATAACGCTCTTTGAGGTTG-3'
MHC2B	Forward	5'-GCTAGGGTGAGGGAGCTTGAA-3'	XM_021175597.1
	Reverse	5'-AGACCCTTGACGGCTTCGA-3'
PGC-1α	Forward	5’-GTCCTTCCTCCATGCCTGAC-3’	XM_006503779.4
	Reverse	5’-GACTGCGGTTGTGTATGGGA-3’
PKB	Forward	5’-GGACTACTTGCACTCCGAGAAG-3’	XM_021201913.2
	Reverse	5’-CATAGTGGCACCGTCCTTGATC-3’
FNDC5	Forward	5'-ATGAGGTGACCATGAAGGAGATGGC-3'	XM_006503212.4
	Reverse	5’-CTGGTTTCTGATGCGCTCTTGGTT-3’
GSY	Forward	5’-CACAGAACGGTTGTCGGACTTG-3’	NM_030678.3
	Reverse	5’-AGGTGAAGTGGTCTGGAAAGGC-3’
SIRT1	Forward	5’-GCAACAGCATCTTGCCTGAT-3’	XM_021204930.2
	Reverse	5’-GTGCTACTGGTCTCACTT -3’
PPARy	Forward	5’-CAAAACACCAGTGTGAATTA-3’	XM_021164279.2
	Reverse	5’-ACCATGGTAATTTCTTGTGA-3’
GAPDH	Forward	5’-TGGGTGTGAACCATGAGAAG-3’	XM_029478683.1
	Reverse	5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3’

7. 통계처리

모든 분석 수치는 mean ± SEM으로 나타내었다. 수집된 결과는 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad software) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 시험물질 처리군과 대조군의 차이를 비교하기 위하여 Student’s t-test 및 one-way analysis variance (ANOVA)를 이용하였다. P < 0.05 이상일 때만 통계적으로 유의성 있는 것으로 판단하였다.

<시험예>

시험예 1: C2C12 세포의 세포 내 ROS 생성에 미치는 영항

ROS는 정상 세포의 호흡 과정에서 발생하는 미토콘드리아의 부산물로서, 산화적 스트레스는 ROS의 생성과 항산화적 방어능력 사이의 불균형에서 비롯된다. 비정상적으로 증가된 ROS는 근육세포의 기능 장애를 유발하며, 근세포의 단백질, 지질 및 핵산 등과 같은 세포 내 거대분자들의 손상을 일으킴으로써 세포 죽음을 야기하는 원인 인자로 작용한다.

실시예 1 내지 4에 따른 각각의 조성물이 C2C12 세포에서 세포 내 ROS 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)을 사용하여 ROS 생성을 측정하여 표 5에 나타내었다. DCF-DA는 세포에서 ROS에 의해 산화되어 형광을 나타내는 DCF로 전환되는 원리를 이용하여 측정한다.

시험군	산화 스트레스 유도 (50 μM TBHP)	시험물질	ROS 생성 (Fluorescence Intensity)
G0	-	-	16.32 ± 0.66
G1	+	-	37.97 ± 2.19***
G2	+	실시예 1	22.12 ± 0.70###
G3	+	실시예 2	20.03 ± 0.39###
G4	+	실시예 3	22.81 ± 1.15###
G5	+	실시예 4	23.54 ± 2.09###
G6	+	Cr	21.13 ± 2.74##

*, ** 및 ***는 G0군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G1).

#, ## 및 ###는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2, G3, G4, G5, G6).

상기 표 5를 살펴보면, C2C12 세포에 TBHP를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였을 때 (G1) ROS 생성은 37.97 ± 2.19로 정상 대조군 (G0)의 16.32 ± 0.66와 비교하여 현저히 증가하였다. 산화적 스트레스로 증가된 ROS 생성은 실시예 1 내지 5에 따른 조성물의 처리에 의해 현저히 감소하였다. STO 처리는 33.97 ± 2.22로 산화적 스트레스유도군 (G1)과 비교하여 ROS 생성이 다소 감소하였다. 양성대조물질인 Cr을 처리한 경우 ROS 생성은 21.13 ± 2.74로 산화적 스트레스 유도 대조군 (G1)에 비해 현저히 감소하였다. 이는 C2C12 세포에서 지페노사이드 화합물이 TBHP에 의해 유도된 산화적 스트레스에 의한 ROS 생성을 효과적으로 억제함을 나타낸다.

시험예 2: C2C12 세포의 peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 alpha (PGC-1α) 관련 단백질 변화에 미치는 영향

미토콘드리아는 에너지원을 산화시켜 ATP를 생산하는 근육의 발전소로서 운동부하가 지속적으로 주어질 때 더 많은 에너지를 산화할 수 있도록 그 수와 양이 증가하게 된다. PGC-1α는 미토콘드리아의 기능, 생합성 및 세포 에너지 대사의 전사를 조절하는 역할을 한다. PGC-1α 활성화는 AMP-activated protein kinase (AMPK) 및 Silent mating-type information regulation 2 homolog 1 (Sirt1)에 의해 유도되며 지구력 운동에 의해 활성화가 증가됨이 보고되었다. AMPK는 세포 내 에너지 상태를 감지하는 효소로써 세포 내 에너지가 부족한 상황, 즉 ATP에 비해 AMP가 증가하는 상황에서 활성화되어 정상 에너지 균형을 회복시키기 위해 다양한 대사경로를 조절한다. Sirt1은 근 수축에 따른 NAD+의 변화에 의해 활성이 증가하고, PGC-1α의 활성을 조절하기 때문에 운동으로 인한 골격근 내 미토콘드리아 생합성을 위한 중요한 조절자로 인식된다. p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)는 다양한 세포 외 자극에 의해 활성화되어 세포의 성장 및 분화, 세포주기 조절 등에 관여하는 것으로 알려진 효소로 운동이나 골격근 수축은 p38 MAPK의 활성을 증가시키며, 최근 p38 MAPK가 PGC-1α를 활성화한다고 보고되었다.

본 연구에서는 시험물질이 PGC-1α 활성화에 관련된 단백질 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 시험물질을 처리하여 제조한 total cell lysate을 사용하여 Western blot을 실시한 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 하기 표 6은 각 시험군의 PGC-1α 활성화에 관련된 단백질 발현량을 상대적 밴드 밀도(%대조군)로 비교하여 나타낸 것이다.

시험군	시험물질	단백질 발현량(%대조군)
		p-AMPK	p-Sirt1	p-p38	p-Nrf2
G1	-	100±0.0	100±0.0	100±0.0	100±0.0
G2	실시예 1	117.7±7.2	143.4±5.6*	133.1±7.1*	135.1±1.6***
G3	실시예 2	135.8±6.2	137.4±4.4	140.8±11.6	146.5±3.4
G4	실시예 3	119.6±3.4	142.1±2.8	135.2±6.4	134.7±2.5
G5	실시예 4	120.4±5.9	141.9±5.7	134.1±5.2	133.6±3.6
G6	Cr	104.6±14.4	114.0±11.1	151.5±41.0	116.2±11.4

상기 Western blot 분석 결과를 토대로 각 단백질에 대한 활성화 단백질의 비율을 통해 각 단백질의 활성을 평가하여 하기 표 7에 나타내었다.

시험군		p-AMPK/AMPK ratio	p-Sirt1/Sirt1 ratio	p-p38/p38 ratio	p-Nrf2/Nrf2 ratio
G1	-	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
G2	실시예 1	1.27±0.25	1.38±0.06*	1.27±0.07*	1.50±0.11*
G3	실시예 2	1.52±0.14	1.32±0.03*	1.38±0.10*	1.61±0.10*
G4	실시예 3	1.28±0.29	1.37±0.07*	1.28±0.10*	1.51±0.12*
G5	실시예 4	1.29±0.07	0.38±0.11*	1.27±0.16*	1.50±0.09*
G6	Cr	1.09±0.13	1.11±0.10	1.15±0.29	1.20±0.26

*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G6).

상기 표 6 및 표 7을 살펴보면, p-AMPK의 발현은 대조군(G1)과 비교하여 실시예의 조성물의 처리(G2 ~ G5)에 의해 증가하였다. p-Sirt1의 발현은 대조군(G1)과 비교하여 실시예의 조성물의 처리(G2 ~ G5)에 의해 유의적으로 증가하였다. p-p38 MAPK의 발현은 대조군(G1)과 비교하여 실시예의 조성물의 처리(G2 ~ G5)에 의해 유의적으로 증가하였다. p-p38/p38의 비율은 실시예의 처리에 의해 유의적으로 증가하였다.

활성화된 PGC-1α는 다양한 다른 전사인자들의 활성을 유도하는데 그 중 leucine zipper transcription factor인 nuclear factor erythroid-2 related factor 2 (Nrf2)의 활성화를 유도하여 항산화 유전자들의 발현을 조절한다. Nrf2는 산화적 스트레스 유도 시, 세포질에서 핵으로 이동하여 항산화 유전자의 promoter 부분에 결합하여 다양한 항산화 유전자의 발현을 유도한다. 실시예의 처리에 의해 p-Nrf2의 발현이 유의적으로 증가하였다. p-Nrf2/Nrf2 비율도 실시예의 처리에 의해 증가하였다.

이상의 결과 실시예에 따른 조성물의 처리는 C2C12세포에서 Sirt1, p38 MAPK, Nrf2의 활성화를 유의적으로 증가시켰다. 반면 CaMKK의 억제제인 STO의 처리는 AMPK, p38 MAPK, Nrf2의 활성화를 유의적으로 억제하여 이들이 Ca2+ level의 변화에 반응하여 활성화됨을 알 수 있고, 억제된 AMPK, p38 MAPK, Nrf2의 활성화는 실시예에 따른 조성물에 의해 회복되는 경향을 나타내었으나 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

시험예 3: C2C12 세포의 미토콘드리아 복제 관련 mRNA 발현에 미치는 영향

미토콘드리아는 ATP 생성, 세포사멸, 지방산 베타 산화, 철-황 결합체 합성 등 여러 가지 세포적 과정들을 위한 중심 기관이기 때문에 생명에 있어서 필수적인 세포소기관이다. 미토콘드리아는 독특하게도 핵에 존재하는 염색체 DNA와는 별도로 자신의 고유한 genome을 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 형태로 보유하고 있다.

Mitochondrial transcription factor A (Tfam)은 미토콘드리아의 핵구조를 변환시켜 ROS의 공격으로부터 DNA를 보호하여 mtDNA의 안정성 (stability) 및 mtDNA의 전사를 조절한다. Carnitine palmitoyl transferase-1 (CPT-1)은 미토콘드리아 내의 ADP 인산화에 관련하는 유전형질 중 지방 산화와 관련된 것으로 미토콘드리아의 외막을 통과한 지방산 (long-chain fatty acyl-CoA)이 세포 내막을 통과하여 미토콘드리아의 기질 내로 유입되도록 관여하는 효소이다.

C2C12 세포에 시험물질의 처리가 미토콘드리아 복제와 관련한 mtDNA, Tfam, CPT-1β의 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하여 하기 표 8에 나타내었다.

시험군		TFam	CPT1-β	mtDNA
G1	-	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
G2	실시예 1	0.91±0.10	1.83±0.41	1.29±0.41
G3	실시예 2	0.98±0.23	2.53±0.61	1.07±0.29
G4	실시예 3	0.92±0.12	1.81±0.17	1.27±0.13
G5	실시예 4	0.92±0.06	1.80±0.23	1.29±0.36
G6	Cr	0.48±0.07**	0.93±0.20	0.72±0.12*

*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G6).

표 8에 나타난 바와 같이 Tfam mRNA 발현은 모든 군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. CPT1-β mRNA 발현은 실시예 처리군 (G2 ~ G5)에서 증가하는 경향을 나타내었다. mtDNA mRNA 발현은 대조군 (G1)과 비교하여 Cr처리군 (G6)에서 유의적으로 감소하였다.

시험예 4: C2C12 세포의 근력타입변화관련 mRNA 발현에 미치는 영향

실시예 1 내지 4에 따른 각각의 조성물이 근력 타입을 대표하는 MHC1, MHC7, MHC2A, MHC2B mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하여 하기 표 9에 나타내었다.

시험군		MHC1	MHC7	MHC2A	MHC2B
G1	-	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
G2	실시예 1	10.30±1.75**	1.80±0.41	1.54±0.32	1.20±0.12
G3	실시예 2	12.93±1.47**	2.53±0.27	1.77±0.27	1.51±0.12
G4	실시예 3	8.55±1.64**	1.79±0.32	1.37±0.24	1.12±0.16
G5	실시예 4	9.61±0.95**	1.94±0.23	1.44±0.18	1.19±0.21
G6	Cr	4.50±1.43	7.87±2.66*	1.74±0.22*	1.10±0.10

*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G6).

미오신 (myosin)은 골격근에서 가장 많이 존재하는 단백으로 근육의 수축에 관여한다. 미오신은 미오신 중쇄 (myosin heavy chain, MHC)와 미오신 경쇄 (myosin light chain, MLC)로 구성되어있으며, MHC는 근육 수축 성상을 결정하는 중요한 요인이다. 골격근에서 잘 알려진 아형 중 MHC2A, MHC2B 아형은 주로 빠른 근수축 속도에 관여하는 것으로 알려져 있으며, MHC1과 MHC7 아형은 느린 근수축 속도에 관여하는 것으로 알려져 있다. MHC1 mRNA 발현은 대조군(G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2 ~ G5)에서 각각 유의적으로 증가하였다. MHC2A mRNA 발현은 실시예 처리군 (G2 ~ G5)에서 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적인 차이는 없었다. 즉, 실시예의 조성물의 처리는 MHC1과 MHC7 mRNA 발현을 증가시켜 느린 근수축 속도에 관여하는 지근 타입으로의 분화를 유도하는 것으로 사료된다.

실시예 1 내지 4에 따른 각각의 조성물이 근력 타입을 대표하는 PGC-1α, PKB, FNDC5 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하여 하기 표 10에 나타내었다.

시험군		PGC-1α	PKB	FNDC5
G1	-	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
G2	실시예 1	11.75±3.82*	3.04±0.46**	2.97±0.39**
G3	실시예 2	13.23±2.64*	4.13±0.28**	3.31±0.38**
G4	실시예 3	11.54±2.13*	3.11±0.45**	2.84±0.24**
G5	실시예 4	11.86±1.61*	3.21±0.60**	2.89±0.33**
G6	Cr	1.54±1.10	2.18±0.51	1.83±0.47

*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G6).

PGC-1α는 골격근 내 미토콘드리아 생합성, 근섬유 형태의 특수화 (fast-to-slow fiber type switching) 등과 같이 운동에 따른 골격근 적응을 위한 유전자 조절에 핵심적인 역할을 하는 전사 보조 활성 인자로 알려져 있다. PGC-1α mRNA발현은 실시예 처리군 (G2 ~ G5)에서 대조군 (G1)과 비교하여 유의적으로 증가하였다. Protein kinase B (PKB)는 Akt로도 알려져 있으며, glucose metabolism 및 여러 세포 대사과정에서 중요한 역할을 한다. GLUT4의 상위 신호전달 인자인 PKB는 GLUT4에 신호를 전달하여 근육 내 포도당 이동을 가능하게 한다. PKB mRNA 발현은 실시예 처리군 (G2 ~ G5)에서 대조군 (G1)과 비교하여 유의적으로 증가하였다. 운동에 반응하여 골격근에서 활성화된 PGC-1α은 골격근 막 단백질인 FNDC5 (fibronectin type III domain-containing protein 5)와 함께 산화 스트레스 조절 기전에 관여할 뿐만 아니라 인슐린 신호전달 경로를 활성화시켜 인슐린 민감성을 향상 시킨다. FNDC5 mRNA 발현은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2 ~ G5)에서 유의적으로 증가하였고, 이외의 모든 군은 유의적인 차이를 나타내지 않았다 .

시험예 5: C2C12 세포의 에너지 관련 mRNA 발현에 미치는 영향

실시예 1 내지 4에 따른 각각의 조성물이 근육세포의 에너지 대사에 관여하는 GSY, SIRT1 및 PPARγ mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하여 표 11에 나타내었다.

시험군		GSY	Sirt1	PPARγ
G1	-	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
G2	실시예 1	2.71±0.32**	1.40±0.22	1.16±0.47
G3	실시예 2	3.06±0.29**	1.64±0.17	1.29±0.34
G4	실시예 3	2.64±0.31**	1.36±0.09	1.10±0.11
G5	실시예 4	2.70±0.18**	1.38±0.18	1.18±0.20
G6	Cr	2.30±0.39*	1.13±0.18	2.93±1.32

*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G6).

Glycogen Synthase (GSY)은 glycogenesis의 핵심효소로 인슐린에 의한 glycogen의 합성 및 저장 작용에 관여하는 대사 관련 효소이다. 골격근 내의 glycogen은 운동 시에 주요 에너지원이며, 운동 강도가 높을수록 glycogen에 대한 에너지 의존도가 높다. GSY mRNA 발현은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2 ~ G5)에서 유의적으로 증가하였고, 양성대조물질인 Cr 처리군 (G6)에서도 유의적으로 증가하였다. 운동 시 골격근 내에 저장되어 있던 ATP가 감소하면서 에너지 요구량이 급격히 증가하게 되는데, 이와 관련된 세포내 NAD+ 증가는 Sirt1을 활성화 시키고, 활성화된 Sirt1은 운동에 필요한 에너지 생성을 위해 에너지생성과 관련된 세포질 및 핵 내 전사인자들을 발현시킨다. Sirt1 mRNA 발현은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2 ~ G5)에서 증가하는 경향을 나타내었지만, 유의적인 차이는 없었다. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ)는 핵 수용체에 속하는 전사인자로 리간드에 의하여 활성화되어 지질과 글루코스 대사 및 에너지 항상성과 관련된 유전자를 조절하며, 세포의 증식과 분화를 조절하는 역할을 한다.

또한 PPAR-γ는 PGC-1α와의 상호작용을 통해서 골격근에서의 지방산 산화 능력을 조절한다. PPAR-γ mRNA 발현은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 처리군 (G2 ~ G5)에서 증가하는 경향을 나타냈으나 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

이상의 결과를 통해 실시예에 따른 조성물의 주요성분인 지페노사이드 화합물은 산화적 스트레스를 억제하고, 근육세포 안의 미토콘드리아 생합성에 관련된 다양한 유전자들의 발현을 증가시킴을 관찰하였다. 이는 실시예에 따른 조성물이 운동으로 인한 피로 억제 및 운동수행능력 향상을 위한 기능성 소재로서의 활용 가능성이 있는 것으로 사료된다.

<인비보 시험>

<재료 및 방법>

1. 시험물질

양성대조물질로는 Creatine monohydrate (Cr)를 사용하였다.

2. 동물실험 승인

본 연구에서의 모든 동물실험은 한림대학교 동물실험윤리위원회의 승인 아래 동물실험 규정에 따라 수행하였다 (Hallym 2019-28).

3. In vivo 체계에서 지페노사이드의 근피로 개선 효능 평가 - 운동 없이 시료만 섭취

(1) 실험동물

특정병원체 (specific pathogen free)가 없는 5주령, 수컷 ICR 생쥐를 (주)두열바이오텍에서 구입하여 사용하였다. 1주일간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기회수 10~15회/시간, 조명시간 12시간 (08:00~20:00), 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 시험 전 기간 실험동물은 실험동물용 고형사료 ((주) 카길애그리퓨리나)와 음수를 자유 섭취하도록 하였다.

시험군		동물수	시험물질 (mg/kg BW)
G1	-	10	-
G2	실시예 1	10	7
G3	실시예 2	10	7
G4	실시예 3	10	7
G5	실시예 4	10	7

(2) 시험군, 시험물질 투여

1주일간의 적응 기간을 거친 후 건강한 동물을 선별하여 난괴법에 의거하여 마우스를 각 군당 10마리씩 6그룹으로 나누어 준비하였다. 일반대조군은 5% tween 80-saline을 경구투여하였고, 양성대조군은 Creatine monohydrate (Cr) 75 mg/kg body weight (BW)을 경구투여하였으며, 시험군들(G2 ~ G5)은 실시예 1 내지 4에 따른 조성물을 각각 7 mg/kg body weight (BW)씩 음수에 녹여 17일 동안 매일 일정한 시간에 경구 투여하였다. 시험 전 기간 실험동물에게 실험동물용 고형사료 ((주) 카길애그리퓨리나) 식이를 공급하였고, 식이와 음수는 자유로이 섭취하도록 하였다.

(3) 체중 측정

시험 기간 동안 매주 일정한 시간에 실험동물의 체중을 측정하였다.

(4) 강제수영 시험 및 혈중 젖산 (lactate) 함량 측정

실험동물의 강제수영 (weight-loaded forced swimming test)은 다음과 같이 실시하였다. 즉, 플라스틱 수조 (90 x 45 x 45 cm)에 물의 깊이를 35cm가 되도록 채우고, 물의 온도를 25 ± 1℃로 유지하였다. 실험동물의 체중의 5%에 해당하는 추를 미근부 (꼬리)에 매달은 후 수조에서 수영을 실시하였고, 탈진의 판단은 실험동물이 물속에서 7초간 표면상으로 떠오르지 않는 상태로 판정하였다.

시험물질 투여 10일차와 12일차에 15분씩 총 2회 수영 적응 운동을 시행하였고, 마지막 수영 적응 운동 2일 후(시험물질 투여 14일차) 16시간 절식한 후 강제수영 시험을 시행하여 탈진까지의 수영시간을 측정하였다.

실험동물의 혈중 젖산 함량은 강제수영시험 시작 전, 수영 직후, 수영 후 10분, 30분에 실험동물의 꼬리에서 혈액을 취해 젖산측정기 (Lactate Pro2, Arkray)를 사용하여 혈중 젖산 함량을 측정하였다.

(5) 채혈

시험물질 투여 17일 차에 체중 부하 없이 일정 시간 (60분) 수영을 시행한 후 실험동물을 tribromoethanol을 tertiary amyl alcohol로 희석하여 만든 마취제를 사용하여 마취한 후 안와에서 채혈하였다. 혈액은 serum separate tube (Becton Dickinson)에 담아 30분간 실온에서 방치하고 3,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였고, 분석 전까지 -70℃에 보관하였다.

(6) 혈청 분석

혈청 내 blood urea nitrogen (BUN)과 creatinine (CREA) 함량 및 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH)의 활성은 혈액생화학분석기 (KoneLab 20 XT, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다. 혈청 내 젖산 함량은 젖산 측정 kit (abcam)을 사용하여 제조회사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.

4. In vivo 체계에서 지페노사이드의 운동수행능력 증진 효능 평가 - 운동과 병행하여 시료 섭취

(1) 실험동물

특정병원체 (specific pathogen free)가 없는 5주령, 수컷 ICR 생쥐를 (주)두열바이오텍에서 구입하여 사용하였다. 1주일간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기회수 10~15회/시간, 조명시간 12시간 (08:00~20:00), 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 시험 전 기간 실험동물은 실험동물용 고형사료 ((주) 카길애그리퓨리나)와 음수를 자유 섭취하도록 하였다.

(2) 시험군 및 시험물질 투여

1주간의 적응 기간을 거친 후 건강한 동물을 선별하여 난괴법에 의거하여 6개의 군으로 분류하였다. 즉, (G1) 비운동 대조군, (G2) 비운동 + 7 mg/kg body weight (BW) 실시예 1 투여군, (G3) 비운동 + 7 mg/kg BW 실시예 2 투여군, (G4) 비운동 + 7 mg/kg BW 실시예 3 투여군, (G5) 비운동 + 7 mg/kg BW 실시예 4 투여군, (G6) 운동 대조군, (G7) 운동 + 7 mg/kg BW 실시예 1 투여군, (G8) 운동 + 7 mg/kg BW 실시예 2 투여군, (G9) 운동 + 7 mg/kg BW 실시예 3 투여군, (G10) 운동 + 7 mg/kg BW 실시예 4 투여군, (G11) 운동 + 75 mg/kg BW Cr 투여군으로 분류하였다. 각 시험군은 각 10마리의 실험동물을 사용하였다.

시험물질은 음수에 녹여 6주 동안 매일 일정한 시간 (운동 2시간 전)에 경구투여하였다. 시험 전 기간 실험동물에게 실험동물용 고형사료 ((주) 카길애그리퓨리나) 식이를 공급하였고, 식이와 음수는 자유로이 섭취하도록 하였다.

시험군		동물수	트레드밀 운동	시험물질 (mg/kg BW)
G1	-	10	-	-
G2	실시예 1	10	-	7
G3	실시예 2	10	-	7
G4	실시예 3	10	-	7
G5	실시예 4	10	-	7
G6	-	10	+	-
G7	실시예 1	10	+	7
G8	실시예 2	10	+	7
G9	실시예 3	10	+	7
G10	실시예 4	10	+	7
G11	Cr	10	+	75

(3) 체중 및 식이 섭취량 측정

시험 기간 동안 매주 일정한 시간에 실험동물의 체중을 측정하였다. 실험동물의 식이 섭취량은 시험 기간 섭취한 양을 측정하여 총 식이 섭취량과 일일 식이 섭취량을 산출하였다.

(4) 트레드밀 시험 및 지구력 운동

실험동물의 지구력 운동훈련은 소동물용 트레드밀 (Exer3/6-treadmill, Columbus Instruments)을 이용하여 6주간 실시하였다. 지구력 운동 훈련은 경사도 10도, 속도 10 m/min으로 하여 1주차에는 15분, 2주차에는 20분, 3주차에는 25분, 4주차에는 30분, 5주차에는 35분, 6주차에는 40분간 운동을 시행하였다.

6주간의 운동 훈련 후 지구력 운동 수행능력을 평가하기 위하여 경사도 10도, 속도 10 m/min으로 5분간 운동을 시작한 후, 매 1분마다 1 m/min의 속도를 높여 운동 강도를 증가시켜 최대 25 m/min의 속도에서 탈진까지의 운동 지속시간을 측정하였다. 탈진상태는 실험동물이 주행 중에 트레드밀의 후미 부분으로 쳐진 상태에서 10초 이상 달릴 수 없는 시점으로 판정하였다. 실험동물의 운동량은 아래의 식으로 산출하였다.

운동량(Exercise capacity)

= body weight (kg) × speed (m/s) × time (s) × grade × 9.8 m/s²

(5) 제지방 (lean body)률 및 체지방 (fat)률 측정

시험 종료 1일 전에 실험동물을 마취 후 dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA, PIXImusTM, GE Lunar)를 사용하여 체구성 성분을 측정하여 제지방률 및 체지방률을 평가하였다.

(6) 채혈 및 조직 적출

실험동물을 희생 전 tribromoethanol을 tertiary amyl alcohol로 희석하여 만든 마취제를 사용하여 마취한 후 안와채혈을 하였다. 혈액은 serum separate tube (Becton Dickinson)에 담아 30분간 실온에서 방치하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였고, 분석 전까지 -70℃에 보관하였다. 채혈 후 실험동물을 희생하여 간과 골격근 [quadriceps femoris muscle (QF, 대퇴사두근), gastrocnemius muscle (GA, 장딴지근), soleus muscle (SOL, 가자미근), extensor digitorum longus muscle (EDL, 장지신근)]을 적출한 후 차가운 생리식염수로 헹구어 여과지로 여분의 물기를 제거한 후 무게를 측정하였다. 가자미근 (SOL)의 일부는 4% paraformaldehyde (PFA)에 고정한 후 파라핀에 포매를 하여 조직면역염색을 수행하였고, 일부는 total RNA를 분리한 후 real-time RT-PCR을 수행하였다. 장딴지근 (GA)의 일부는 단백질을 분리한 후 Western blot을 수행하였다. 나머지 조직은 분석 전까지 -70℃에 보관하였다.

(7) 혈액 생화학 분석

혈청 내 포도당 (Glucose), 중성지방 (TG), 총콜레스테롤 (CHOL), LDL-콜레스테롤 (LDL-CHOL), HDL-콜레스테롤 (HDL-CHOL)의 함량 및 blood urea nitrogen (BUN), creatinine (CREA)의 함량과 creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP) 활성은 혈액생화학분석기 (KoneLab 20 XT, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다. 혈청 내 젖산 (lactate) 함량은 젖산 측정 kit (abcam)을 사용하여 제조회사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.

(8) 간 조직액 제조

간 조직 내 글리코겐 (glycogen) 함량을 측정하기 위해 간 조직액을 제조하였다. 100 mg 간 조직에 1 mL PBS를 넣어 homogenizer로 균질화하였다. 균질화한 용액 을 5,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취해 간 조직액으로 사용하였다.

(9) 근육 조직액 제조

근육 조직 내 글리코겐 함량 및 효소 활성 측정을 위해 근육 조직액을 제조하였다. 적출한 골격근 대퇴사두근 (QF), 장딴지근 (GA), 가자미근 (SOL), 장지신근 (EDL)에 1 mL PBS를 넣어 homogenizer로 균질화하였다. 균질화한 용액을 5,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취해 근육 조직액으로 사용하였다. 근육 조직액의 단백질 양은 BCA protein assay kit (Thermo Scientific)을 사용하여 측정하였다.

(10) 간 및 골격근 내 글리코겐 함량 측정

간 및 골격근 (GA) 내 글리코겐 함량은 글리코겐 측정 kit을 사용하여 제조회사 (abcam)에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.

(11) 골격근 내 효소 활성 측정

골격근 (QF, SOL, EDL) 내 citrate synthase (BioVision), beta-hydroxyacyl CoA-dehydrogenase (MyBioSource), lactate dehydrogenase (abcam)의 활성은 각각의 측정 kit을 사용하여 제조회사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다

(12) 골격근의 조직형태학적 관찰 (hematocylin & eosin 염색)

4% PFA로 고정된 가자미근을 파라핀에 포매하고, 포매된 조직들로부터 5 μm의 조직 절편을 제작하였다. 파라핀 제거 후, 100% 알코올에서 시작하여 0% 알코올 (H₂O)까지 순차적으로 알코올의 %를 낮춤으로 조직을 수화하였다. 가자미근 (SOL)의 조직형태학적 관찰을 위해 Accustain® Hematoxylin and Eosin Stains (Sigma-Aldrich Co.)을 사용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 조직을 염색하였다. 이후 광학현미경 (Carl Zeiss)을 사용하여 조직학적 변화를 관찰하였다.

(13) 근육조직 내의 단백질 발현 조사 (Western blot analysis)

근육조직 (장딴지근, GA) 내 단백질 발현을 조사하기 위해 lysis buffer (20 mmol/L Hepes, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 100 mmol/L NaF, 10 mmol/L sodium pyrophosphate, 1 mmol/L Na3VO4, 20 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL antipain, 10 μg/mL leupeptin, 80 μg/mL benzamidine HCl, 0.2 mmol/L PMSF)를 첨가한 후 homogenizer로 균질화하였다. 균질화한 용액을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취해 근육조직 lysates 얻었다. 근육 조직 lysate의 단백질 양은 BCA protein assay kit (Thermo Scientific)을 사용하여 측정하였다.

단백질 (50 μg)을 10 % sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리한 후, polyvinylidene difluoride membrane (Milipore)에 이동시켰다. Membrane을 5% skim milk-TBST (20 mmol/L Tris·HCl, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 0.1% Tween 20)에서 1시간 동안 blocking 한 후, 측정하고자 하는 antibody를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 동안 또는 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 실험에 사용한 항체 정보는 하기 표 14에 나타내었다. 그 후 horseradish peroxidase (HRP)-linked anti-rabbit IgG, HRP-linked 또는 anti-mouse IgG 를 첨가하여 1시간 교반하였으며, 각 단백질 밴드는 LuminataTM Forte Western HRP Substrate (Millipore)를 사용하여 enhanced chemiluminscence 방법으로 가시화하였다. 단백질 발현 수준은 ImageQuantTM LAS 500 imaging systems (GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 사용하여 정량하였다.

항체명	세부정보		제조회사
p-AMPK	Phospho-AMPKα (Thr172)	Cat No. #2535	Cell Signaling Technology
AMPK	AMPKα	Cat No. #2532	Cell Signaling Technology
p-p38	Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)	Cat No. #9211	Cell Signaling Technology
p38	p38 MAPK	Cat No. #9212	Cell Signaling Technology
p-PGC1α	Phospho-PGC1α (Ser571)	Cat No. AF6650	R&D system
PGC1α	PGC1α	Cat No. #4259	Cell Signaling Technology
p-NRF2	Phospho-NRF2 (Ser40)	Cat No. ab76026	Abcam
NRF2	NRF2	Cat No. ab31163	Abcam
β-actin	Beta-actin	Cat No. #3700	Cell Signaling Technology

(14) 근육조직의 mRNA 발현 조사 (real-time RT-PCR)

시험 종료 시 수집한 근육조직 (SOL)에서 TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 total RNA를 분리하였고, micro-volume spectrophotometer (BioSpec-nano, SHIMADZU)을 사용하여 정량하였고, OD260/280 값이 1.8 이상인 RNA를 실험에 사용하였다. Total RNA (2 μg)로부터 HyperScriptTM RT master mix kit (GeneAll Biotechnology)을 이용하여 cDNA를 얻은 후, Rotor-Gene 300 PCR (Corbett Research)와 Rotor-GeneTM SYBR Green kit (QIAGEN)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 실험에 사용한 primer 정보는 하기 표 15에 나타내었다. 유전자의 발현의 정량 분석은 Rotor-Gene 6000 Series System Software program (Corbett Research)을 이용하여 수행하였다.

mRNA		Primer sequences	Genebank No.
SOD2	Forward	5’-ATCAGGACCCATTGCAAGGA-3’	NM_013671.3
	Reverse	5’-AGGTTTCACTTCTTGCAAGCT-3’
GPx1	Forward	5′-CAGGTCGGACGTACTTGAG-3′	NM_001329528.1
	Reverse	5′-CAGGTCGGACGTACTTGAG-3′
UCP2	Forward	5’-CTCGTCTTGCCGATTGAAGGT-3’	NM_011671.5
	Reverse	5'-TCTGCAATGCAGGCAGCTGTC-3'
UCP3	Forward	5'-GCCTACAGAACCATCGCCAG-3'	NM_009464.3
	Reverse	5'-GCCACCATCTTCAGCATACA-3'
PGC1α	Forward	5’-GTCCTTCCTCCATGCCTGAC-3’	XM_006503779.4
	Reverse	5’-GACTGCGGTTGTGTATGGGA-3’
PPARδ	Forward	5’-GGACCAGAACACACGCTTCCTT-3’	NM_011145.3
	Reverse	5’-CCGACATTCCATGTTGAGGCTG-3’
MCT1	Forward	5’-GCTGGGCAGTGGTAATTGGA-3’	XM_021196222.2
	Reverse	5'-CAGTAATTGATTTGGGAAATGCAT-3'
CPT1β	Forward	5′-CCTGGAAGAAACGCCTGATT-3′	NM_009948.2
	Reverse	5′-CAGGGTTTGGCGAAAGAAGA-3′
ERRα	Forward	5’-TTCGGCGACTGCAAGCTC-3’	NM_007953.2
	Reverse	5’-CACAGCCTCAGCATCTTCAATG-3’
LDH B	Forward	5′-CCTCAGATCGTCAAGTACAGCC-3′	NM_001316322.1
	Reverse	5′-ATCCGCTTCCAATCACACGGTG-3′
mtDNA	Forward	5’-CACGATCAACTGAAGCAGCAA-3’	NM_001362199.2
	Reverse	5’-ACGATGGCCAGGAGGATAATT-3’
NRF-1	Forward	5’-GGCAACAGTAGCCACATTGGCT-3’	XM_030255219.1
	Reverse	5’-GTCTGGATGGTCATTTCACCGC-3’
Tfam	Forward	5’-ATAGGCACCGTATTGCGTGA-3’	NM_009360.4
	Reverse	5’-CTGATAGACGAGGGGATGCG-3’
IL-6	Forward	5’-CCTCTGGTCTTCTGGAGTACC-3’	NM_031168.2
	Reverse	5’-ACTCCTTCTGTGACTCCAGC-3’
TNF-α	Forward	5’-ATGAGCACAGAAAGCATGA-3’	XM_021149735.1
	Reverse	5’-AGTAGACAGAAGAGCGTGGT-3’
PPARγ	Forward	5’-CAAAACACCAGTGTGAATTA-3’	XM_021164279.2
	Reverse	5’-ACCATGGTAATTTCTTGTGA-3’
GSY	Forward	5’-CACAGAACGGTTGTCGGACTTG-3’	NM_030678.3
	Reverse	5’-AGGTGAAGTGGTCTGGAAAGGC-3’
GAPDH	Forward	5’-TGGGTGTGAACCATGAGAAG-3’	XM_029478683.1
	Reverse	5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3’

5. 통계 처리

모든 분석 수치는 mean ± SEM으로 나타내었다. 수집된 결과는 SAS statistical software, version 9.4 또는 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad software) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 시험물질 투여군과 대조군의 차이를 비교하기 위하여 Student’s t-test 및 one-way analysis variance (ANOVA)를 이용하였다. 또한, 대조군과 시험물질 투여군 간의 차이를 비교하기 위해 ANOVA로 분석 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검증하였다. p < 0.05 이상일 때만 통계적으로 유의성 있는 것으로 판단하였다.

<시험예>

<인비보 체계에서의 근피로 개선 효능 평가> - 운동 없이 시료만 섭취한 경우

시험예 6: 실험동물의 체중에 미치는 영향

시험 기간 동안 매주 1회 실험동물의 체중을 측정하여 표 16에 나타내었다. 모든 시험군의 실험동물은 시험 기간 지속적으로 체중이 증가하여 정상적인 체중 변화를 나타내었다. 시험 기간 동안 대조군 (G1)과 모든 시험물질 투여군 (G2 ~ G5)간의 체중은 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

시험군		0주	1주	2주
G1	-	31.0±0.5	33.5±0.4	34.4±0.5
G2	실시예 1	31.0±0.3	33.2±0.8	34.1±0.9
G3	실시예 2	31.1±0.1	33.5±0.6	34.0±0.6
G4	실시예 3	31.0±0.4	33.2±0.5	34.1±0.5
G5	실시예 4	30.9±0.2	33.3±0.4	34.1±0.6

시험예 7: 운동(강제수영) 시간에 미치는 영향

시험물질의 운동 피로 개선 효과를 평가하고자 실험동물 체중의 5%에 해당하는 추를 꼬리에 매달아 탈진 시까지의 수영 시간을 측정하여 표 17에 나타내었다.

시험군		탈진 시까지 걸리는 시간(sec)
G1	-	1119.2±125.2
G2	실시예 1	1193.4±176.8
G3	실시예 2	1351.7±201.5**
G4	실시예 3	1190.3±157.3
G5	실시예 4	1189.7±165.4

표 17을 살펴보면, 탈진 시까지 걸린 시간은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 2 투여군(G3)에서 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다.

시험예 8: 운동(강제수영) 전후 젖산 농도에 미치는 영향

운동 시 혈중 젖산 수치의 증가는 운동 강도와 비례하는 것으로 알려져 있고, 유산소성 운동능력 지표로 젖산 역치가 이용되었으며, 운동 시 또는 회복 시의 혈중 젖산 제거 능력은 운동 수행능력과 양의 상관관계를 나타낸다.

시험물질의 투여가 운동 (강제수영) 전후 혈중 젖산 농도에 미치는 영향을 조사하여 표 18에 나타내었다.

시험군		운동(강제수영) 전후의 젖산 농도 (μmol/L)
		강제수영 직전	강제수영 직후
			0 min	10 min	30 min
G1	-	1.29±0.06	14.78±1.22	11.13±0.77	8.32±1.40
G2	실시예 1	2.27±0.07	12.94±0.56	10.09±1.28	8.68±1.54
G3	실시예 2	2.11±0.22	12.11±0.18	8.64±1.12*	6.12±1.26*
G4	실시예 3	2.21±0.06	12.77±0.24	10.14±1.17	8.89±1.51
G5	실시예 4	2.20±0.05	12.86±0.37	10.16±1.31	8.88±1.48

상기 표 18을 살펴보면, 모든 시험군의 혈중 젖산 농도는 운동전과 비교하여 운동직후 (탈진 시)에 최대치를 나타냈으며 시간이 경과할수록 혈중 젖산 농도는 감소하였다. 특히, 실시예 2에 따른 조성물은 운동 전후 혈중 젖산농도를 유의적으로 감소시켰다.

시험예 9: 혈청 지표에 미치는 영향

체중 부하 없이 일정 시간 (60분) 수영을 시행한 후 채취한 혈청 내 젖산, BUN, CREA의 함량과 CK, LDH, ALT, AST 활성을 측정하여 표 19에 나타내었다.

구분	G1	G2	G3	G4	G5
	-	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4
젖산 (μmol/L)	5.35±0.33	4.53±0.49*	3.42±0.36**	4.52±0.27*	4.46±0.52*
LDH (U/L)	1030.7±124.6	1224.3±162.1	912.6±104.5*	1216.4±117.5	1221.5±121.7
BUN (mg/dL)	9.54±0.72	8.15±0.68	8.26±0.64	8.07±0.14	8.11±0.19
CREA (mg/dL)	0.34±0.01	0.35±0.01	0.33±0.01	0.34±0.02	0.35±0.01
CK (U/L)	1094.5±260.5	1896.1±196.4	1124.7±181.4	1765.8±118.2	1871.4±213.7
ALT (U/L)	57.88±12.10	100.41±19.75	67.86±15.45	95.13±14.59	97.24±13.68
AST (U/L)	106.45±15.81	160.81±20.53	124.15±14.19	157.46±14.87	162.31±15.88

젖산 (lactate)은 조직 내 무산소성 해당작용에서 pyruvate 가 환원되어 생성된 물질로 근세포 내의 환경을 산성화시키고 phosphorylase의 활성과 myosin ATPase 의 활성도를 저해하여 운동 수행능력을 감소시키는 원인으로 작용하기 때문에 많은 연구에서 운동에 의한 피로 지표로 이용하고 있다. Lactate dehydrogense (LDH)는 pyruvate로부터 lactate의 형성을 촉매하는 효소로써, 고강도의 운동시 과량의 pyruvate가 생성되며 이를 젖산으로 전환하는 과정을 촉매하는 LDH 활성이 증가하게 된다. 따라서 혈청 LDH 활성의 증가는 골격근의 부담이 증가하는 것으로 근 손상의 지표가 된다.

상기 표 19를 살펴보면, 혈청 내 젖산 농도는 대조군(G1)과 비교하여 실시예 투여군 (G2 ~ G4)에서 유의적으로 감소하였고, 혈청 내 LDH 활성은 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 투여군 (G2)에서 유의적으로 감소하였다.

<인비보 체계에서의 운동수행능력 향상 효능 평가> - 운동과 병행하여 시료 섭취한 경우

시험예 10: 실험동물의 체중

시험 기간 동안 2주에 1회 실험동물의 체중을 측정하여 하기 표 20에 나타내었다.

시험군		실험동물의 체중 (g)
		0주	2주	4주	6주
G1	-	26.9±0.3	34.8±0.5	39.0±0.8	42.5±0.7
G2	실시예 1	26.6±0.4	32.7±0.7	35.5±1.0	37.9±1.2
G3	실시예 2	26.6±0.1	32.5±0.3	35.0±0.7	37.4±0.8
G6	-	26.6±0.2	31.8±0.4	35.4±0.5	38.7±0.5
G7	실시예 1	26.5±0.2	30.5±0.4	33.0±0.5	36.6±0.7
G8	실시예 2	26.6±0.3	30.4±0.3	33.0±0.5	36.1±0.8
G9	실시예 3	26.5±0.2	30.3±0.4	33.1±0.4	36.5±0.5
G10	실시예 4	26.4±0.2	30.4±0.2	32.9±0.4	36.4±0.4
G11	Cr	26.8±0.3	31.2±0.6	34.0±0.8	38.0±1.0

상기 표 20을 살펴보면, 모든 군의 실험동물은 시험 기간 동안 지속적으로 체중이 증가하여 정상적인 체중 변화를 나타내었다. 비운동 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 투여군 (G2)의 체중은 4주차부터 시험 종료 시까지 체중이 유의적으로 감소하였고, 운동 대조군 (G6)의 체중은 비운동 대조군 (G1)과 비교하여 1주차부터 시험 종료 시까지 체중이 유의적으로 감소하였다. 운동 시험 군에서 실시예 투여군 (G7 ~ G10)의 체중은 운동 대조군 (G6)과 비교하여 2주차부터 유의적으로 감소하였다.

시험예 11: 탈진 시까지의 운동시간과 운동량에 미치는 영향

시험물질의 지구력 운동 수행능력을 평가하기 위하여 경사도 10도, 속도 10 m/min으로 5분간 운동을 시작한 후, 매 1분 마다 1 m/min의 속도를 높여 운동 강도를 증가시켜 최대 25 m/min의 속도에서 탈진까지의 운동 지속시간을 측정하여 표 21에 나타내었다.

시험군		탈진시까지의 시간 및 운동량 (g)
		탈진시간 (sec)	운동량
G1	-	1,119±58	1,217±127
G2	실시예 1	1,472±66*	1,583±91*
G3	실시예 2	1,675±49**	1,794±87**
G4	실시예 3	1,463±75*	1,559±43*
G5	실시예 4	1,531±64*	1,611±84*
G6	-	1,950±85***	2,406±123***
G7	실시예 1	2,393±93+	2,832±119+
G8	실시예 2	2,850±74+++	3,710±51+++
G9	실시예 3	2,384±67+	2,716±75+
G10	실시예 4	2,274±91+	2,893±48+
G11	Cr	2,674±177++	3,668±279++

*, ** 및 ***는 G1군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G2~G5, G6).

+, ++ 및 +++는 G6군과 비교하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서 유의적 차이가 있음을 의미한다(G7~G11).

상기 표 21에 나타낸 바와 같이, 탈진 시까지의 운동시간은 비운동 대조군 (G1)이 1,119 ± 58초로 다른 시험군과 비교하여 운동시간이 가장 짧았으며, 비운동 시험군의 실시예 투여군 (G2 ~ G5) 및 운동 대조군 (G6)은 비운동 대조군 (G1)에 비해 탈진 시까지의 운동 시간이 유의적으로 증가하였다. 운동 시험군의 실시예 투여군 (G7 ~ G10) 및 Cr 투여군 (G11)은 운동 대조군 (G6)과 비교하여 탈진 시까지의 운동 시간이 유의적으로 증가하였다.

실험동물의 운동량을 산출한 결과, 비운동 대조군 (G1)에 비해 비운동 시험군의 실시예 투여군 (G2 ~ G5)은 운동량이 유의적으로 증가하였다. 운동 대조군 (G6)의 운동량은 비운동 대조군 (G1)과 비교하여 현저히 증가하였고, 운동 시험군의 실시예 투여군 (G7 ~ G10) 및 Cr 투여군 (G11)의 운동량은 운동 대조군 (G6)과 비교하여 유의적으로 증가하였다.

이는 실시예에 따른 조성물의 투여가 운동수행능력을 향상시키는 효과가 있음을 나타낸다.

시험예 12: 간과 근육 무게

시험 종료 후 실험동물의 부위별 근육 및 간 무게를 측정하여 표 22에 나타내었다.

시험군		간 및 근육 무게 (g)
		대퇴사두근 (QF)	장딴지근 (GA)	가자미근 (SOL)	장지신근 (EDL)	간
G1	-	0.283±0.017	0.400±0.013	0.021±0.001	0.020±0.001	2.16±0.07
G2	실시예 1	0.282±0.014	0.392±0.010	0.021±0.001	0.021±0.001	1.87±0.08
G3	실시예 2	0.284±0.013	0.396±0.015	0.022±0.001	0.022±0.001	1.88±0.06
G6	-	0.289±0.015	0.404±0.007	0.024±0.001	0.024±0.001	1.98±0.05
G7	실시예 1	0.296±0.025	0.406±0.012	0.023±0.001	0.020±0.001	1.83±0.07
G8	실시예 2	0.298±0.021	0.410±0.011	0.024±0.001	0.022±0.001	1.85±0.06
G9	실시예 3	0.295±0.024	0.405±0.013	0.023±0.001	0.021±0.001	1.84±0.08
G10	실시예 4	0.294±0.023	0.406±0.008	0.024±0.001	0.021±0.001	1.85±0.07
G11	Cr	0.330±0.026	0.409±0.012	0.023±0.001	0.022±0.001	2.08±0.05

실험동물의 체중이 운동 및 시험물질 투여에 의해 감소하였기에 체중 100g당 부위별 근육의 무게 및 간 무게를 변환하여 표 23에 나타내었다.

시험군		상대적인 간 및 근육 무게 (g/100 g body weight)
		대퇴사두근 (QF)	장딴지근 (GA)	가자미근 (SOL)	장지신근 (EDL)	간
G1	-	0.668±0.040	0.940±0.031	0.049±0.001	0.047±0.001	5.08±0.15
G2	실시예 1	0.742±0.031	1.040±0.036	0.056±0.002*	0.056±0.002*	4.92±0.10
G3	실시예 2	0.747±0.033*	1.094±0.024*	0.060±0.001*	0.059±0.001*	4.95±0.11
G6	-	0.744±0.036	1.044±0.019*	0.062±0.002*	0.063±0.001*	5.12±0.18
G7	실시예 1	0.827±0.080+	1.122±0.032+	0.064±0.001	0.056±0.003	5.07±0.19
G8	실시예 2	0.832±0.064+	1.211±0.024++	0.068±0.002	0.064±0.001	5.10±0.09
G9	실시예 3	0.823±0.075+	1.120±0.016+	0.065±0.001	0.058±0.002	5.11±0.17
G10	실시예 4	0.825±0.057+	1.124±0.021+	0.064±0.002	0.055±0.002	5.12±0.19
G11	Cr	0.873±0.067+	1.078±0.028	0.061±0.002	0.059±0.004	5.49±0.13

상기 표 23을 살펴보면, 장딴지근 (GA), 가자미근 (SOL), 장지신근 (EDL)의 상대적 무게는 비운동 대조군 (G1)과 비교하여 운동 대조군 (G6)에서 유의적으로 증가하였다. 또한, 가자미근 (SOL), 장지신근 (EDL)의 상대적 무게는 비운동 대조군 (G1)과 비교하여 실시예 투여군 (G2)에서 유의적으로 증가하였다. 또한, 운동 시험군에서, 대퇴사두근(QF) 및 장딴지근 (GA)의 상대적인 무게는 운동 대조군 (G6)에 비해 실시예 투여군 (G7 ~ G10)에서 유의적으로 증가하였다.

즉, 본 발명에 따른 실시예의 조성물의 투여는 근육 증대 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

시험예 13: 혈액 생화학 분석

시험 종료 시 수집한 혈청 내 젖산, CREA, BUN의 함량과 CK, LDH, ALT, AST, ALP 활성을 측정하여 표 24에 나타내었다.

시험군		혈청 분석
		CK (U/L)	젖산 (μmol/L)	LDH (U/L)	BUN (mg/dL)	CREA (mg/dL)
G1	-	393.2±80.6	6.51±0.47	1,009±77	8.57±0.41	0.335±0.014
G2	실시예 1	416.7±65.1	5.15±0.30*	894±94*	7.54±0.47	0.312±0.008
G3	실시예 2	384.5±45.3	4.80±0.53**	815±45*	7.23±0.31	0.308±0.005
G6	-	552.8±64.0	7.68±0.61	1,569±91	8.39±0.34	0.324±0.015
G7	실시예 1	471.7±63.2+	6.27±0.31+	1,198±51+	7.10±0.40	0.348±0.006
G8	실시예 2	324.6±27.4+++	5.76±0.23++	1,007±49++	6,89±0.31++	0.342±0.011
G9	실시예 3	468.4±45.7+	6.20±0.36+	1,186±56+	7.26±0.29	0.338±0.005
G10	실시예 4	476.3±31.9+	6.19±0.42+	1,245±53+	7.15±0.38	0.346±0.012
G11	Cr	521.5±68.3	5.30±0.41++	1,169±103+	7.84±0.47	0.363±0.006

상기 표 24를 살펴보면, 본 발명의 실시예에 따른 조성물 투여군 (G7 ~ G10)은 운동 대조군 (G6)에 비해 CK 및 LDH 활성, 및 혈청 내 젖산 및 BUN (혈청 요소 질소) 농도가 유의적으로 감소하였다.

따라서, 상기의 결과로부터 본 발명의 실시예에 따른 조성물의 투여는 근피로 개선에 도움을 주는 것을 알 수 있다.

시험예 14: 간과 근육 (장딴지근, GA) 내 글리코겐 함량

운동 중 가장 중요한 에너지원 중 하나인 탄수화물은 글리코겐 분해 과정을 통해 근수축을 위한 에너지를 공급한다. 운동 중 혈중 glucose 농도가 감소하면, 간 또는 근육에 저장되어있는 글리코겐이 곧바로 에너지원으로 사용되게 되므로 글리코겐 분해 억제 즉, 글리코겐을 절약하여 사용한다는 것은 그만큼 오랫동안 근수축을 유지할 수 있는 능력을 갖춘다는 것을 의미한다.

이에 따라, 시험 종료 시 수집한 근육 (GA) 내 글리코겐 함량을 측정하여 하기 표 25에 나타내었다.

시험군		GA 1mg 내 글리코겐 함량 (㎍/mg GA)	전체 GA 내 글리코겐 함량 (㎍/GA)
G1	-	3.20±0.22	1285.5±113.1
G2	실시예 1	3.56±0.15*	1442.1±76.2*
G6	-	2.83±0.14	1145.8±62.4
G7	실시예 1	3.38±0.12+	1404.4±83.3+
G8	실시예 2	4.23±0.16++	2031.1±72.6++
G9	실시예 3	3.29±0.11+	1341.5±64.1+
G10	실시예 4	3.31±0.13+	1391.3±62.8+
G11	Cr	3.32±0.21+	1350.5±73.7+

상기 표 25를 살펴보면, 근육 (GA) 조직 내 글리코겐 함량은 운동 시험군에서 실시예 투여군 (G7 ~ G10)은 운동 대조군 (G6)과 비교하여 유의적으로 증가하였다.

상기의 결과로부터 본 발명의 실시예에 따른 조성물은 근육 (GA) 조직의 글리코겐 함량을 증가시켜, 근 피로 감소 및 근지구력 향상에 도움을 주는 에너지원이 될 것으로 판단된다.

시험예 15: 근육 (장딴지근, GA) 내 단백질 발현 변화

본 연구에서는 시험물질의 투여가 PGC-1α 활성화에 관련된 단백질의 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 근육 (장딴지근, GA) 조직 lysate를 사용하여 Western blot을 실시하였다. 그리고, 상기 Western blot 분석 결과를 토대로 각 단백질에 대한 활성화 단백질의 비율을 통해 각 단백질의 활성을 평가하여 하기 표 26에 나타내었다.

시험군		p-PGC1α/PGC1α ratio	p-AMPK/AMPK ratio	p-p38/p38 ratio	p-Nrf2/Nrf2 ratio
G1	-	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
G2	실시예 1	1.14±0.07*	1.22±0.09*	1.71±0.16*	1.02±0.06
G6	-	1.38±0.42**	1.33±0.09**	0.84±0.08	1.52±0.05**
G7	실시예 1	1.98±0.34+	1.41±0.14	1.86±0.13+	1.30±0.16
G8	실시예 2	2.44±0.23++	1.83±0.27+	2.24±0.31++	1.64±0.22
G9	실시예 3	1.86±0.19+	1.40±0.08	1.75±0.11+	1.28±0.08
G10	실시예 4	1.80±0.24+	1.38±0.20	1.80±0.17+	1.31±0.06
G11	Cr	2.28±0.84++	1.43±0.13	1.94±0.16+	1.35±0.17

상기 표 26을 살펴보면, 실시예 투여군에서 PGC-1α 활성화에 관련된 단백질의 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있고, 특히 운동 시험군에서 실시예 투여군 (G7 ~ G10)은 운동 대조군 (G6)과 비교하여 PGC1α, AMPK 및 p-38 MAPK의 활성이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과를 통해, 규칙적인 운동훈련과 함께 실시예의 조성물의 투여는 PGC-1α 활성화에 관련된 단백질인 AMPK 및 p38 MAPK의 활성화를 유의적으로 증가시켜 미토콘드리아 생합성 및 당 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하여 운동수행능력을 향상시키는 것을 유추할 수 있다.

시험예 16: 근육 (가자미근, SOL)의 mRNA 발현 변화

근육은 생리적 수축 속도에 의해 지근과 속근으로 구분할 수 있으며, 그 중 지근은 미토콘드리아의 수가 많고 활성이 높아 피로에 대한 저항력이 높으므로 장시간 동안 운동을 가능하게 한다. 따라서 본 연구에서는 지구력 운동훈련과 시험물질의 투여가 지근에 속하는 가자미근 (SOL)의 항산화 관련 유전자 (SOD2, GPx1, UCP2, UCP3), LDH 관련 유전자 (ERRα, LDH B, MCT1), 미토콘드리아 합성관련 유전자 (Tfam, CPT-1β, mtDNA, NRF1), 에너지 대사 관련 유전자 (PGC-1α, GYS, PPARγ, PPARδ)의 발현에 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 하기 표 27 내지 표 30에 나타내었다.

항산화 관련 mRNA 발현 변화

시험군		SOD2	GPx1	UCP2	UCP3
G1	-	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
G2	실시예 1	1.16±0.03*	0.89±0.10*	1.23±0.05*	0.51±0.09
G6	-	1.11±0.03*	1.15±0.13	1.50±0.46*	0.69±0.22
G7	실시예 1	1.47±0.13+	3.28±0.36++	6.91±1.47++	0.64±0.10
G8	실시예 2	1.73±0.22++	4.57±0.29+++	7.64±1.50++	0.73±0.11
G9	실시예 3	1.45±0.11+	3.05±0.16++	6.84±1.06++	0.60±0.13
G10	실시예 4	1.40±0.15+	3.19±0.28++	6.85±1.13++	0.62±0.12
G11	Cr	1.52±0.08+	1.92±0.29+	14.96±1.96+++	0.87±0.22

상기 표 27을 살펴보면, 실시예 투여군에서 항산화와 관련된 단백질의 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있고, 특히 운동 시험군에서 실시예 투여군 (G7 ~ G10)은 운동 대조군 (G6)과 비교하여 SOD2, GPx1 및 UCP2의 활성이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과를 통해, 규칙적인 운동훈련과 함께 실시예의 조성물의 투여는 SOD2, GPx1, UCP2 mRNA 발현을 증가시킴으로써 산화적 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하여 근육세포 손상을 억제할 수 있음을 유추할 수 있다.

LDH 관련 mRNA 발현 변화

시험군		ERRα	LDH B	MCT1
G1	-	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
G2	실시예 1	1.67±0.22**	1.76±0.49**	0.41±0.03**
G6	-	1.24±0.32*	1.20±0.22*	0.28±0.07**
G7	실시예 1	1.41±0.22	1.26±0.46	0.56±0.25+
G8	실시예 2	1.52±0.16+	1.35±0.31+	0.64±0.13+
G9	실시예 3	1.40±0.21	1.25±0.24	0.50±0.12+
G10	실시예 4	1.44±0.11	1.27±0.13	0.57±0.20+
G11	Cr	0.58±0.19+	0.35±0.11+	0.99±0.31++

상기 표 28을 살펴보면, 실시예 투여군에서 LDH와 관련된 유전자 중 ERRα 및 LDH B mRNA 발현이 증가하고, MCT1 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였다.

미토콘드리아 합성 관련 mRNA 발현 변화

시험군		mtDNA	Tfam	CPT-1β	NRF1
G1	-	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
G2	실시예 1	1.29±0.12*	4.74±0.32***	0.34±0.02*	15.52±2.59***
G6	-	1.52±0.09**	1.47±0.14*	0.38±0.03***	4.92±0.95**
G7	실시예 1	4.66±0.64++	1.98±0.42+	0.86±0.04++	29.20±3.10++
G8	실시예 2	5.78±0.57+++	2.17±0.34++	0.89±0.02++	31.34±3.06++
G9	실시예 3	4.57±0.45++	1.81±0.27+	0.81±0.03++	28.31±0.82++
G10	실시예 4	4.46±0.29++	1.94±0.14+	0.79±0.06++	28.19±0.57++
G11	Cr	1.69±0.20	1.34±0.07	0.95±0.28++	9.17±2.18

상기 표 29를 살펴보면, 실시예 투여군에서 미토콘드리아 합성과 관련된 유전자의 발현이 증가하는 경향을 확인할 수 있고, 특히 운동 시험군에서 실시예 투여군 (G7 ~ G10)은 운동 대조군 (G6)과 비교하여 mtDNA, Tfam CPT-1β 및 NRF1 mRNA의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과를 통해, 규칙적인 운동훈련과 함께 실시예의 조성물의 투여는 mtDNA, Tfam CPT-1β 및 NRF1 mRNA 발현을 증가시킴에 따라 미토콘드리아의 생합성을 증가시킴으로써 운동수행능력을 향상시킬 수 있음을 유추할 수 있다.

에너지 대사 관련 mRNA 발현 변화

시험군		PGC1α	PPARγ	PPARδ	GSY
G1	-	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00
G2	실시예 1	0.88±0.08	0.25±0.00	2.87±0.95	2.60±0.51
G6	-	2.34±0.32**	0.54±0.12*	1.44±0.28	0.40±0.11
G7	실시예 1	2.73±0.51	5.82±1.27+	2.42±0.45+	0.27±0.06
G8	실시예 2	2.89±0.42	6.98±1.16++	3.81±0.27++	0.31±0.03
G9	실시예 3	2.62±0.40	5.64±1.20+	2.24±0.16+	0.21±0.05
G10	실시예 4	2.68±0.37	5.57±1.08+	2.37±0.21+	0.22±0.03
G11	Cr	5.09±1.22+	0.29±0.05	3.82±0.90++	0.92±0.31

상기 표 30을 살펴보면, 실시예 투여군에서 에너지 대사와 관련된 유전자의 발현이 증가하는 경향을 확인할 수 있고, 특히 운동 시험군에서 실시예 투여군 (G7 ~ G10)은 운동 대조군 (G6)과 비교하여 PPARγ 및 PPARδ의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과를 통해, 규칙적인 운동훈련과 함께 실시예의 조성물의 투여는 PGC1α, PPARγ 및 PPARδ mRNA 발현을 증가시킴에 따라 에너지 대사를 증가시킴으로써 운동수행능력을 향상시킬 수 있음을 유추할 수 있다.

결론적으로, 지구력 운동훈련과 함께 실시예의 조성물의 투여는 근육 증대 효과를 나타내고, 운동 시 증가된 젖산농도를 감소시켜 근피로 개선 도움을 주고, 미토콘드리아 생합성 및 당 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하여 운동수행능력을 향상시키는 것으로 사료된다. 이는 실시예의 조성물이 지구력 운동 수행 시 운동수행능력을 향상시키는 기능성 소재로의 개발 가능성을 제시한다.

<제조예>

제조예 1: 정제의 제조

실시예 1 내지 실시예 4 중에서 선택된 어느 하나의 조성물 10 mg, 비타민 E 9 mg, 비타민 C 9 mg, 갈락토올리고당 200 mg, 유당 60mg 및 맥아당 140 mg을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester) 6 mg을 첨가한다. 이들 조성물 500 mg을 통상의 방법으로 타정하여 정제를 제조한다.

제조예 2: 캡슐의 제조

통상의 연질 캡슐제 제조방법에 따라, 실시예 1 내지 실시예 4 중에서 선택된 어느 하나의 조성물 10 mg, 비타민 C 9mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납4mg 및 레시틴 9mg을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 연질 캡슐제를 제조하였다.

제조예 3: 환제의 제조

실시예 1 내지 실시예 4 중에서 선택된 어느 하나의 조성물 5 mg에 꿀, 덱스트린, 전분, 미결정 셀룰로스, CMC 칼슘 등과 적절하게 반죽을 한 후 환제를 제조하였다.

제조예 4: 드링크제의 제조

실시예 1 내지 실시예 4 중에서 선택된 어느 하나의 조성물 20 mg, 비타민 E 9 mg, 비타민 C 9 mg, 포도당 10 g, 구연산 0.6 g, 액상 올리고당 25 g을 혼합한 후 정제수 300 ml을 가하여 각 병에 200 ml씩 되도록 충진하였다. 병에 충진한 후 130℃에서 4~5초간 살균하여 드링크제를 제조하였다.

제조예 5: 과립제의 제조

실시예 1 내지 실시예 4 중에서 선택된 어느 하나의 조성물 5 mg, 비타민 E 9 mg, 비타민 C 9 mg, 무수결정 포도당 250 mg 및 전분 550 mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 과립제를 제조하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

1. 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI을 유효성분으로 포함하되,
   상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI은 100 : 50 내지 70의 중량비인 것을 특징으로 하는, 운동수행능력 향상용 건강기능식품 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 지페노사이드 L 및 지페노사이드 LI은 100 : 60의 중량비인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 유효성분의 투여 용량은 0.01 내지 200 mg/kg/day인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
6. 삭제