CN110609096B

CN110609096B - 一种食用油中4种多环芳烃化合物的快速提取净化方法及其检测应用

Info

Publication number: CN110609096B
Application number: CN201910823374.6A
Authority: CN
Inventors: 章再婷; 杨亮; 李双; 刘忠义; 陈树兵
Original assignee: Ningbo Customs Technology Center; Ningbo Joysun Testing Service Co ltd
Current assignee: Ningbo Customs Technology Center; Ningbo Zhongsheng product testing Co., Ltd
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2039-09-02
Also published as: CN110609096A

Abstract

本发明公开了一种食用油中4种多环芳烃化合物的快速提取净化方法及其检测应用，特点是包括以下步骤：（1）称取待测食用油样品，依次加入提取液和脂肪酶，恒温震荡酶解后，加入碳酸钾和乙醇或碳酸钠和乙醇，涡旋混匀；（2）然后加入正己烷和水，震荡离心后，分离得到上层有机相和下层水相；（3）取下层水相按步骤（2）方法，重复萃取1次；合并两次萃取所得上层有机相部分，混匀，40℃旋蒸至干，用乙腈复溶，过滤膜待分析；其检测应用为按上述方法进行样品前处理，然后进行液相色谱‑荧光检测，根据4种PAHs的浓度与仪器响应值之间的定量关系，计算获得待测液中4种PAHs含量；优点是提取回收率高，简单快速、灵敏度和准确性高。

Description

一种食用油中4种多环芳烃化合物的快速提取净化方法及其检测应用

技术领域

本发明涉及一种食用油中4种多环芳烃的前处理以及检测方法，尤其是涉及一种食用油中4种多环芳烃化合物的快速提取净化方法及其检测应用。

背景技术

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)作为一类强致癌性化合物，主要来源于反复使用或高温油炸的食用油中，苯并[a]蒽(BaA)、苯并[b]荧蒽(BbF)、苯并[k]荧蒽(BkF)和苯并[a]芘(BaP)是毒性较强的4种PAHs，其中BaP被国际癌症研究机构归为1类致癌物，其余三种归为2B类致癌物。受暴利的驱使，非正常食用油越来越频繁的出现在人们的生活中，对人们的身体健康存着巨大的威胁，国家严厉打击此类食品违法行为。因此，建立能够快速同时测定食用油中4种PAHs含量的方法尤为重要。

尽管已有学者建立了食用油中单一或多个多环芳烃的快速筛查方法，但前处理过程复杂，且成本较高，不能满足市场快速、环保的检测需求。现有的前处理技术主要包括：基质分散萃取技术(QuEChERS等)，固相萃取技术(HLB小柱，中性氧化铝柱等)和凝胶渗透色谱法(GPC)等。其中固相萃取柱通过氢键相互作用而保留在吸附剂上，虽能有效除去油脂基质，但操作过程繁琐耗时，且重现性差；GPC方法虽具备自动化优势，但单样需耗时3小时净化完成，需要消耗大量有机溶剂，实验成本高。例如，吴春英等建立了餐厨废弃中苯并(a)芘的Oasis HLB小柱净化方法，为避免油脂洗脱，采用中等极性的乙腈作为淋洗液；同样的，王溪等采用QuEChERS/净化技术对枸杞籽油中多环芳烃类物质进行提取净化，乙腈作为提取液，对含有多个环状结构的亲脂性化合物不能保证高回收率。王磊等建立了花生油中苯并芘的凝胶色谱净化方法，经凝胶渗透色谱装置净化后联合了氧化铝填充柱除油，最大限度的降低了油脂基质干扰，且很好的保证了高回收率(>95％)，但此方法有机溶剂消耗巨大，GPC净化过程繁琐耗时，随着样品检测量逐年攀升，大大限制了此方法在日常检查中的应用。如何把亲脂性化合物从油脂中有效提取出来，这始终是一个艰巨的挑战。因此，建立研究各类食用油中4种PAHs快速筛查技术对于提高监管工作效率，保障我国人民的食品安全具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提取回收率高的食用油中4种多环芳烃化合物的快速提取净化方法及其检测应用，该检测方法操作简单快速、灵敏度和准确性高。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种食用油中4种多环芳烃化合物的快速提取净化方法，包括以下步骤：

(1)称取待测食用油样品，依次加入提取液和脂肪酶，于37±2℃恒温震荡酶解1.5-2.5h后，加入碳酸钾和乙醇，或碳酸钠和乙醇，涡旋混匀；

(2)然后加入正己烷和水，震荡4-6min，以4000-5000r/min离心4-6min，分离得到上层有机相和下层水相；

(3)取下层水相按步骤(2)方法，重复萃取1次；合并两次萃取所得上层有机相部分，混匀，40℃旋蒸至干，用乙腈复溶，过滤膜，得到含有苯并蒽、苯并荧蒽、苯并荧蒽和苯并芘4种多环芳烃化合物的待测样品。

所述的提取液的配制方法如下：将磷酸二氢钾溶于水中配制成浓度为0.108kg/L的磷酸二氢钾溶液，用氢氧化钾调pH至8.0。

每克待测食用油样品中提取液的添加量为2.5mL，脂肪酶的添加量为0.1g，碳酸钾的添加量为0.5g，乙醇的添加量为2.5mL，正己烷的添加量7.5mL以及水的添加量为2.5mL。

步骤(1)中酶解时间为2h。

2、一种食用油中4种多环芳烃化合物的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理

A.称取待测食用油样品，依次加入提取液和脂肪酶，于37±2℃恒温震荡酶解1.5-2.5h后，加入碳酸钾和乙醇，或者碳酸钠和乙醇，涡旋混匀；

B.然后加入正己烷和水，震荡4-6min，以4000-5000r/min离心4-6min，分离得到上层有机相和下层水相；

C.取下层水相按步骤(2)方法，重复萃取1次；合并两次萃取所得上层有机相部分，混匀，40℃旋蒸至干，用乙腈复溶，过0.22μm微孔滤膜得到含有苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽和苯并[a]芘4种多环芳烃化合物的待测样品，备用；

(2)标准曲线制作

分别用乙腈配制苯并蒽、苯并荧蒽、苯并荧蒽和苯并芘的一系列标准溶液，每一种多环芳烃化合物的系列标准溶液浓度均为0.1ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，制作标准曲线；

(3)液相色谱-荧光检测

液相条件：Dikma Plus C18色谱柱或Hypersile Gold C18色谱柱，柱温40℃，流动相A：水，流动相B：乙腈，流速：1.0mL/min，梯度见下表1：

表1 HPLC洗脱程序

时间/min	A/％	B/％
			0	90	10
2	50	50
			15	0	100
17	0	100
			17.1	90	10
20	90	10

；

荧光检测器，检测波长见下表2：

表24种多环芳烃的荧光检测参数

时间/min	激发波长(nm)	发射波长(nm)
			0	270	380
10	294	406

；

(4)待测样品浓度计算：

样品中4种多环芳烃待测物的含量根据如下计算公式得到：X＝C*V/m，

式中：X-试样中某一待测多环芳烃化合物含量，单位为μg/kg；

C-试样处理液中该多环芳烃化合物浓度，根据该多环芳烃化合物的基质标准曲线计算得到，单位为μg/L；

V-定容体积，单位为mL；

m-试样体积或质量，单位为g。

所述的提取液的配制方法如下：将磷酸二氢钾溶于水中配制成浓度为0.108kg/L的磷酸二氢钾溶液，用氢氧化钾调pH至8.0；每克待测食用油样品中提取液的添加量为2.5mL，脂肪酶的添加量为0.1g，碳酸钾的添加量为0.5g，乙醇的添加量为2.5mL，正己烷的添加量7.5mL以及水的添加量为2.5mL。

步骤(1)中酶解时间为2h。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种食用油中4种多环芳烃化合物的快速提取净化方法及其检测应用，其根据4种多环芳烃化合物的多环结构以及食用油基质中高脂肪含量，前处理采用专一性酶解技术，采用的脂肪酶只是对环化化合物适用，它会水解掉链状的甘油三酯等脂肪，但对大多数含链化合物是不适用的。因此，通过联合脂肪酶水解和碳酸钾皂化除油(除油率高达98％以上)，在有效去除油脂基质干扰的同时，大大降低了前处理时间和有机溶剂使用量，可实现各类食用油的快速提取、净化的目的，检出限远远低于现有方法。与传统方法相比，酶解技术无需借助任何仪器、耗材及有机溶剂，环境污染小、经济安全，回收率稳定，更适用于批量试验。通过高效液相色谱法对该体系的效果进行了评价。结果表明，本方法对各类食用油基质均具有较强的适用性，4种多环芳烃化合物线性范围在0.1～5.0ng/mL，检出限为0.1μg/kg，回收率大于90％，标准偏差小于10％，具有简便快捷，节约经济，很好的满足实验室大量、快速分析的要求。

附图说明

图1为4种多环芳烃化合物(PAHs)标准物质色谱图

图2为脂肪酶添加量、酶解时间对3种食用油除油率的影响；

图3为碳酸钾添加量对3种食用油除油率的影响；

图4为乙醇和正己烷添加量对3种食用油中4种多环芳烃化合物回收率的影响：4a，苯并[a]蒽(BaA)；4b，苯并[b]荧蒽(BbF)；4c，苯并[k]荧蒽(BkF)；4d，苯并[a]芘(BaP)。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

1、仪器与试剂

高效液相色谱仪LC-20AT(岛津SHIMADZU公司，日本)，配置有荧光检测器。色谱柱为Dikma Plus C18柱(4.6mm x 250mm，5.0um)。Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore公司)。冷冻离心机(德国SIGMA公司)。漩涡振动器(德国Heldolph公司)。旋转蒸发仪(德国IKA公司)。电热恒温水浴锅(DK-S28型)。滤膜(DIKMA,Nylon 0.22μm)。

标准品均购自Sigma公司，纯度≥95％。标准品配置：二氯甲烷溶解，乙腈定容，配制成1.0mg/mL的标准储备液，-20℃下保存；准确吸取10μL标准储备液，用乙腈溶液定容至10mL，配制1.0mg/L标准溶液，于-20℃避光保存。

脂肪酶(酶活力>700U/mg)购自加拿大Rrugosa公司。色谱纯正己烷、乙腈、二氯甲烷、乙醇均购自美国Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为分析纯，购自南京化学试剂一厂。实验用水为Milli-Q超纯水(18.2ΩM·cm)。

2、一步式提取净化流程

基质样品来自国家残留监控抽样和进出口送检企业。

提取液的配制：称取54g的磷酸二氢钾，用500mL水溶解，氢氧化钾调pH至8.0。

根据样品基质性质，本文采用专一性酶解技术去除油脂。步骤如下：

(1)称取2.00g样品，依次加入5mL提取液和0.2g脂肪酶，于37±2℃恒温震荡酶解2h后，加入1.0g碳酸钾(碳酸钠)，5mL乙醇，涡旋混匀；

(2)加入15mL正己烷，5mL水，震荡4-6min，以4000-5000r/min离心4-6min，分离得到上层有机相和下层水相；

(3)取下层水相按照步骤(2)，重复萃取1次；合并两次萃取所得上层有机相部分，混匀，40℃旋蒸至干，用1.0ml乙腈复溶，过滤膜得到含有苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽和苯并[a]芘4种多环芳烃化合物的待测样品，待分析。

3、液相色谱-荧光检测

液相条件：色谱柱为Dikma Plus C18柱(4.6mm x 250mm，5.0um)，柱温40℃，流动相A：水，流动相B：乙腈，流速：1.0mL/min，进样量：20μL，梯度见下表1：

表1 HPLC洗脱程序

时间/min	A/％	B/％
			0	90	10
2	50	50
			15	0	100
17	0	100
			17.1	90	10
20	90	10

；

荧光检测器，检测波长见下表2：

表24种多环芳烃的荧光检测参数

时间/min	激发波长(nm)	发射波长(nm)
			0	270	380
10	294	406

。

4、定性、定量分析

分别用乙腈配制苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽和苯并[a]芘的一系列标准溶液，每一种多环芳烃化合物的系列标准溶液浓度均为0.1ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，以浓度为横坐标，仪器响应值(响应值＝标准品峰面积/标准品质量)为纵坐标，制作标准曲线(各多环芳烃化合物标准曲线见表3所示)，根据保留时间定性，外标法定量，标准物质的色谱图见图1。

5、待测样品浓度计算：

式中：X－试样中某一待测多环芳烃化合物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中该多环芳烃化合物浓度，根据该多环芳烃化合物的基质标准曲线计算得到，单位为μg/L；

V—定容体积，单位为mL；

m－试样体积或质量，单位为g。

二、实验结果分析

1、提取净化条件的选择

本实验针对食用油特殊基质成分和4种多环芳烃化合物(PAHs)的非极性性质，采用脂肪酶处理样品，酶作为一种生物催化剂，具有专一性，整个酶解过程温和可控(37±2℃)，本文通过磷酸二氢钾(C＝0.108g/mL,PH＝8.0)作为提取液进行提取，既可以使脂肪酶保持最佳的活力条件，又可以防止脂肪过多的被提取出来，减少脂肪的干扰。此外，本实验还利用了碳酸钾提供的弱碱性环境，用于终止酶解反应的同时，可以进一步起到油脂皂化的作用，确保最大的除油率，通过测量氮吹充分后的残余油脂的精确质量值计算除油率，除油率(％)＝(M₀-M_X)/M₀×100，其中M_X是指联合了脂肪酶水解和碳酸钾皂化除油后的残余油脂质量值，M₀是指未经任何处理的残余油脂质量值。皂化方法作为维生素检测的常用方法，主要是在浓碱环境下进行(KOH或NaOH等强碱性物质)，待测化合物结构极易被破坏，且后续需要进行有机相多次水洗以消除残留的强碱性化合物，不可避免的造成检测时间和成本的消耗，对待测化合物也会造成一定的损失，本文选择的方法很好的弥补了这一不足。

脂肪酶用量以及酶解时间都与除油率相关联，在充分净化的前提下，也要避免成本的浪费。实验中分别比较了添加0.05g，0.1g，0.2g，0.5g，1.0g脂肪酶，在37±2℃条件下，震荡酶解1.0h，2.0h，3.0h，5.0h的除油率情况。通过对3类常见食用油：动物油、植物油和煎炸油进行前处理分析。由图2可知，当添加脂肪酶0.05g和0.1g时，脂肪酶用量不足，受酶解时间影响：≥2.0h酶解时间的除油率明显高于1.0h，但均低于80％；当脂肪酶用量大于0.1g时，2.0h除油率明显高于1.0h，2.0h，3.0h，5.0h的除油率差别很小，油脂酶解充分，也就是说，当脂肪酶用量充足时，酶解时长占主导，时间越长除油率越好，并最终保持稳定。从节约时间和成本的角度出发，本研究最终将净化条件确定为：脂肪酶添加量为0.2g，酶解时长2.0h。

在确保脂肪酶保持最佳活力的前提下，本实验还对具有皂化油脂功能的碳酸钾添加量进行了研究，以保证最大除油率。实验中分别比较了添加0g,0.5g,1.0g,2.0g碳酸钾在上述酶解条件下的最终除油率情况。由图3可知，碳酸钾添加量为0g,0.5g,1.0g时，随着添加量的增加除油率明显增长，添加量为1.0g时达到最大值(98.1％-99.8％)，添加量为2.0g时除油率反而降低，推测是过碱环境破坏了酶的活性进而降低了除油效率，因此，在上述称样量及脂肪酶添加量的情况下，碳酸钾最佳添加量为1.0g。

2、有机萃取液的添加量对回收率的影响

在正己烷萃取待测化合物前，加入适量乙醇可以很好的防止乳化现象的发生，此外，乙醇还起到预萃取的作用，正己烷的加入量对弱极性的4种PAHs的回收率有很大的影响。通过对3类常见食用油：动物油、植物油和煎炸油，进行4种PAHs的添加回收试验(0.1μk/kg)，通过加入不同体积的乙醇和正己烷，即乙醇2.5mL,5mL，10mL和15mL，乙醇用量2.5mL，体系乳化严重，乙醇用量5mL，10mL和15mL时，且均可保持液-液界面清晰，消除乳化。同时考察有机萃取液添加量对4种PAHs添加回收率的影响，即正己烷15mL，15mL*2和15mL*3。结果表明，4种PAHs作为弱极性化合物，萃取率受正己烷加入量的影响很大，从图4可见，正己烷体积为15mL时，萃取效率低，回收率低于77％，当正己烷体积为15mL*2(利用正己烷萃取2次)和15mL*3(利用正己烷萃取3次)，回收率趋于稳定，均能达到90％以上。而不同体积的甲醇对4种PAHs回收率影响较小，乙醇用量5mL时即可保持液-液界面清晰，消除乳化。从节约浓缩时间和成本的角度出发，最终确定甲醇加入量为5mL，正己烷加入量为15mL*2。

3、液相条件的优化

液相方法检测目标化合物时，多在流动相中加入缓冲盐，大量长期使用对仪器有损害，本实验只用乙腈-水溶液做流动相进行色谱分析，通过优化流动相梯度达到合适的保留时间，峰型以及分离效果。实验中，比较了甲醇-水和乙腈-水体系作流动相时的色谱行为，结果表明，乙腈-水体系柱压更低、安全性好，所以，试验采用乙腈-水体系作为流动相。另外，针对2款不同型号的色谱柱进行了比较：Dikma Plus C18色谱柱和Hypersile GoldC18色谱柱,发现两柱只显示出组分保留时间的差异，在分离度方面均可满足检测的需要。

4、加标回收结果分析

将4种PAHs标准品添加到常见的3种食用油基质中，采用液相色谱-荧光检测器进行检测，保留时间定性，外标法定量，线性范围在0.1～5.0ng/mL，相关系数r²>0.997，定量限为0.1μg/kg，加标回收率范围90％～100％，标准偏差在10％以内。结果表明，本方法对各类食用油样品均具有较强的适用性，可实现油脂中4种PAHs的快速提取、净化的目的。

表3 4种PAHs在动物油、植物油和煎炸油中的添加浓度及其回收率的实验数据

目前，脂肪酶酶解技术主要应用于营养成分方面，包括酶解后脂肪酸测定及各种维生素的检测，在食品添加剂及有毒有害物质检测方面应用甚少。本文根据4种PAHs的多环结构以及食用油基质中高脂肪含量，前处理采用专一性酶解技术，大大降低了前处理时间和油脂的基质抑制效应，检出限远远低于现有方法，为各类食用油中4种PAHs化合物的检测开辟了新的途径，可作为油脂中亲脂性化合物的快速检测技术广泛推广。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种食用油中4 种多环芳烃化合物的快速提取净化方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）称取待测食用油样品，依次加入提取液和脂肪酶，于37±2℃恒温震荡酶解1.5-2.5h后，加入碳酸钾和乙醇，或碳酸钠和乙醇，涡旋混匀，其中所述的提取液的配制方法如下：将磷酸二氢钾溶于水中配制成浓度为0.108kg/L的磷酸二氢钾溶液，用氢氧化钾调pH至8.0；

（2）然后加入正己烷和水，震荡4-6 min，以4000-5000 r/min离心4-6 min，分离得到上层有机相和下层水相；

（3）取下层水相按步骤（2）方法，重复萃取1次；合并两次萃取所得上层有机相部分，混匀，40℃旋蒸至干，用乙腈复溶，过滤膜，得到含有苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽和苯并[a]芘4 种多环芳烃化合物的待测样品。

2.根据权利要求1所述的一种食用油中4 种多环芳烃化合物的快速提取净化方法，其特征在于：每克待测食用油样品中提取液的添加量为2.5 mL，脂肪酶的添加量为0.1g，碳酸钾的添加量为0.5g，乙醇的添加量为2.5mL，正己烷的添加量7.5 mL以及水的添加量为2.5mL。

3.根据权利要求2所述的一种食用油中4 种多环芳烃化合物的快速提取净化方法，其特征在于：步骤（1）中酶解时间为2 h。

4.一种食用油中4 种多环芳烃化合物的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品前处理

A．称取待测食用油样品，依次加入提取液和脂肪酶，于37±2℃恒温震荡酶解1.5-2.5h后，加入碳酸钾和乙醇，或者碳酸钠和乙醇，涡旋混匀，其中所述的提取液的配制方法如下：将磷酸二氢钾溶于水中配制成浓度为0.108kg/L的磷酸二氢钾溶液，用氢氧化钾调pH至8.0；每克待测食用油样品中提取液的添加量为2.5 mL，脂肪酶的添加量为0.1g，碳酸钾的添加量为0.5g，乙醇的添加量为2.5mL；

B．然后加入正己烷和水，震荡4-6 min，以4000-5000 r/min离心4-6 min，分离得到上层有机相和下层水相，每克待测食用油样品中正己烷的添加量为7.5 mL和水的添加量为2.5 mL；

C．取下层水相按步骤B方法，重复萃取1次；合并两次萃取所得上层有机相部分，混匀，40℃旋蒸至干，用乙腈复溶，过0.22µm微孔滤膜得到含有苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽和苯并[a]芘4 种多环芳烃化合物的待测样品，备用；

（2）标准曲线制作

分别用乙腈配制苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽和苯并[a]芘的一系列标准溶液，每一种多环芳烃化合物的系列标准溶液浓度均为0.1 ng/mL，0.5 ng/mL，1.0 ng/mL，2.0 ng/mL，5.0 ng/mL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，制作标准曲线；

（3）液相色谱-荧光检测

液相条件：Dikma Plus C18色谱柱或Hypersile Gold C18色谱柱，柱温40℃，流动相A：水，流动相B：乙腈，流速：1.0 mL/min，梯度见下表1：

表1 HPLC洗脱程序

；

荧光检测器，检测波长见下表2：

表2 4种多环芳烃的荧光检测参数

；

（4）待测样品浓度计算：

样品中4种多环芳烃待测物的含量根据如下计算公式得到：X=C*V/m，

V— 定容体积，单位为mL；

m－试样体积或质量，单位为g。

5.根据权利要求4所述的一种食用油中4 种多环芳烃化合物的快速检测方法，其特征在于：步骤（1）中酶解时间为2 h。