CN101639467A - 高效液相色谱荧光法检测水产品中氟苯尼考的残留量 - Google Patents

高效液相色谱荧光法检测水产品中氟苯尼考的残留量 Download PDF

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吴光红
杨洪生
陈玲珍
孟勇
张美琴
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吴光红
杨洪生
陈玲珍
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Abstract

本测定方法是利用高效液相色谱-荧光法测定水产品中氟苯尼考的残留。水产品样品中氟苯尼考用乙酸乙酯提取,经正己烷去脂、浓缩后,C18固相萃取柱净化,用液相色谱仪-荧光检测器检测、外标法定量。该方法能够快速、灵敏、准确的测定水产品中氟苯尼考残留量。

Description

髙效液相色谱荧光法检测水产品中氟苯尼考的残留量
技术领域
本发明涉及一种检测水产品中氟苯尼考残留量的检测技术。 背景技术
在水产养殖业中,水产动物的疾病经常发生,特别是细菌性疾病对水产动物的危害仍非常 严重。病害的发生所造成的经济损失每年达上百亿元。给养殖业带来了巨大损失。以前,预防 和治疗这类疾病时常用氯霉素等抗菌药,但氯霉素易产生耐药性,其致再生障碍性贫血的缺点, 使我国水产品出口屡遭限制和封杀。美国及欧盟于1996年,我国于2002年3月,就明令禁止 食用动物使用氯霉素。鉴于上述情况,亟需寻求一种替代药物。1990年氟苯尼考在日本最先 上市,中国于2000年研制成功。氟苯尼考属于动物专用的第三代氯霉素类广谱抗生素,作为 氯霉素替代品,该药不仅使用安全,不会引起人类的再生障碍性贫血,而且疗效显著,是治 疗细菌性疾病效果较显著的药物之一,在病害防治方面有着重要作用,目前,在国际上以较为 成熟药物的姿态形成相当大的产业市场。但是作为一种新药,在水产养殖业中其使用还存在 较大的盲目性。由于国内对氟苯尼考相关研究较少,所以需对氟苯尼考检测方法、药物动力 学等方面开展深入和广泛的研究,为规范用药,禁止乱用药、滥用药,保障人民食品安全卫 生等方面给予技术上的保证。
目前国内在检测氟苯尼考残留的监测方法中,大多采用气相色谱、高效液相色谱-紫外检 测器检测或者是色质联用方法检测,而用高效液相色谱-荧光检测器检测氟苯尼考的残留,在 国内还处于空白阶段。该方法能够快速、灵敏、准确的测定水产品中氟苯尼考残留量,为氟 苯尼考的检测提供了一种新的检测技术。
发明内容
1、 要解决的技术问题
本测定方法是利用高效液相色谱-荧光法测定水产品中氟苯尼考的残留。
2、 技术方案 (1)试剂与仪器
①试剂氟苯尼考标准品(纯度为99.5%);乙腈(色谱纯);正己垸、乙酸乙酯、K2HP04、 KH2P04等试剂均为分析纯。
标准溶液的配制:准确称取0.05g(精确至0.0001g)的氟苯尼考标准品,用乙腈溶解并定容至500mL,配制成100mg/L标准储备液,-5°<:冰箱中冷藏保存。使用时用流动相依次稀释成氟苯尼考含量为lmg/L。
磷酸缓冲液的配制莉(8.00gK2HPO4和2.00gKH2PO4,定容1000mL,此缓冲液pH值为6.0。②仪器
Waters2695型高效液相色谱仪,配Waters2475荧光检测器;超高速冷冻离心机(Beckman21R);旋转蒸发仪(BuchiR215)等。
(2) 样品前处理过程
① 提取
称取5g样品(精确至0.01g)置于50mL离心管中,加入20mL乙酸乙酯,5g酸性氧化铝,涡旋振荡5min,以10000r/min离心10min,上清液转移至250mL旋转蒸发瓶中。残渣中加入20mL乙酸乙酯,按上述方法再提取一次,上清液合并于旋转蒸发瓶屮,于40。C旋转蒸发至干。
② 脱脂
往旋转蒸发瓶中加入10mL磷酸盐缓冲液溶解残渣,涡旋2min,转移至50mL离心管中,向离心管中加入2xl0mL正己烷,离心分层,弃正己垸层,提取液以过C!s柱。
③ 净化
C,8固相萃取柱先后用3mL乙腈和3mL水预洗并活化,弃掉洗涤液。经过脱脂后的提取液过柱,带样液全部流出后,用3mL水清洗ds柱,弃掉流出液。用6mL乙腈洗脱,将洗脱液收集至50mL玻璃离心管中,于4(TC水浴条件下减压旋转蒸发至干。往离心管中加入lmL流动相溶解残渣,混合lmin,过0.45pm微孔滤膜过膜,滤液作HPLC。
(3) 仪器检测条件
a) 色谱柱:Waters Symmetry ds柱(250mmx4.6mm, 5fam)
b) 流动相:乙腈:水=25:75;
c) 流速:1.0mL/min;
d) 柱温:35°C;
e) 进样量:lO^L;
f) 检测波长:激发波长225nm,发射波长295nm。
4(4)结果计算
按式(1)计算样品中氟苯尼考残留量。计算结果需扣除空白值。
式中:
X——样品中氟苯尼考残留量,吗/kg;C——样液中氟苯尼考的浓度,叱/L;A——样液中氟苯尼考的峰面积;As——氟苯尼考标准溶液的峰面积;V——样液的最终定容体积,mL;W——样品的称样量,g。
3、有益效果
本发明能够快速、灵敏、准确的测定水产品中氟苯尼考残留量,为氟苯尼考的检测提供了一种新的检测技术,为深入开展水产品中氟苯尼考代谢动力学等方面提供技术保障。
附图说明
图l流动相为乙腈+水(25:75)时氟苯尼考标准液(1.00mg/L)色谱图图2流动相为乙腈+水(30:70)时氟苯尼考标准液(1.00mg/L)色谱图图3流动相为乙腈+水(20:80)时氟苯尼考标准液(1.00mg/L)色谱图图4未经过固相萃取柱净化的鳕鱼加标色谱图(200吗/kg)图5经过C18固相萃取柱净化的鳕鱼加标色谱图(200 pg/kg)图6氟苯尼考标准曲线(n=6)
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明
实施例1:提取
由于乙腈和水的比例不同会影响色谱峰的保留时间,为了保证氟苯尼考的处峰时间较理想和峰形尖锐,所以最终将流动相乙腈和水的比例定为25:75,这个比例出峰时间比较理想,目标峰与杂质峰也得以完全分离。如增大流动相乙腈的比例,虽然能够縮短分析时间,但是氟苯尼考出峰时间过早,难与杂质峰完全分离(图2)。如减小乙腈的比例,氟苯尼考出峰时间较晚,分析时间较长(图3)。
因此为了保证各目标物具有较好的分离效果和色谱峰形,本方法采用乙腈+水(25:75)溶液作为流动相,采取合适条件,不但很好的实现了目标峰与杂质峰的分离,并且目标峰分离度大,峰形尖锐,对称性好(图l)。
实施例2:净化
很多文献都是处理到脱脂净化后,就浓縮、定容、上机测定。本研究也做了这方面大量的实验,发现在低浓度药物检测时,有些基质的存在干扰了对目标药物峰的定性定量、降低了检测灵敏度(图4)。因此仅仅通过正己烷脱脂净化是不够的,因为正己垸只是去除大部分的非极性杂质成分,还有许多极性物质,如磷脂、糖蛋白等仍然存在于提取溶剂中,所以需要进一步SPE净化。在比较不同类型,不同种类填料和不同填料量的固相萃取柱对目标化合物净化效果基础上,得出采用C18固相萃取柱净化效果较理想(图5)。
实施例3:方法线性范围与相关性
分别取一定量的1.0mg/L标准中间液,用乙腈将其依次稀释成0.2、0.5、 5、 10、 50、 100mg/L系列浓度的标准工作液,按上述色谱条件检测。以各浓度的峰面积Y对标准工作溶液的质量浓度X (mg/L)进行线性回归分析,线性回归方程丫=225043乂 + 82815,相关系数r=0.9996(图6)。结果表明:氟苯尼考在0.2吗/mL〜100(ag/mL浓度范围内各组分线性关系良好。
实施例4:检测限
根据液相色谱最低检测限测定方法,按公式MDL-3CN/R计算结果。式中MDL为最低检测限,C为最低加标样品,N为实测噪声,R为检测器响应值。在5.0g空白样品中添加0.50mg/L标准溶液l.OOmL,得到加标浓度为100吗/kg的样品,进样测得信噪比R/N为6.2,按上式计算得本方法中MG的最低检测限约为50pg/kg。
实施例5:回收率与重复性
在确定检测方法后,我们分别以阴性的鳕鱼、对虾为测试对象,进行加标回收率实验,以考察方法的适用性。实验采用5g样品中分别加入500昭、IOOO吗和2000吗的标样,其加标量相当于100吗/kg、 200吗/kg和400叫/kg,回收率及精密度测定结果(表l、表2)。对所考察的样品的几个添加浓度的实验结果显示,氟苯尼考的回收率在88.6〜95.4%之间,相对标准偏差小于10%。
表l阴性鳕鱼肌肉中加标回收率实验(n=6)
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Claims (1)

  1. 一种采用高效液相色谱荧光法检测水产品中氟苯尼考(Florfenicol)残留量的检测技术,其特征在于包括下列步骤: 1、乙酸乙酯提取:称取5g样品(精确至0.01g)置于50mL离心管中,加入20mL乙酸乙酯,5g酸性氧化铝,涡旋振荡5min,以10000r/min离心10min,再加入20mL乙酸乙酯,重复提取一次。 氟苯尼考微溶于水,易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂。甲醇、乙腈这两种溶剂对人体毒性较大,同时旋转蒸发时间较长;丙酮具有挥发性,提取效果不好。而乙酸乙酯提取率高、毒性小,容易蒸干。因此,本实验中采用乙酸乙酯作为提取剂。 2、正己烷去脂:将旋转蒸发瓶中提取液在40℃旋转至近干,残渣用磷酸缓冲液10mL溶解,转移到50mL离心管中,加入10mL正己烷离心分层,弃正己烷,再加入10mL正己烷,重复一次。 氟苯尼考含有-OH、-F、-SO2CH3极性基团,采用非极性的正己烷初步去脂肪,为下一步的C18固相萃取柱净化做好准备,效果较好。 3、C18固相萃取柱净化:过C18固相萃取柱前,C18固相萃取柱先后用3mL乙腈和3mL水预洗并活化,弃掉洗涤液。离心管中的下层溶液过C18固相萃取柱,待样液流干后,用3mL水淋洗,弃掉流出液。用6mL乙腈洗脱,将洗脱液收集至150mL旋转蒸发瓶中。于40℃减压旋转蒸发至干。 C18固相萃取柱作为非极性吸附剂,以硅胶作为基质,具有键和密度高、流失少、回收率高等特点,能很好地吸附氟苯尼考,去除杂质干扰。 4、测定条件:流动相:乙腈∶水=25∶75;流速:1.0mL/min;柱温:35℃;进样量:10μL;荧光检测器检测:激发波长225nm,发射波长295nm。 在此检测条件下,目标峰与杂质峰分开,目标峰的英光强度高,峰形尖锐,对称性好(图1、表1)。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103336072A (zh) * 2013-06-19 2013-10-02 湖北龙翔药业有限公司 一种测定氟苯尼考中手性活性成分含量的方法
CN106596791A (zh) * 2016-12-28 2017-04-26 重庆金邦动物药业有限公司 增效氟苯尼考粉干混悬剂的质量标准

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