CN113640401B - 一种土壤中马兜铃酸的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析化学及环境检测技术领域，具体涉及一种土壤中马兜铃酸的检测方法，特别涉及一种分散固相萃取‑液相色谱串联质谱联用测定土壤中马兜铃酸的高灵敏度检测方法。本发明提供的土壤中马兜铃酸的检测方法，采用分散固相萃取‑液相色谱串联质谱法技术；其中所述分散固相萃取的提取溶剂为0.1‑2％乙酸乙腈。本发明选择乙酸乙腈作为提取溶剂，对马兜铃酸具有特异选择性，既能够最大程度提高马兜铃酸的提取率，又可以避免土壤中较多杂质随之进入提取液中，提高后续检测的准确性；而且该提取溶剂还同时兼具仪器响应值高、灵敏度高及提取效率高的优势。

Description

一种土壤中马兜铃酸的检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学及环境检测技术领域，具体涉及一种土壤中马兜铃酸的检测方法，特别涉及一种分散固相萃取-液相色谱串联质谱联用测定土壤中马兜铃酸的高灵敏度检测方法。
背景技术
马兜铃酸(Aristolochic acids，AAs)是一种硝基菲类化合物，主要含马兜铃酸I(AA-I)和马兜铃酸II(AA-II)两种成分。马兜铃酸广泛存在于马兜铃科马兜铃属Aristolochia及细辛属Asarum等植物中，具有肾毒性、致癌和致基因突变等毒性。
当前含马兜铃酸的中药(如马兜铃、防己、青木香、天仙藤等)仍有种植，其茎叶、果实、残根等散落、遗留到土壤中，势必会造成土壤中马兜铃酸残留。因此，有必要建立土壤中马兜铃酸的快速准确检测方法，以确保环境和食品质量安全。
目前样品中马兜铃酸的检测手段主要采用液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、毛细管电泳法、电化学法等；但这些检测方法的检测对象多集中在中药及中成药制剂等马兜铃酸含量相对较高的药品中。对于痕量甚至超痕量的马兜铃酸的检测，目前报道较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种土壤中马兜铃酸的检测方法。该方法具有简便快速、灵敏度高、适用性强、环境友好的优点，可以满足中药种植区不同类型土壤中痕量马兜铃酸的检测需求。
本发明提供的土壤中马兜铃酸的检测方法，采用分散固相萃取-液相色谱串联质谱法技术；其中所述分散固相萃取的提取溶剂为0.1-2％乙酸乙腈。
现有关于中药制品中马兜铃酸的提取试剂种类较多，例如氯仿、甲醇等，可通过不同提取试剂的组合以满足不同样品提取体系的提取效果；但由于土壤样品与中药制品的提取体系相差较大，目前公开的提取试剂组合并不适用于土壤中痕量马兜铃酸的检测。
而目前常用的土壤中痕量有机物的提取主要采用加速溶剂萃取或者索氏提取的方法，采用的有机溶剂有二氯甲烷、正己烷、丙酮等，但由于试剂用量大而且提取杂质多，需要进一步采用固相萃取柱进行净化，存在整个前处理过程步骤繁琐、耗时长、易污染环境、检测准确性低等问题。
因此，如何选择合适的提取溶剂，既能有效地从土壤中提取马兜铃酸有效成分，又能较少地提取土壤中杂质，同时又对环境污染较小，成为土壤中痕量马兜铃酸检测的技术难题之一。
本发明通过大量试验发现，与土壤常规提取溶剂如二氯甲烷、正己烷、丙酮等有机溶剂相比，乙腈不易于与非极性物质互溶，可避免土壤中一些油脂等非极性杂质被提出，显著减少提取溶液中杂质相对含量；而进一步添加乙酸后，乙酸乙腈作为提取溶剂对马兜铃酸具有特异选择性，既能够最大程度提高马兜铃酸(特别是对AAII)的提取率，又可以避免土壤中较多杂质随之进入提取液中，提高后续检测的准确性；同时乙酸的加入还可以作为马兜铃酸的保护剂，有利于维持马兜铃酸在提取溶剂中的稳定性；此外，该提取溶剂还同时兼具仪器响应值高、灵敏度高及提取效率高的优势。优选地，所述分散固相萃取的提取溶剂为0.5-2％乙酸乙腈，进一步优选1％乙酸乙腈。
优选地，所述乙酸乙腈与土壤样品的比例为2-3mL：1g。研究表明，通过控制二者的合理比例，既能保证提取效果，同时又避免试剂浪费。
土壤经过乙酸乙腈溶剂提取后，提取溶液中仍含有一些杂质，需要进一步净化去除杂质。现有净化技术通常采用N-丙基乙二胺(PSA)作为固相吸附剂，可以吸附一些糖类、色素和脂肪酸等极性化合物，但本发明进一步研究发现，该吸附剂在强效除杂的同时也吸附一定量的马兜铃酸，导致回收率偏低，影响了马兜铃酸检测的准确性。
为此，本发明筛选C18作为固相吸附剂，其既能够有效去除提取液中杂质(如脂类、部分色素、糖类等化合物)，又能避免马兜铃酸被吸附，更有利于提高后续检测的准确性。优选地，所述C18的添加量为土壤样品质量的5-10％。
本发明还对分散固相萃取的操作进一步优化。
为了提高提取率，本发明在加入所述提取溶剂之前，将土壤样品与水混合，并控制土壤样品的浓度为0.4-0.5g/mL；通过控制浓度，使土壤样品在水中分散更均匀，更有利于提高马兜铃酸的提取率。
所述提取溶剂处理结束后，加入除水剂脱水；所述除水剂无水硫酸镁和氯化钠。通过除水使水和乙腈分层，避免马兜铃酸溶解在水相中造成损失。同时提取和脱水过程可以同时在离心管中进行，提取液无需转移，减少目标化合物的损失，而且还可以节省时间。
优选地，所述无水硫酸镁与氯化钠的质量比为6-8：1；通过控制二者比例，起到去除提取液中水分的作用。该配比可以有效地去除提取液中水分，而不至于引起马兜铃酸的损失。
本发明所述方法还包括：将所述固相吸附剂处理后的上清液过滤；所用滤膜尺寸为0.2μm。研究表明，选择此尺寸的滤膜，起到过滤净化液中微小颗粒物，保护色谱柱的作用。由于色谱柱内径较小，如果采用0.45μm滤膜，一些细小颗粒物不能有效去除，容易堵塞色谱柱。
作为本发明的具体实施方式之一，所述分散固相萃取的操作如下：
称取土壤样品5.0g于50mL塑料离心管中，加入10.0mL纯水，涡旋混匀，加入1％乙酸乙腈10mL，振荡30min，再加入6.0g无水硫酸镁和1.0g氯化钠，剧烈振荡1分钟，4℃离心3分钟(8000r/min)；
吸取2.0mL提取液加到内含0.3g硫酸镁、0.1gC18的5mL塑料离心管中，涡旋振荡1min，4℃离心3分钟(8000r/min)。吸取上清液过0.2μm滤膜，放入玻璃进样瓶中。
所述液相色谱串联质谱的色谱条件中：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，规格为100×2.1mm，1.7μm；
流动相A：纯甲醇；
流动相B：5mM/L甲酸铵、0.1％甲酸水溶液。
与现有技术常用的水相乙腈-乙酸水溶液、乙腈-乙酸铵水溶液相比，本方法采用甲酸铵和甲酸作为水相，采用纯甲醇作为有机相，可以有效地提高马兜铃酸的离子化效率，提高灵敏度；采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，与相同规格ACQUITY BEH C18色谱柱相比，峰对称性更好。研究表明，采用上述优化后的条件，马兜铃酸的峰形好，分离度高，灵敏度高。
其他所述色谱条件如下：
柱温：40℃；
样品室温度：10℃；
流速：0.3mL/min；
进样量：5μL；
梯度洗脱比例：
0-0.25min，30％A；
0.25-6.0min，30％-95％A；
6.0-8.0min，95％-30％A。
所述液相色谱串联质谱的质谱条件为：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子；监测模式：多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：3.0kV(正离子模式，ESI+)；雾化气温度：400℃；去溶剂气流量：800L·h-1；离子源温度：150℃。
优选地，母离子优化选用加铵峰；研究表明，相比加氢峰，加铵峰的响应值明显升高。
本发明所述的检测方法还包括将所得峰面积代入公式，计算得到土壤样品中马兜铃酸的含量；
所述公式为：
对于AAI，公式为y＝21428.9X-4744.7；
对于AAII，公式为y＝12828.1X-2386.1。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明通过提取溶剂、固相吸附剂的选择及操作条件的优化，大大节省了前处理时间，提高了净化效率、回收率和灵敏度，使整体检测效率得到大幅度提高，解决了现有痕量马兜铃酸检测中存在的前处理耗时长、检测准确性低的问题。
(2)本发明通过对色谱条件及质谱条件的优化，进一步提高了痕量马兜铃酸的检测准确性。
(3)本发明所述检测方法适用范围广泛，可满足大批量不同中药类型种植区域土壤中痕量马兜铃酸的检测需求，也可用于其他用途土壤中马兜铃酸的检测。
(4)本发明所述检测方法具有简便、快速、灵敏度高、精密度和准确度高、适用性强的特点，而且有机溶剂使用量少，环境友好，检出限和定量限低，重现性强。
附图说明
图1为土壤中马兜铃酸MRM总离子流色谱图。
图2为不同提取溶剂对回收率影响。
图3为不同吸附剂种类及用量对回收率影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所用材料与试剂、仪器与设备如下：
1、材料与试剂
乙腈、甲醇(HPLC级，美国Fisher公司)；
无水硫酸镁、氯化钠(分析纯，北京化工厂)，使用前马弗炉500℃加热5h，冷却后放入干燥器备用；
键合硅固相萃取吸附剂C18填料(日本YMC公司)；
N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂填料(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；
0.2μm微孔过滤膜(美国Gelman Laboratory公司)。
2、仪器与设备
ACQUITY超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；
XEVO TQ三重四极杆质谱仪，配有ESI电离源(Waters公司)；
3K30高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；
空气浴振荡器(哈尔滨市东明医疗仪器厂)。
实施例1
本发明提供一种检测土壤中痕量马兜铃酸含量的建立方法，具体测定步骤如下：
(1)样品前处理
粉碎：土壤样品采集后风干去杂物，研碎过250μm筛，充分混匀，装入样品瓶中备用。
提取：称取土壤样品5.0g于50mL塑料离心管中，加入10.0mL纯水，涡旋混匀，加入10mL1％乙酸乙腈，振荡30min；
脱水：再加入6.0g无水硫酸镁和1.0g氯化钠，剧烈振荡1分钟，4℃离心3分钟(8000r/min)。
净化：吸取2.0mL提取液加到内含0.3g硫酸镁、0.1gC18的5mL塑料离心管中，涡旋振荡1min，4℃离心3分钟(8000r/min)。
过滤：吸取上清液过0.2μm滤膜，放入玻璃进样瓶中。
(2)LC-MS/MS条件
超高效液相色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(100×2.1mm，1.7μm)；
色谱柱温：40℃；
样品室温度：10℃；
进样体积：5μL；
流动相A：甲醇；
流动相B：5mM/L甲酸铵、0.1％甲酸水，流速为0.3mL·min-1；
梯度洗脱条件：0-0.25min，30％A；0.25-6.0min，30％-95％A；6.0-8.0min，95％-30％A。
(3)质谱条件
离子源：电喷雾电离源(ESI)；
扫描方式：正离子；
监测模式：多反应监测模式(MRM)；
毛细管电压：3.0kV(正离子模式，ESI+)；
雾化气温度：400℃；
去溶剂气流量：800L·h-1；
离子源温度：150℃。
质谱分析参数见表1。
表1马兜铃酸质谱分析参数
注：表中*代表定量离子。
图1为土壤样品中马兜铃酸MRM总离子流色谱图。
(4)定量方程的建立
首先，计算马兜铃酸在土壤溶液中的基质效应，A：在纯溶剂中分析物的响应值；B：土壤样品基质中添加相同含量分析物的响应值，基质效应(％)＝B/A×100％，基质效应为40.7％。
基质效应大于20％，说明存在明显的基质效应。因此采用基质溶液配标的方法进行定量。
如果基质效应低于20％，说明基质效应不明显，可以忽略基质效应，采用溶剂配标的方法进行定量。
选取不含马兜铃酸的土壤按上述方法前处理，作为空白基质溶液，配制不同浓度的马兜铃酸基质标准溶液，制作标准曲线，外标法定量。
其次，方法线性范围、检出限与定量限
按上述条件，对不同浓度的马兜铃酸基质标准溶液进行测定，以马兜铃酸的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，建立线性回归方程。
以3倍信噪比作为检出限，10倍信噪比作为定量限，见表2。
表2马兜铃酸线性方程、相关系数、检出限和定量限
再次，方法加标回收率
在空白土壤样品中添加20、50、100μg·kg-1共3个质量分数的马兜铃酸的混合标准溶液，按照上述优化的实验方法进行加标回收率试验，每个添加水平重复测定6次。
结果见表3，2种马兜铃酸回收率在79.3％～99.3％之间，相对标准偏差在1.6％～8.1％之间，符合国家标准《GB/T27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南》的要求。
表3马兜铃酸加标回收率及精密度
化合物名称 加入量(μg·kg-1) 回收率(％) 相对标准偏差(％)
AAI 20 79.8 6.7
50 90.1 8.1
100 99.3 1.6
AAII 20 79.3 2.4
50 94.1 1.7
100 88.7 2.9
(5)样品测定
将步骤(3)所得峰值代入步骤(4)所得线性方程中，计算出浓度。
结果显示，对于采集的中药种植地土壤样品，仅检测到AAI残留，且含量为1.8-70.6μg·kg-1，说明本发明所述检测方法可以用于中药种植地土壤中马兜铃酸的准确测定。
基于检测结果，有必要对含马兜铃酸中药种植土壤中马兜铃酸含量进行监测，保证中药种植地产地环境安全。
效果验证
本发明还对所述检测方法的主要关键技术点进行考虑，具体如下：
1、提取溶剂种类的考察
采用与实施例1相同的检测步骤，区别仅在于提取溶剂为纯乙腈、0.1％乙酸乙腈、0.2％乙酸乙腈、0.5％乙酸乙腈、1％乙酸乙腈、2％乙酸乙腈。
结果如图2所示，乙腈中加入0.1％-1％乙酸有利于提高马兜铃酸的回收率，其中加入1％乙酸回收率最高。
另外，由于甲酸相对乙酸而言，酸性和毒性较强，因此不适合将甲酸加入乙腈中作为提取溶剂。
2、考察吸附剂种类
采用与实施例1相同的检测步骤，区别仅在于吸附剂及添加量不同，相对于土壤样品质量而言，吸附剂添加量分别为PSA20％、PSA 20％+C18 20％、C18 5％、C18 10％、C1820％、C18 30％。
结果如图3所示，PSA 20％的回收率较低；而C18 5％、C18 10％、C18 20％、C1830％的回收率均较高；特别的是，当C18与PSA复配时，其回收率同样较低。从节约成本的角度考虑，优选C18的添加量为土壤样品质量的5-10％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种土壤中马兜铃酸的检测方法，采用分散固相萃取-液相色谱串联质谱联用技术；其特征在于，所述分散固相萃取的提取溶剂为0.1-2％乙酸乙腈；
所述乙酸乙腈与土壤样品的比例为(2-3)mL：1g；
所述检测方法包括提取前土壤样品与水的混合；控制土壤样品的浓度为0.4-0.5g/mL；
所述检测方法包括提取后脱水处理；所述脱水使用的除水剂为无水硫酸镁和氯化钠；所述无水硫酸镁与氯化钠的质量比为6-8:1；
所述分散固相萃取中的吸附剂为C18。
2.根据权利要求1所述的土壤中马兜铃酸的检测方法，其特征在于，所述分散固相萃取的提取溶剂为0.5-2％乙酸乙腈。
3.根据权利要求2所述的土壤中马兜铃酸的检测方法，其特征在于，所述提取溶剂为1％乙酸乙腈。
4.根据权利要求1所述的土壤中马兜铃酸的检测方法，其特征在于，所述C18的添加量为土壤样品质量的5-10％。
5.根据权利要求1所述的土壤中马兜铃酸的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括吸附后的过滤；所述过滤使用的滤膜尺寸为0.2μm。
6.根据权利要求1-5任一项所述的土壤中马兜铃酸的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的色谱条件中：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，规格为100×2.1mm，1.7μm；
流动相A：纯甲醇；
流动相B：5mM/L甲酸铵、0.1％甲酸水溶液。
7.根据权利要求6所述的土壤中马兜铃酸的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的质谱条件中：母离子选用加铵峰。
8.根据权利要求7所述的土壤中马兜铃酸的检测方法，其特征在于，所述的检测方法还包括将所得峰面积代入公式，计算得到土壤样品中马兜铃酸的含量；所述公式为：
对于AAI，公式为y＝21428.9X-4744.7；
对于AAII，公式为y＝12828.1X-2386.1。
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